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1 中藥濃縮製劑 微生物限量檢驗法 日期 : ~24

2 大綱 目的 檢驗規格之依據 ( 衛生署公告 ) 檢驗方法介紹 檢驗流程 查驗登記案文件準備須知 查驗登記常見問題

3 微生物限量檢驗法 目的 各種非無菌性藥品 ( 原料藥至最終產品 ) 微生物總生菌數及特殊致病原菌之檢驗方法

4 中藥製劑含微生物限量之公告規格 公告日期 署授藥字第號 適用範圍 總生菌數 酵母菌及黴菌 總數 公告事項 ( 微生物限量規格 ) 大腸桿菌 沙門氏桿菌 中藥碎片劑型 10 7 cfu/g 10 4 cfu/g 10 2 cfu/g 不得檢出 個處方中藥濃縮製劑 10 5 cfu/g 未規定不得檢出不得檢出 複方製劑,2 年內完成單味製劑 10 5 cfu/g 未規定不得檢出不得檢出 複方製劑 100 項單味 製劑 ( ) 單味製劑 修正藥品查驗登記準 則第 86 條 - 萃取濃縮製 劑之審查基準 10 5 cfu/g 未規定不得檢出不得檢出 1. 生物限量應準用製劑添加之輔助劑或賦形劑之規格 ; 2. 萃取濃縮製劑之微生物限量應依主管機關公告之規定

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7 公告修訂 中藥濃縮製劑含異常物質之限量 發文日期 : 中華民國 99 年 5 月 28 日發文字號 : 署授藥字第 號 主旨 : 公告修訂 中藥濃縮製劑含異常物質之限量, 並自 99 年 7 月 1 日起, 生產之產品, 均須符合本公告之規定 依據 : 藥品查驗登記審查準則第 86 條 公告事項 : 一 附 中藥濃縮製劑含異常物質之限量 如附表 二 本署 95 年 10 月 26 日署授藥字第 號令 97 年 9 月 15 日署授藥字第 號公告 98 年 7 月 14 日署授藥字第 號公告, 與本公告之規定有牴觸之部分, 均自 99 年 7 月 1 日起停止適用 三 持有前述許可證者, 應依本公告修正檢驗規格並留廠備查, 毋須向本署報備, 惟本署將加強上市後產品抽查

8 中藥濃縮製劑含異常物質之限量 ( 署授藥字第 號公告 ) 異常物質限量適用範圍檢驗方法備考 總重金屬 砷 鎘 汞 鉛 微生物總生菌數 大腸桿菌 沙門氏菌 30 以下 (ppm) 3 以下 (ppm) 0.5 以下 (ppm) 0.5 以下 (ppm) 10 以下 (ppm) 10 5 以下 (cfu/g) 不得檢出 複方製劑,2 年內完成單味製劑 33 方 ( 註 ) 製劑,3 年內完成公告 200 基準方其餘製劑 複方製劑,2 年內完成單味製劑 台灣傳統藥典 中華藥典 日本藥局方 歐洲藥典 美國藥典 中華人民共和國藥典或藥廠自行開發檢驗方法 ( 需提依據 ) 等, 藥典以最新版本或前一版本為限 附表 一 特殊情形者, 另行公告 二 本限量將於實施六個月後檢討修正 註 :33 方中藥濃縮製劑包括 : 葛根湯 小青龍湯 加味逍遙散 桂枝湯 甘露飲 麻杏甘石湯 補中益氣湯 六味地黃丸 黃連解毒湯 獨活寄生湯 四逆散 血府逐瘀湯 杞菊地黃丸 辛夷清肺湯 定喘湯 知柏地黃丸 柴葛解肌湯 消風散 清心蓮子飲 龍膽瀉肝湯 炙甘草湯 八味地黃丸 川芎茶調散 逍遙散 藿香正氣散 香砂六君子湯 荊防敗毒散 疏經活血湯 止嗽散 濟生腎氣丸 防風通聖散 二陳湯 六君子湯

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10 ( 署授藥字第 號公告 )

11 ( 署授藥字第 號公告 )

12 檢驗方法依據 依據中華藥典第六版 _ 附錄第 131 頁 ~138 頁 微生物限量檢驗法 好氧性微生物總數 ( 總生菌數 ) 及酵母菌與黴菌總數 微生物污染檢驗法 ( 特殊致病原菌 ) 大腸桿菌 沙門氏桿菌 綠膿桿菌 金黃色葡萄球菌

13 微生物限量檢測項目 總生菌數 - 好氧性微生物總數 (Total Viable Aerobic Count) - 酵母菌與黴菌總數 (Total Yeasts and Molds Count) 特殊致病原菌 - 大腸桿菌 (Escherichia coli) - 沙門氏桿菌 (Salmonella) - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa) - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)

14 檢驗方法 檢驗前準備 培養基製備 培養基效能性測試 標準菌株及保存 檢驗流程 檢體預試驗 取樣 稀釋及增菌 培養 結果觀察

15 檢驗前準備事項 1 設備 天平 無菌操作台 ( Laminer Flow) 高壓滅菌釜 ( Autoclave) 培養箱 ( Incubator) ph 測定儀 培養基配製 配製後應標示 : 培養基名稱 批次號碼 製備日期及有效期限 滅菌條件 : 一般為 mins 或依藥典之規定 融化的培養基儲存不應超過 8 小時

16 檢驗前準備事項 2 培養基效能試驗 (Growth Promotion Test) 稀釋液之配製 使用器具之滅菌

17 緩衝液與培養基 ph 7.2 磷酸鹽緩衝液 (PBS) : 稀釋 液體培養基 : 稀釋 增殖 Tryptic soy broth (TSB) E.Coli. Salmonella Lactose broth (LB) Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus 固體培養基 : 斜面 平板 Tryptic soy agar (TSA, 好氧性微生物總數 ) Sabouraud dextrose agar (SDA, 酵母菌及黴菌總數 ) 特殊培養基 : 鑑別如 MacConkey Agar 固體培養基再融化最多 1 次, 以免影響其效能

18 ph 7.2 磷酸鹽緩衝液 (PBS) 儲備溶液 磷酸二氫鉀 ( KH 2 PO 4 ) 34g / 500 ml H 2 O 以氫氧化鈉試液調其 ph 值為 7.2 ± 0.1 加水至全量為 1000 ml 混均, 儲存於 2 ~ 8 冰箱備用 使用溶液 取儲備溶液加水稀釋 ( 1:800) 滅菌後使用

19 致病原菌之特殊培養基 大腸桿菌 MacConkey agar medium Levine Eosine-Methylene Blue (EMB) agar medium 沙門氏桿菌 Selenite Cystine broth (SCB) Tetrathionate broth 使用前加入 0.1% 煌綠 (Brill Green) 及碘 - 碘化鉀試液,不可再加熱 Brillant Green agar (BGA) Xylose-Lysine Desoxycholate agar(xld) Bismuth Sulfite agar (BSA) Triple Sugar Iron agar (TSIA) 斜面

20 培養基效能測試 (Growth Promotion of the Media) 無菌性試驗 (Sterility of media) 於 30~ 35 恆溫培養箱中培養 18 ~24 小時, 觀察是否有菌落生長 有效性試驗 (Growth promotion test) -TSA medium 選適當菌種, 菌種接種量 (10~100 CFU) 30~ 35 培養 3~5 日觀察是否能長菌 - SDA medium Candida albicans 菌種接種量 (10~100 CFU) 20~ 25 培養 5 ~7 天觀察是否能長菌 - 選擇性培養基以相對應之菌株接種, 菌種接種量 (10~100 CFU) 30~ 35 培養 18 ~24 小時觀察是否能長菌

21 微生物限量試驗標準菌株 藥典建議之品管標準菌株名稱 ATCC 編號 BCRC 編號 Escherichia coli ATCC 8739 BCRC Salmonella typhimurium ATCC BCRC Staphylococcus aureus ATCC 6538 BCRC Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 BCRC Bacillus subtilis ATCC 6633 BCRC Candida albicans ATCC BCRC Aspergillus niger ATCC BCRC ATCC: American Type Culture Collection BCRC: Bioresourse Collection and Research Center ( 食科所 )

22 菌種之保存 (Maintenance of Stock Culture) 繼代培養菌種 ( 4 ) 冷凍保存 ( 一 )(-20 ~ -30 ) 約半年 冷凍保存 ( 二 )(-40 ~ -90 ) 數年 冷凍保存 ( 三 ) 液態氮 (-180 以下 )( 可長期保存 ) 冷凍乾燥法 ( 可長期保存 )

23 冷凍保存 (-40 ~ -90 ) 器具 : 無菌吸管 無菌菌種保存瓶及菌種盒 材料 : 菌株 細菌培養液 20% 無菌甘油溶液 方法 : 取菌液與 20% 無菌甘油溶液以 1:1 比例置於 菌種保存瓶內均勻混合後放入菌種盒置 4 冰箱 2 小時 小時 再置 -40 ~ 90 保存

24 微生物限量檢驗流程圖 檢體特性及檢體預備試驗之確認 好氧性微生物總數 取樣 稀釋 培養皿製備 培養 結果計算 特殊致病原菌 取樣 增菌培養 特殊培養基篩選 再確認培養基篩選 結果觀察及判定

25 檢體預備試驗 目的 確認檢體是否具抑菌作用 檢體稀釋階之決定 避免誤判各項檢驗結果之正確性

26 預備試驗方法 1 活化微生物限量試驗 4 株標準菌 將金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 綠膿桿菌及沙門氏桿菌等菌種經二十四小時培養後使用 檢體系列稀釋 分別將上述菌株接種不少於 10-3 之菌液 1 ml 加入不同稀釋階之檢體中 ( 如 10g 檢品 + 90mL7.2 PBS 或 TSB 至 100mL) 結果應有增殖作用 ( 混濁或有菌落產生 ) 表示檢體不具抑菌作用

27 預備試驗方法 2 試驗結果具抑菌作用 ( 培養基不產生混濁 ) 處理法 增加菌種稀釋液之量 增加檢體稀釋倍數 於培養基中加入適量不活化劑 (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin 0.5% - Polysorbate % Medium) 或用微孔濾膜法 (membrane filtration)

28 檢體取樣原則 原則 將檢體依其物理性質, 調製成適合之溶液或懸浮液, 調製後以不改變原存在於檢體內生菌之數量及種類為主

29 取樣 取樣器具 ( 無菌 ) 容器藥匙吸管培養皿 取樣環境及設備 天平 無菌操作台 取樣量 固體粉末 10g 2 液體檢體 10mL x 2

30 稀釋及增菌 好氧性微生物總數- 10g/10mL 檢品 + 90mL7.2 PBS 或 TSB 至 100mL(10 倍稀釋 ) ( 必要時以 10 倍稀釋方式逐步稀釋至所需倍數 ) 供作檢液, 使成 30~300 cfu/plate -黏性強或很混濁檢液將稀釋倍數放大 (10 50 ) -混合均勻後取樣 -檢品稀釋至培養皿製備, 不超過一小時 增菌- 10g/10mL 檢品加入 90mL Lactose broth 混合均勻後培養

31 好氧性微生物總數檢驗 ( 培養皿法 ) 取檢品 10 g/10ml 加 ph 7.2 磷酸鹽緩衝液 90mL 或 TSB 至 100mL (10 倍稀釋液 ), 視情況以 10 倍稀釋方式逐步稀釋至所需倍數, 供作檢液 取上述各種不同比例稀釋液各 1.0mL 加入培養皿 ( 做二重複 ) 各加 15 ~ 20 ml 45~ 50 之 Tryptic soy agar ( TSA ), 水平均勻混合, 靜置使凝固 將培養皿倒置, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 48 ~ 72 小時 ( 連續觀察 ) 取同稀釋倍數之兩個培養皿之菌落數, 求其平均值, 再乘以其稀釋數, 即為其每克 / 每毫升之生菌數 * 單位 : CFU/g or CFU/mL(colony forming unit )

32 酵母菌與黴菌總數檢驗 ( 培養皿法 ) 取檢品 10g/10mL 加 ph7.2 磷酸鹽緩衝液 90 ml 或 TSB 至 100mL (10 倍稀釋液 ), 視情況以 10 倍稀釋方式稀釋至所需倍數 ), 供作檢液 取上述各種不同比例稀釋液各 1.0mL 加入培養皿 ( 做二重複 ) 各加 15~20mL 45 ~50 之 Sabouraud Dextrose Agar ( SDA ), 水平均勻混合靜置使凝固 將培養皿倒置, 於 20 ~ 25 恆溫培養箱中培養 5 ~ 7 天 ( 連續觀察 ) 取同稀釋倍數之兩個培養皿之菌落數, 求其平均值, 再乘以其稀釋倍數, 為其每克 / 每毫升之生菌數

33 總生菌數與酵母菌及黴菌數比較 稀釋液培養基培養溫度培養時間 總生菌數 7.2 PBS TSA 酵母菌及黴菌總數 SCDA 7.2 PBS SDA PDA 30~35 2~3 天 20~25 5~7 天 總生菌數 : Tryptic Soy Agar (TSA) Soybean-Casein Digest Agar (SCDA) 酵母菌及黴菌 : Sabouraud Dextrose agar (SDA) Potato Dextrose Agar (PDA)

34 特殊致病原菌 - 大腸桿菌 (E.Coli.) 取檢品 10g/10mL, 加入 Lactose Broth 至 100mL, 於 30 ~35 恆溫培養箱中做增菌培養 24~48 小時 以接種環直接接種於 MacConkey Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置 於 30 ~35 恆溫培養箱中培養 24~48 小時, 觀察其菌落生長情形 取可疑菌落分別接種於 EMB Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置 於 30 ~35 恆溫培養箱中培養 24~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形

35 特殊病原菌 - 大腸桿菌 (E.Coli.) 特殊培養基 MacConkey Agar EMB Agar 菌落特徵 磚紅色外圍有膽汁沉澱環 於反射光下有特殊光澤, 於透射光下為藍黑色 Escherichia coli colonies on MacConkey Agar 革蘭氏染色陰性桿菌陰性桿菌 EMB Agar w/ E. coli * 必要時可用其他適當選擇性培養基及生化試驗方法予以確認 ( 如 Vitek 等 )

36 特殊病原菌 - 沙門氏菌 (Salmonella) 取檢品 10g/10mL, 加入 Lactose Broth 至 100mL, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中作增菌培養 24 ~ 48 小時 若有菌產生, 則取該菌液 1.0mL 各加入內含 10mL Selenite Cystine Broth 之試管及內含 10mL Tetrathionate Broth 之試管, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中作再次增菌培養 12 ~ 24 小時 以接種環畫線接種於 BGA medium XLD agar medium (BSA) medium 培養基之表面上, 加蓋並倒置於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 上述可疑菌落進行分別先接種於 TSIA 斜面培養基, 再做深層穿刺, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察菌落生長情形

37 特殊病原菌 - 沙門氏菌 (Salmonella) 特殊培養基 BGA XLD BSA TSIA 菌落外觀 形小 透明 無色或粉紅色 ( 常有粉紅色至紅色圈 ) 紅色 有或無黑色中心 黑色或綠色 斜面培養紅色 salmonella_bsa 革蘭氏染色 陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌 Salmonella_XLD

38 特殊病原菌 - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeroginosa) 取檢品 10g/10mL, 加入 TSB medium 至 100mL, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中增菌培養 24 ~ 48 小時 以接種環直接接種於 Cetrimide Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 若培養基上之菌落為綠色, 於紫外光下成綠色螢光, 對革蘭氏染色呈陰性桿菌反應的話, 則取上述可疑菌落以接種環分別接種於 Pseudomonas-Agar Medium 培養基之表面上, 加蓋並倒置, 於 33 ~ 37 下, 培養三天, 檢測 Fluorescin 及 Pyocyanin 上述可疑菌落在進行 Oxidase and Pigment Test

39 特殊病原菌 - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeroginosa) 特殊培養基 Cetrimide Agar Medium Pseudomonas-Agar Medium for detection of Fluorescin Pseudomonas- Agar Medium for detection of Pyocyanin 菌落特徵一般為綠色一般為無色至黃色一般為綠色 紫外光之螢光綠色黃色藍色 氧化試驗陽性陽性陽性 革蘭式染色陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌 Pseudomonas / Cetrimide

40 特殊病原菌 - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 取檢品 10g/10mL, 加入 TSB 至 100mL, 於 30 ~35 恆溫培養箱中增菌培養 24 ~ 48 小時 以接種環直接接種於 Mannitol-Salt Agar 或 Baird-Parker Agar 或 Vogel-Johnson Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置於,30 ~35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 上述可疑菌落再進行 Coagulase Test ( 凝血酶試驗 )

41 特殊病原菌 - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 特殊培養基 Vogel-Johnson Agar Mannitol-Salt Agar Baird-Parker Agar 菌落特徵 黑色, 周圍有黃色圈汁沉澱環 一般為無色至黃色 一般為綠色 凝血試驗陽性陽性陽性 革蘭式染色陽性球菌 ( 成串狀 ) 陽性球菌 ( 成串狀 ) 陽性球菌 ( 成串狀 ) Staphylococcus / Mannitol

42 查驗登記案文件準備須知 檢驗依據 檢驗規格 詳細檢驗標準作業程序 (SOP) 培養基配製方法 檢體前處理 取樣量 稀釋方法 原始檢驗紀錄 ( 表格化 ) 成績書

43 查驗登記案常見問題 ( 一 ) 檢驗依據非藥典等公定書 檢送規格 不符合所依據之公定書 勿影印藥典附錄之內文代替 SOP SOP 內容不完整 缺與送驗檢體同批號 原始檢驗紀錄 ( 含培養基配製等資料 ) 成績書

44 查驗登記案常見問題 ( 二 ) 總生菌數結果表示 0 cfu/g ( 10 倍稀釋 ) 應為 < 10 cfu/g 直接寫 <10 5 cfu/g 非寫實際檢驗結果 未逐步稀釋僅作 10 4 ( 單階 ) 稀釋溶液二重複 無法反應實際污染情形 趨勢分析評估 檢體特性 & 稀釋階 檢驗結果與 SOP 無法比對 總生菌數規格訂為 cfu/g? 無法提供原始檢驗紀錄或不完整

45 The End 謝謝!

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