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1 中藥濃縮製劑 微生物限量檢驗法 主講人 : 許鳳麟葉美伶 日期 :

2 微生物限量檢驗法 目的 各種非無菌性藥品 ( 原料藥至最終產品 ) 微生物總生菌數及特殊致病原菌之檢驗方法

3 中藥規格 ( 行政院衛生署公告 ) 公告 總生菌數 酵母菌及黴 菌總數 大腸桿菌 沙門氏桿菌 署授藥字第 號中藥濃縮製劑 10 5 cfu/g 未規定不得檢出不得檢出 署授藥字第 號中藥碎片劑型 10 7 cfu/g 10 4 cfu/g 10 2 cfu/g 不得檢出

4 微生物限量檢測項目 總生菌數 - 好氧性總生菌數 (Total Viable Aerobic Count) - 酵母菌與黴菌總數 (Total Yeasts and Molds Count) 特殊致病原菌 - 大腸桿菌 (Escherichia coli) - 沙門氏桿菌 (Salmonella) - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa) - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)

5 檢測方法 檢測前準備 培養基製備 培養基效能性測試 標準菌株及保存 檢測流程 取樣 稀釋及增菌 培養 結果觀察

6 檢測前準備事項 1 設備 - 天平 - 無菌操作台 ( Laminer Flow) - 高壓滅菌釜 ( Autoclave) - 培養箱 ( Incubator) - ph 測定儀 培養基配製 - 配製後應標示 : 培養基名稱 批次號碼 製備日期及有效期限 - 滅菌條件 : 一般為 mins 或依藥典之規定

7 檢測前準備事項 2 培養基效能試驗 (Growth Promotion Test) 稀釋液之配製 使用器具之滅菌

8 培養基 固體培養基 - 斜面 平板 Tryptic soy agar ( TSA 好氧性總生菌數 ) Sabouraud dextrose agar ( SDA 酵母菌及黴菌數 ) 液體培養基 - 增殖 Lactose Broth ( LB ) E.Coli. Salmonella Tryptic soy broth ( TSB ) Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus 固體培養基再融化不超過 1 次, 以免影響其效能 融化的培養基儲存不應超過 8 小時

9 致病原性之特殊培養基 大腸桿菌 MacConkey agar medium Levine Eosine-Methylene Blue (EMB) agar medium 沙門氏桿菌 Selenite Cystine broth (SCB) Tetrathionate broth ( 使用前加入 0.1% 煌綠 (Brill Green) 及碘 - 碘化鉀試液,不可再加熱 ) Brillant Green agar (BGA) Xylose-Lysine Desoxycholate agar(xld) Bismuth Sulfite agar (BSA) Triple Sugar Iron agar (TSIA) 斜面

10 培養基效能測試 (Growth Promotion of the Media) 無菌性試驗於 30~ 35 恆溫培養箱中培養 18 ~24 小時, 觀察是否有菌落生長 有效性試驗 - TSA medium 致病原性四株菌任選 1~2 株接種量 <100 cfu 30~ 35 培養 18 ~24 小時觀察是否能長菌 - SDA medium Candida albicans 接種量 <100 cfu 20~ 25 培養 2 ~3 天觀察是否能長菌 - 選擇性培養基以相對應之菌株接種, 接種量 <100 cfu 30~ 35 培養 18 ~24 小時觀察是否能長菌 Candida albicans (ATCC10231;BCRC21538)

11 微生物限量試驗標準菌株 藥典建議之品管標準菌株名稱 ATCC 編號 BCRC 編號 Escherichia coli ATCC 8739 BCRC Salmonella typhimurium ATCC BCRC Staphylococcus aureus ATCC 6538 BCRC * Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 BCRC ATCC: American Type Culture Collection BCRC: Bioresourse Collection and Research Center

12 菌種活化製備 選擇正確菌種, 並確認菌種身份 依據生產廠商說明書活化菌種 不要重覆從菌種包裝瓶中移取菌種或重新冷凍菌種 繼代次數 ( 每接種一次即為一代 ) 所有接觸菌種 ( 液 ) 之器具皆須經高溫高壓滅菌處理

13 菌種之保存 (Maintenance of Stock Culture) 繼代培養 ( 適當培養基於 4 ) 冷凍保存 ( 一 )(-20 ~ -30 ) 約半年 冷凍保存 ( 二 )(-40 ~ -90 ) 數年 冷凍保存 ( 三 ) 液態氮 (-180 以下 )( 可長期保存 ) 冷凍乾燥法 ( 可長期保存 )

14 冷凍保存 (-40 ~ -90 ) 器具 : 無菌吸管 無菌菌種保存瓶及菌種盒 材料 : 菌株 細菌培養液 20% 無菌甘油溶液 方法 : 取菌液與 20% 無菌甘油溶液以 1:1 比例置於 菌種保存瓶內均勻混合後放入菌種盒置 4 冰箱 2 小時 小時 再置 -40 ~ 90 保存

15 ph 7.2 磷酸鹽緩衝液 儲備溶液 磷酸二氫鉀 ( KH 2 PO 4 ) 34g / 500 ml H 2 O 以氫氧化鈉試液調其 ph 值為 7.2 ± 0.1 加水至全量為 1000 ml 混均, 儲存於 2 ~ 8 冰箱備用 使用溶液 取儲備溶液加水稀釋 ( 1:800) 滅菌後使用

16 微生物限量檢測流程圖 好氧性總生菌數 取樣 稀釋 培養皿製備 培養 結果計算 特殊致病原菌 取樣 增菌培養 特殊培養基篩選 再確認培養基篩選 結果觀察及判定

17 取樣 取樣器具 ( 無菌 ) 容器藥匙吸管培養皿 取樣環境及設備 天平 無菌操作台 取樣量 固體粉末 10g 2

18 稀釋及增菌 總生菌數- 10g 檢品 + 90mL7.2 PBS 至 100mL(10 倍稀釋 ) ( 必要時以 10 倍稀釋方式逐步稀釋至所需倍數 ) 供作檢液, 使成 30~300 cfu/plate -黏性強或很混濁檢液將稀釋倍數放大 (10 50 ) -混合均勻後取樣 -檢品稀釋至培養皿製備, 不超過一小時 增菌- 10g 檢品加入 Lactose broth 混合均勻後培養

19 好氧性總生菌數測試 ( 培養皿法 ) 取檢品 10 g 加 ph 7.2 磷酸鹽緩衝液 90mL 至 100mL (10 倍稀釋液 ) ( 視情況以 10 倍稀釋方式逐步稀釋至所需倍數 ), 供作檢液 取上述各種不同比例稀釋液各 1.0mL 加入培養皿 ( 做二重複 ) 各加 15 ~ 20 ml 45~ 50 之 Tryptic soy agar ( TSA ), 水平均勻混合, 靜置使凝固 將培養皿倒置, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 48 ~ 72 小時 ( 連續觀察 ) 取同稀釋倍數之兩個培養皿之菌落數, 求其平均值, 再乘以其稀釋數, 即為其每克之生菌數 * 單位 : CFU/g (colony forming unit )

20 酵母菌與黴菌總數測試 ( 培養皿法 ) 取檢品 10g 加 ph7.2 磷酸鹽緩衝液 90 ml 至 100mL (10 倍稀釋液 ) ( 視情況以 10 倍稀釋方式稀釋至所需倍數 ), 供作檢液 取上述各種不同比例稀釋液各 1.0mL 加入培養皿 ( 做二重複 ) 各加 15~20mL 45 ~50 之 Sabouraud Dextrose Agar ( SDA ), 水平均勻混合靜置使凝固 將培養皿倒置, 於 20 ~ 25 恆溫培養箱中培養 5 ~ 7 天 ( 連續觀察 ) 取同稀釋倍數之兩個培養皿之菌落數, 求其平均值, 再乘以其稀釋倍數, 為其每克之生菌數

21 總生菌數與酵母菌及黴菌數比較 稀釋液培養基培養溫度培養時間 總生菌數 7.2 PBS TSA SCDA 酵母菌 7.2 PBS SDA 及黴菌數 PDA 30~35 2~3 天 20~25 5~7 天 總生菌數 : Tryptic Soy Agar (TSA) Soybean-Casein Digest Agar (SCDA) 酵母菌及黴菌 : Sabouraud Dextrose agar (SDA) Potato Dextrose Agar (PDA)

22 總生菌數之結果計算 案例 10X 培養皿 0, 0 結果 <10 cfu/g 案例 10X 培養皿 15,25 結果 <200 cfu/g ( cfu/g) 案例 100X 培養皿 130,120 平均 X 培養皿 38, 54 平均 46 結果 ( ) 2= cfu/g * 中藥濃縮製劑之總生菌數規格為 10 5 cfu/g 以下

23 特殊致病原菌 - 大腸桿菌 (E.Coli.) 取檢品 10g, 加入 Lactose Broth 至 100mL, 於 30 ~35 恆 溫培養箱中做增菌培養 24~48 小時 以接種環直接接種於 MacConkey Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置 於 30 ~35 恆溫培養箱中培養 24~48 小時, 觀察其菌落生長情形 取可疑菌落分別接種於 EMB Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置 於 30 ~35 恆溫培養箱中培養 24~48 小時, 觀察其菌落生長情形

24 特殊病原菌 - 大腸桿菌 (E.Coli.) 特殊培養基 MacConkey Agar EMB Agar 菌落特徵 磚紅色外圍有膽汁沉澱環 於反射光下有特殊光澤, 於透射光下為藍黑色 Escherichia coli colonies on MacConkey Agar 革蘭氏染色陰性桿菌陰性桿菌 EMB Agar w/ E. coli * 必要時可用其他適當之培養及生化試驗方法予以確認 ( 如 Vitek 等 )

25 特殊病原菌 - 沙門氏菌 (Salmonella) 取檢品 10g, 加入 Lactose Broth 至 100mL, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中作增菌培養 24 ~ 48 小時 若有菌產生, 則取該菌液 1.0mL 各加入內含 10mL Selenite Cystine Broth 之試管及內含 10mL Tetrathionate Broth 之試管, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中作再次增菌培養 12 ~ 24 小時 以接種環畫線接種於 BGA medium XLD agar medium (BSA) medium 培養基之表面上, 加蓋並倒置於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 上述可疑菌落進行分別先接種於 TSIA 斜面培養基, 再做深層穿刺, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察菌落生長情形

26 特殊病原菌 - 沙門氏菌 (Salmonella) 特殊培養基 BGA XLD BSA TSIA 菌落外觀 形小 透明 無色或粉紅色 ( 常有粉紅色至紅色圈 ) 紅色 有或無黑色中心 黑色或綠色 斜面培養紅色 salmonella_bsa 革蘭氏染色 陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌 Salmonella_XLD

27 特殊病原菌 - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeroginosa) 取檢品 10g, 加入 TSB medium 至 100mL, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中增菌培養 24 ~ 48 小時 以接種環直接接種於 Cetrimide Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置, 於 30 ~ 35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 若培養基上之菌落為綠色, 於紫外光下成綠色螢光, 對革蘭氏染色呈陰性桿菌反應的話, 則取上述可疑菌落以接種環分別接種於 Pseudomonas-Agar Medium 培養基之表面上, 加蓋並倒置, 於 33 ~ 37 下, 培養三天, 檢測 Fluorescin 及 Pyocyanin 上述可疑菌落在進行 Oxidase and Pigment Test

28 特殊病原菌 - 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeroginosa) 特殊培養基 Cetrimide Agar Medium Pseudomonas-Agar Medium for detection of Fluorescin Pseudomonas- Agar Medium for detection of Pyocyanin 菌落特徵一般為綠色一般為無色至黃色一般為綠色 紫外光之螢光綠色黃色藍色 氧化試驗陽性陽性陽性 革蘭式染色陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌 Pseudomonas / Cetrimide

29 特殊病原菌 - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 取檢品 10g, 加入 TSB 至 100mL, 於 30 ~35 恆溫培養箱中增菌培養 24 ~ 48 小時 以接種環直接接種於 Mannitol-Salt Agar 或 Baird-Parker Agar 或 Vogel-Johnson Agar 培養基之表面上, 加蓋並倒置於,30 ~35 恆溫培養箱中培養 24 ~ 48 小時, 觀察其菌落生長情形 上述可疑菌落再進行 Coagulase Test ( 凝血試驗 )

30 特殊病原菌 - 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 特殊培養基 Vogel-Johnson Agar Mannitol-Salt Agar Baird-Parker Agar 菌落特徵 黑色, 周圍有黃色圈汁沉澱環 一般為無色至黃色 一般為綠色 凝血試驗陽性陽性陽性 革蘭式染色陽性球菌 ( 成串狀 ) 陽性球菌 ( 成串狀 ) 陽性球菌 ( 成串狀 ) Staphylococcus / Mannitol

31 實驗報告內容應包括 : 實驗日期 微生物檢驗人員名字 受測材料名稱 批號 數量 標準作業程序編號 檢測方法 檢測結果 審核員簽名

32 查驗登記案文件準備 檢驗依據 檢驗規格 詳細檢驗標準作業程序 (SOP) 培養基配製方法 檢體前處理 取樣量 稀釋 檢驗 結果計算方法 原始檢驗紀錄 ( 表格化 ) 成績書

33 查驗登記案常見問題 ( 一 ) 檢驗依據非藥典等公定書 檢送規格 不符合所依據之公定書 SOP 不能以影印藥典附錄之內文替代 SOP 內容不完整 缺與送驗檢體同批號 原始檢驗紀錄 ( 含培養基配製等資料 ) 成績書

34 查驗登記案常見問題 ( 二 ) 總生菌數結果表示 0 cfu/g ( 10 倍稀釋 ) 應為 < 10 cfu/g 直接寫 <10 5 cfu/g 非寫實際檢驗結果 只作 10 4 稀釋溶液二重複 無法反應實際污染情形 趨勢分析評估 增加取樣量欲達到 30~300 cfu/plate 非以 10 倍系列稀釋方式 總生菌數規格訂為 cfu/g? 無法提供原始檢驗紀錄

35 The End 謝謝!