Microsoft PowerPoint - biochemAPI_生化八管 [相容模式]

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1 1 微生物學實驗十一 十二十二 微生物之生化性質測試 生化八管

2 葡萄糖發酵性革蘭氏陰性桿菌鑑定流程 葡萄糖發酵性革蘭氏陰性桿菌鑑定流程接種 8 管培養基 TSIA(slant) CIT(slant) URE(slant) SIM(broth) VP(Semi-Solid ) ORN(broth) ARG(broth) LYS(broth) 2

3 3 IMViC VCTest I: indole ( 引朵 ) 反應 ( 第四管 ) M: (MR) methyl red 甲基紅反應 Vi: (VP) Voges-Proskauer 反應 ( 第五管 ) C: (Citrate) t 檸檬酸反應 ( 第二管 )

4 I: indole ( 引朵 ) 反應 ( 第四管 ) 4 某些微生物可產生 tryptophanase, 將胺基酸 tryptophan 水解產生 indole 與 pyruvic acid 以 Kovacs reagent 偵測 p-dimethylamino benzaldehyde + butanol + HCl 酸化的 butanol 可將 indole 萃取出, 再與 p- dimethylamino benzaldehyde 反應產生紅色化合物 (broth 上層 )

5 5 Tryptophan hydrolysis ys s 培養基 :SIM agar 左 :positive (E. coli) 右 :negative

6 6 Sulfide-Indole-Motility Medium(SIM) Indole test => 陽性 : 紅色 陰性 : 黃色或無色 Motility tese => 陽性 : 擴散生長且混濁 陰性 : 生長固定於接種線上 PIA=> SIM 上層出現棕褐色環

7 MR-VP-Test (Methyl-red ed test) ( 第五管 ) 7 葡萄糖是所有腸內微生物, 用來氧化產生能量的主要碳源, 但因各別微生物的特殊酵素代謝途徑不同, 所產生的最終產物也不盡相同 以甲基紅作為酸鹼指示劑, 用來測試大量酸性產物的生成 甲基紅在 ph 6.2 以上時呈黃色, 在 ph 4.2 以下則轉變成紅色

8 Mixed acid fermentation (Methyl-red test) 8 培養基 :MR-VP medium 左 :positive (E. coli) 右 :negative

9 Butanediol fermentation (Voges-Proskauer test) t) Negative methyl-red test ( 可利用葡萄糖, 但其終產物非酸性 ) 9 鑑定某些微生物代謝葡萄糖產生有機酸後, 再將其轉變成一些非酸性最終產物 ( 如 2,3 butanediol, ethanol) 的能力 2,3 butanediol 不易偵測, 其前趨物 acetoin (acetylmethylcarbinol) 可輕易由 Barritt s reagent 所偵測 α-naphthol (reagent A)+ KOH(reagent B) 當 acetoin 存在時, 可與 α-naphthol 作用形成深玫瑰紅色錯和物, 為陽性反應

10 10 Butanediol fermentation (Voges-Proskauer test) 培養基 :MR-VP medium 左 :positive (E. aerogenes) 右 :negative

11 11 Voges-Proskauer 半固體培養基 (Semi- Solid VP Medium) 陽性 : 紅色 陰性 : 黃色

12 12 Citrate eutilization 在沒有葡萄糖或乳糖可供發酵的情形下, 有些微生物可利用檸檬酸, 作為碳源以獲取能量 以 Simmons citrate agar 偵測 Citrate: 唯一碳源 ph indicator: 溴瑞香草藍 ( 綠色深藍色 ) Citrate pyruvate+co2 CO2+H2O+Na+ 碳酸鈉 ( 使培養基變為鹼性 ) P: 菌生長, 培養基變藍 N: 菌不長

13 13 Citrate eutilization 培養基 :Simmons citrate agar 左 : 無菌 中 :positive (E. aerogenes) 右 :negative

14 14 Simmons Citrate Agar(CIT) 陽性 : 培養基變藍色 陰性 : 培養基維持綠色

15 15 Urea Ue hydrolysis ydoyss 某些腸內革蘭氏陰性菌可產生 Urease, 水解尿素產生氨 以 urea agar slant 偵測 尿素 + 水 Urease CO2+H2O+NH3( 氨 ) 當氨產生時,pH 值上升使得 ( 酚紅 )phenol red 由黃色轉為紅色

16 16 Urea hydrolysis 培養基 :Urea broth 左 : 無菌 中 :positive (Proteus) P 右 :negative

17 17 Christensen s s UreaAgar(URE) 陽性 : 粉 ( 桃 ) 紅色 陰性 : 黃色

18 Triple sugar iron (TSI) agar method ( 三糖鐵瓊脂試驗法 ) 18 把細菌接種於 TSI 培養基底部 ( 鬆蓋培養 ) 0.1% glucose 1% lactose 1% sucrose 以 FeSO4 偵測 H2S 以酚紅為酸鹼指示劑

19 19 (K/A)=> 斜面 (slant): 鹼性 ( 呈紅色 ) 基底 (butt): 酸性 ( 呈黃色 ) 僅葡萄糖醱酵 如產生 H2S, 黑色沉澱將會遮住黃色 因此發現基底呈黑色, 就要當產酸 (A/A)=> 斜面 : 酸性 ( 呈黃色 ) 基底 : 酸 性 ( 呈黃色 ) 除了葡萄糖醱酵外, 乳糖與 ( 或 ) 蔗糖也醱酵 (K/K)=> 斜面及基底均呈紅色 無糖類醱酵 (CO2 和 H2S)=> 產生氣泡或撕裂培養基 H2S 產生 => 基底變黑色

20 20 斜面 底部 氣體 H2S 菌屬 酸性 ( 黃 酸性 ( 黃 + - Ecoli E. )(A) )(A) 鹼性 ( 紅 )(K) 酸性 ( 黃 )(A) - - Shigella 鹼性 ( 紅 酸性 ( 黃 + + Most Salmonella )(K) )(A) 鹼性 ( 紅 )(K) 鹼性 ( 紅 )(K) - - Pseudomonas

21 21

22 22 Moeller s Ornithine Decarboxylase Medium Moeller s Arginine Decarboxylase Medium Moeller s Lysine Decarboxylase Medium 均為 1% 鹼性胺基酸接種後須加礦物油 ph5.2( 黃 ) Bromcersol purple ph6.8( 紫 ) 陽性 : 雖然葡萄糖醱酵, 但由於脫梭基產生的鹼性終產物會使培養基最終呈鹼性 紫色 陰性 : 葡萄糖醱酵 --- 黃色

23 23 Oxidase test 在 Whatman No.1 濾紙 (6 公分 ) 滴 2 3 滴試藥, 取少許可疑菌落置於藥紙上, 以白金耳線塗抹之,Oxidase 陽性者在 5~30 秒間即呈暗藍色 Oxidase 試驗陽性 :30 秒內出現藍色 陰性 :30 秒後無色或不呈色

24 24 ( )MR-VP test 中何者為非?(A) 於 MR 試驗中, 若甲基紅呈現黃色, 則有大量酸性產物之產生 (B) 於 VP 試驗中, 出現深玫瑰紅色為陽性反應 (C) VP positive 表示 acetyl methyl-carbinol 存在 (D) 甲基紅為酸鹼指示劑

25 25 ( ) 於澱粉水解實驗中, 若微生物可分解澱粉, 则 (A) 滴入碘液後成紫黑色 (B) 表示有澱粉分解酵素存在 (C) 為陽性反應 (D) 使用 starch agar 作測試試問以上何者為非

26 26 ( )IMViC 何者為非? (A) I: Insulin (B) M: Methyl red (C) Vi: Voges-Proskauer 反應 (D) C: Citrate

27 27 ( ) 檸檬酸利用試驗中和者為非?(A) 以 SIM 培養 (B) 酸鹼指示劑為溴瑞香草藍液 (C) 檸檬酸試驗陽性時, 培養基為酸性 (D) 檸檬酸試驗陽性時, 培養基變為深藍色

28 28 Indole production test a. 以無菌操作將 SIM agar deep tube 穿刺 接種後,37 下培養 24 小時 b. 滴加 10 滴柯瓦氏試劑 c. 觀察試劑層之顏色變化, 並紀錄結果 d. 依觀察結果判斷菌體水解色氨酸的能力

29 29 Methyl red test a. 以無菌操作接種 MR-VP broth,37 下培養 24 小時 b. 滴加 5 滴甲基紅指示劑 c. 依觀察結果判斷菌體醱酵葡萄糖產生高濃度酸性物質之能力 Voges-Proskauer test a. 以無菌操作接種 MR-VP broth,37 下培養 24 小時 b. 滴加 10 滴巴利特試劑 A, 搖勻, 再滴加 10 滴巴利特試劑 B, 搖勻, 之後每隔 3-4 分鐘再度搖勻,15 分鐘後觀察結果 c. 依觀察結果判斷菌體醱酵葡萄糖產生 acetylmethylcarbinol 之能力

30 30 Citrate test a. 以無菌操作接種 citrate agar slant,37 下培養 24 小時 b. 觀察菌有無生長與培養基的顏色變化 c. 依觀察結果判斷菌體利用檸檬酸作為唯一碳源之能力

31 Idl Indole production test t 31

32 32 Methyl red test Voges-Proskauer test

33 Citrate test 33