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1 畜牧兽医学报 热应激致 (' 出入核与细胞凋亡的关系 陈洪博 段滇宁 鲍恩东 龙岩学院生命科学学院 龙岩 南京农业大学动物医学院 南京 摘 要 旨在探讨热应激对 心肌细胞构成型 * 7 出入核及细胞凋亡的影响 以 H 作为热应激模型温度 通过转染 6" 抑制 表达 3 检测细胞质和细胞核内 表达 检测细胞培养液! 浓度 /& 双染法检测细胞凋亡 结果表明 正常 心肌细胞质 表达量较高 细胞核中表达量很低 细胞质和细胞核 5 表达量非常低 热应激后细胞质 表达量无显著差异 而细胞核 热应激 和 后极显著升高 - 热应激 后开始降低 细胞质和细胞核 5 热应激后显著升高 - 或 - 抑制表达后 细胞质 水平显著降低 热应激后 入核明显减少 但仍然有入核现象 抑制表达对细胞质和细胞核 5 表达无显著影响 与热应激组相比 热应激 6" 组! 表达量呈升高趋势 热应激 两组出现显著差异 - 抑制表达后 细胞在热应激后更容易发生凋亡 而且在热应激 和 内 两组之间存在显著差异 - 结果提示 热应激可诱使 出入细胞核 抑制表达后热应激诱导 入核显著降低 细胞损伤加重 细胞凋亡升高 关键词 热应激 出入核 细胞凋亡中图分类号 文献标志码 文章编号 / &"%(1+ -%('$ 1" 5 1"'&% 1"1"( (+! (( &" 3!1"! ' $&' $ $ $ "/%%&' $/ +('/) 5 ** ) 5 5 * 55 5 H ) ) ) " ) 5) 5 * * 3 3! ** /& *3 /) *)) ) 7 5 )) )* * ) * * 7 /) ) 5) /) 5* * ) - ) ) ) )3 ) 7 5* * ) )3 ) ) * * & 5 ) ) ) *5 ) 5! 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金面上项目 龙岩学院博士启动项目 ' 作者简介 陈洪博 男 山东青州人 讲师 博士 主要从事热休克蛋白 保护作用的研究!7 通信作者 鲍恩东 教授 3!* *

2 期 陈洪博等 热应激致 出入核与细胞凋亡的关系 ) ) 6" *5 ) 3) *5 ) - ) ) ) 3)*5 ) - *) *5 5* )7 * ** 7 ) 55 )!-" () 5 5* 55 热休克蛋白 ))5 是具有高度保守性 在机体内起非特异性保护作用的一类蛋白质 在维持细胞内环境稳态中起重要作用 根据分子量大小分为四个家族 和小 其中 是热休克蛋白家族中最重要的成员 在细胞内源性保护机制中起 重要作用 根据其表达特征可分为诱导型 * 3 5 和构成型 * 7 在正常生理状态下 细胞内 大量存在 在细胞的正常代谢和生理调控过程中发挥作用 而 5 在正常细胞内含量非常低 当机体受到多种应激原刺激时表达量显著升高 5 通过绑定到受损蛋白质和错误折叠的多肽 从而起到修复或者降解变性蛋白 的目的 使细胞产生耐受性 热应激不仅影响畜禽的生长 发育 免疫能力及生产性能 而且能引起畜禽的猝死 造成应激过程中动物猝死的主要原因在于动物重要生命器官 例如心 的组织细胞遭受严重的应激性病理损伤 可以保护自身的组织细胞免受不良应激原刺激所产生的各种应激性伤害 在应激耐受和应激保护中发挥重要作用 虽然应激状态下有关 的研究报道很多 但作为动物体内最保守的蛋白质之一 的确切功能 热应激后细胞核内 含量动态变化及规律 在热应激致细胞凋亡中的作用还不十分清楚 本试验拟通过 6 " 抑制 细胞中 的表达 观察热应激后细胞质和细胞核中 的表达规律 细胞凋亡的变化 阐明 出入核在细胞凋亡中的作用 材料与方法 实验材料 细胞系购自中国科学院上海细胞库 细胞核蛋白裂解提取试剂盒 /) '& 蛋白定量试剂盒 /) *5 5 化学发光底物试剂盒美国 /) / 公司 抗体! (5 抗体! ( & /) 抗体购自碧云天生物技术公司 荧光标记的阴性对照 6 " 6" 引物序列 &&/+ &++&/&/ 和 5 脂质体转染试剂 7! 试剂盒和 /& 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司 试验设计将 细胞按 G 的细胞密度接种在六孔板中 使细胞均匀分布于孔板中 培养 ) 后严格按照 5 操作步骤转染 6" 转染 ) 后 热应激处理细胞 将细胞置于 H 的水浴中孵育分别应激 和 收集细胞用于流式细胞仪检测和 3 检测 细胞核蛋白和细胞质蛋白的提取严格按照试剂盒说明书操作 用预冷 ' 将贴壁细胞洗一遍 用细胞刮刮下细胞 H 离心 收集细胞 弃掉上清液 留下细胞沉淀备用 每 细胞沉淀加入 含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白抽提试剂 高速剧烈振荡 把细胞沉淀完全悬浮并分散开 冰浴 加入细胞蛋白抽提试剂 ' 高速剧烈振荡 冰浴 高速剧烈振荡 H 离心 吸取上清至预冷的离心管中 即为抽提得到的细胞质蛋白 H 保存备用 将沉淀部分的上清液吸尽 加入 含蛋白酶抑制剂的细胞核蛋白抽提试剂 振荡 使细胞沉淀团块完全分散开且悬浮于蛋白提取试剂中 之后放在冰块上冰浴 静置 再重复振荡 持续操作 H 离心 立即吸取上清液至预

3 畜 牧 兽 医 学 报 卷 冷的离心管中 即为抽提得到的细胞核蛋白 '& 法测定样品蛋白质浓度 H 保存备用 (%+&" 检测 表达将待测样品与 G!3* 按照 比例混合 置于漩祸振荡仪振荡 充分混匀 煮沸变性 冷却 置于 H 冰箱保存备用 取 加入到浓缩胶的上样孔中 以预染的蛋白质 作为对照 条件下 电泳 冰浴条件下 电转 将脱脂奶粉溶于 /' / 中配制成 : 的封闭液 将转印好的! 膜置于其中 室温封闭 ) 一抗 H 孵育过夜 二抗室温孵育 ) 显影后进行灰度扫描 $* 软件进行分析 流式细胞仪检测细胞凋亡用预冷的 & '* 将应激处理后的细胞洗 次 每孔加入 不含!/ 的胰酶消化液消化并离心收集细胞 再用预冷 & '* 洗三次 最后将心肌细胞重悬于 ''* 中 加入 /& 轻轻混匀 室温避光反应 加入 染色 避光 然后在 ) 内进行检测 将 ''* 加入待测样品中 移入流式细胞专用试管中 混匀检测 数据分析采用 软件 6 活性的检测按照试剂盒操作步骤检测细胞上清液中! 的含量 数据统计与分析用 统计软件提供的多重比较的单因素分析对热应激组与试验组的差异进行统计分析 每个试验重复 次 结果以平均值 标准差 表示 - 表示差异显著 - 表示差异极显著 和 表示与对照组相比时试验组在 和 水平差异显著 - - ) 5 ) ) *5) ) 图 热应激 ' 细胞质内 相对表达量 ) && &("1( "% % 5((!"'&' &('!"1& ( 热应激对 ' 细胞核内 (' 和 (1 表达的影响 热应激对 心肌细胞核 蛋白表达变化如图 所示 细胞核 和 5 的含量都很低 热应激 和 后细胞核中 表达量极显著升高 - 热应激 后 表达量呈下降趋势 但仍显著高于对照组 - 热应激后 5 表达呈升高趋势 热应激 后表达量显著升高 - 结 果 热应激对 ' 细胞质内 (' 和 (1 表达的影响 热应激后 心肌细胞质内 的表达变化如图 所示 心肌细胞质内 的含量呈下降趋势 但各组无显著差异 - 正常 心肌细胞质中 5 表达量非常低 但热应激处理后 5 表达量迅速升高 热应激 后 5 表达量显著升高 - 热应激 后 5 表达量极显著升高 - 和 表示与对照组相比时试验组在 和 水平差异显著 - - ) 5 ) ) *5) ) 图 热应激 ' 细胞核内 相对表达量 ) && &("1( "% % 5((!"'&' &(%'& (

4 !% 期 )%1 陈洪博等$热应激致 J 1& 出入核与细胞凋亡的关系 (! 转 染 R $" G*+ 后 热 应 激 对 RM!细胞质 内 R $" 和 R I$! 表达的影响 1& 基 因 干 涉 对 J/ 细 胞 质 J 1& 和!! J JS1 表达的影响如图 * 所 示!转 染 J 1& $T5 后细胞质中 J 1& 含 量 明 显 减 少!热 应 激 %&&) )& $ - 后 J 1& 表 达 量 显 著 升 高 " &&转 染 J 1& $T5 对 JS1 表达量无明 显 影 响!JS1 表达量非常低!但热应激处理后 JS1 表达 量 迅 速 升高!热应激 %&&) )&$ - 后 JS1 表 达 量 极 显 著 升高" &%' & 和 &' &% 水 平 " 和 "" 表示与对照 组 相 比 时 试 验 组 在 &' 差异显著 S $ -F AM AM "&! "" &%! VAM- M M"F BSV$ A AM 图 %! 转染 R $" G*+ 后热应激 RM! 细胞核内 R/H$" 相 对表达量 %! 5R/H$" YI 7 7 S 71 1 R $"A 7 7 >3 ' $T5 组 3J 含 量 极 显 著 升 高 " &%!两 组 之间存在显著差异" &' & 和 &' &% 水 平 " 和 "" 表示与对照 组 相 比 时 试 验 组 在 &' 差异显著 S $ -F AM AM "&! "" &%! VAM- M M"F BSV$ A AM 图 (! 转染 R $" G*+ 后热应激 RM! 细胞质内 R/H$" 相 对表达量 (! 5R/H$" YI 7 7 S R $"A 7 7 >3 ' I > 3 %! 转 染 R $" G*+ 后 热 应 激 对 RM!细胞核 内 R $" 和 R I$! 表达的影响 1& 基 因 干 涉 对 J/ 细 胞 核 J 1& 和!! J JS1 表达的影响如图 ) 所示! J 1& 抑制表达后! 细胞核中 J 1& 表达量明显减少!热应激后呈升高趋 势!热应激 %&&$ -后表达量显著升高" &!热 应激 )&$ - 后 表 达 量 开 始 降 低&细 胞 核 中 JS1 含量非常低!热 应 激 后 JS1 表 达 量 呈 升 高 趋 势! 热应激 )&$ - 后表达量极显著升高" &%' '! 热应激对 RM! 心肌细胞中 V)R 的影响 热应 激 J/ 心 肌 细 胞 培 养 液 中 3J 活 力 的 "" 和 Q 分 别 表 示 在 &' & 和 &' &% 水 平 上 差 异 显 著 和 极 显著 &-"Q &% S M"V$ A "! b 图 '! 热应激后 RM!细胞培养液中 V)R 的水平" &c5%^ " " '! 5V)R 7 > 1> 5 &c5% ^" T! 热应激对 RM! 心肌细胞凋亡的影响 热应激对 J/ 心 肌 细 胞 凋 亡 影 响 如 图 ) 1所 示!热应激后 J/ 细胞凋亡率呈升高趋势!在 JK 组 影响如图 所 示!在 JK 组 和 JKj $T5 组 热 应 激后 3J 的表达量都呈升高趋势!热应 激 )& $ - 热应激 %&&$ - 后细胞凋亡 率显 著升 高" &! 后 3J 含量极 显 著 升 高 " &%' 热 应 激 %&& &' &%&在 JKj $T5 组热应激*&$ - 后细胞凋亡 率显著升高" &!热应激 %&&$ - 后细胞凋亡 $ - 后 JK 组 3J 含量显著升高" &! JKj 热 应 激 )& $ -后细胞凋亡率极显著升高" E%

5 )%( 畜!牧!兽!医!学!报 )( 卷! 5'对照组& 'J 1& $T5 组& '热应激 )&$ - 组& 3'热应激 )&$ - j J 1& $T5 组 5' F BS&'J 1& $T5F BS&'JK)&$ -F BS&3'JK)&$ - j J 1& $T5F BS 图 T! 热应激对 RM! 心肌细胞凋亡的影响 T!: RM! II 的应激耐受 性)提 高 细 胞 存 活 率 *%%!%+' J 1& 也 存 在于其他细 胞 器 内!如 细 胞 核 和 近 细 胞 膜 位 置 *%*+' 研究发 现!在 正 常 细 胞 质 内 J 1& 表 达 量 很 高!热 应激后 J 1& 的 表 达 量 降 低!但 并 无 显 著 差 异&细 胞核 内 J 1& 热 应 激 后 表 达 量 显 著 升 高!热 应 激 %&&$ - 后极显著升 高" &%!热 应 激 )& $ 后表 达 量 开 始 降 低!表 明 热 应 激 后 J 1& 可 能 入 核!与细胞核内某些蛋白质相结合!防止某些蛋白质 错误折叠!从而 抑 制 细 胞 凋 亡 的 发 生' JS1 在 正 常细胞质中表达量非常低!应激后大量表达!细胞核 "" 和 Q 分别表示在 &' & 和 &' &% 水平上 与 对 照 组 差 异 显 著和极显著 S M"V$ A!"! ' &&Q' &% c5%^" 图 $! 热应激后 RM! 细胞凋亡的影响" & c5%^" $!: RM!II " & 中 JS1 的 表 达 量 与 细 胞 质 中 表 达 规 律 相 一 致' D'a O $ - 等研究发现 J 1& 含量在应激前后的 细 * + 胞内 无 明 显 变 化 %)!D'7A-F 等 研 究 发 现 细 胞 内 JS1 在应激后显著 升 高!而 在 正 常 细 胞 内 水 平 较 低 *%+!这与我们的研究相一致' 大 量 研 究 表 明 热 应 率极 显 著 升 高 " &%' 在 热 应 激 *& 和 %&& 激后细胞核内 JKH1& 迅速增加!细胞质内只有少量 $T5 组 细 胞 凋 亡 率 显 $ -!与 JK 组 相 比!JKj 著升高" &' 存在!当细胞处于恢复阶段时!核内的 JKH1& 消失! 细胞质内仍有低水平 JKH1& 表达 *%!%1+!而本研究发 (! 讨! 论 现热应激后 细 胞 核 内 J 1& 呈 现 先 增 多 后 减 少 的 现象!应激后 JS1 在细胞核和 细胞 质中 都大 量 表 J 1& 是 一 种 重 要 的 细 胞 质 分 子 伴 侣 保 护 蛋 白!广泛参与各种保护机体和细胞的功能!增强机体 达'细胞质中 J 1& 和 JS1 的 含 量 变 化 与 其 他 学者研究相一致!但细 胞 核 J 1& 的 含 量 变 化 之 前

6 期 陈洪博等 热应激致 出入核与细胞凋亡的关系 并无报道 6" 干扰技术 6" 6" 能 使得细胞系中特定蛋白质的表达下调 该技术被大规模的应用在细胞系上 用于某种特定蛋白质的 研究 本试验采用 6" 转染 心肌细胞 转染 ) 后细胞质内 表达量极显著降低 - 达到试验所需条件 与热应激组相比 6" 组的 细胞质内 表达量呈升高趋势 但 的含量始终处于相对较低的水平 细胞核内 的含量显著降低 变化规律与热应激组相一致 试验结果表明热应激后 进入细胞核 抑制使得进入细胞核的 减少 与热应激组相比 热应激 6" 组的 细胞质和细胞核内 5 的表达变化规律并无显著改变 但细胞质中 5 的表达出现时间提前 试验结果表明 抑制表达后 细胞更容易受到高温的刺激 为减少高温对细胞的影响 5 的表达量迅速升高 热应激可使细胞遭受损伤 随着热应激时间延长细胞损伤越来越严重 细胞上清液中! 的表达量极显著升高 - 这与许多报道研究一致 与热应激组相比 热应激 6" 组! 变化规律是相一致 但! 的表达量呈升高趋势 热应激 两组出现显著差异 - 表明 抑制表达后细胞更容易受到损伤 热应激后 细胞凋亡率升高 与热应激组相比 热应激 6" 组 细胞凋亡率变化规律相一致 抑制表达后 细胞在热应激后更容易发生凋亡 而在热应激 和 内 两组之间存在显著差异 - 表明 抑制表达后细胞更容易发生凋亡 等研究表明细胞内 过表达后使 " 活性受到 抑制 从而抑制细胞凋亡 还能抑制应激 激酶 + 的活性 防止细胞凋亡!! 等研究发现过表达 能抑制 5 的活性 从而抑制细胞凋亡的发生 结 论 研究发现热应激既能引起 入核 又能使 出核 细胞凋亡和损伤与细胞内 的表达量呈负相关 即当细胞核内 表达量降低后 热应激造成的细胞凋亡和损伤的程度明显加重 表明 可以保护自身细胞免受不良刺激 但 是具体通过哪一条信号通路来抑制细胞凋亡和损伤还有待进一步研究 参考文献 / %' ( 李玉保 付旭彬 鲍恩东 热休克蛋白研究进展 畜牧与兽医 -' 1 > ''!6 7)) 5 )!(% )"$ $ "&) -1'!-"-5 (5 ) ) 3 7 ) 3 +66!&+16'1>" 6 +"" )5* * 55 )! $ 1!!% %' "/ ) 5 -! 鲍恩东 龚远英 6/1"+ 等 肉鸡热应激病理损伤与应激蛋白 相关性研究 中国农业科学 '!+" /1"+6 3 5) ) *) 3% % &) 6! "!$1 / /)* )) 5 75%1' + "!6 " %/" ++6'1%! +6 3 )) * ) ) '6" /! "!7 ) 5) 5)5 ) )5 + "+ / & * )) 55 * * )) *5! '' "+1% 6+1'!* 5 ) ) 3 3* 3(

7 畜 牧 兽 医 学 报 卷 & +&// 6 "&% "+ - /) ) 5 & * & /6 5 +6"+!6 &6 * ) ) 5 5 '53) 3* % $ &"+ "! "+ -& ))5 ) * ) ) ) 3 "! * - $ /"& -"" 6' /) 5 )) )3 ) / /6 ) - % "+ -1 % 1 %5 5 )* * 5 6/ 16/" * 5* )*) &! 5 5) * ) 5 " "!$1 / ) 5 ) * 5 7* 5 & " & 6'- & " " "1 *3 6" * 5) - " & '6 6'6/ "! &!*5 * 6" 6" ** % 1 >"+! )3) " ' 5) ' 7 1* 55 +"+ > 1 / /! "+ * 3 5!$ 1!!% 6!!&6" '16+ / /)) 5 * ) 5 *5 * 55 编辑 白永平

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