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1 義守大學 生物技術與化學工程研究所 碩士論文 醱酵條件對 Lactobacillus reuteri 之活性影響 Influence of fermentation conditions on the activity of Lactobacillus reuteri 研究生 : 蘇殷只 指導教授 : 吳俊毅博士 中華民國一百年八月

2 醱酵條件對 Lactobacillus reuteri 之活性影響 Influence of fermentation conditions on the activity of Lactobacillus reuteri 研究生 : 蘇殷只指導教授 : 吳俊毅博士 Student:Yin-Jhih Su Advisor:Dr. Jiumn-Yih Wu 義守大學 生物技術與化學工程研究所 碩士論文 中華民國一百年八月

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4 摘要 乳酸菌為一種益生菌, 在自然界中廣泛地存在 通常在培養乳酸菌 ( Lactobacillus reuteri ), 其培養基會選用 MRS Broth, 但 MRS Broth 耗費成本, 實驗以節省成本得到最大之菌體量作為實驗目標 研究利用 MRS Broth 培養基, 作為對照組並初步探討其中個別成分對乳酸菌 ( L. reuteri ) 的影響, 由實驗結果得知, 影響乳酸菌最為顯著之因子為碳源與氮源, 故以此作為本實驗之主要探討因子 同時利用市售砂糖與試藥級蔗糖作比較, 取同樣 10 g/l 的濃度來看, 其菌體量依序為 3.10 g/l 2.92 g/l, 從實驗結果得知, 市售砂糖與試藥級蔗糖分別醱酵所得之菌體量差不多, 所以選擇市售砂糖作為其濃度對菌體量之影響因子 氮源 ( peptone beef extract yeast extract) 對菌體量之影響又以酵母萃取粉對菌體量的增加影響較為顯著, 其菌體量依序為 1.00 g/l 1.38 g/l 2.38 g/l, 所以選擇酵母萃取粉作為其濃度對菌體量之影響因子 本研究之目的以 L. reuteri 醱酵, 提高 L. reuteri 醱酵時的菌體產量 本研究探討於液態培養 L. reuteri 中之培養液, 包括控制條件 ( ph ) 及基質 ( 酵母萃取粉 砂糖 ) 對 L. reuteri 醱酵的影響 再利用回應曲面法找出各組成分之最適濃度 : 砂糖 g/l 酵母萃取粉 g/l, 其預測值為 ± 0.49 g/l, 以血清瓶試驗進行醱酵, 實際值為 ± 0.14 g/l, 由迴歸模式所預測值與實際值相符合, 其產量也相對提高 關鍵字 : Lactobacillus reuteri 回應曲面法 I

5 Abstract Lactic acid bacteria are kinds of probiotics bacteria that widely exist in nature and are usually cultivated on MRS broth medium. MRS broth medium is very expensive, so we hope to use more economic and efficient combination of cheaper medium to substitute for the MRS broth medium. According to experimental results, the carbon and nitrogen sources are the important factors for fermentation by Lactobacillus reuteri. Therefore, we chose granulated sugar as the carbon source and yeast extract as the nitrogen source. The maximum biomass is 3.10 g/l on granulated sugar medium. The experimental results show the same fermentation result both on sucrose and granulated sugar medium, so we chose granulated sugar which is cheaper as the carbon source. The maximum biomass is 2.38 g/l on yeast extract medium. The experimental results are better than both on peptone medium and beef extract medium, so we chose yeast extract as the nitrogen source. The purpose of this research is to enhance the biomass (dry cell weight) by using response surface methodology (RSM). Initially, we discussed the effects of ph control; the concentrations of granulated sugar and yeast extract on fermentation by Lactobacillus reuteri. Optimization of medium components was carried out using RSM. The final concentrations of the optimized medium were g/l of granulated sugar and g/l of yeast extract. The RSM model predicted that the production of biomass could reach ± 0.49 g/l. The validation experimental value was ± 0.14 g/l, thereby showing that the experimental and predicted values were in good agreement. The biomass of the optimized experiment proves a 4-fold increase with initial unscheduled fermentation by Lactobacillus reuteri. Keywords: Lactobacillus reuteri, Response Surface Methodology II

6 誌謝 首先感謝指導教授吳俊毅博士, 在我剛踏上研究生的生活時, 給予我莫大的鼓勵 自由與空間做研究, 並於研究期間耐心的指導與討論, 對於研究的方向 思考與邏輯適時地逐一斧正, 無論是研究上或處事態度, 皆蒙受老師細心的照顧, 無私的栽培, 讓我由衷感謝 而對於我剛踏進義守化工所, 對於校園的一切與所上的規定都毫無頭緒時, 所上的惠媚姐與家敏姐就會小天使們一樣對我伸出援手, 有她們的幫忙讓我在學校的生活更順利與愉快 感謝義守大學洪哲穎博士與台南縣家畜疾病防治所所長謝耀清博士, 於百忙中不辭前來參與學生的論文口試, 給予寶貴的建言與指導, 讓論文更甚完備 在研究所期間陪伴我一路成長的同學靜雯 于甯 欣昱與學長姐致平 惠瑜以及學弟妹們, 宇姮 新惠 志鴻 政樺 祐安 佳莉 迺詒 欣妤及詩婷等給予我莫大的協助與建議, 謝謝你們的陪伴, 讓我的研究所生活平順與精彩, 在此一併致謝 回首求學生涯, 實驗的成功喜悅, 失敗的沮喪難過, 點滴在心, 家人與好友的鼓勵是我完成學業的原動力 最後, 僅以此論文, 獻給敬愛的雙親和家人, 感謝您們在我求學過程中無怨無悔的支持與鼓勵 在此, 願將本論文的成果 喜悅與榮耀與你們分享 III

7 目錄 中文摘要... I 英文摘要... II 誌謝... III 目錄... IV 表目錄... VII 圖目錄... VIII 第一章緒論 前言 益生菌 ( probiotics ) 之介紹 益生菌之定義 乳酸菌 (Lactic Acid Bacteria, LAB) 之介紹 乳酸菌之定義 有機酸的合成 畜牧領域之應用 乳酸菌之分類 乳酸菌在人體內的作用 乳酸菌的保存 回應曲面法 (Response surface methodology)... 7 第二章文獻回顧 乳酸菌 回應曲面法 (Response surface methodology) 第三章研究目的 實驗目的 第四章材料方法 實驗藥品 儀器 糖類 乳酸及醋酸的定量分析 菌種來源與保存 培養條件 Lactobacillus 培養基 菌落測試 菌落數之判定 IV

8 前培養的培養方法 取代培養基 菌體量的測量 實驗設計法 二水準部份因子設計 陡升路徑實驗 回應曲面法 ( Response surface methodology ) 第五章結果與討論 以 MRS Broth 為培養基時,pH 控制對 L. reuteri 菌體活性的影響 以砂糖與酵母萃取物為培養基時,pH 控制對 L. reuteri 菌體活性的影響 MRS 培養基之主要成分影響 不同醣類對乳酸菌醱酵之影響 不同含氮之營養源對乳酸菌醱酵的影響 一次一因子實驗設計 醣類濃度對菌體的影響 酵母萃取粉濃度對菌體的影響 培養條件最適化 陡升實驗 - (1) 陡升實驗 - (2) 利用最適化組成進行醱酵試驗 利用最適化活菌組成進行醱酵試驗 第六章結論與未來方向 結論 未來方向 第七章參考文獻 V

9 表目錄 表 4-1 實驗藥品 表 4-2 糖類 ( 蔗糖 ) 乳酸及醋酸的分析條件 表 4-3 固態培養基 ( MRS Broth Agar ) 之成分 表 4-4 液態培養基 ( MRS Broth ) 之成分 表 5-1 二水準因子實驗設計之實際值範圍 - (1) 表 5-2 部分因子實驗設計及實驗數據 - (1) 表 5-3 陡升路徑之實驗設計 - (1) 表 5-4 二水準部分因子實驗設計之實際值範圍 - (2) 表 5-5 部分因子實驗設計及實驗數據 - (2) 表 5-6 陡升路徑之實驗設計 - (2) 表 5-7 二階 RSM 模式之變異係數分析 (ANOVA) 表 5-8 經 Design-expert 5.0 軟體, 回歸出來的二階方程式 表 5-9 醱酵成本 表 5-10 二階 RSM 模式之變異係數分析 (ANOVA) 表 5-11 經 Design-expert 5.0 軟體, 回歸出來的二階方程式 VI

10 圖目錄 圖 1-1 乳酸菌之醣類代謝途徑... 4 圖 3-1 實驗流程圖 圖 4-1 蔗糖 ( Sucrose ) 樣品之標準曲線 圖 4-2 乳酸 ( Lactic acid ) 樣品之標準曲線 圖 4-3 醋酸 ( Acetic acid ) 樣品之標準曲線 圖 4-4 菌體量濃度與 OD₆₀₀ 關係圖 圖 5-1 ph 控制於 4.6~4.8 之間與 ph 不控制時,L. reuteri 醱酵之 ph 與 Dextrose 濃度時程圖 圖 5-2 ph 控制於 4.6~4.8 之間與 ph 不控制時,L. reuteri 醱酵之 DCW 與 CFU/ml 時程圖 圖 5-3 砂糖 150g/L 與酵母萃取粉 100 g/l 作為探討, 探討 ph 值控制與不調控 ph 值, 對 L. reuteri 醱酵的蔗糖濃度變化關係圖 圖 g/L 砂糖與 100 g/l 酵母萃取粉作為探討, 探討 ph 值控制與不控制 ph 值, 對 L. reuteri 醱酵的 log CFU/ml 變化關係圖 圖 5-5 基礎培養基添加不同成分, 對 L. reuteri 醱酵之時程圖 圖 5-6 不同糖類的添加對菌體量之影響 圖 5-7 控制組 (MRS Broth 55g/L) 與以基礎培養基 (MRS Broth 55g/L) 添加不同糖類 ( 蔗糖 果糖 乳糖 半乳糖 葡萄糖 ) 相同濃度 (20g/L) 之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 圖 5-8 MRS 添加不同濃度之砂糖與蔗糖, 對乳酸菌菌體量影響之時程圖 圖 5-9 控制組 ( MRS Broth 55g/L ) 與以 MRS Broth 55g/L 當作基礎培養基加以添加不同濃度 ( 10g/L 20g/L 40g/L ) 的蔗糖及糖之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 圖 5-10 砂糖 20g/L 添加不同的氮源濃度 25g/L ( 蛋白腖 牛肉萃取物 酵母萃取粉 ) 與控制組 (MRS Broth 55g/L ) 之時程圖 VII

11 圖 5-11 砂糖 20g/L 添加不同的氮源濃度 25g/L( 蛋白腖 牛肉萃取物 酵母萃取粉 ) 與控制組 (MRS Broth 55g/L ), 經 L. reuteri 醱酵後之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 圖 5-12 液態培養液其固定酵母萃取粉 100 g/l 加上不同砂糖濃度對最大乾菌重 ( g/l ) 之影響, 與控制組 ( MRS Broth 55g/L ) 比較圖 圖 5-13 固定砂糖 100g/L 搭配不同酵母萃取粉濃度做為醱酵條件, 此條件對乳酸菌的最大菌量之影響 圖 5-14 二水準因子實驗設計之 ph 值的實驗數據 - (1) 圖 5-15 二水準因子實驗設計之 DCW ( g/l ) 的實驗數據 - (1) 圖 5-16 二水準因子實驗設計之蔗糖濃度 ( g/l ) 的實驗數據 - (1) 圖 5-17 二水準因子實驗設計之 log CFU/ml 的實驗數據 - (1) 圖 5-18 陡升實驗之 DCW ( g/l ) 結果 - (1) 圖 5-19 陡升實驗結果 - (1) 圖 5-20 二水準因子實驗設計之 ph 值的實驗數據 - (2) 圖 5-21 二水準因子實驗設計之 DCW ( g/l ) 的實驗數據 - (2) 圖 5-22 二水準因子實驗設計之蔗糖濃度 ( g/l ) 的實驗數據 - (2) 圖 5-23 陡升實驗之 DCW ( g/l ) 結果 - (2) 圖 5-24 再次確認之陡升實驗結果 - (2) 圖 5-25 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等高線圖 圖 5-26 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等反應曲面圖 圖 5-27 最適化培養基培養乳酸菌之醱酵產物 圖 5-28 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等高線圖 圖 5-29 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等反應曲面圖 VIII

12 第一章緒論 1-1 前言由於歐盟已在 2006 年全面禁止在動物飼料中添加抗生素, 因此開發新的微生物飼糧配方, 利用益生菌 ( 主要屬於 Bifidobacterium Lactobacillus Lactococcus Streptococcus thermophilus Enterococcus Saccharomyces 等 ) 的添加, 提昇畜牧類的消化及免疫力, 建立不使用生長促進用抗生素之飼養模式, 以降低排泄物污染值, 應是畜牧業環保化的一個重要發展方向 乳酸菌 (Pediococcus Lactobacillus Streptococcus Lactococcus 等 ) 可以促進維生素 B1 維生素 B2 維生素 B6 維生素 B12 葉酸 菸鹼酸 維生素 K 等的合成, 所以乳製品當中若添加乳酸菌, 可以增加乳製品中維生素的含量 乳酸菌因其棲息環境之不同而可分為 : 1. 使用於酸 乳酸菌飲料及乾乳酪等畜產加工品之動物性來源乳酸菌 2. 生長於人及動物腸道內之腸內乳酸菌 1-2 益生菌 ( probiotics ) 之介紹被允許使用在食品中之益生菌 ( 主要屬於 Bifidobacterium Lactobacillus Lactococcus Streptococcus thermophilus Enterococcus Saccharomyces 等 ) 益生菌 ( probiotics ) 一字, 是由希臘文 for live 衍生而來的 早期將 probiotics 定義為對宿主有益的補給物, 而現今定義擴展為足以改變宿主胃腸道菌相的活菌量及有益宿主健康, 至今漸被接受的益生菌無論是活 死菌 菌體萃取物, 甚或是微生物代謝產物等均為益生菌的應用形態 可有效促進宿主本身已存在的有益菌的數量, 藉以改善宿主腸道微生物的平衡, 藉此降低病源菌之增殖, 因此能改善動物之腸道健康, 提高宿主之抗病力 1-3 益生菌之定義 益生菌對宿主產生影響之主要方式, 為修飾宿主腸道中之代謝反應, 使宿主 1

13 獲利之機制, 並改善素主腸道內的微生物平衡 方式如下 : 1. 抑制有毒或致癌物質生成 2. 刺激有關解毒酵素反應的生成 3. 刺激或供應有關消化時所需要之酵素產生 4. 合成食物中缺乏的維生素及其他營養物質 5. 分泌抑菌物質或者形成抑菌環境, 使致病原菌不能增殖 6. 增加宿主的免疫力 益生菌主要包含了單一或多種類的乳酸菌, 在許多動物並不會引發疾病, 屬於腸道內天然的微生物, 一般公認是安全的 (Generally Regarded As Safe, GRAS) 但除了需要是安全的之外, 還須具備幾個特性 : 1. 對胃酸及膽鹽需具有耐受性 2. 對抗生素有耐受性 3. 在動物宿主的腸道上皮細胞具吸附能力 4. 對其它的微生物具競爭及拮抗作用 5. 產品製備及儲存期間保持活性與穩定性 1-4 乳酸菌 (Lactic Acid Bacteria, LAB) 之介紹 1873 年 Lister 利用稀釋法, 由酸奶中純化分離出 Bacterium lactis, 即為目前的 Streptococcus lactis, 是最早被分離出來的乳酸菌 ( 廖,2006) 乳酸菌之定義乳酸菌指能利用碳水化合物進行醱酵產生大量乳酸之一群細菌總稱 為革蘭氏陽性菌 (Gram positive bacteria), 外型上為球菌及桿菌, 非產孢菌 (nonsporing) 觸酶陰極反應 (catalase negative) 不具活動性(nonmotile) 微好氧性(microaerophilic) 至厭氧性 (anaerobic) 複合營養需求性(complex nutritional requirement) 及除了 Bifidobacterium 外的菌屬能代謝 glucose 產生 50% 以上的乳酸等一般普通特性, 2

14 符合上述特徵者即可判斷為乳酸菌 ( 林,2003) 有機酸的合成澱粉質或醣質受微生物作用生成乳酸 乳酸菌經由醣類的醱酵途徑不同, 可分為同質醱酵 (homofermentation) 異質醱酵(heterofermentation) 混合酸醱酵 ( mixed acid fermentation) 等三類, 其過程如圖 1-1 所示 同質乳酸醱酵 (C₆H₁₂O₆ 2CH₃CHOHCOOH) 為經由 Embden-Meyerhof-Parnas(EMP) 代謝葡萄糖後, 其最終產物為 90~100 % 之乳酸 ( 圖 1-1 A)(Thomas et al., 1979; Smith et al., 1975) 異質發酵 (C₆H₁₂O₆ CH₃CHOHCOOH+C₂H₅OH+CO₂) 經由 phosphoketolase 路徑將葡萄糖醱酵為乳酸和其他產物 ( 如酒精 CO₂ 醋酸等 )( 圖 1-1 B)(Axelsson, 1993; Garvie, 1980) 混和酸醱酵( 2 C₆H₁₂O₆ 2 CH₃CHOHCOOH +3 CH₃COOH 為雙叉桿菌屬的醱酵作用, 則會產生乳酸和醋酸 ) 所進行之路徑和同型醱酵一樣, 差異在於丙酮酸之代謝不同 ( 圖 1-1 C) 丙酮酸代謝後除了會得到乳酸外, 也藉由丙酮酸甲酸裂解酶 (pyruvate formate lyase, PFL) 代謝成 acetyl-coa 和醋酸, 而當有氧存在時,PFL 會呈現不活化狀態 (Takahashi et al., 1982), 丙酮酸藉由丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase, PDH ) 代謝成酒精 CO₂ NADH(de Vos, 1996) 畜牧領域之應用乳酸菌 (Pediococcus pentosaceus MFL Pediococcus pentosaceus MFS Lactobacillus plantarum BCRC12250) 做為菌種發酵吳郭魚食品之優勢菌種, 可抑制吳郭魚食品中雜菌生長 ( 陳,2004) 乳酸菌在豬隻飼料之應用 ( 葉,2008): (1) 利用對蛋白質分解能力較好之枯草桿菌 (Bacillus subtilis natton21) 將飼料進行分解 (2) 使用產酸能力較好的酵母菌或乳酸菌 (Saccharomyces cerevisiae Y10 或 Lactobacillus sporogenes L12) 進行醱酵, 並探討醱酵後飼料組成之變化 (3) 以混合型枯草桿菌 + 酵母菌或乳酸菌醱酵 3

15 飼料對豬生長之影響與生長機制 (4) 以混合型枯草桿菌 + 乳酸菌醱酵飼料對生長 豬生長之影響與生長機制 圖 1-1 乳酸菌之醣類代謝途徑 (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, 2000) 1-5 乳酸菌之分類依菌體型態, 可分為球菌及桿菌 球菌又可分為雙球菌及鏈鎖狀球菌, 如乳酸鏈球菌屬 (Streptococcus spp. 及 Lactococcus spp.) 及四連球菌 (Pediococcus spp.); 白念珠菌屬 (Leuconstoc spp.) 桿菌則有乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.) 及雙叉乳桿菌屬 (Bifidobacterium spp.) (Sneath et al., 1991;Hayakawa, 1992) 1. 雙叉乳桿菌屬 (Bifidobacterium ) 屬於乳酸菌群, 為革蘭氏陽性, 厭氧不產孢子桿菌, 其型態成多樣性, 有彎曲桿狀 Y 狀 V 狀, 但不會形成長鏈狀, 大小約 0.5~1.3x 1.0~8.0 um, 此外無運動 4

16 性, 無觸酶反應, 亦無 indole 反應及還原硝酸鹽能力, 最適溫度為 37~41 (Hawkins, 1993) 其缺乏 aldolase 與 glucose-6-phosphate dehydrogenase, 但含有 fructose-6-phosphate phosphoketolase, 屬於異發酵型乳酸菌, 能產生醋酸及乳酸, 其比例為 1.5:1( 楊,1998) 2. 乳酸鏈球菌屬 (Streptococcus) 乳酸鏈球菌屬為格蘭氏陽性, 兼性厭氧或耐氧性, 型態為球狀或卵圓狀, 大小約 0.5~2.0 μm, 呈成對或鏈狀, 其代謝 glucose 產生 L(+) 型乳酸 而 S. themophilus 為高溫菌, 在 45 能生長, 為發酵乳製品常用之菌酛, 而 Lc. Lactic 利用於生產乾酪製品, 此屬有較佳的產酸能力 (Whitaker et al., 1991) 3. 四連球菌屬 (Pediococcus ) 此菌屬為格蘭氏陽性, 型態為球狀, 大小約 1.0~2.0 um, 呈成對或四球狀, 為兼性厭氧同發酵型乳酸菌, 產生 D 型或 L(+) 型乳酸 (Hayakawa, 1992); 最適生長溫度為 25~40, 但是 P. acidilactiici 對熱具有耐性, 能於 50 下生長 ; 且 P. acidilactiici 及 P. pentosaceus 能產生抑菌素 ; 而 P. cerevisiae 會產生黏膜而造成啤酒腐敗 4. 白念珠菌屬 (Leuconostoc) 白念珠菌屬為革蘭氏陽性, 型態為球狀或卵圓狀, 大小約 0.5~0.7 x 0.7~1.2 um, 呈成對或鏈狀, 最適生長溫度 20~30, 在 5 不生長, 一般為厭氧或兼性厭氧之異發酵型乳酸菌, 產生 D(-) 型乳酸及酒精 (Hayakawa, 1992) 5. 乳酸桿菌屬 (Lactobacillus) 此菌屬約包含 50 種以上的菌種, 為革蘭氏陽性, 無孢子形成, 型態有球桿狀 彎曲桿狀 棒狀或絲狀, 大小約 0.5~1.2 x 1.0~10 um, 無運動性, 且不產生觸酶 (catalase) 反應, 最適生長溫度為 20~45 (Hayakawa, 1992) 對高溫 (65-75 ) 耐受性差 此菌屬大多為有益菌, 生存於動物胃腸道中, 為腸道微生物之ㄧ部分且有很強醣類發酵能力, 並能產生達 50% 以上的乳酸, 能使食品 ph 值達到 4.0 左右, 在 ph 7.2 時也能生長, 應用範圍很廣, 例如各種發酵乳製品 葡萄酒 加工肉製品 5

17 等 此菌屬亦可分為三個亞屬 : Themobacterium Streptobacterium 和 Betabacterium L. acidophilus 及 L. bulgaricus 皆屬於 Themobacterium 亞屬, 為絕對同發酵型乳酸菌 (obligate homofermentative lactic acid bacteria), 可生長在 45, 但 15 時不能生長 Streptobacterium 能生長在 15, 不會產生氣體, 為兼性異發酵型乳酸菌 (facultative heterofermentative lactic acid bacteria), 代表有 L. casei Betabacterium 為絕對異發酵型乳酸菌 (obligate heterofermentative lactic acid bacteria), 代表有 L. brevis 雙叉桿菌(Betabacterium) 屬異型發酵, 較具代表性為 B. bifidum, 可在成人及幼兒糞便中分離出 ; 而 B. longum 則在人類的糞便及反芻動物的瘤胃中均可發現它的存在 乳酸菌在人體內的作用乳酸菌在腸道進行醱酵分解糖類, 產生乳酸 醋酸, 使腸內環境維持酸性, 因而抑制腐敗菌的增生 有些乳酸菌會分泌殺菌物質直接對付壞菌 日本養樂多公司中央研究所曾經讓一些志願者連續五週, 每天服用 100 億個的比菲德氏菌, 發現他們的排泄物偏酸性, 而且大腸桿菌 產氣的莢膜桿菌等壞菌數目皆大幅減少, 連排泄物中的氨氣也明顯降低 證明乳酸菌確實能夠改善腸道的菌相, 抑制腐敗菌的活動 ( 陳,2007 ) 乳酸菌的保存一般乳酸菌之保存方法可分為 :(1) 液態保存,(2) 低溫冷凍 ( -30 ~ -40 ) 及超低溫冷凍 (-196 ) 的冷凍保存,(3) 乾燥保存, 即利用噴霧 真空 冷凍乾燥等方式來進行乾燥 三種乾燥方法中, 因冷凍乾燥菌體比真空乾燥菌體的存活率高 (King and Su, 1993), 而且許多乳酸菌在噴霧乾燥的期間不能忍受高溫 (Porubcan and Sellars, 1979), 因此以冷凍乾燥的使用是最為廣泛的 這三種保存方法, 以冷凍乾燥的菌體穩定性高於冷凍或液態保存 一般冷凍菌體貯存於 -20, 只能維持幾個星期的活性 (Lawrence et al., 1976), 而將乾燥菌體貯存 -20 6

18 則可維持至少一年的活性 所以, 一般保存細菌 酵母菌 產孢絲狀真菌皆可用冷凍乾燥來進行保存 (Berny and Hennebert, 1991) 菌種保存之方法以冷凍乾燥為最理想的保存方式, 冷凍乾燥已普遍用於保存細菌 酵母菌和產孢絲真菌 (Berny and Hennebert, 1991), 可是並非所有菌種皆能在冷凍乾燥過程中存活, 因此在菌液中需要加入適當的保護劑以減少冷凍乾燥時對菌體產生傷害, 但保護劑的效果會因不同菌株而有所不同 (Font de Valdez et al., 1983a) 其原理用利用低溫低壓下藉由昇華作用將凍結樣品中的水分移除的乾燥方法 由於冰是直接昇華, 所以製品會有多孔性及溶解性佳 ; 此外由於是在低溫下操作, 所以可以保持成分而得到高品質 通常用於高價值 高品質的乾燥產品, 所以常常被應用在微生物學 醫學 藥學等方面 主要優點是乾燥在低溫下進行, 可以避免產品因暴露在高溫下而影響品質 但冷凍乾燥的主要缺點為能量消耗太大 乾燥時間長, 其他缺點如容易吸濕 被氧化及變質 脆裂, 而為了改善這些缺點, 在包裝及添加的保護劑上都必須慎選材質, 因此增加包裝成本 1-6 回應曲面法 (Response surface methodology) 對於多變數因子系統的最適化, 傳統上大多以 一次一因子 的方法來尋找最適點 但是此種方法往往沒有考慮因子與因子之間的交互影響效應, 即使考慮因子交互效應, 其所需實驗次數也比較多 此外, 當因子間交互影響效應極為顯著時, 往往無法得到其真正的最適化值 因此為了改善上述幾項缺點, 而有一些最適化方法, 如 : 梯度法 三角點搜尋法 展開操作法及回應曲面法等, 被發展出來, 並應用於在不同程序的操作條件最適化上 ( 洪, 1992) 首先在 1951 年由 Box 和 Wilson 提出回應曲面法之觀念被發表 (Box, G. E. P. and Wilson, K.B., 1951), 由實驗結果數據以數學和統計方法描述數個因子與目標函數之間數學模式, 由此數學模式, 可以預測最適值之極點所在 回應曲面法發展至今可歸納成五個主要步驟 : (1) 最適水準組合區域之逼近 7

19 其中包含因子設計實驗 ( Factorial design) 陡升設計實驗 ( Steepest ascent design ) 中心混成設計實驗( Central composition design ) (2) 回應曲面數學模式之建立 利用經驗方程式 ( Empirical equation ) 的統計回歸 (3) 模式適切性之統計檢驗 (4) 極值點之搜尋 (5) 因子影響效應與交互影響的分析 利用陡升路徑法探索極值的所在區域, 可確認極值點的位置是否位於因子設計實驗的嘗試範圍 若否, 則必須參考此一陡升實驗的實際數據重新設定嘗試範圍, 並進行另一組二水準因子設計及陡升路徑實驗 依此方式逐漸修正嘗試範圍及搜索方向, 直到確定極值點已在因子設計的嘗試範圍內為止 ( 葉, 2005 ) 其後由實驗數據進行統計迴歸所得的回應曲面模式, 對於實驗數據的適切程度, 可利用變異數分析法 (Ana1ysis of variance) 和檢定係數 (Correlation coefficient) 來檢驗確認, 此回應曲面模式的可靠性 ( 黎, 2003) 使用回應曲面法可以用較少的實驗成本及時間得到有效的資訊, 並經由分析與配適模式來研究因子間的交互作用, 進而討論因子對反應變數的影響程度, 同時利用配適反應方程式繪出模式三度空間曲面圖與等高線圖, 觀察並分析出最優化的參數組合, 故本研究將利用回應曲面法搜尋乳酸菌的最佳醱酵條件, 增加其菌體產量 8

20 第二章文獻回顧 2-1 乳酸菌利用 6 株不同的乳酸桿菌 (Lactobacillus reuteri CF2-7F, DSM20016, MF14-C, MM2-3, MM7 and SD2112) 對六糖類 ( dextrose,galactose,lactose,melibiose, raffinose,sucrose ) 和四個蛋白質 ( beef extract,tryptic soy,tryptone,yeast extract ) 來誘導 α- 和 β- 半乳糖苷酶 (α- and β-galactosidases) 進行研究 L. reuteri 生長在棉子糖 (raffinose) 具有最高活性的 α- 半乳糖苷酶 (10.55 Gal U/ml), 而生長在乳糖具有最高活性的 β- 半乳糖苷酶的 (43.82 Gal U/ml) L. reuteri 生長在酵母萃取物與其他蛋白質相比具有最高的 α- 和 β- 半乳糖苷酶的活性 (15.27 和 Gal U/ml) MF14C 生長在棉子糖和 SD2112 具有最高的 α- 半乳糖苷酶的活性 (14.75 和 Gal U/ml), 其次是 CF2 的 - 7 層 (13.38 Gal U/ml) CF2-7F 成長於乳糖具有最高的 β- 半乳糖苷酶活性 (82.01 Gal U/ml) SD2112,MM2-3 和 CF2 7F 成長於酵母提取物 (20.96,19.67,19.67 Gal U/ml) 具有最高的 α- 半乳糖苷酶活性 MM2-3 和 CF2 7F 成長於酵母提取物具有最高的 β- 半乳糖苷酶活性 (18.1 和 Gal U/ml) 棉子糖和乳糖是最好的碳水化合物來源, 生產 α- 和 β- 半乳糖苷酶, 分別為 酵母提取物是最好的蛋白質來源, 生產兩種酶 ( Alazzeh et al., 2009) 一般乳酸菌之保存方法可分為 :(1) 液態保存,(2) 低溫冷凍 ( -30 ~ -40 ) 及超低溫冷凍 (-196 ) 的冷凍保存,(3) 乾燥保存, 即利用噴霧 真空 冷凍乾燥等方式來進行乾燥 三種乾燥方法中, 以冷凍乾燥菌體為最為常用之方法 冷凍乾燥對乳酸菌生理生化特性之影響, 其試驗結果如下 :1. 添加保護劑對乳酸菌之影響, 試驗以添加 10% NFSM 為保護劑之 L. acidophilus 冷凍乾燥後菌數明顯低於乾燥前 2. 冷凍及乾燥後會使菌體對 NaCl lysozyme 及膽汁 (oxgall) 等物質敏感性 ( 細胞壁穩定性及細胞膜通透性的改變 ) 增加的趨勢, 探討耐受性表現, 其中以 L. bulgaricus 組及 S. thermophilus+l. bulgaricus 混合組有較佳的耐受性表現 ; 添 9

21 加 10% NFSM+5% glycrol 為保護劑組, 則有提高 S. thermophilus 及 L. acidophilus 的耐受性 3. 經冷凍乾燥後乳酸菌 (L. acidophilus) 產 β-galactosidase 活性之探討, 以冷凍乾燥菌體經培養於含 2% 乳糖液態培養基中, 其中以添加保護劑之 B. longum 及 L. acidophilus+b. longum 之組別經冷凍乾燥後 β-galactosidase 活性測定有明顯比冷凍乾燥前增加 4. 冷凍乾燥前後乳酸菌菌數之變化隨著貯存時間增長而有減少之趨勢 5. 冷凍乾燥後菌體細胞溶出物試驗, 添加保護劑之冷凍乾燥菌株貯存四個月後細胞溶出物每組皆可發現分子量約 33 kda 之蛋白質, 這可能因貯存環境之影響, 使菌體細胞壁上蛋白質結構變得不穩定, 因此容易被解離出來 ( 林,2003) 2-2 回應曲面法 ( Response surface methodology ) 回應曲面法通常用在探討培養基組成的最適化 最佳製程條件的探討 亦被 應用於醱酵程序中產物的最適化探討, 利用統計軟體來設計實驗, 以少量的實驗 組數壓縮實驗時所花的時間 以回應曲面法作為探討的有 : (1) 培養基組成的最適化 ( 陳,2003) 使用自蔗渣篩選分離出之酵母菌 Candida subtropicalis, 以木糖為原料發酵生產木糖醇 利用回應曲面法, 探討酵母菌生產木糖醇之最適化培養基成份及其最適化濃度之條件, 分析培養基中三種組成份 (xylose glucose peptone) 對木糖醇產量的影響 結果由回應曲面法實驗, 發現木糖 葡萄糖與蛋白腖對木糖醇的產量有顯著的影響 利用回應曲面法迴歸, 可換算出各成份對應濃度, 再以此各成份對應濃度作為培養基做三重複實驗, 結果所得木糖醇之平均值為 %, 與預測結果相符 ( 陳,2003) (2) 最佳製程條件的探討白殭菌生產蛋白質分解酵素過程中, 為提高酵素蛋白產率以及降低生產成本, 利用回應曲面法進行培養基組成的探討, 從模式中觀察培養基各成分對酵素產率的影響, 並找到最適化培養基組成 再以此培養基進一步擴大至 5 公升攪拌 10

22 式發酵槽以及 30 公升氣舉式發酵系統進行操作條件之探討, 最後決定酵素最適化生產的培養基組成與發酵操作條件 ( 呂,2004 ) (3) 醱酵程序中產物的最適化探討利用回應曲面法以微生物醱酵法取代化學法改善其己二烯二酸的生產提高產率 探討對己二烯二酸醱酵的影響於液態培養 Pseudomonas sp. 中之培養液, 包括基質 ( 苯甲酸 琥珀酸 酵母萃取粉 葡萄糖 鐵離子及亞鐵離子 ) 及控制條件 ( 初始 ph 溫度) 再利用回應曲面法找出各組成分之最適濃度, 使產率提高為對照組的 3 倍 ( 潘,2009 ) 在很多方面都可以利用統計學上的回應曲面法, 例如 :Lactobacillus amylophilus GV6 之菌株能廣泛的利用澱粉生產乳酸之能力, 研究探討碳源利用豆類澱粉與氮源利用麵包酵母 蛋白腖 (peptone) 由統計學上的回應曲面法規畫設計實驗找出組成分之最適濃度, 使豆類澱粉醱酵轉換生產乳酸之轉換率提高 (96%) (Altaf et al., 2006) 利用回應曲面法與中心組合設計, 應用在醱酵產氫的研究, 優化厭氧培養利用葡萄糖產氫 探討 ph 值 溫度和濃度對葡萄糖產氫之單一和交互影響 最大的最佳條件, 氫氣產量為 1.75 mol-h 2 /mol-glucose, 發現隨著溫度 38.8,pH 值 5.7, 葡萄糖濃度 9.7 g/l 的 (Yang et al., 2009 ) 利用統計實驗設計法使得廢棄稻草提升其附加價值並使用白腐菌使稻草糖化率提高 白腐菌 ( Trametes hirsute ), 發現含有纖維素水解酶 ( cellulose degrading enzymes ) 其中含有 : 內切葡聚醣酶 (endoglucanase), 外切纖維素酶 (cellobiohydrolase) 和 β- 葡萄糖苷酶 (ß-glucosidase) 其酵素活性依序為 和 5.0U /mg-protein 白腐菌(Trametes hirsute ) 醱酵生產纖維素酶, 稻草被認為是一個潛在的良好生長基質經統計實驗設計法, 以優化水解條件, 如 ph 值, 溫度和基質 (concentrations of substrates) 和酶 (enzymes), 達到最高糖化 (saccharification) 量 利用酶進行稻草糖化其最高糖化率 (saccharification rate) 為 88 %, 酶濃度為 37.5 FPU/g-substrate 水解後的參數優化 (Jeya et al., 2009 ) 11

23 第三章研究目的 3-1 實驗目的培養乳酸菌大都是用 MRS Broth(Difco Lactobacilli) 當作培養基, 由於此培養基在市售上, 價格頗高, 一罐 500 克的 MRS Broth (Difco Lactobacilli ), 其價格為台幣 2800 元 本實驗希望利用簡單的碳 氮源, 提供乳酸菌生長所需的養分, 並且本實驗藉由具統計學概念的回應曲面法 ( Response surface methodology ), 在考慮因子間的交互影響效應之下, 找尋培養基的最適組成, 以有效提升菌體量的增加 實驗架構如下 : MRS Broth 培養探討 ph 值對菌體之活性影響探討 MRS Broth 其主要成分的影響 Carbon source Nitrogen source Sucrose granulated sugar Yeast Extract 一次一因子實驗設計 回應模式之最適化 圖 3-1 實驗流程圖 12

24 第四章材料方法 4-1 實驗藥品本實驗所分析之標準品為高純度之糖類及試藥級之乳酸 ( Lactic acid ) 以及醋酸 ( Acetic acid ) 等 表 4-1 實驗藥品 藥品名稱 Yeast Extract Beef Extract Sodium acetate Peptone Agar NaOH Sucrose Glucose 二級砂糖 ( granulated sugar ) Acetic acid Lactic acid 廠牌 Alibaba Difco 共榮化學株式會社 Difco Difco Merck J.T.Baker TEDIA 台糖聯工化學 Alfa Aesar 4-2 儀器 分光光度計 ( Ultrospec 2100 pro, Amersham pharmaica biotech ) HPLC ( HEWLETT PACKARD series 1100, Agilent ) RI detector ( Waters 2414 ) ion exchange column ( ICSep ICE-ORH-801 ) 冷凍離心機 ( himac CF 16RX, HITACH ) ph meter ( sp-701, Suntex ) 13

25 4-3 糖類 乳酸及醋酸的定量分析主要是以高效能液相層析儀 ( HPLC ) 分析蔗糖 乳酸及醋酸, 其分析條件如表 4-2 表 4-2 糖類 ( 蔗糖 ) 乳酸及醋酸的分析條件 分析設備 HPLC 分析條件 HEWLWTT PACKARD series 1100, Agilent RI-detector Waters 2414 Column Ion exchange column ICSep ICE-ORH-801 Column temperature 65 Pump flow rate Mobile phase Sample injection Data analysis 0.6 ml/min 0.01N H₂SO₄ 20μl SISC software (1) 樣品前處理樣品在進行 HPLC 分析前, 先以離心機 rpm 離心 10 min, 再以濾膜 ( 0.45 μm ) 過濾菌體與雜質, 以避免分析時管柱阻塞 (2) 配製移動相 ( Mobile phase ) HPLC 使用之管柱與移動相的選擇是分析準確度最主要的重要關鍵 一般移動相的濃度 管柱溫度和流速等, 都是分析的主要影響因素 配製移動相 0.01N H₂SO₄ 溶液, 使用前必須經濾膜過濾並去除氣體 (degas), 以符合 HPLC 之規格 測試結果顯示, 蔗糖 ( Sucrose ) 標準品 ( 圖 4-1 ) 之滯留時間為 7.98 min, 乳酸 ( Lactic acid ) ( 圖 4-2) 為 min 和醋酸 (Acetic acid)( 圖 4-3) 為 12.1 min 14

26 22 20 Sucrose conc. (g/l)= 8.41*10-6 *A R 2 = Sucrose conc. (g/l) Area 圖 4-1 蔗糖 ( Sucrose ) 樣品之標準曲線 1.0 Lactic acid conc. (g/l) = 8.20*10-6 *A R 2 = Lactic acid conc. (g/l) Area 圖 4-2 乳酸 ( Lactic acid ) 樣品之標準曲線 15

27 1.0 Acetic acid conc. (g/l) = 8.71*10-6 *A R 2 = Acetic acid conc. (g/l) Area 圖 4-3 醋酸 ( Acetic acid ) 樣品之標準曲線 4-4 菌種來源與保存本實驗使用 Lactobacillus reuteri, 自台南縣家畜疾病防治所所提供之菌株 本研究使用甘油保存, 其方法如下 : 1. 將取台南縣家畜疾病防治所的菌株於固態培養基 ( 表 4-3) 上活化, 並置於 37 恆溫培養 48 hr 2. 以高溫火焰槍加熱殺菌後之白金圓環刮取已活化之菌株, 接種入含有 50 ml 液態培養液 ( 表 4-4 ) 之 50 ml 之離心瓶中 3. 置於 37,200 rpm 恆溫培養箱培養 12 hr 4. 以高溫火焰槍加熱殺菌後之含有菌液之 50 ml 之離心瓶, 接種入含有 200 ml 液態培養液 ( 表 4-4 ) 之 500 ml 之血清瓶中 6. 置於 37,200 rpm 恆溫培養箱培養 hr 7. 將經由滅菌釜滅菌過的無菌水及甘油, 以 1:1 比例配製成甘油水溶液 16

28 8. 將含有菌液的血清瓶經恆溫培養箱培養 小時後 (lag phase), 分別取 0.5 ml 的菌體懸浮液及甘油水溶液, 收入微小離心管中, 充份混合均勻後, 置 -80 與 -20 低溫冷凍保存備用 表 4-3 固態培養基 ( MRS Broth Agar ) 之成分 Ingredient Proteose peptone No.3 (10.0 g/l) Beef extract (10.0g/L) Yeast extract (5.0g/L) Dextrose (20.0g/L) Polysorbate 80 (1.0g/L) Ammonium citrate (2.0g/L) Sodium acetate (5.0g/L) Magnesium sulfate (0.1g/L) Manganese sulfate (0.05 g/l) Dipotassium phosphate (2.0g/L) Agar (15.0 g/l) 表 4-4 液態培養基 ( MRS Broth ) 之成分 Ingredient Proteose peptone No.3 (10.0 g/l) Beef extract (10.0g/L) Yeast extract (5.0g/L) Dextrose (20.0g/L) Polysorbate 80 (1.0g/L) Ammonium citrate (2.0g/L) Sodium acetate (5.0g/L) Magnesium sulfate (0.1g/L) Manganese sulfate (0.05 g/l) Dipotassium phosphate (2.0g/L) 4-5 培養條件 Lactobacillus 培養基固態培養 (MRS Broth Agar, 成分如表 4-3) 的培養條件為 : 含有菌體的固態培養基置於 37 恆溫培養箱培養 48 hr 液態培養的培養條件為: 液態取代培養基 17

29 或 MRS Broth 置於 37 恆溫培養箱, 以 200 rpm 培養, 接菌量為 20%(v/v),200 ml 液態培養基置於 500 ml 的血清瓶中 菌落測試 1. 配製含有 5.5 % 之 MRS Broth 及 15g/L agar powder 之水溶液 ( 作為固態培養基 ) 置於血清瓶中 2. 將包好鋁箔紙之三角形玻棒 血清瓶 蒸餾水 試管及微量離心管置入滅菌釜中, 以 121 滅菌 15 min 3. 滅菌完成之後, 將裝有固態培養基之血清瓶於無菌操作台中分裝於塑膠培養皿 ; 培養皿上的培養基必須均勻 平滑 無氣泡, 厚度約為 2 mm 4. 將三角形玻棒 蒸餾水 試管 微量離心管置入無菌操作台 5. 將醱酵中的乳酸菌定時取樣, 取樣前需震盪均勻, 樣品裝入滅菌過的試管或微量離心管內 6. 將含有菌液之樣品以無菌水做倍數稀釋 7. 將稀釋後的菌液取 0.1 ml 滴在培養皿上 8. 將三角形玻棒過火 9. 待三角形玻棒冷卻後, 三角形玻棒輕觸於固態培養基上, 三角形玻棒沿著培養皿周圍左右些微移動 ( 震幅約 3 cm) 並以順時針旋轉培養皿, 使得固態培養基上的菌液可以均勻塗佈 10. 塗佈均勻菌液被固態培養基吸收後蓋上培養皿蓋, 將培養皿倒蓋 11. 重複步驟 6, 稀釋至適當的 3 種濃度 12. 每種濃度重複做步驟 三次, 每種濃度三重複 13. 用封口膜沿著培養皿外圍封好, 倒蓋培養 14. 置於 37 培養箱中培養 48 hr 18

30 菌落數之判定 1. 培養時間需 48 hr 2. 培養皿上的固態培養基內不可有污染 3. 菌落數需在 50~400 個之間 4. 菌落在培養皿上必須均勻分佈 5. 當一個或多個菌落連在一起, 視為一個菌落數 6. 不同濃度間之菌落數的平均值必須有比例關係 7. 同濃度之固態培養基上的菌落數不得差異過大 ( 約 ±10 %) 8. 菌落數乘上稀釋倍數即是該樣品之菌體濃度 ( 亦是活菌數 ), 單位為 CFU/mL (colony forming units/ml) 前培養的培養方法將保存在 -20 低溫冷凍備用之菌株取出回溫, 並將其震盪均勻, 接入含有 50 ml 的 5.5% MRS Broth 之離心管, 接菌量為 2% ( v/v ), 並置於 37 恆溫培養 12 hr 此前培養的目的為活化菌株與提高菌量 取代培養基一般常用來培養乳酸菌的培養基為 MRS Broth(Difco Lactobacilli), 實驗利用 MSR Broth 搭配添加其 MRS Broth 內的主要成分, 探討何種成分的添加有助於菌體量的增加 成分的添加有助於菌體量的增加做為其主要的探討, 利用主要探討因子作為取代培養基的成分, 用來取代 MRS Broth(Difco Lactobacilli) 經由實驗證明顯著影響菌體量的因子為碳源與氮源, 而碳源用一般市售的二級砂糖取代與用酵母萃取粉來取代氮源, 接菌量 20% (v/v) 為前培養 37 恆溫培養 12 hr 之醱酵液 19

31 4-5-3 菌體量的測量菌體量的量測是以分光光度計於可見光波長 600nm 下量測到之光學密度 (optical density), 經由校正曲線公式換算成菌體量 菌體量之校正曲線製作 : 1. 將鋁箔紙製之鋁皿於 105 烘箱烘乾 overnight 後, 秤其空重 2. 將醱酵培養之菌體, 以 11,000 rpm 離心 20 分鐘 3. 將離心後之菌體以磷酸緩衝液潤洗, 再以 11,000 rpm 離心 20 分鐘 4. 將離心後之菌體溶於 100 ml 之無菌水 5. 然後取 50 ml 之菌液於 11,000 rpm 離心 20 分鐘, 再以少量去離子水將殘留的菌體洗入烘乾後之鋁皿, 於 105 烘箱烘乾 (overnight), 再秤其重量 6. 將另一半剩餘之菌液分別稀釋不同的倍率, 再分別測量其 OD₆₀₀ 值並紀錄, 使所測之 OD₆₀₀ 介於 0.1~0.8 之間, 至少五點 7. 將烘乾之菌體量 (DCW) 與其 OD₆₀₀ 作圖, 繪出菌體量對 OD₆₀₀ 之標準曲線, 如圖 DCW (g/l) = *OD 600 R 2 = DCW (g/l) OD 600 圖 4-4 菌體量濃度與 OD₆₀₀ 關係圖 20

32 4-6 實驗設計法利用統計學上的實驗設計法, 可以提供有效及有系統的實驗計畫來達到某一目標, 並且可以同時分析出操作因子對系統的影響程度 常用的實驗設計法有 : simplex method,response surface methodology ( 簡稱 RSM ),evolutionary operation 及 Taguchi method 等 二水準部份因子設計一般常用來培養乳酸菌的培養基為 MRS Broth(Difco Lactobacilli), 實驗利用 MSR Broth 搭配添加其 MRS Broth 內的主要成分, 探討何種成分的添加有助於菌體量的增加, 由實驗結果設定因子的水準範圍的中心點與其因子的差異範圍, 設計其主要實驗計畫, 並由實驗數據回歸得到一階方程式 ( Y = a₁x₁ + a₂x₂ + a₀ ) 且規畫接下來要進行的陡升實驗路徑 陡升路徑實驗利用上述的二水準部份因子實驗設計法所達到所達到之實驗結果, 設計陡升實驗的進行, 規畫出出發點 ( 水準範圍之中心點 ) 單位因子的水準實際範圍值 因子爬升比率 ( 回歸模式之係數值比率 ) 單位爬升距離( 單位因子的水準實際範圍值 * 因子爬升比率 ) 實際爬升距離( 單位爬升距離 * 實驗者基於實驗經驗依系統狀況而決定之值 ) 設計 6 個或多個爬升路徑實驗, 依以上幾個步驟規畫出實驗設計, 由實驗結果畫出三度空間曲線圖來確定極值點已在因子設計的嘗試範圍內 ; 若否, 則必須參考此一陡升實驗的實際數據重新設定因子範圍, 並進行另一組二水準因子設計及陡升路徑實驗 依此方式逐漸修正嘗試範圍及搜索方向, 直到確定極值點已在因子設計的嘗試範圍內為止 ( 葉, 2005 ) 21

33 4-6-3 回應曲面法 ( Response surface methodology ) 實驗結果數據以數學和統計方法描述數個因子與目標函數之間數學模式, 由此數學模式, 可以預測最適值之極點所在 回應曲面法發展至今可歸納成五個主要步驟 : (1) 最適水準組合區域之逼近 其中包含因子設計實驗 ( Factorial design) 陡升設計實驗 ( Steepest ascent design ) 中心混成設計實驗 ( Central composition design ) (2) 回應曲面數學模式之建立 利用經驗方程式 ( Empirical equation ) 的統計回歸 (3) 模式適切性之統計檢驗 (4) 極值點之搜尋 (5) 因子影響效應與交互影響的分析 依上述的二水準部份因子設計實驗 陡升路徑實驗及一些相關實驗所得的實驗數據, 利用 Design-Expert 套裝軟體 ( 5.0 版,Stat-Ease Inc., USA ) 來進行 22

34 第五章結果與討論 5-1 以 MRS Broth 為培養基時,pH 控制對 L. reuteri 菌體活性的影響從 -20 低溫冰箱中取出保存菌株, 於室溫下回溫, 並將其震盪均勻, 接菌量為 2% ( v/v ), 接入含有 50 ml 的 55g/L MRS Broth 之離心管, 置於 37 恆溫培養 12 hr, 作為前培養 將醱酵 12 hr 的前培養菌液接入 200 ml 的主培養基 (55g/L MRS Broth, 置於 37 恆溫培養箱, 以 200 rpm 培養, 接菌量為 20%(v/v)), 其液態主培養基置於 500 ml 的血清瓶中 在醱酵期間, 定期以分光光度計於可見光波長 600nm 下量測光學密度 (optical density) 與定時觀測 ph 值變化, 並作適當的調整, 當 ph 值低於 4.8 時, 以飽和的氫氧化鈉水溶液調整酸鹼度, 使 ph 值維持在 4.8 以上 ; 而另一組不控制 ph 值之控制組, 主要是觀察其實驗在醱酵期間之酸鹼值變化, 並與控制 ph 值的實驗組作比較, 並分析菌落測試與用 HPLC 定量分析糖類, 上述之實驗結果皆做為控制組與本實驗之探討因子的實驗結果作為比較 L. reuteri 之 MRS 活性測試分為 : 醱酵期間將 ph 值調控於 4.6 ~ 4.8 之間與不調控 ph 值, 實驗結果 ( 如圖 5-1 與圖 5-2 所示 ) 發現以 55g/L MRS Broth 作為培養基時,pH 值的調控對活菌數無明顯影響, 當調控 ph 值時, 糖消耗速度 ( 1.5 g/l-hr ) 比沒有調控 ph 值時的糖消耗速度 ( 1.15 g/l-hr ) 時快 ; 在無調控 ph 值時, 最終菌體量比在有 ph 控制條件下培養的實驗組來得高 (1.2 倍 ) 由此可知, 當以 MRS Broth 為培養基時,pH 的調控與否對 L. reuteri 活菌數的影響不顯著 ; 但調控 ph 於 4.6~4.8 時, 有助於醱酵時活菌數比例的增加 23

35 ph ph (without ph control) ph (ph control) Time (hr) Dextrose conc. (without ph control) Dextrose conc.(ph control) Dextrose conc. (g/l) 圖 5-1 ph 控制於 4.6~4.8 之間與 ph 不控制時,L. reuteri 醱酵之 ph 與 Dextrose 濃度時程圖 24

36 DCW (g/l) DCW (without ph control) log CFU/ml (without ph control) DCW (ph control) log CFU/ml (ph control) Time (hr) log CFU/ml 圖 5-2 ph 控制於 4.6~4.8 之間與 ph 不控制時,L. reuteri 醱酵之 DCW 與 CFU/ml 時程圖 25

37 5-2 以砂糖與酵母萃取物為培養基時,pH 控制對 L. reuteri 菌體活性的影響以 150g/L 砂糖與 100 g/l 酵母萃取物為基質, 探討 ph 值控制 ( 控制條件為 ph 4.6~4.8 ) 與無 ph 值控制對 L. reuteri 醱酵之影響 在控制 ph 值之實驗組, 定時觀測 ph 值變化, 並作適當的調整 結果如圖 5-3, 定時調整醱酵液酸鹼度, 並維持在 4.8 以上的實驗組, 其糖的消耗速度 ( 4.81 g/l-hr ) 較不調控 ph 之控制組 ( 4.17 g/l-hr ) 為快, 菌體量也是比不控制 ph 為高, 活菌數也較高 不控制 ph 值的控制組, 醱酵後期 ph 值降至 4.0 以下, 活菌數將會受到醱酵液偏酸之影響, 明顯下降 ; 調控 ph 值的實驗組, 醱酵後期時醱酵液裡的活菌數依舊維持一定的數量 可見利用砂糖與酵母萃取物為基質時, 醱酵後期調控適當的 ph, 對菌體的活性影響很大 由圖 5-4 可看出明顯差異, 實驗組 ph 控制在 4.8 以上, 在醱酵後期活菌數都維持在 3*10⁹ CFU/ml 以上的菌量 ; 實驗組不控制 ph, 其活菌數在醱酵第 9 小時 ( ph =4.0 ) 時可達最高活菌數 ( 4.95*10⁸ CFU/ml ), 隨著醱酵後期 ph 值降至 4.0 以下, 醱酵液中的活菌量有顯著的減少 之後陡升實驗 二水準因子實驗設計與回應模式之實驗,pH 值都控制在 4.8 以上 26

38 ph ph (without ph control) Sucrose conc. (without ph control) ph (ph control) Sucrose conc.(ph control) Time (hr) Sucrose conc. (g/l) 圖 5-3 砂糖 150g/L 與酵母萃取粉 100 g/l 作為探討, 探討 ph 值控制與不調控 ph 值, 對 L. reuteri 醱酵的蔗糖濃度變化關係圖 27

39 DCW (g/l) DCW (without ph control) DCW (ph control) Time (hr) log CFU/ml (without ph control) log CFU/ml (ph control) log CFU/ml 圖 g/L 砂糖與 100 g/l 酵母萃取粉作為探討, 探討 ph 值控制與不控制 ph 值, 對 L. reuteri 醱酵的 log CFU/ml 變化關係圖 28

40 5-3 MRS 培養基之主要成分影響本實驗利用 55g/L MRS Broth 培養基與各別添加養養源或離子 ( 蛋白腖 10 g/l 酵母萃取粉 5 g/l 葡萄糖 20 g/l 牛肉萃取物 10 g/l 醋酸鈉 5 g/l ) 作為探討之液態培養基 ; 實驗步驟 :(1) 前培養, 將菌體接入以 MRS Broth 55g/L 之液態培養基內, 以 37 C 的恆溫培養箱培養 12hr 備用 (2) 將經前培養備用之菌液分別取 50ml 菌液, 接菌量為 20% ( v/v ), 接入探討之液態培養基內觀察 ; 溫度控制在 37 C,200 rpm 培養 實驗以 MRS Broth 55g/L 當作基礎培養基加上添加 MRS Broth 裡的各種成分作為比較, 實驗結果 ( 如圖 5-5) 無明顯差異, 其中原因有兩種 :(1) MRS Broth 裡每種成分已達到充足的情況下, 而添加其中任一種主要成分, 相對其他成分在培養基內是比較不足的狀態之下, 所以對菌體量的增加效果為不顯著的 ; 或者是 (2) 添加之成分不是主要影響的因子 實驗各別添加其成分, 觀測結果得知添加成分對菌體量的增加無顯著的幫助, 因此將以不同糖類與不同的含氮營養源 ( 酵母萃取粉 牛肉萃取物 蛋白腖) 對 L. reuteri 進行醱酵, 並觀測何者對菌體量有顯著影響 29

41 DCW (g/l) MD MP MB MY 2.2 MS control (MRS 55g/L) Time (hr) 圖 5-5 基礎培養基添加不同成分, 對 L. reuteri 醱酵之時程圖 MD:MRS 55g/L + Dextrose 20g/L MP:MRS 55g/L + Peptone 10g/L MB:MRS 55g/L + Beef extract 10g/L MY:MRS 55g/L + Yeast extract 5g/L MS:MRS 55g/L + Sodium acetate 5g/L 30

42 5-3-1 不同醣類對乳酸菌醱酵之影響以 MRS Broth 當作基礎培養基, 添加 MRS Broth 裡的各種成分作為比較, 菌體量無明顯差異, 所以實驗單獨以添加糖類作為探討, 其探討條件有 : 控制組 (MRS Broth 55g/L ) MRS Broth 110g/L 及 MRS Broth 55g/L + 各種不同的糖類 ( 蔗糖 果糖 乳糖 半乳糖 葡萄糖 ) 20g/L, 實驗結果如圖 5-6 與圖 5-7 由實驗結果得知蔗糖對菌體量有顯著的影響力, 其最高菌體量是控制組的 1.3 倍 由長條圖可以更明顯的看出在最大菌體量上的差別, 以最大菌體量由大到小之依序排列為 :(1) MRS Broth 55g/L + 蔗糖 20g/L (2) MRS Broth 110g/L (3) 控制組 (MRS Broth 55g/L ) (4) MRS Broth 55g/L + 乳糖 20g/L (5) MRS Broth 55g/L + 果糖 20g/L (6) MRS Broth 55g/L + 半乳糖 20g/L (7) MRS Broth 55g/L + 葡萄糖 20g/L ; 其最大菌量依序為 : 2.79 g/l 2.48 g/l 2.23 g/l 2.20 g/l 2.11 g/l 2.08 g/l 1.67 g/l 由實驗結果得知, 在能提供菌體生長所需之營養源充足情況之下,20 g/l 蔗糖的添加使菌體量有顯著的增加 蔗糖對菌體量的增加是有幫助的, 因此將由蔗糖當作主要碳源, 基於成本考量, 選用市售的二級砂糖, 其原因是砂糖主要成分是蔗糖 ; 以砂糖 (10 g/l 20 g/l 30 g/l ) 與蔗糖 ( 10 g/l 20 g/l 30 g/l ) 探討不同濃度對系統的影響 由數據得知 ( 如圖 5-8 與圖 5-9), 凡添加砂糖或蔗糖的培養基都比控制組 ( 2.30 g/l ) 的菌體量高, 相同濃度之下砂糖對菌體量的影響較蔗糖的影響效果為高, 可能是因為砂糖比純蔗糖具有維他命或其他生長因子, 所以往後實驗以砂糖作為碳源 31

43 2.5 control (MRS 55g/L) MS ML MD 2M MF MG 2.0 DCW (g/l) Time (hr) 圖 5-6 不同糖類的添加對菌體量之影響 圖上代號依序為 2M:MRS 110g/L MS:MRS 55g/L + Sucrose 20g/L MF:MRS 55g/L + Frucose 20g/L ML:MRS 55g/L +Lactose 20g/L MG:MRS 55g/L + Galactose 20g/L MD:MRS 55g/L + Dextrose 20g/L 32

44 DCW max (g/l) Sample 圖 5-7 控制組 (MRS Broth 55g/L) 與以基礎培養基 (MRS Broth 55g/L) 添加不同糖類 ( 蔗糖 果糖 乳糖 半乳糖 葡萄糖 ) 相同濃度 (20g/L) 之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 Sample 0:control (MRS 55g/L ) Sample 1:MRS 55g/L + Dextrose 20g/L Sample 2:MRS 55g/L + Galactose 20g/L Sample 3:MRS 55g/L + Frucose 20g/L Sample 4:MRS 55g/L +Lactose 20g/L Sample 5:MRS 110g/L Sample 6:MRS 55g/L + Sucrose 20g/L 33

45 MS1 MS2 MS4 MG1 MG2 MG4 control (MRS 55g/L) 3.0 DCW max (g/l) Time (hr) 圖 5-8 MRS 添加不同濃度之砂糖與蔗糖, 對乳酸菌菌體量影響之時程圖 圖上代號依序為 MS1:MRS 55g/L + Sucrose 10g/L MS2:MRS 55g/L + Sucrose 20g/L MS4:MRS 55g/L + Sucrose 40g/L MG1:MRS 55g/L + granulated sugar 10g/L MG2:MRS 55g/L + granulated sugar 20g/L MG4:MRS 55g/L + granulated sugar 40g/L 34

46 DCW max (g/l) Sample 圖 5-9 控制組 ( MRS Broth 55g/L ) 與以 MRS Broth 55g/L 當作基礎培養基加以添加不同濃度 ( 10g/L 20g/L 40g/L ) 的蔗糖及糖之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 Sample 0:control (MRS 55g/L ) Sample 1:MRS 55g/L + Sucrose 10g/L Sample 2:MRS 55g/L + granulated sugar 10g/L Sample 3:MRS 55g/L + Sucrose 20g/L Sample 4: MRS 55g/L + granulated sugar 20g/L Sample 5:MRS 55g/L + Sucrose 40g/L Sample 6:MRS 55g/L + granulated sugar 40g/L 35

47 5-3-2 不同含氮之營養源對乳酸菌醱酵的影響之前實驗以 MRS Broth 55 g/l 當作基礎培養基, 添加 MRS Broth 裡的各種成分作為比較, 實驗結果無預期的明顯, 所以利用砂糖 20 g/l 添加不同的氮源 ( 蛋白腖 牛肉萃取物 酵母萃取粉 ), 探討何種氮源對乳酸菌生長影響更為顯著, 其中探討的氮源濃度以控制組 ( MRS Broth 55g/L ) 裡的總氮源濃度 25 g/l, 來做比較 實驗中以最大菌體量由大到小依序排列為砂糖 20g/L + 酵母萃取粉 25g/L control 砂糖 20g/L + 牛肉萃取物 25 g/l 砂糖 20g/L + 蛋白腖 25 g/l; 相對之對大菌體量依序為 2.38 g/l 1.84 g/l 1.38 g/l 1.00 g/l 其結果如圖 5-10 與圖 5-11, 由實驗數據得知其中以砂糖 20g/L 加上酵母萃取粉 25 g/l 之實驗結果對菌體量之影響最為顯著, 其結果是控制組之 1.3 倍 研究依 與 之結果作為本論文之主要的探討因子, 並對其主要因子作濃度上的優化設計 36

48 3.0 control (MRS 55g/L) GB GP GY DCW (g/l) Time (hr) 圖 5-10 砂糖 20g/L 添加不同的氮源濃度 25g/L ( 蛋白腖 牛肉萃取物 酵母萃取粉 ) 與控制組 (MRS Broth 55g/L ) 之時程圖 圖上代號依序為 GP:granulated sugar 20g/L + peptone 25g/L GB:granulated sugar 20g/L + beef extract 25g/L GY: granulated sugar 20g/L + yeast extract 25g/L 37

49 DCW max (g/l) Sample 圖 5-11 砂糖 20g/L 添加不同的氮源濃度 25g/L( 蛋白腖 牛肉萃取物 酵母萃取粉 ) 與控制組 (MRS Broth 55g/L ), 經 L. reuteri 醱酵後之最大乾菌重 (g/l) 比較圖 當砂糖 20g/L 添加酵母萃取粉 25g/L 其最高菌量微控制組的 1.3 倍 Sample 0: control (MRS 55g/L) Sample 1:granulated sugar 20g/L + peptone 25g/L Sample 2:granulated sugar 20g/L + beef extract 25g/L Sample 3:granulated sugar 20g/L + yeast extract 25g/L 38

50 5-4 一次一因子實驗設計 實驗初步, 實驗先固定其中一因子之濃度, 對另一因子作濃度上的改變, 進 行研究, 並觀察對菌體量之影響 醣類濃度對菌體的影響實驗以固定其中一因子之濃度, 對另一因子作濃度上的改變, 進行研究, 並觀察對菌體量之影響 將前培養之菌液 50ml ( 接菌量為 20% (v/v) ) 接入固定酵母萃取粉 100 g/l 搭配探討的不同濃度的砂糖培養基內 ( 培養條件為 37 C,200 rpm), 觀察其最高菌體量之變化 實驗結果如圖 5-12, 可知酵母萃取粉 100 g/l 搭配砂糖濃度 90 g/l 120 g/l 及 150 g/l 之培養基有最高的菌體量 ; 從圖 5-12 可看出, 再增加砂糖的濃度時 ( 超過 150 g/l) 時, 最大菌體量有明顯的下降, 因而判定在酵母萃取粉 100 g/l, 砂糖的濃度高過 150 g/l, 則 L. reuteri 會出現部分抑制之結果 酵母萃取粉 100 g/l 搭配砂糖濃度 60 g/l 時, 其最大菌體量相對變少, 由此說明了氮源需與碳源有適量比例 之後實驗將選定 100 g/l 砂糖, 來做後續之探討 39

51 DCW max (g/l) Time (hr) control (MRS 55g/L) G6 G12 G18 G36 G60 G3 G9 G15 G24 G48 圖 5-12 液態培養液其固定酵母萃取粉 100 g/l 加上不同砂糖濃度對最大乾菌重 ( g/l ) 之影響, 與控制組 ( MRS Broth 55g/L ) 比較圖 由此途可見在 100g/L 酵母萃取粉其砂糖濃度在 90~150g/L 時有最高菌體量 圖上代號依序為 G3: granulated sugar 30g/L G6:granulated sugar 60g/L G9:granulated sugar 90g/L G12:granulated sugar 120g/L G15:granulated sugar 150g/L G18:granulated sugar 180g/L G24:granulated sugar 240g/L G36:granulated sugar 360g/L G48:granulated sugar 480g/L G60:granulated sugar 600g/L 40

52 5-4-2 酵母萃取粉濃度對菌體的影響實驗以固定其中一因子之濃度, 對另一因子作濃度上的改變, 進行研究, 並觀察對菌體量之影響 將前培養之菌液 50ml ( 接菌量為 20% (v/v) ) 接入固定砂糖濃度 100 g/l, 探討不同濃度的酵母萃取粉, 觀察其最高菌體量之變化 實驗結果如圖 5-13, 當砂糖濃度為 100 g/l 時, 酵母萃取粉濃度介於 100 g/l 與 200 g/l 的範圍, 菌體量有極值 ; 當酵母萃取粉濃度 200 g/l 以上, 其濃度對 L. reuteri 已產生部分抑制之結果 在酵母萃取粉低於 100 g/l, 其濃度對 L. reuteri 生長時所需要之氮源濃度是不足的, 相反的酵母萃取粉濃度高於 200 g/l, 其濃度對 L. reuteri 已產生部分抑制 由一次一因子實驗, 奠定了後續實驗規畫的基礎, 進而利用統計系統的回應曲面模式設計規畫出實驗設計法優化能達到最高菌體量之取代培養基 41

53 8 7 6 control (MRS 55g/L) Y50 Y200 Y400 Y25 Y100 Y300 DCW max (g/l) Time (hr) 圖 5-13 固定砂糖 100g/L 搭配不同酵母萃取粉濃度做為醱酵條件, 此條件對乳酸菌的最大菌量之影響 當砂糖濃度為 100g/L 其酵母粉濃度在 100~200g/L 時有最高的菌體量 圖上代號依序為 Y25:yeast extract 25g/L Y50:yeast extract 50g/L Y100:yeast extract 100g/L Y200:yeast extract 200g/L Y300:yeast extract 300g/L Y400:yeast extract 400g/L 42

54 5-5 培養條件最適化本實驗的目的, 欲利用實驗設計法優化能達到最高菌體量之取代培養基 固定前培養的培養基與條件 ( 操作溫度 37,12 hr), 並以砂糖 (X 1 ) 酵母萃取粉(X 2 ) 探討最適化, 而最高菌體量 ( OD₆₀₀ ) 為回應值, 並根據前期實驗, 確定各因子的實驗範圍, 見表 5-1 以二因子實驗設計法設計一階實驗, 如表 5-2, 再將實驗值以 Design-expert 5.0 軟體, 進行一階模式的迴歸分析, 可得到以各因子單位水準表示的迴歸方程式 : Y = X X 2 由此一階方程式的結果, 可繼續下一步的陡升實驗 由實驗數據 ( 如圖 5-16 與圖 5-17) 在 ph 控制在 4.8 時, 砂糖 50 g/l + 酵母萃取粉 50 g/l 醱酵 18 hr 後, 糖已消耗完, 其活菌數在後期有明顯的下降, 與最高活菌數相差 100 倍 43

55 表 5-1 二水準因子實驗設計之實際值範圍 - (1) Factor X1 X2 Coded level Carbon source conc.( g/l ) Nitrogen source conc.( g/l ) 表 5-2 部分因子實驗設計及實驗數據 - (1) No. X 1 X 2 最高菌體量 ( OD₆₀₀ )

56 G5+Y5 G25+Y5 G5+Y25 G25+Y25 ph Time (hr) 圖 5-14 二水準因子實驗設計之 ph 值的實驗數據 - (1) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y25:granulated sugar 50g/L + yeast extract 250g/L G25+Y5:granulated sugar 250g/L + yeast extract 50g/L G25+Y25:granulated sugar 250g/L + yeast extract 250g/L 45

57 DCW max (g/l) Time (hr) G5+Y5 G25+Y5 G5+Y25 G25+Y25 圖 5-15 二水準因子實驗設計之 DCW ( g/l ) 的實驗數據 - (1) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y25:granulated sugar 50g/L + yeast extract 250g/L G25+Y5:granulated sugar 250g/L + yeast extract 50g/L G25+Y25:granulated sugar 250g/L + yeast extract 250g/L 46

58 Sucrose conc. (g/l) G5+Y5 G5+Y G25+Y5 G25+Y Time (hr) 圖 5-16 二水準因子實驗設計之蔗糖濃度 ( g/l ) 的實驗數據 - (1) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y25:granulated sugar 50g/L + yeast extract 250g/L G25+Y5:granulated sugar 250g/L + yeast extract 50g/L G25+Y25:granulated sugar 250g/L + yeast extract 250g/L 47

59 10.0 G5+Y5 G25+Y5 G5+Y25 G25+Y log CFU/ml Time (hr) 圖 5-17 二水準因子實驗設計之 log CFU/ml 的實驗數據 - (1) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y25:granulated sugar 50g/L + yeast extract 250g/L G25+Y5:granulated sugar 250g/L + yeast extract 50g/L G25+Y25:granulated sugar 250g/L + yeast extract 250g/L 48

60 5-5-1 陡升實驗 - (1) 通常在初始實驗所決定的因子範圍會和最適化的因子範圍相差甚大, 因此可利用陡升路徑實驗快速並有效率的逼近極值點 表 5-3 為陡升路徑之實驗設計, 圖 5-18 為陡升實驗結果 其最高點落在第二個所決定的爬升路徑設計實驗範圍上, 為防止最高點的所在位置是實驗誤差所造成之結果, 實驗規畫二水準因子實驗設計之實際值範圍, 確認其極值所在範圍, 其圖 5-19 為陡升路徑實驗數據之爬升範圍 表 5-3 陡升路徑之實驗設計 - (1) X 1 X 2 (1) 出發點 (2) 單位水準之實際範圍 (3) 因子爬升比率 (4) 單位爬升距離 (5) 實際爬升距離 ( (4) q* ) (6) 爬升路徑設計出發點 q* factor : 依照實驗經驗所設定的值, q* =

61 DCW max (g/l) Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample Time (hr) 圖 5-18 陡升實驗之乾菌重 ( g/l ) 結果 - (1) 圖上代號依序為 Sample 1: granulated sugar 150g/L + yeast extract 150g/L Sample 2:granulated sugar 177g/L + yeast extract 157.8g/L Sample 3:granulated sugar 204g/L + yeast extract 165.6g/L Sample 4:granulated sugar 231g/L + yeast extract 173.4g/L Sample 5:granulated sugar 258g/L + yeast extract 181.2g/L Sample 6:granulated sugar 285g/L + yeast extract 189g/L 50

62 DCW max (g/l) granulated sugar conc.(g/l) yeast extract conc. (g/l) 圖 5-19 陡升實驗結果 - (1) 根據前期實驗, 確定各因子的實驗範圍, 見表 5-4 因為了再次確認之前陡升實驗設計之極值得所在範圍, 所以重新再以二因子實驗設計法設計一階實驗, 如表 5-5, 再將實驗值以 Design-expert 5.0 軟體, 進行一階模式的迴歸分析, 可得到以各因子單位水準表示的迴歸方程式 : Y = X X 2 由此一階方程式的結果, 可繼續下一步的陡升實驗 51

63 表 5-4 二水準部分因子實驗設計之實際值範圍 - (2) Factor X1 X2 Coded level Carbon source conc. ( g/l ) Nitrogen source conc. ( g/l ) 表 5-5 部分因子實驗設計及實驗數據 - (2) No. X 1 X 2 最高菌體量 ( OD₆₀₀ )

64 5.5 G5+Y5 G19+Y5 G5+Y19 G19+Y ph Time (hr) 圖 5-20 二水準因子實驗設計之 ph 值的實驗數據 - (2) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y19:granulated sugar 50g/L + yeast extract 190g/L G19+Y5:granulated sugar 190g/L + yeast extract 50g/L G19+Y19:granulated sugar 190g/L + yeast extract 190g/L 53

65 12 G5+Y5 G19+Y5 G5+Y19 G19+Y19 10 DCW max (g/l) Time (hr) 圖 5-21 二水準因子實驗設計之乾菌重 ( g/l ) 的實驗數據 - (2) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y19:granulated sugar 50g/L + yeast extract 190g/L G19+Y5:granulated sugar 190g/L + yeast extract 50g/L G19+Y19:granulated sugar 190g/L + yeast extract 190g/L 54

66 Sucrose conc. (g/l) 200 G5+Y5 G5+Y19 G19+Y5 G19+Y Time (hr) 圖 5-22 二水準因子實驗設計之蔗糖濃度 ( g/l ) 的實驗數據 - (2) 圖上代號依序為 G5+Y5:granulated sugar 50g/L + yeast extract 50g/L G5+Y19:granulated sugar 50g/L + yeast extract 190g/L G19+Y5:granulated sugar 190g/L + yeast extract 50g/L G19+Y19:granulated sugar 190g/L + yeast extract 190g/L 55

67 5-5-2 陡升實驗 - (2) 通常在初始實驗所決定的因子範圍會和最適化的因子範圍相差甚大, 因此可利用陡升路徑實驗快速並有效率的逼近極值點 表 5-6 確認之陡升路徑之實驗設計, 圖 5-23 與圖 5-24 為確認之實驗結果 最高點落在第四個所決定的爬升路徑設計實驗範圍上, 而極值所在範圍與第一次的極值所在範圍相差不遠, 所以利用這兩次之實驗結果與相關實驗數據, 以 Design-expert 5.0 軟體, 進行二階模式的迴歸分析, 可得到以各因子單位水準表示的迴歸方程式 表 5-6 陡升路徑之實驗設計 - (2) X 1 X 2 (1) 出發點 (2) 單位水準之實際範圍 (3) 因子爬升比率 (4) 單位爬升距離 (5) 實際爬升距離 ( (4) q* ) (6) 爬升路徑設計出發點 q* factor : 依照實驗經驗所設定的值, q* =

68 12 Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 10 DCW max (g/l) Time (hr) 圖 5-23 陡升實驗之乾菌重 ( g/l ) 結果 - (2) 圖上代號依序為 Sample 1: granulated sugar 120g/L + yeast extract 120g/L Sample 2:granulated sugar 139.7g/L + yeast extract 137.2g/L Sample 3:granulated sugar 159.4g/L + yeast extract 154.4g/L Sample 4:granulated sugar 179.1g/L + yeast extract 171.6g/L Sample 5: granulated sugar 198.8g/L + yeast extract 188.8g/L Sample 6:granulated sugar 218.5g/L + yeast extract 206g/L 57

69 DCW max (g/l) granulated sugar conc.(g/l) yeast extract conc. (g/l) 圖 5-24 陡升實驗結果 - (2) 58

70 陡升實驗只是大略的搜尋其極值點的範圍, 若要再更精確的搜尋最大值, 則可使用二階方程式, 更詳細的描述回應曲面變化, 再依此二階方程式搜尋最佳值 實驗將相關實驗之所得數據, 利用 Design-expert 5.0 軟體, 進行迴歸得到一個二階模式的迴歸分析, 由此二階模式的迴歸分析可得知回應曲面變化的二階方程式, 依此二階方程式進行微分, 可得知因子的最佳濃度, 而依此濃度去進行實驗確認 其回歸之二階方程 ( 表 5-8): DCW(g/L) = X X X 1 ² X 2 ² X 1 X 2 X 1 : 10³ * granulated sugar (g/l) X 2 : 10³ * yeast extract (g/l) 利用此二次迴歸方程式來描述各因子與菌體量 ( DCW ( g/l ) ) 的關係, 繪製 回應曲面圖與等高線圖, 其結果如圖 5-25, 最適化值分別為 granulated sugar g/l yeast extract g/l, 菌體量預測值為 g/l 由實驗數據進行統計迴歸而得到的回應曲面模式對於表示實驗數據的適切 程度, 可利用變異數分析法 (Analysis of Variance) 及檢定係數 (Determination Coefficient) R 2 來檢驗 如表 5-7, 表示此迴歸模式的 P 值為 < , 具有顯 著性, 即此回應曲面模式信賴度高達 99.99% 另此模式之變異係數 (Coefficient of Variation, C.V.) 為 6.01, 小於 20 (Montgomery, 2001), 表示此試驗之準確性及可靠 性高 若 R 2 值趨近於 1, 表示此曲面模式可適切地描述實驗數據 ; 若 R 2 值遠低於 1, 則表示此模式與實驗數據之總偏差相當大 在本實驗中的檢定係數為 0.96, 表示 此一回應模式能適切地描述實驗數據 利用最適化組成於血清瓶試驗結果顯示 ( 圖 5-25 與圖 5-26), 以最適化之條件 進行三重複之確認實驗, 實際值為 ± 0.14 g/l, 由迴歸模式所預測值 ( ± 0.49g/L ) 與確認實驗相符合, 顯示本研究之誤差在可接受範圍 59

71 表 5-7 二階 RSM 模式之變異係數分析 (ANOVA) ANOVA for Response Surface Cubic Model Sum of Mean F Source Squares DF Square Value Prob > F Model < Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total Root MSE R-Squared Dep Mean C.V PRESS Adj R-Squared Pred R-Squared Adeq Precision Desire > 4 表 5-8 經 Design-expert 5.0 軟體, 回歸出來的二階方程式 Factor Estimate DF Intercept X1-granulated sugar X2-yeast extract X1² X2²

72 圖 5-25 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等高線圖 DESIGN EXPERT Plot Actual Factors: X = granulated sugar Y = yeast extract DCW (g/l) yeast extract granulated sugar 圖 5-26 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等反應曲面圖 ( 圖上所示之 yeast extract 與 granulated sugar 直接為實際值之 1/10³) 61

73 5-5-3 利用最適化組成進行醱酵試驗利用最適化組成於血清瓶試驗結果顯示 ( 圖 5-25 與圖 5-26), 以最適化之條件進行三重複之確認實驗, 實際值為 ± 0.14 g/l, 由迴歸模式所預測值 ( ± 0.49g/L ) 與確認實驗相符合, 顯示本研究之誤差在可接受範圍 L. reuteri 醱酵菌量, 經由回應曲面法獲得了大幅度的改善, 菌體產值亦向前邁進一步 35 Lactic acid conc. Acetic acid conc conc. (g/l) Time (hr) 圖 5-27 最適化培養基培養乳酸菌之醱酵產物 62

74 利用最適化培養基培養 L. reuteri, 經由 HPLC 分析實驗結果 ( 如圖 5-27 ) 可得知 L. reuteri 是屬於異質醱酵, 結果得知 L. reuteri 利用碳水化合物進行醱酵產生乳酸與醋酸 由回應曲面法找出各組成分之最適濃度, 其結果為 : 砂糖 184.2g/L 酵母萃取粉 g/l; 醱酵時隨著醱酵時間愈長所消耗的糖越多, 相反的隨著醱酵時間愈長, 產生酸會隨著時間越長而累積增加, 然而醱酵結束時乳酸菌消耗了 5.06 mloe-c, 產生醋酸 ( 0.36 mloe-c ) 與乳酸 ( 0.86 mloe-c ) 依此實驗結果計算成本上的花費 ( 如下表 5-9 ), 當以 MRS Broth 55 g/l 為培養基時, 所生產出來的菌其每克成本為 163 元 /g ; 當以本實驗中最適化之培養基醱酵所生產出的菌其每克成本為 15 元 /g 較原有的 MRS 培養基, 相同菌體量時, 成本可降為 1/10 表 5-9 醱酵成本 條件 MRS Broth 最適化培養基 成本 2800 元 /500g 1L 培養基的成本 308 元 148 元 CFU/mol-C 1.49*10¹² 1.55*10¹² DCW (g/l) 砂糖 :42 元 /1000g YE:900 元 /1000g 63

75 5-6 利用最適化活菌組成進行醱酵試驗陡升實驗只是大略的搜尋其極值點的範圍, 若要再更精確的搜尋最大值, 則可使用二階方程式, 更詳細的描述回應曲面變化, 再依此二階方程式搜尋最佳值 實驗將相關實驗之所得數據, 利用 Design-expert 5.0 軟體, 進行迴歸得到一個二階模式的迴歸分析, 由此二階模式的迴歸分析可得知回應曲面變化的二階方程式, 依此二階方程式進行微分, 可得知因子的最佳濃度, 而依此濃度去進行實驗確認 其回歸之二階方程 ( 表 5-8): Log CFU/ml = X X X 1 ² X 2 ² X 1 X 2 X 1 : 10³ * granulated sugar (g/l) X 2 : 10³ * yeast extract (g/l) 利用此二次迴歸方程式來描述各因子與活菌數 ( log CFU/ml ) 的關係, 繪 製回應曲面圖與等高線圖, 其結果如圖 5-28, 最適化值分別為砂糖 g/l 酵母萃取粉 112 g/l, 預測值為 4.34*10 9 CFU/ml 由實驗數據進行統計迴歸而得到的回應曲面模式對於表示實驗數據的適切 程度, 可利用變異數分析法及檢定係數 R 2 來檢驗 如表 5-10, 表示此迴歸模式 的 P 值為 , 具有顯著性, 即此回應曲面模式信賴度高達 99.02% 另此 模式之變異係數為 0.74, 小於 20 (Montgomery, 2001), 表示此試驗之準確性及 可靠性高 若 R 2 值趨近於 1, 表示此曲面模式可適切地描述實驗數據 ; 若 R 2 值遠 低於 1, 則表示此模式與實驗數據之總偏差相當大 在本實驗中的檢定係數為 0.84, 表示此一回應模式能適切地描述實驗數據 利用最適化組成於血清瓶試驗結果顯示 ( 圖 5-28 與圖 5-29 ), 以最適化之 條件進行三重複之確認實驗, 實際值為 3.90*10 9 CFU/ml, 由迴歸模式所預測值 (4.34*10 9 CFU/ml) 與確認實驗相符合, 顯示本研究之誤差在可接受範圍 L. reuteri 醱酵菌量, 經由回應曲面法獲得了大幅度的改善, 活菌數產值亦能提高 64

76 表 5-10 二階 RSM 模式之變異係數分析 (ANOVA) ANOVA for Response Surface Cubic Model Source Squares DF Square Value Prob > F Model Residual Cor Total Root MSE R-Squared Dep Mean C.V Adj R-Squared PRESS N/A Adeq Precision Desire > 4 表 5-11 經 Design-expert 5.0 軟體, 回歸出來的二階方程式 Factor Estimate DF Intercept X1-granulated sugar X2-yeast extract X1² X2²

77 圖 5-28 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等高線圖 ( 圖上所示之 yeast extract 與 granulated sugar 直接為實際值之 1/10³) DESIGN EXPERT Plot Actual Factors: X = granulated sugar Y = yeast extract log CFU/ml yeast extract granulated sugar 圖 5-29 以相關實驗與陡升實驗數據所畫的等反應曲面圖 ( 圖上所示之 yeast extract 與 granulated sugar 直接為實際值之 1/10³) 66

78 第六章結論與未來方向 6-1 結論 1. MRS Broth 的成分裡含有一些緩衝鹽類, 所以在醱酵期間 ph 值的變化不大 取代培養基內並無添加緩衝鹽類, 所以在醱酵期間 ph 值之變化很大, 然而本實驗所用之 L. reuteri, 在醱酵期間當醱酵液之 ph 值下降至 4.0 以下, 其活菌數明顯受到 ph 值之影響而下降 2. 培養基的酵母萃取粉濃度高於 300 g/l 時, 對 L. reuteri 之菌體生長會產生部分 抑制的結果 ; 高於 240 g/l 砂糖時, 對 L. reuteri 之菌體生長會產生部分抑制的 結果 3. 經由回應曲面法找出各組成分之最適濃度, 其結果如下 : 砂糖 184.2g/L 酵 母萃取粉 g/l, 其預測值為 ± 0.49g/L, 以血清瓶試驗進行醱酵, 實際值為 ± 0.14 g/l, 由迴歸模式所預測值與實際值相符合 4. 當以 MRS Broth 為培養基時, 所生產出來的菌其每克成本為 163 元 /g ; 當以本實驗中最適化之培養基醱酵所生產出的菌其每克成本為 15 元 /g 以單位成本所生產出的菌量來比較, 經實驗最適化之成本較一般做乳酸菌醱酵所用之培養基 ( Difco MRS Broth ) 便宜, 其成本能節省大約 9 成之花費 67

79 6-2 未來方向 由回應曲面法決定了最適培養基組成, 根據目前成果還可繼續探討 : 1. 利用由回應曲面法所尋求之最適培養條件, 放大到醱酵槽培養, 並探討 ph 值 溫度及攪拌速度對乳酸菌生長之影響 2. 利用階段醱酵策略, 在醱酵後期供給最適培養基, 探討其影響 3. 以 fed-batch 方式培養, 探討乳酸菌醱酵之影響 4. 探討保存方式對乳酸菌之活性的影響 68

80 第七章參考文獻 Alazzeh A.Y., Ibrahim S.A., Song D., Shahbazi A., and AbuGhazaleh A.A., Carbohydrate and protein sources influence the induction of α- and β-galactosidases in Lactobacillus reuteri. Food Chemistry, 117: ( 2009) Axelsson, L. T., Lactic acid bacteria: classification and physiology.,lactic Acid Bacteria (1993 ) Berny, J. F., and G. L. Hennebert. Viability and stability of yeast cells and filamentous fungus spores during freeze drying: Effects of protectants and cooling rates. Mycologia. 83: (1991) De Vos, W. M., Metabolic engineering of sugar catabolism in lactic acid bacteria. A van Leeuw. 70: (1996) Font de Valdez, G., G. S. de Giori, A. P. de Ruiz Holgado, and G. Oliver. 1983a. Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology. 20: Garvie, E. I., Bacterial lactate dehydrogenases. Microbiol Rev. 44: (1980) Hawkins, S.M., Bifdobacteria in dairy products. Cult. Dairy Prod. J. 28: (1993) Hayakawa., Function of fermented milk. Elsevier Science Publishing Co. London. (1992) Hofvendahl K., and B. Hahn-Hagerdal., Factors affecting the fermentative lactic acid roduction from renewable resources. Enzyme Microb Technol. 26: (2000) Jeya M., Zhang Y. W., Kim I. W., and Lee J. K., Enhanced saccharification of alkali-treated rice straw by cellulase from Trametes hirsuta and statistical optimization of hydrolysis conditions by RSM. Bioresource Technology, 100: (2009) 69

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