通氣與攪拌

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1 9 通氣與攪拌 前言很多的發酵工程都是好氣性的, 故需要供給氧氣, 以化學量論的 (stoichiometry) 來考慮呼吸時, 其代表的就是 glucose 的完全氧化 C6H12O6 +6O2 6H2O+6CO2 即, 完全氧化 180g 的 glucose 則需 192g 的氧氣 但是在液中被微生物利用時, 氧氣的溶解度只有 glucose 的 1/6000( 與空氣接觸之水溶液中的飽和氧氣濃度是 10mg/L 左右 ) 因此在微生物之培養系中, 被當基質所添加之 glucose 或其他的碳源, 要使完全氧化所需的氧氣量一次供給的話, 實際上是不可能, 因此氧氣要依微生物之生長速度, 在滿足其氧氣需求量的情形下來連續的供給 工業上的發酵工程, 培養之氧氣需求量則以通氣與攪拌來供給, 但是很多的發酵工程, 其發酵槽之氧氣供給能會律速其生產性, 這是實情, 因此檢討發酵槽中微生物培養系之氧氣供給的影響因素, 是非常重要的工作 本章則記述發酵工程中氧氣需求的基本概念, 定量的處理氧氣移動, 影響培養液中氧氣移動速度之各因子等 發酵工程之氧氣要求呼吸的化學量論是考慮氧氣供給問題的一個指標, 沒有考慮被菌體吸收之碳的平衡, 就無法表示微生物之真正的氧氣要求量, 把氧 碳 氮等被菌體吸收利用之所有元素, 列入考慮發酵工程對氧氣要求量的預測方法, 全面 (overall) 的化學量論被很多的研究者加以檢討 由這些檢討的結果, 可知培養系之氧氣要求量受被使用培養基之碳源種類影響的部份非常大 Darlington(1964) 說, 乾燥酵母菌體 100g 之組成為 C3.92 H6.5 O1.94, 由碳水化物或碳氫化物生產菌體, 則可以下式來表示 6.67 CH2O O2=C3.92 H6.5 O CO H2O 7.14 CH O2=C3.92 H6.5 O CO H2O 在此,CH2O 表示碳水化物,CH2 為碳氫化物 依 Darlington 之式子, 同樣要得到 100g 之酵母菌體, 與碳水化物的情形來比較, 以碳氫化物為原料時約需三倍的氧氣 259

2 發酵工程的基礎 Johnson(1964) 則提出下式 A Y - B = C 在此,A 是 1g 之基質要燃燒分解成 CO2 H2O 及 NH3( 基質中含氮時 ) 所需的氧氣量, 理論的計算法 B 是 1g 菌體要燃燒分解成 CO2 H2O 及 NH3 所需的氧氣量, 若菌體之元素組成知道時就可以計算,Johnson 則求出 41.7mmol/g 的值 Y 是由 1g 基質所得到的菌體克數, 即菌體收率,C 是要生產 1g 菌體所要的氧氣量 即,A/Y 是要生產 1g 菌體所需基質被燃燒所需的氧氣量,B 是 1g 菌體被燃燒分解所需的氧氣量, 其差 C 是表示生產 1g 菌體所需的氧氣量 該 Johnson 之式子若適用於利用 glucose 及烷屬烴 (alkane) 來生產酵母菌的話則成為下式 Glucose 的情形 C (mmol/g) = Alkane 的情形 Y = 41.7 C (mmol/g) = Y = 41.7 假設,glucose 之 Y 為 50%,alkane 之 Y 為 100% 的話, 則成為 Alkane 的情形 Glucose 的情形 C = 65.4 mmol O2/g cell C = mmol O2/g cell Mateles(1971) 說, 代謝生產物為菌體與二氧化碳及水而已, 菌體的元素組成假定為 C=53% N=12% O=19% H=7% 時, 則導出碳源與氧氣要求量之關係式為 氧氣要求 g數菌體生成 g數 = 32C+8H-16O Y M 在此,Y 是對碳源基質之菌體收率 ( 消費每 g 碳源基質之菌體生產 g 數 ),M 是被當碳源用之基質的分子量,C H O 是 1 分子各基質中之碳 氫 氧原子之數 Mateles 利用此式來計算各種微生物利用各種基質來培養時之氧氣消費量, 其結果則如表 9.1 中所示 260

3 9 通氣與攪拌 表 9.1 各種微生物在各種基質中生長時之氧氣要求量 (Mateles,1979) 基質 微生物 氧氣要求量 文獻 (O2/ 乾燥菌體 g) Glucose Escherichia coli 0.4 Schulze and Lipe(1964) Methanol Pseudomonas C 1.2 Goldberg et al.(1976) Octane Pseudomonas sp. 1.7 Wodzinski and Johnson(1968) 到此為止所述之式子是假定在菌體生產中, 除二氧化碳及水之外一切菌體外物質都不生產的情形下 因此該式雖適用於菌體生產為目的來推定發酵之氧氣要求量, 若在生產菌體以外之物質的發酵時, 該式則需加以修正 例如 Cooney(1979) 提出對 penicillin 發酵的式子如下 0.53 Yo/p = X P Y P/G 在此,Yo/p = 生產 1g 之 penicillin G 鈉時所消費的氧氣量,YP/G 是消費 1g glucose 所生產之 penicillin G 鈉的 g 數,X 為乾燥菌體生成量,P 為 penicillin G 鈉生產量 但是, 如以上述之氧氣供給量來預測其單純的 total balance 也並非很正確, 何以會如此, 因菌的代謝會受培養系之溶氧水準的影響, 比氧氣消費速度 (QO2= 單位時間, 每單位乾燥菌體重量之氧氣消費量則以 mmol 表示 ; 註解 : 氧氣消費速度等於呼吸速度 ) 與被當基質所在溶液中的氧氣濃度 ( 溶氧濃度 ) 之間, 會成立酵素反應之一般式的 Michaelis-Menten 式子 ( 圖 9.1) 圖 9.1 影響微生物比氧氣消費速度 QO2 之溶氧濃度. 由圖 9.1 可知, 比氧氣消費速度在某種值 ( 該值稱為臨界溶氧濃度 Ccrit) 範圍內會隨著溶氧濃度之增加而增大, 在此以上則成一定 各種微生物之臨界溶氧濃度則示於表 9.2 中 為了要得到最大的菌體生產性, 在培養系之 261

4 發酵工程的基礎 氧氣供給量一面要使溶氧濃度保持在臨界濃度以上, 來滿足菌的最大氧氣要求量 假如, 培養系之溶氧濃度要低於臨界濃度以下時, 菌之代謝活動就會亂掉 但是, 在發酵產業上並非一定以生產菌體為目的, 大多是以生產各種代謝生產物為目的, 這些之中有幾種之代謝生產物為其目的的發酵, 反而在氧氣不足的狀態下會蓄積更多產物者也很多 表 9.2 各種微生物之臨界溶氧濃度 (Rviere,1977) 微生物 溫度 臨界溶氧濃度 ( ) (mmoles/l) Azotobacter sp Escherichia coli Saccharomyces sp Penicillium chrysogenum 反之, 在不影響菌體生產之高溶氧濃度下可以得到良好蓄積之代謝生產物者也有, 因此, 物質生產之最適溶氧濃度與菌體生產的情形是不同 Hirose 與 Shibai(1980) 對 Brevibacterium flavum 之胺基酸發酵, 研究其生產物代謝與溶氧濃度之關係是一個良好的例子 他們發現 B. flavum 之臨界溶氧濃度是在 0.01mL/L, 在此以上之溶氧濃度, 雖然增加氧氣供給量, 但菌的呼吸速度則呈最大而且一定, 表示已經不再增大已成氧氣充足的條件 換言之, 溶氧濃度若在其臨界濃度以下時, 氧氣供給量是表示尚未滿足培養系之要求的意思 以此種思考來求其氧氣充足度, 調查其對胺基酸蓄積所造成影響的結果則如圖 9.2 所示 由該圖可知,glutamic acid 系列 aspartic acid 系列等胺基酸之生產情形, 在氧氣充足率未滿時則對蓄積造成不良影響 但 phenylalanine valine leucine 等之情形, 反而在氧氣不充足時較好, 其最適氧氣充足率各別為 由圖 9.3 所示之胺基酸的生合成路徑可知,glutamic acid 及 aspartic acid 系列之胺基酸全部都經由 TCA cycle 之成分 (member) 來生成 phenylalanine valine leucine 之各胺基酸則以解糖系之中間體的 pyruvic acid 或 phosphoenolpyruvic acid 來生成, 在氧氣充分供給的情形,TCA cycle 則充分的作用, 在其各成分 (member) 被代謝中, 當氧氣供給被限制時,TCA cycle 所用之 glucose 的氧化就無法充分進行, 就會偏向 phenylalanine valine leucine 之代謝系, 因此種代謝系之擾亂而造成由 pyruvic acid 生合成之胺基酸蓄積 262

5 9 通氣與攪拌 圖 9.2 溶氧對 Brevibacterium flavum 之胺基酸生產的影響 (Hirose and Shibai,1980). 圖 9.3 B. flavum 之各種胺基酸生合成路徑. 關於對二次代謝生產物之影響,Feren 與 Squires(1969) 則利用 Cephalosporium sp. 對 cephalosporin 與 capreomycin 的生產研究, 依他們的發現,cephalosporin 生產菌株, 其臨界溶氧濃度 Ccrit 是在 0 到 7% 飽和之間,capreomycin 生產菌株則在 13 到 23% 飽和之間 但是會影響抗生物質生產之溶氧濃度,cephalosporin 的情形是在 10 到 20% 之間,capreomycin 則在 8% 即 cephalosporin 生產, 是抗生物質生產其最適溶氧濃度比 Ccrit 要高,capreomycin 生產則比 Ccrit 要低 在很多的好氣發酵, 其培養中要求很高的溶氧濃度, 故開發出使培養系之氧氣要求量不會超越設備之氧氣供給能力, 可以管理的發酵工程, 培養系之氧氣要求量主要是受到菌體濃度與呼吸活性所左右, 當然與生長速度也有關係, 對培養開始之培養基濃度加以限制的話, 可使發酵槽之菌體濃度保持在適當的水準, 隨後再追加添加培養基對生長速度, 即對呼吸速度可加以制御, 此種方法已在第 2 章 第 4 章敘述過, 在本章後面也會再敘述 氧氣供給氧氣通常是以空氣來供應給培養系, 此因空氣是最廉價的氧氣源, 同 263

6 發酵工程的基礎 時供給空氣之發酵設備, 隨著工程之 scale 的不同而有各種的東西 (1) 在實驗室, 則將 250mL 到 500mL 之三角瓶 (conical flask) 置於恆溫箱內之板上, 在三角瓶中裝入 50mL 到 100mL 之培養液, 給予振盪培養的方法來進行 (2) 在中間工場 (pilot plant) 或工業生產設備上, 則以如第 7 章所述之通氣攪拌法來進行, 即使用所謂發酵槽 (fermenter) 的設備, 但是, 也有為了方便於詳細檢討培養條件, 利用 1L 左右之小型發酵槽, 可以添加流加液, 進行採樣 (sampling) 之通氣攪拌型的容器 (mini ja r 等 ), 另外也有不需攪拌而能保有所需氧氣移動速度的發酵槽, 這些都已經在第 7 章敘述過 依 Bartholomew 等 (1950) 說, 在培養系要使空氣中的氧氣移動到菌體中, 則有下列幾個階段的步驟 (step) 存在 (1) 氧氣從氣泡進入液中的移動 (2) 溶解的氧氣從培養基到達菌體的移動 (3) 菌體對氧氣的攝取 他們發現在培養 Streptomyces griseus 時從空氣到達菌體之氧氣移動的律速是在氣泡氧氣溶解到溶液中的階段, 上述的第二階段 (2), 其氧氣移動之抵抗, 可經由提高攪拌速度來克服, 這些發現已確認與低黏度之非 newton 流體的發酵則非常一致, 使用高黏度培養基來發酵時, 則屬其他二個步驟中之任何一個會成為律速的階段, 在使用高黏度培養基之發酵的氧氣移動上, 其獨特的困難點則會後述 結論是從氣泡到液相之氧氣移動則依下式來表示 dc L =KLa (C * -C L) (9.1) dt dc 在此,CL 是表示培養液中之溶氧濃度 (mmol/l),t 是時間 (hr), L 是在一定時間中之溶 dt 氧濃度的變化, 即氧氣移動速度 (mmol/l hr),kl 是液境膜之氧氣移動速度係數 (cm/hr),a 是每單位體積之氣液界面積 (cm 2 /cm 3 ),C * 是氣泡之氧氣分壓與平衡的溶氧濃度 (mmol/l) KL 是氧氣從氣相移動到液相之抵抗的逆數,(C * -C L) 則可視為逆著抵抗來移動的推進力 (driving force) 發酵系之 KL 與 a 的測定則非常困難, 故利用把此二項乘在一起之 KL a, 被稱為氧氣移動容量係數的東西 KLa 之大小 (dimension) 是時間的逆數, 通常以 hr -1 表示, 氧氣移動容量係數是表示發 264

7 9 通氣與攪拌 酵槽之氧氣移動能, 大概的目測值, 在相同條件下 KLa 越大者表示其氧氣移動的能力越大 供應到發酵槽中的氧氣量與微生物所吸收之量的平衡 (balance) 可以表示培養液的溶氧濃度 假如, 發酵槽之 KLa 小於微生物之氧氣要求速度時, 培養液之溶氧濃度就會低於臨界溶氧濃度 Ccrit 反之, 發酵槽之 KLa 能充分滿足微生物之氧氣要求速度時, 培養液的溶氧濃度就會大於其臨界溶氧濃度 Ccrit, 可能就會表現氧氣之飽和水準 (level) 的 70~80% 左右的值, 即發酵槽之 KLa 在培養之全期間要使生產物蓄積需維持在最適的溶氧濃度 KLa 之測定發酵槽之 KLa 的測定, 要定量的把握通氣攪拌效果, 氧氣供給條件之正確設定是不可缺少的事情, 在本節針對能適用於測定 KLa 之各種方法, 及其特徵與適用範圍加以說明 亞硫酸氧化 (sulfite oxidation) 法利用亞硫酸鈉之氧化來測定被通氣之槽的氧氣移動速度, 最初是 Cooper 等 (1944) 所用的方法 此種方法, 並非直接測定溶氧濃度, 而是在銅或鈷之催化劑存在下, 測定 0.5M 之亞硫酸鈉被氧化成硫酸鈉之速度來瞭解氧氣移動速度的方法 Na2SO3 + 1/2 O Cu ( aq) 或 Co ( aq) Na2SO4 在該系中, 若有氧氣進入時, 立刻就會用於氧化亞硫酸而被消費, 可以說亞硫酸的氧化速度會等於氧氣移動速度, 該測定系實際上, 亞硫酸鈉之溶氧濃度為 O, 故 KLa 則以下式來表示 OTR = K La C * (OTR 是氧氣移動速度的意思 ) 實際測定之順序則如後, 首先在發酵槽中加入含 10-3 M 之 Cu 2+ 離子的 0.5M 亞硫酸鈉溶液, 以一定的速度加以通氣攪拌, 每隔一定時間 ( 間隔則依攪拌條件而定 ) 進行採樣 (sampling), 立刻加入過量的碘液, 使未反應之亞硫酸與碘反應, 再以 sodium thiosulfate 來逆滴定, 把滴定量對時間來圖示 (plot) 時, 就可從其斜線 ( 率 ) 來求出氧氣移動速度, 亞硫酸氧化法是非常簡單, 在不含不純物之系中可以求得正確的值, 但是, 此種方法隨著液體的採樣 (sampling) 對其液量變化有加以補正的必 265

8 發酵工程的基礎 要, 此種方法在測定上需長時間 ( 通常是依攪拌條件而定, 一次的測定需要 3 小時的情形也有 ), 只要有微量的界面活性劑混入就會產生誤差 Bell 與 Gallo (1971) 則認為胺基酸 蛋白質 脂肪酸 酯 (ester) 脂質等界面活性物質, 只要微量存在, 對該測定的精度就會有很大的影響, 使發酵槽間之通氣效果產生差異, 他們認為這些物質之含量差異為其原因 另外, 亞硫酸鈉溶液之流動學 (rheology) 與實際的培養液有很大的差異, 尤其是絲狀菌之培養液的通氣攪拌效果, 由亞硫酸氧化法之測定值來類推者, 認為會有很大的不同, 然而對大型的槽則需很高的藥品費, 故在生產設備上對此種方法的應用是有其極限 Gassing out 法培養系之 KLa, 可從測定通氣攪拌中之液體的溶氧濃度變化來推定 在通氣狀態, 其氧氣移動之推進力 (C * -C L) 減少時,C L 在接近 C * 的話, 是表示氧氣移動速度變小的意思 如圖 9.4 所示, 在通氣中的系, 溶氧濃度之變化對時間來圖示 (plot) 的曲線, 其曲線之直線的斜線 ( 率 ) 則表示其氧氣移動速度 圖 9.4 通氣使溶氧濃度的增加. 可從時間 X 與曲線之接線的斜線 ( 率 )Y 來求出其氧氣移動速度 為了要觀察在適當範圍之溶氧的增加, 需預先將溶氧降到很低的水準 (level), 降低溶氧的方法則有靜態的方法 (static method) 與動態的方法 (dynamic method) 二種 1. 靜態的方法 (static method) 266

9 9 通氣與攪拌 Wise(1951) 最初所發表的方法, 首先吹入氮氣置換 (scrubbed) 溶液中的氧氣, 使系之溶氧水準 (level) 降下, 再對脫氧的溶液加以通氣攪拌, 利用適當的氧氣電極來測定溶氧的增加, 溶氧的增加則如 (9.1) 式所示 dc dt L = KLa(C * -CL) 因有上式的關係, 故圖 9.4 只能以式子來表示 將 (9.1) 式積分則成為 In(C * -C L) = -KLat (9.3) 因此如圖 9.5 所示, 把 (C * -C L) 之對數對時間來圖示 (plot) 時, 就可得到其直線關係, 其斜線 ( 率 ) 則為 KLa, 此種方法與亞硫酸氧化法比較時其測定所需時間較短 ( 通常約 15 分鐘左右 ), 直接用於發酵生產培養基, 進而要使測定系更近似實際的培養系, 因而可以添加殺菌過的菌體或菌絲使其濃度與培養時相同濃度再來測定等之優點 但是利用使菌體與其共存, 或不共存之培養基, 在測定時則需要膜電極, 要詳細追蹤在短時間內所發生之溶氧濃度的變化時, 在應答時間上膜電極則不適當 如膜電極具有暫時遲延要素之電極的步驟 (step) 應答中, 將表示 63% 之應答時間定義為時常數 (Tp), 合於上述目的之溶氧電極的時常數, 需要比氧氣物質移動速度的應答時間 (1/KLa) 要充分的短很多 Van t Riet(1979) 說利用市販之時常數 2~3 秒的氧氣電極, 幾乎可以無誤差的測到 360hr 之 KLa 值 但是要測定很大的 KLa 值時, 如 Taguchi 與 Humphrey(1966) Heinekin( ) Wernau 與 Wilke(1973) 等所檢討過似的, 在計算時需要加入電子之應答速度的補正項目 因此 Banks(1979) 推薦使用具有比膜電極更快應答速度之非膜型的電極, 但是使用此種電極時, 需以 0.1M KCl 之電解液來代替培養基加入 不論如何, 此種方法應用在工業上最大的問題是在要脫氧氣 ( 除氧氣 ) 時需要大量的氮氣, 尚且也要依其測定法而異, 從發酵槽取出測定之樣品 (sample) 沒有完全代表發酵槽全體之試料是事實 267

10 發酵工程的基礎 圖 9.5 以 ln(c * -CL) 對通氣時間的圖示 (plot), 斜線 ( 率 ) 等於 -K La. 2. 動態的方法 (dynamic method) Taguchi 與 Humphrey(1966) 在通氣之前, 考慮將培養生菌之培養系的溶氧水準 (level) 降低之方法, 因此在該方法上, 可以測定比實際之培養系更接近之系中的氧氣移動速度為其優點, 此種情形, 因要觀察如培養液複雜組成之液中的溶氧舉動, 需要使用膜電極, 故要進行如前述之電極應答時間的補正 其測定順序, 首先要停止對發酵槽的通氣, 結果則會如圖 9.6 所示因菌之呼吸而使培養液之溶氧呈直線的減少 菌之呼吸速度則可從圖 9.6 之直線 AB 的斜線 ( 率 ) 來求出 在 B 點給予再通氣, 溶氧濃度就會增加, 濃度就會恢復到 X, 在 BC 間之溶氧濃度的增加, 表示在進入培養液之氧氣移動速度與菌之呼吸對溶氧吸收之差, 應該可以得到下式 dc L =KLa(C * -C L)-xQO 2 (9.4) dt 在此,x 表示菌體濃度,Q O2 表示比呼吸速度 ( 以 mmol O2/g cell 表示 ) 268

11 9 通氣與攪拌 圖 9.6 以 dynamic gassing out 法測定 K L a. 在 A 點停止通氣,B 點再開始通氣. 圖 9.7 以 dynamic gassing out 法測定 KLa. 在圖 9.6 之曲線上以 BC 區間之接線的斜線 ( 率 ) 對各種 CL 所做的圖示. 項目 xqo 2 就是圖 9.6 之直線 AB 的斜線 ( 率 ) (9.4) 式則可以寫成如下 CL= 1 ( dc L +xqo 2 )+C * (9.5) K L a dt 把 CL 對 (9.5) 式之 dcl/dt+xqo 2 來圖示 (plot) 時就可得到直線關係, 其斜線 ( 率 ) 則以 -1/K La 來表示即可知道, 此種關係則表示於圖 9.7 Dynamic method 與 static method 不同, 其優點是在實際之培養最旺盛時也可以進行測定 KLa, 可用於調查培養之各階段中 KLa 的差異 此種測定在短時間即可完成, 需使用膜電極, 但是在溶氧濃度增加之培養期, 此種方法則不能使用 當然在進行脫氧時, 其溶氧濃度不得低於其臨界濃度 Ccrit 假如溶氧濃度低於其臨界濃度 Ccrit 時就會影響比呼吸速度, 因再通氣時之 XQO 2 則不會呈一定 在脫氧途中之溶氧濃度降得太低是否使氧氣成為律速之條件, 則如圖 9.8 所示, 可從隨時間的經過之溶氧濃度減少是否失去其直線關係上來判定 圖 9.8 以 dynamic gassing out 法在測定 KLa 中可能發生氧氣不足的現象. 培養系之氧氣要求速度很大時, 要使培養中之溶氧濃度維持在 Ccrit 以上則非常困難, 此種培養, 其 K L a 可以測定的範圍則非常狹小 因此培養之氧氣要求速度與發酵槽之氧氣供給速度大約相等之呼吸旺盛的培養期中, 使 269

12 發酵工程的基礎 用此種方法是不合理的 此種方法另外, 在培養系之混合攪拌未達完全均勻混合時, 其測定結果, 不要忘記一定不能代表發酵槽之全體 排氣 gas 分析法 發酵槽之 KLa 是從發酵中的一定時間內, 直接定量被培養液吸入之氧氣量來求出 即在發酵槽中測定下列的參數 (parameter) (1) 發酵槽中之培養液量 (VL)(L) (2) 空氣入口與出口之正確的空氣流量 (Qi 與 Q0)(L/min) (3) 空氣入口與出口之正確的空氣壓 (Pi 與 P0)(atm) (4) 空氣入口與出口之絕對溫度 (Ti 與 T0)( O K) (5) 空氣入口與出口之氧氣的 mol 分率 (yi 與 yo) 氧氣移動速度則以下式來表示 (Wang 等,1979) OTR= (QiPiyi/Ti-Q0P0y0/T0) (9.6) V L 在此, 是,(60min/hr)[1mole/22.4L (STP)](273 O K /1atm) 之換算係數. 這些的測定則需正確的流量計 壓力計 測溫計器 氣相氧氣濃度分析器 ( 氣體分析器 參照第 8 章 ) 等 氧氣濃度分析器最好使用磁氣式者, 使用此種分析器, 可得到誤差在 1~2% 之分析精度 若知道 C L 與 C * 時, 依 (9.1) 就可求出 KLa OTR = K La (C * -C L) 或 KLa = OTR C * C L 則可用膜電極來測定, 而且此種測定, 只要測定在定常狀態之溶氧濃度即可, 並非測定其變化速度, 電極之應答時間則不會有問題 但是並非以一支電極以一點測定法來測定溶氧濃度, 是以數隻電極安裝在發酵槽內測定數點之溶氧濃度, 再取其平均值較好 C * 值與排氣 gas 氧氣濃度則有平衡關係, 認為相等的也很多 但是依 Wang 等 (1979) 說, 此種想法則適用於小型發酵槽, 在大型發酵槽中的情形,C * 值則需考慮空氣入口與出口之間的平衡 gas 壓, 因此他們在考慮發酵槽內移動之 gas 的舉動時, 則以求出雙重管內外中的流體, 與求取在其流動中之熱傳導溫度差的式子同樣, 應該使用溶氧濃度之對數平均值 C L 270

13 9 通氣與攪拌 OTR KLa= * * ( C C ) ( C C in L out L ) (9.7) C in C L ln ( ) * C C out * L 在此 Cin * 與 Cout * 是發酵槽中入口與出口之氣相氧氣分壓的平衡關係, 是其各別的溶氧濃度 (mmol/l) 排氣 gas 分析法是檢討培養系之 KLa 與通氣攪拌效果之最簡單的方法 亞硫酸氧化法或 static gassing out 法, 其測定系不僅與實際的培養系不同, 而且培養基也用完全不同之化學物質溶液來測定的問題 Banks(1977) 說, 以此種方法所得到之值與培養系所得到之值, 與所謂真的值是不同的東西, 這也許只適用於比較培養設備之差異 或運轉條件之差異的方法 但是此種情形也一樣, 在培養細菌或酵母含有菌體之培養液的流動學 (rheology) 則與培養基或亞硫酸鈉溶液之化學物質溶液幾乎相同的情況下, 才能這樣說, 如在培養絲狀菌或放線菌的情形, 其培養液之流動學 (rheology) 則與培養基極端的不同時則無法成立 Tuffile 與 Pinho(1970) 以具有黏性之放線菌培養液來比較檢討 static gassing out 法 dynamic gassing out 法 排氣 gas 分析法等之 KLa 的測定 他們的報告中說在 static gassing out 法中是否添加死菌體則沒有明記, 從其結果推測, 是添加死菌體所測定的結果 即與其他二種方法測定時之溶液的流動學 (rheology) 沒有很大的差異, 使用培養 90 小時之 Streptomyces aureofaciens 的菌體, 利用上述三種方法測定 300L 發酵槽之 KLa 則表示於表 9.3 中 表 9.3 以 300L 發酵槽培養 S.aureofaciens 90 小時之培養液的 KLa (Tuffile and Pinho,1970) Kla 測定法 氧氣要求速度 KLa (mmol/l hr) (hr -1 ) Static gassing out 法 Dynamic gassing out 法 排氣 gas 分析法 從表 9.3 中可知,static gassing out 法與 dynamic gassing out 法之間的 KLa 非常一致,dynamic gassing out 法與排氣 gas 分析法之間, 發現其氧氣要求速度 KLa 均有很大的差異 Tuffile 與 Pinho(1970) 說, dynamic gassing out 法顯示很低的氧氣要求速度, 是因在該測定中, 其培養液中含 271

14 發酵工程的基礎 有氣泡的關係, 因有氣泡殘留, 在停止通氣後之溶氧的減少, 並非表示溶氧直接被菌體吸入之純粹的氧氣要求速度, 可能是表示由氣泡的氧氣移動速度與菌之氧氣要求速度的差 在停止通氣後 15 分鐘左右, 已確認有大量的氣泡殘留 可能是此種原因, 在表面上使用很小的氧氣要求速度來計算時, 當然就會得到比實際更小的 KLa 依這些考察結果可知, 粘度較高之培養液利用排氣 gas 分析法來測定 KLa 較好 但是依 Tuffile 與 Pinho 的此種考察, 在以 dynamic gassing out 法來求出氧氣要求速度, 與不能用來求出氧氣要求速度之 static gassing out 法之間的 KLa 呈非常一致的關係, 故以排氣 gas 分析法測定氧氣要求速度時之實測的通氣攪拌條件, 套用於 dynamic gassing out 法之通氣條件來求出 KLa 時會如何, 很可惜沒有檢討 Heijgnen 等 (1980) 發現大的氣泡會很快的從發酵槽排出, 小的氣泡則在發酵槽內滯留較長的時間, 在黏度較高的培養液因有此種關係, 故其 KLa 之值則與非黏性液不同 將這些綜合加以考慮時, 認為排氣 gas 分析法是最優良的氧氣移動速度測定法, 使其測定在線上 (on line) 進行之通氣攪拌效果可以常時監視, 故其發酵槽之追加設備投資, 在其利益 (merit) 上是充分的可以平衡 Wang 等 (1979) 提議, 以本章開始所述之化學量論來求出 KLa 的方法, 依他們的方法, 培養系之氧氣吸收速度可以下式表示 Na = μx(k / /YO) (9.8) 在此,N a 表示氧氣吸收速度 ( 但是, 溶氧在臨界溶氧分壓以上之培養系時, 則與氧氣要求速度相等 ;mmol/hr),x 是菌體濃度 ( 乾燥菌體重量 ;g/l),yo 是有關氧氣之菌體轉換率 ( 氧氣收率 ;g/g),k / 是氧氣之分子量, 即 10/32 或 31.3 mmol/g Y0 則與前述之 Darlington(1964) Johnson(1964) Mateles(1971) 等之式子相同, 是從碳及氧轉換到菌體之化學量論來求出 不論如何, 他們的式子, 是限定在假設其生成物為菌體 CO2 H2O 等的條件下, 若有菌體外之生產物存在時則不適用 但是若以化學量論來表示其大約的實際情形時, 就能以 (9.8) 式所求出之氧氣要求速度來當氧氣移動速度, 因此 KLa 則可以下式表示 KLa= OTR ( C * ) C L 此種情形,CL 則用溶氧電極來測定 此種方法則非常簡單, 其適用範圍只限於表示培養之實際的化學量論 272

15 9 通氣與攪拌 模式 (model) 然而, 當要考慮培養系對 KLa 之影響時, 首先就需檢討被攪拌中之液體的性狀 溶液的流動學 (rheology) 溶液其黏性流是否依 newton 之法則而定, 流動學 (rehology) 的性質則區分稱為 newton 流體與非 newton 流體 現在以面積 A, 間隔 x 距離之二個平行之平面中所夾住的流體, 在下面之平面則以一定的速度, 一定的方向使移動時, 與其平面接近之流體, 則隨著平面往同方向移動, 其運動直接傳達到其上層部時, 運動之方向則不變, 但愈往上層其速度就會越慢 要表示黏性流之狀態的 newton 法則, 以速度斜線 ( 率 )dv/dx 流動之二個流體層, 在其間之界面作用的逆 ( 反 ) 力, 即其黏性力 F 則可以下式表示 dv F =μa dx (9.9) 在此,μ 是溶液的黏度, 與流動之流體的抵抗性相同的意思 (9.9) 式可改寫為 F / A μ= dv/dx 在此,F/A 稱為剪斷應刀 (τ), 每單位面積之應力,d v/d x 稱為剪斷速度 (γ), 即速度斜線 ( 率 ) 剪斷應力與剪斷速度之比就是黏度 Newton 流體, 以剪斷應力對剪斷 速度來圖示 (plot) 時可得到直線, 其斜線 ( 率 ) 就表示黏度 此種曲線圖 (graph) 稱為流動曲線 (rheogram)( 圖 9.9) 273

16 發酵工程的基礎 圖 9.9 Newton 流體之流動曲線. 圖 9.10 不同流動學性格之各種流體的流動曲線. Newton 流體其剪斷速度不管如何, 其黏度則一定, 因此表示 newton 流體特性的培養液, 其黏度不受攪拌強度而改變 但是黏性流不依 newton 法則之非 newton 流體的情形, 黏度就不會一定, 會隨著剪斷速度而變化, 此種培養液之黏度會隨著攪拌強度而變化 因此非 newton 流體之黏度則稱為表面的黏度 (μa) 非 newton 流體之剪斷應力與剪斷速度之關係, 與圖 9.9 所表示者應該不同 有幾個非 newton 流體之特性也很清楚, 其中在檢討培養液之流動時, 認為很重要之代表的流動曲線則表示於圖 9.10, 其性質則如下所述 Bingham 塑性 Bingham 塑性是類似 newton 流體, 只有在其剪斷應力到達某種界限值為止是不發生流動的地方不同, 此種剪斷應力之界限值叫剪斷應力的降伏值 τo, 剪斷應力一旦超過界限值時, 剪斷應力與剪斷速度之關係就成直線, 其直線的斜線 ( 率 ) 就稱為剛性係數或塑性黏度, 即表示 Bingham 塑性之流體的流動則以下式表示 τ = τo +ηγ (9.10) 在此,η 表示剛性係數,τO 表示剪斷應力之降伏值 依 Deindoerfer 與 Gaden(1955) 說,Penicillium chrysogenum 之培養液是呈 Bingham 塑性 依 Sato(1961) 說, kanamycin 發酵 broth 之流動學 (rheology) 的性質也可處理成 Bingham 塑性 擬塑性擬塑性之流體, 其表面 ( 外觀 ) 黏度會隨剪斷速度之增加而減少, 高分子化合物幾乎全部都顯示擬塑性, 在高剪斷速度其表面 ( 外觀 ) 黏度會減少, 因在此種條件下, 呈很長的分子排列排成整齊的序列, 使變成容易流動 擬塑性之流體的流動可以下式表示 τ = K(γ) n (9.11) 在此,K 表示黏稠度,n 是流動指數 K 與黏度相同有大小 (dimension), 與剪斷速度為 1 時之表面 ( 外觀 ) 黏度相同的意思 流動指數是無次元 ( 因次 ) 之常數, 表示在流動曲線上其直 274

17 9 通氣與攪拌 線性消失的程度,n 愈小則離 newton 流體之性質 ( 直線 ) 越遠, 把 (9.11) 式轉變成對數時, 就成為, log τ = log K+n long γ (9.12) 以剪斷應力之對數對剪斷速度之對數來圖示 (plot) 時就可得到直線, 其斜線 ( 率 ) 會使流動指數, 在剪斷應力之對數軸斷面給予黏稠度的對數 Tuffile 與 Pinho(1970) 以二種 Streptomyces sp. 之培養液來檢討, 在培養之後半期, 任一種均顯示擬塑性 Deindoerfer 與 West(1960) 說, Penicillium chrysogenum 之培養液 (broth) 也有擬塑性, 此與前面 Deindoerfer 與 Gaden (1955) 所得到之結果不一致 Taguchi 等 (1968) 也報告,Endomyces 之培養液會顯示擬塑性 Dilatant 表示 dilatant 之流體, 其表面 ( 外觀 ) 的黏度, 會隨著剪斷速度之增加而增加 Dilatant 流體之流動則與擬塑性同樣的以 (9.12) 式來表示 只是在此種情形, 流動指數在 1 以上, 比 1 愈大就會離 newton 流體越遠 即 dilatant 也同樣以剪斷應力之對數值對剪斷速度之對數值來圖示 (plot), 再從中可以求出 k 與 n Casson 體 Casson(1959) 說表面 ( 外觀 ) 的黏度會隨著剪斷速度之增加而減少之點則與擬塑性相似, 具有剪斷應力之降伏值 (yield valve) 之點則與 Bingham 塑性類似的非 newton 體, 將其定義為 casson 體 Casson 體之流動特性則以下式表示 τ = τ 0 +Kc γ (9.13) 在此,Kc 表示 casson 黏度 將 τ 對 γ 來圖示 (plot) 時就可得到直線, 其斜線 ( 率 ) 則為 casson 黏度, τ 軸之斷面則表示 τ 0 Roels 等 (1974) 說 penicillin 發酵 broth 能以 casson 體加以整理得很好 因此, 要確認流體之流動學 (rheology) 時, 一定要利用迴轉黏度計來取得廣範之剪斷速度下的資料 (data), 作成流動曲線 但對有菌絲存在的系則有其特別困難的地方, 對含有菌絲之培養系的流動學 (rheology) 有關的問題則由 Metz 等 (1979) 加予詳細的檢討過 275

18 發酵工程的基礎 影響發酵槽之 KLa 的各種因子影響發酵槽之 KLa 的各種因子, 已知的則很多, 如通氣速度 攪拌強度 培養液之流動學 (rheology) 消泡劑之存在等 在 scale up 時, 以小的 scale 來確認之最適 KLa, 要能使其 scale 到大的 tank 給以確保的事最為重要 從不同 scale 的 tank 要取得相同的 KLa 時, 雖然是很大的 tank, 也要改變各種的運作條件同時加以測定其 KLa 但是把運作條件之變化與 KLa 之變化的關係給予定量化, 要取得特定之 KLa 所需之運作條件則無法預測, 因此在發酵槽之 scale up 或在設計時對該問題應如何處理則比較重要 通氣速度對 KLa 之影響 如圖 9.11 所示, 固有型之發酵槽圖 9.11 通氣速度對通氣攪拌槽之, 其 KLa 受通氣速度的影響則比較小 KLa., 單位培養基液量, 每一分鐘之通氣量會離開 0.5~1.5vvm 之範圍的情形則很少 假如通氣量要過大時, 就發生氣泡之溢流 (flooding) 而使氧氣移動速度變得非常小 所謂 flooding 是通氣量變得太大而使攪拌機之翼如在氣相中迴轉, 而使氣體無法溶入溶液中的現象 容積通氣速度 vvm 在 scale up 時, 一般都維持原狀一定不加以變化的情形較多, 但是採用此種方法時則有可能使發泡性變激烈, 何以如此呢, 因空氣可以在培養液上面之自由表面排出, 自由表面會依空氣而呈二次方的增加, 通氣量可達三次方故只要微弱之通氣量的增大, 就會導致每單位之自由表面之泡沫發生的增大 部份的研究者推薦使表面 ( 外觀 ) 之空氣線速度維持在一定條件下來 scale up 的方法 即表面 ( 外觀 ) 的空氣線速度則如下所示 ( 通氣量發酵槽斷面積 ) 但是若採用此種 scale up 法時, 在很大的槽中其通氣量就會很小, 很容易造成氧氣不足 因此在很多的情況, 在發泡不會形成很嚴重的程度 276

19 9 通氣與攪拌 下, 使其通氣量也隨之 scale up, 採取折中的方案 攪拌強度對 KLa 的影響已知攪拌強度對發酵槽之氧氣移動速度會造成很大的影響 Banks(1977) 把攪拌與氧氣移動的關係整理如下 (1) 由攪拌使分散在培養液中的氣泡分斷成很小, 使與氧氣移動有關的表面積增大 (2) 由攪拌使在液中之氣泡的逸散延遲 (3) 由攪拌來防止氣泡彼此間形成結合體 (4) 由攪拌使培養液形成渦流, 減少氣液境膜之液膜的厚度 攪拌強度的測定是在測定攪拌培養液時其消費的動力, 消費動力則利用安裝在攪拌機軸 (shaft) 上之張力錶 (strain gauge) 來測定 也可以用電力計來測定攪拌機馬達 (motor) 之電力消費量 ( 第 8 章 ) 但是以電力消費量來測定攪拌強度之方法只適用於大型槽 (tank) 的情形 把消費動力 ( 攪拌強度 ) 與 KLa 之關係加以處理, 在發酵槽之設計或 scale up 時, 要取得最適 KLa 所需的攪拌強度, 已知有幾種數學的預測方法 但是此種方法只限於以 newton 流體所得到的關係式, 對一般之培養液的非 newton 流體, 則不一定適用 1. KLa 與消費動力之關係 Cooper 等 (1944) 以具有一段翼之攪拌機, 容量在 66 L 以內, 很多的通氣攪拌槽之 KLa 則利用亞硫酸氧化法來測定, 而得到下列的關係式 KLa=k( P Vg ) 0.95 Vs 0.67 (9.14) 在此,Pg 表示通氣攪拌槽之消費動力量,V 為槽內的液量,Vs 是表面 ( 外觀 ) 的空氣線速度, 有下式的關係 k 為常數 通氣量槽斷面積 由 (9.14) 式,KLa 值大約會與每單位液量之通氣時的消費動力量成比例 但是 Bartholomew(1960) 說, 此種關係會依 tank 之規格 (scale) 的不同而異, Pg/V 之指數則應依 tank 之 scale 來如下的加以改變 277

20 發酵工程的基礎 Scale 指數 Lab 用 minijar 0.95 Pilot 用 jar 0.67 生產設備用 tank 0.5 但是,Bartholomew 所用的 tank 是具有數段翼之攪拌機,Cooper 等所用之 tank 則為具有一段翼的 tank, 二人所用的不同 因要使氧氣移動, 上段翼比下段翼要消費更多的動力, 這個會影響 Bartholomew 所求出之指數的值 Richards(1966) 說 KLa 與單位液量之消費動力的關係, 除到目前為止所談過之 parameter 以外, 還含有其他更多的 parameter, 可以式子表示之複雜的東西, 此種 parameter 就是攪拌翼之迴轉速度 大小 培養液之流動學 (rheology) 表面 ( 外觀 ) 的空氣線速度等 Richards 把 KLa 與這些 parameter 之關係用下式來表示 KLa (Pg/v) 0.4 Vs 0.5 N 0.5 (9.15) 在此,N 表示攪拌機之迴轉速度 Richards 以此種半實驗式把自己的資料 (data) Cooper 等的結果 亞硫酸鈉氧化法所取得之很多的資料 (data) 等, 針對各種大小之槽或運作條件, 加以解析所得到的結果, 發現雖然不能說有好的對應關係, 但可以獲得能接受的直線關係 Taguchi 等 (1968) 對會呈現非 newton 流體之擬塑性舉動的 Endomyces 培養中, 裝載 20~30m 3 液量在運作時, 調查其 KLa 與消費動力之關係, 他們將該培養之 KLa 與消費動力之關係用下式來表示 KLa=k P V 033. g Vs 0.56 (9.16) Steal 與 Maxon(1962) 對流動學 (rheology) 顯示 Bingham 塑性之 novobiocin 生產株 Streptomyces niveus, 調查其培養之消費動力與氧氣移動速度的關係時, 得到下列的關係式 KLa =kpg 0.45 (9.17) 278

21 9 通氣與攪拌 但是在其各別之消費動力所得到的 KLa, 在其發酵槽直徑與攪拌翼直徑比之間, 並無關係, 發現在相同消費動力下, 反而攪拌翼較小這邊的氧氣移動較好 Steel 與 Maxon 則把其理由解釋為, 非 newton 流體之氣泡則不像 newton 流體的情形那麼容易結合成結合體, 因此非 newton 流體之攪拌的主要作用, 是在高剪斷速度之條件下使形成小氣泡, 另外 newton 流體的情形, 攪拌的主要作用是使產生氣泡同時要防止氣泡彼此間結合成結合體, 此種情形, 力的傳達比剪斷速度來得重要 此種想法, 在氧氣移動速度與攪拌翼直徑沒有關係下, 是支持翼周速度可以加以處理的事實 OTR = k / (S) 1.6 (9.18) 在此,S 為翼周速度, 與 πnd (N 為迴轉數,D 為翼直徑 ) 相等, 以 m/sec 來表示的情形較多 k / 為常數 在此消費動力與 Kla 之關係則用翼周速度與氧氣移動速度之關係來表示的新想法 如此就不僅以消費動力來當攪拌強度的指標, 只要認定有可以測定之相關 parameter 時, 這些均應被做為檢討的對象是很重要的 在氧氣移動速度與翼周速度具有良好對應之事實時, 就是以非 newton 流體之培養液也一樣維持其翼周速度一定, 就可以推測能使其達到保持通氣攪拌效果在相同水準 (level) 依 Wang 等 (1979) 說, 大部份的企業, 在 scale up 時, 不只是採用大概的 Kla, 在大的槽則採用配合槽的直徑, 使決定翼直徑之翼周速度維持一定的 scale up 法 從這些檢討的結果, 可以清楚知道通氣攪拌槽之 KLa, 會受攪拌之消費動力, 即受攪拌強度的影響很大 所有規格 (scale) 均能適用之 KLa 與消費動力之關係是無法導出的 但在某種範圍之條件下則可以導出成立其關係 考慮消費動力與 KLa 之關係可以存在時, 其次重要的工作就是要調查與消費動力有關之各種操作變數的關係 調查消費動力與這些操作變數之定量的關係, 是使合於下列目的所需要的 (1) 推定在某種條件下之攪拌機所消費之動力的總量, 可當作發酵槽之設計值 (2) 在不同規格 (scale) 之槽中, 若能給予相同程度之消費動力時, 結果就可以使其攪拌強度, 即 KLa 相同 2. 消費動力與操作變數之關係 Rushton 等 (1960) 對於具有阻擋板之攪拌槽的消費動力與操作之變數的 279

22 發酵工程的基礎 關係, 利用次元 ( 因次 ) 解析的手法來調查, 依他們的說法, 無通氣之 newton 流體, 其攪拌時的消費動力, 則由下式所給予之動力數與所定義之無次元項來表示 Np= P ρn 3 D (9.19) 5 在此,NP 為動力數,P 是由攪拌機所給予的動力,ρ 為流體密度,N 為攪拌機之迴轉數, D 為攪拌機翼直徑 因此, 動力數則由外部所加的力 ( 外力,P) 與液體內部被傳達之力 ( 慣性力,ρN 3 D 5 ) 之比所構成 攪拌之某系液體的流動, 也可用別的無次元數 ( 無因次數 ) 之某 Reynolds number 來表示, 此為慣性力與黏性力之比 NRe= ρ D 2 N (9.20) μ 在此,NRe 為雷諾數,μ 為流體之黏度 另外, 還有一個無次元數之 Froude number 是慣性力與重力加速度的比, 以下式來表示 NFr= ND g 2 (9.21) 在此,NFr 表示 Froude number,g 為重力加速度 Rushton 等 (1950) 把動力數當 Reynolds number 與 Froude number 之函數, 清楚的可以下式來表示 Np = c (NRe) x (NFr) y (9.22) 在此,c 是不依槽之大小而是依形狀所決定的常數,x 及 y 為指數 但是阻擋板能有效完全混合之攪拌槽, 重力效果會變成最小, 其動力數與無次元數之關係的 (9.22) 式, 結果就變成 Np = c (NRe) x (9.23) 把 (9.19) (9.20) 式代入上式, 則可得到下式 P ρn 3 D =c( ρ D 2 N ) x 5 μ (9.24) 280

23 9 通氣與攪拌 對 N D μ ρ 之各種數值的 P 值可用實驗來求出, 然後可以計算出在各實驗條件下之 Reynolds number 以及動力數 將 Reynolds number 之對數值對動力數之對數值所圖示 (plot) 的東西稱為動力曲線 具有平翼渦輪之攪拌翼, 及具有阻擋板之攪拌槽的動力曲線則示於圖 9.12 圖 9.12 平翼渦輪 具有阻擋板之攪拌槽中的動力曲線 該曲線所表示的關係則與槽的大小無關, 只依幾何學的相似性來決定 從該圖可知, 動力曲線則明顯的可區別為三個區域, 然後, 各個流體之流動的差異則如下加以說明 (1) 層流或黏性流之領域, 該領域其動力數之對數值會隨著 Reynolds number 之對數值的增加呈比例的減少 曲線圖 (graph) 之斜線 ( 率 ) 則等於 (9.24) 式之指數 x 為 -1 該領域之消費動力則成為液黏度之函數[ 即消費動力會隨液黏度之變動而變動 ],Reynolds number 則在 10 以下 (2) 變遷期之領域, 該領域則看不見動力數與 Reynolds number 之間一貫的關係 x 值 ( 即, 曲線圖之斜率 ) 不會一定,Reynolds number 則在 10~10 4 之間 (3) 亂流域, 在此動力數與 Reynolds number 之間無關係故呈一定, 因此 x 在 0 時 Reynolds number 是在 10 4 以上 把黏性流與亂流域之指數 x 的值代入 (9.24) 式時, 各別可得到下式 黏性流則為 p = cμn 2 D 3 (9.25) 亂流則為 p = cρn 3 D 5 (9.26) 由這個式子, 在黏性流領域中其消費動力只受黏度的影響, 另外亂流域則因攪拌機之迴轉數的增加 攪拌翼之直徑增大時, 比黏性流要傳達更大的動力到流體中, 這些都可以讀取 發酵工程中培養液會呈現黏性流的 281

24 發酵工程的基礎 情形則很少, 大部份的培養液在變遷期都呈現亂流域的性質 假如判斷培養液是呈現亂流域時, 則依 (9.26) 式就可預測其消費動力, 槽的大小改變時也一樣, 可以決定要取得同一種攪拌條件之操作條件, 關於這方面則有 Banks(1979) 的總論, 小型發酵槽之消費動力則以下式表示 Psm=cρN 3 smd 5 sm (9.27) 然而, 大型發槽則為, PL=cρN 3 LD 5 L 在此, 下註文字 sm 與 L 是區別小型與大型的記號 要使單位液量之動力相同時, 則為, P P sm L = V V sm L 3 cρ N = cρ N 在此,V 表示液量 sm 3 L D D 5 sm 5 L (9.28) 發酵槽若具有幾何學之相似性的話,c 則與發酵槽之規格 (scale) 無關 會相同, 若屬相同之發酵的話, 培養液 (broth) 的性狀則不變, 故 ρ 也相 同, 因此就可得到下式 V V sm L = N N 3 sm 3 L D D 5 sm 5 L (9.29) 因具有幾何學之相似性, 故會成立下列關係 D D sm L =( V V sm ) 1/3 將此代入 (9.29) 式時就成為, L NL=Nsm( V V sm L ) 2/9 (9.30) 假如, 培養液顯示變遷期之性質的話, 必須透過所預想之運作條件, 全部作成動力曲線, 關於這部份則在本章後述 Rushton 等 (1950) 之研究則使用無通氣之液體, 但實際上大部份的發酵都有進行通氣 通氣中的液體給予攪拌時之消費動力量, 比無通氣時要小是眾所週知的事 這是因通氣中之液體含有氣泡, 比無通氣之液體的密度要低的關係 Oyama 與 Endoh(1955) 調查攪拌槽中之通氣與消費動力的關 282

25 9 通氣與攪拌 係, 通氣狀態之消費動力與無通氣狀態之消費動力的比, 提出以通氣數 Na 之無次元數 ( 無因次數 ) 來表示的概念 P g =ƒ(na) (9.31) P 在此,P 與 Pg 則各別表示無通氣狀態之消費動力與通氣狀態之消費動力 V sm Na= ND (9.32) Michel 與 Miller(1962) 說, 要使攪拌翼周速度或翼直徑之操作變數廣範圍的變化時, 通氣數則會顯示有效的指標 他們在亂流域中, 導出可使運作條件能廣範圍成立之通氣攪拌系的消費動力量實驗式 Pg=k ( P 2 ND 3 ) 0.45 (9.33) 056. Q 在此,Q 表示通氣速度,k 是依發酵槽之形狀所決定的常數 該式是對亂流域之流體, 可以有效的推定其通氣攪拌系的消費動力量 例如在不含菌絲之培養系也一樣, 如對槽內培養基進行殺菌時, 在無通氣狀態要進行攪拌時, 攪拌動力則需非常大的事是不要忘記 因此, 在設計槽時必須設置具有足夠之攪拌機馬達 (motor) 使能耐無通氣時之攪拌, Banks(1979) 一面參考 Michel 與 Miller 之結果來改良 Rushton 之式子, 導出更實用的式子, 其結果已非常的近似 到目前為止所敘述的事, 會直接影響 KLa 之消費動力與攪拌強度, 將其有關之操作變數可以加以處理的方法已知是存在的 但是此種方法只適用於 newton 流體, 無法直接應用於非 newton 流體 非 newton 流體沒有一定的黏度, 要決定流體黏度之關係式是無法明確的問題 此種問題, 在發酵中其攪拌能常時維持在亂流域的話, 消費動力就與 Reynolds number 無關, 對液體的黏度就沒有依存性, 就可以解決 但是大部份含菌絲的培養液都是高黏度, 要使液體在完全亂流域進行攪拌幾乎是不可能, 此種培養液普通會顯示變遷域之流動特性, 需要掌握操作變數與消費動力之關係來作成動力曲線 非 newton 流體之黏度會受剪斷速度的影響, 在攪拌翼近旁之剪斷速度會比槽之其他部份的剪斷速度要大, 因此非 newton 流體培養液之黏度在發酵槽中不會變成均勻 因此, 使得培養液之黏度無法固定, 結果就無法求出攪拌翼之變形 Reynolds number Metzner 與 Otto(1957) 為了要解決這個問題, 則如下式所示導入與槽之攪拌機周速度成比例之平均剪斷速度 (γ ) 283

26 發酵工程的基礎 的概念 γ = k N (9.34) 在此,k 是表示比例常數 他們用具有一塊平翼渦輪及附有阻擋板之普通的發酵槽, 其擬塑性之流體的 k 為 13 另外數位研究者也在各種的操作變數下來測定此種比例常數, 大都分佈在 10~13 之間 Metzner 等 (1961) 在此採取折中的方式在計算中則用 11, 使誤差變小, 省掉在不同條件下一一的來測定 k 的時間 因而依此, 只要知道培養液之流動學 (rheology) 的話, 從流體之表面 ( 外觀 ) 黏度的平均值, 就可以求出與攪拌翼之各種迴轉速度對應之攪拌翼的變形 Reynolds number, 再由此就能作成動力曲線 然後, 再利用該動力曲線, 推定使達到相同單位液量之消費動力的發酵槽所需動力, 或進行在 scale up 上所需的計算 如 Banks(1977) 所指出的,Metzner 與 Otto 之該理論是無法適用於發酵系, 雖沒有明確的理由, 但幾乎也沒有看到應用在培養系中的報告 這是有點奇妙的事, 這可能是因對非 newton 流體之培養液的流動學 (rheology) 有關的知識還未很充足, 該問題未到達能充分解決時, 此種方法可能無法廣範被適用於實際的培養系 對非 newton 流體之通氣, 其攪拌系的消費動力, 幾乎尚未進行研究 非 newton 流體的情形也一樣, 進行通氣時對其消費動力就會變小之事已很清楚, 關於其定量方面有關的報告例子則幾乎沒有 Taguchi 與 Miyamoto (1962) 對於會顯示擬塑性之 Endomyces 培養液的消費動力, 則利用 Michel 與 Miller(1962) 之通氣系的攪拌動力消費解析法來檢討, 他們說非 newton 流體也一樣, 在亂流域中該理論則適合, 但在黏性流, 變遷期則不適用 因此該方法對不會形成亂流域之高黏度的非 newton 流體則不適用 培養基與培養液之流動學 (rheology) 對 KLa 的影響 如前節所見, 培養液之流動學 (rheology) 對 KLa 與攪拌強度之關係會有顯著的影響 因此在本節則考慮, 培養基或培養液之流動學 (rheology) 對培養之氧氣移動會有什麼樣的影響 所謂發酵液 (broth), 在其中首先是由菌在液體培養基中生長產生菌體, 再由該菌生產其能生成的生產物, 因此, 培養液的流動學 (rheology) 首先最初是受培養基組成的影響很大, 接著菌體產生, 再受其濃度 生產物等的影響, 因此發酵 broth 之流動學 (rheology) 依發酵種類之不同則有很大差異, 同時依培養的 phase( 時間 ) 也會有很大的變化 284

27 9 通氣與攪拌 1. 培養基的流動學 (rheology) 發酵培養基常常會以澱粉當碳源, 這會使培養基黏度提高成為非 newton 流體的原因 但是菌開始生長時澱粉被分解, 黏度就降低使培養基的流動學 (rheology) 發生變化, 此種澱粉培養基之變化,Tuffile 與 Pinho(1970) 則以 Streptomyces aureofacien 的情形來處理 在接種菌之前, 培養基具有明顯之剪斷應力的降伏點 (yield point), 顯示 Bingham 塑性之性質, 表面 ( 外觀 ) 黏度約 18 pseudo poise( 註解 :Tuffile 與 Pinho 對表面黏度之單位所下的定義, 原來與 poise 相同是 g/cm sec), 培養 22 小時之後, 因菌之作用而使黏度降到數 pseudo poise, 培養液的流動學 (rheology) 則接近 newton 流體, 以後由於菌絲的增多而使表面黏度慢慢上昇, 最高可達 90 pseudo poise, 培養液的流動學 (rheology) 則會顯示成擬塑性 從此例可知, 由培養基所形成之培養液的流動學 (rheology) 的性質, 與其後面菌絲生長後之變化來相比時其作用很小, 尤其在培養初期培養系對氧氣要求速度也很小, 對其發酵可以認為幾乎沒有影響 2. 菌體對 KLa 之影響菌體的濃度或形態對氧氣移動速度會造成重大的影響, 大部份之細菌或酵母的發酵是屬低黏性 因此這類液體是顯示 newton 流體之亂流域的性質, 氧氣移動速度與流動學 (rheology) 之問題可以比較簡單的加以處理, 但是對絲狀菌或放線菌似的非 newton 流體之培養液, 在氧氣供給上會造成很多困難的情形, 此類發酵之生產物生產性很容易受氧氣供給的律速 Banks(1977) 對單細胞微生物與形成菌絲之微生物, 如圖 9.13 所示, 在其氧氣吸收上會有很大的差異 從對數增殖期起到達氧氣成為律速的菌體濃度, 不論單細胞微生物或會形成菌絲之微生物都一樣在其氧氣吸收上幾乎都看不出有差異, 但是在氧氣供給成律速進入比例增殖期時, 單細胞微生物之氧氣吸收速度能保持一定, 而菌絲形成微生物則會慢慢的減少 依 Banks 說, 這是可由菌絲的濃度變高, 培養液之黏度增大等現象來說明 285

28 發酵工程的基礎 圖 9.13 氧氣供給律速對培養系之氧氣消費速度的影響 (Banks,1977) (a) 細菌發酵的情形,(b) 絲狀菌發酵的情形 分數個組 (group) 檢討菌絲存在下對氧氣移動速度之抑制影響, 以定量的來進行檢討, 表示於圖 9.14 中的是其中由 Deindoerfer 與 Gaden(1955) 調查 Penicillium chrysogenum 之菌絲對 KLa 之影響所得的結果 圖 9.14 Penicillium chrysogenum 菌絲對攪拌槽之 KLa 的影響 (Deindoerfer and Gaden,1955). Steel 與 Maxon(1966) 調查 Streptomyces niveus 之 novobiocin 發酵時, 其菌絲的菌塊與氧氣供給的關係, 發現該發酵在 60~80% 之高溶氧水準 (level) 下也會發生氧氣供給不足的現象, 因此他們認為在該發酵之氧氣供給律速階段並不像單細胞微生物在氧氣溶入液體的階段, 而是在氧氣被細胞吸收的階段 另外他們發現在相同的單位動力下, 小型攪拌機使氧氣 286

29 9 通氣與攪拌 從氣相移動到菌絲上的效果比大型攪拌機要好 Wang 與 Fewkes(1977) 也確認過 Steel 與 Maxon 的結果, 發現 S.niveus 之培養的臨界溶氧濃度受到攪拌強度與攪拌翼之大小的影響而變化 依此種結果他們也認為該菌之氧氣移動的律速階段是在氧氣要移動到菌體表面時 Wang 與 Fewkes 利用此種結果來調查攪拌機的能力對亂流剪斷應力與吐出之性能的關係 亂流剪斷應力是會與 N 2 D 2 成比例的函數, 吐出之性能則會與 ND 3 成比例的函數 (N 是攪拌機迴轉速度,D 是攪拌翼直徑 ), 因此亂流剪斷應力與吐出之性能的比則會與下列的項目成比例 2 2 N D ND 3 或 N D (1/cm sec) 圖 9.15 S.niveus 之臨界氧氣濃度對亂流剪斷應力與吐出性能比的影響 (Wang and Fewkes,1977). 如圖 9.15 所示, 該系之表面的臨界溶氧濃度, 其亂流剪斷應力與吐出之性能的比, 從 0.2 到 1.0(cm/sec) 之間隨著其增加而呈對數的減少 因此, 亂流剪斷應力與吐出之性能的比要增加的話, 氧氣向菌體移動的抵抗就會降低, 在很低之溶氧濃度下也可以維持足夠的呼吸活性, 可以如此來解釋 依 Wang 與 Fewkes 的解析, 在 S.niveus 的培養中, 小型攪拌翼給予對菌體之氧氣移動會有良好的結果, 這是對 Steel 與 Maxon 之結果給予定量化的結果, 這個在上式可以看到,D 在較小時其亂流剪斷應力與吐出之性能的比會變大的地方是可以理解 Wang 與 Fewkes 之關係式, 在含菌絲之培養液呈現擬塑性的時候特別有 287

30 發酵工程的基礎 效 呈現擬塑性之培養液的黏度會隨其剪斷應力的增加而減少, 在離開攪拌機翼位置愈遠部位之培養液的黏度就愈高 發酵槽內給予通氣時, 在充分被攪拌之黏度較低的中心部份, 其抵抗變得最小, 使空氣全部由此通過, 在槽內就會有部份之流動變遲鈍, 有氧氣不足之部份發生, 因此攪拌系統 (system) 需使液體全部形成均勻的亂流, 使氧氣均勻的溶入液體, 同時需使形成高剪斷應力之領域, 也要使培養液之循環正確的進行, 使保持足夠之吐出的性能 Wang 與 Fewkes 之關係式, 可用來檢討此類的培養系 Legrys 與 Solomons (1977) 使用下段為圓盤渦輪 上段為彎曲平翼渦輪之具有二段攪拌機的槽, 檢討含菌絲培養中之氧氣移動速度與吐出之性能的關係, 下段之圓盤渦輪使形成亂流域, 上段之彎曲平翼渦輪促使加速攪拌速度, 槽中的完全混合在 20~30 秒就能達成 如此來防止菌絲停留在氧氣不足的狀態, 而使氧氣可以跑到槽的整個部位 如第 6 章所述, 在深部培養中的菌絲, 能在培養基中均質的分散成紙漿 (pulp) 狀的東西, 而到會形成菌絲塊之 pellet 各種情形都有 據 Deidoerfer 與 Gaden(1955) 說, 變成紙漿 (pulp) 狀者其黏度會變高容易變成非 newton 流體, 變成 pellet 狀者是低黏度, 容易變成 newton 流體 據 Metz(1979) 說,pellet 狀之培養液也有形成非 newton 流體的情形, 此種情形也是容易使黏度降低 如此在深部培養之菌的形態也會對培養液的流動學 (rheology) 給予很大的影響, 當然氧氣移動效率也會受到這些菌之形態的影響 Carilli 等 (1961), 以 300L 之槽來培養 Penicillium chrysogenum 與 Aspergillus niger, 調查菌之形態的不同與通氣攪拌效果的關係, P.chrysogenum 之二種的菌, 即一種菌之菌絲很短分枝很多, 另一種是菌絲很長分枝很少的菌所比較的結果, 菌絲很短分枝很多之菌的培養液, 其黏度較低, 菌絲很長分枝很少之菌, 其培養液的黏度較高, 在黏度低的培養液中顯示其氧氣移動速度約黏度高的 2 倍,A.niger 則由 Carilli 等成功的以改變培養條件的方法使培養成紙漿 (pulp) 狀與 pellet 狀的菌, 發現 pellet 狀之菌的培養液, 其黏度為紙漿 (pulp) 狀菌之培養液的 1/2, 因此在培養初期或在菌呈 pulp 狀生長的時期, 發現很容易造成氧氣供給的律速 確實, 在 pellet 狀的生長, 容易形成亂流域之低黏度的 newton 流體的培養液,pellet 太大也會發生氧氣供應的問題 在大的 pellet 中, 內部很緊密的話, 其中心部份不受由攪拌所形成之亂流域的影響, 氧氣則只靠擴散使滲透到 pellet 內部,pellet 之中心部份當然就呈氧氣不足的狀態, 因此要使 288

31 9 通氣與攪拌 pellet 之中心部份也能保持最適氧氣濃度時, 需使其具有足夠的濃度斜率 ( 梯度 ), 足夠的使氧氣擴散到中心部份 Kobayashi 等 (1973) 認為 A.niger 之 pellet, 要以相同的比氧氣要求速度使其滿足的話, 較大之 pellet 會比小的 pellet 需要更高的溶氧濃度,pellet 中變成氧氣供給律速時, 就會只有 pellet 之外側的菌對發酵有貢獻, 內部之菌就會容易發生自己消化的可能性很高 Righelato(1979) 檢討菌絲之形態對培養液的流動學 (rheology) 與氧氣移動的影響, 深部培養時最希望的菌絲生長形態為呈分散而菌絲很短者, 此種情形的培養液比 pellet 的情形較不會有氧氣之擴散滲透的問題, 而且比長菌絲之 pulp 狀較不會造成高黏度的培養液 攪拌強度對菌的形態也會有影響, 在此種意義上, 以此來當控制 (control) 培養液之流動學 (rheology) 的手段也可以 依 Metz 與 Kossen(1977) 之說法, 以很強的攪拌來防止胞子凝集所造成的 pellet 另外他們說很強的攪拌會影響 pellet 之生長及其內部構造, 就是形成 pellet 的話也會很小, 而形成菌絲密度很高的 pellet 依 Ziegler 等 (1980) 說, 管狀環 (tubular loop) 型之培養槽使形成很高的剪斷速度時, 會抑制菌絲之菌絆 (clamp) 形成, 因此剪斷應力也同時會影響 pellet 之形成及其生長, 故剪斷速度可成為其調節的因素 但是, 希望做成呈分散狀之短菌絲而不要很長之 pulp 型菌絲, 來使剪斷速度增加時, 只有少數的例子 (case) 成功而已 Dion 等 (1954) 說, Penicillium chrysogenum 之菌絲的形態會受攪拌強度的影響, 在高攪拌速度時會形成具有短分枝的菌絲 低速度時會形成長的菌絲 Katinger(1977) 說, 給予菌絲很大的剪斷速度使形成短的菌絲時, 菌絲被打碎要大於菌絲被打斷的感覺 Van Suiydam 與 Metz(1981) 調查剪斷速度對 P.chrysogenum 之菌絲長度的影響, 要使菌絲確實的變短時需給予很大的動力, 以此種方法使含菌絲之培養液的黏度降低並非實用的 Righelato(1979) 認為很難以剪斷應力來使菌絲崩壞, 認為由自己消化或一部份菌絲的溶菌是比較重要的調節因子, 即他說, 菌絲之形態變化無法以物理的因子來制御, 而是屬遺傳水準 (level) 的問題 Kuenzi(1978) 報告, 以 Cephalosporium 之數種變異株培養在相同的條件下, 其黏度會有 7~8 倍的差異, 但對培養液中之菌的形態則沒有提到, 因此在此種情形其形態變異與液體黏度之間的關係, 什麼也沒有發現, 要如何分離所希望之形態的菌, 其育種方法已在第 3 章詳述過 289

32 發酵工程的基礎 另外, 依 Kuenzi(1978) 說,Cephalosporium 之培養液的黏度, 在 27 培養時比在 25 培養的要低很多, 在高的培養溫度下使菌絲分斷成很小, 在低溫培養時則長得很長使培養液的黏度提高, 在相同的設備下, 與在高溫培養比較時其氧氣的供給也變成較困難 有數位研究者認為要使含菌絲之培養液黏度降低的方法, 考慮在培養後半期以水或培養基來稀釋培養液 Sato(1961) 說會呈現 Bingham 塑性之 kanamycin 發酵的收率, 在其培養液中加入 5% 滅菌水而使其收率提高 20 % Taguchi(1971) 也一樣在 Endomyces 之培養上, 在培養液中加入 10% 之水或新培養基而使其黏度降低 50% Blanch 與 Bhavaraju(1976) 提出在模式 (model) 發酵系中抑制黏度與溶氧濃度的方法, 據他們的方法, 當溶氧濃度下降到接近臨界值時, 從發酵槽中取出一定量的培養液, 並以新培養基置換之, 然後一面測定培養液之溶氧濃度與黏度, 此種置換反覆操作使培養系不會發生氧氣律速 如此就能使培養液之黏度維持在會發生氧氣供給律速以下的值 據 Kuenzi(1978) 說, 在培養 Cephalosporium 時, 以非常慢的速度來流加 (feed) 培養基時, 菌會形成長的菌絲而使粘度上昇, 造成無法充分通氣的例子 此種情形也可以第 2 章所述之流加培養來控制 (control) 其工程 (process) 3. 發酵生產物對通氣攪拌效果之影響一般而言, 發酵生產物會影響培養液之黏度的例子 (case) 則很少 但是會生產多醣類之細菌的情形則例外, 也有會形成到達 30,000cP 非常高黏度之非 newton 培養液的情形 (Sutherland and Ellwood, 1979) Charles(1978) 說生產多醣類之發酵, 並非細菌本身使培養液之黏度提高, 黏度的上昇完全是由多醣類之蓄積所造成 普通微生物生產之多醣類會顯示擬塑性之性質的流體, 有些也有顯示剪斷應力之降伏值 (yield valve) 者 如此由細菌的多醣類發酵, 可知與含菌絲之培養一樣會有氧氣移動與攪拌的問題存在 在多醣類之發酵液所見到之擬塑性流體, 會由剪斷速度的增加而使黏度減少, 只要把攪拌機之迴轉速度加大就有可能解決通氣的問題 但是離開攪拌機位置之部位的黏度則會上昇, 通氣到發酵槽內之空氣, 其抵抗是最小, 充分被攪拌的部位黏度很低, 只有中心部最容易上升 因此在攪拌不充分時, 在槽中就會形成氧氣無法充分供給的部份 Wang 與 Fewkes(1977) 提出, 在含菌絲之培養液中考慮攪拌機之亂流剪斷應力與吐出之性能的比, 在很容易形成攪拌不充分領域之細菌的多醣類發酵也很重要 用於此 290

33 9 通氣與攪拌 類發酵之攪拌機需使其亂流剪斷應力與吐出之性能的比要適當, 在維持氧氣移動速度之效率的同時, 使高剪斷應力之領域也一樣要充分的使培養液進行循環 但是, 在多醣類發酵可以使用的攪拌機, 目前尚無報告的例子 泡與消泡劑對氧氣移動的影響需要很強之通氣攪拌條件的培養, 常常會有發泡的問題發生, 很極端的情形, 泡沫會從空氣出口或採樣噴嘴 (sampling nozzle) 等部位噴出, 不僅造成培養基或生產物的損失, 也會增加 contamination 的機會 泡沫的存在對氧氣移動速度也會帶給負面的效果 Hall 等 (1973) 說,Waldhof 型或 Vortex 型之發酵槽 ( 參照第 7 章 ) 特別容易受到泡沫的影響, 產生的泡沫在槽內循環在內部滯留時間變長, 在泡沫內部會形成氧氣飢餓狀態 具有一般型之阻擋板的通氣攪拌發酵槽也有會使泡沫滯留時間變長的較多, 也會形成氧氣飢餓狀態而發生問題 另外在攪拌翼周邊有大量的泡沫存在時, 使培養液之攪拌混合發生障礙, 因此在工程 (process) 中障礙出現之前, 如第 7 章所述需加以消泡, 因而有機械的消泡或化學的消泡, 採用其中之任何一種, 化學消泡劑全部都是界面活性劑, 如 Aiba 等 (1973) 或 Hall 等 (1973) 所檢討的, 需以某種形式來影響氧氣移動速度 因此對泡沫的制御, 以及由制御所造成之障礙的雙方的平衡 (balance) 來決定是很重要 很容易發生氧氣供給律速的發酵, 對此種問題就特別重要, 此類發酵所用之化學消泡劑, 其使用量應抑制到最下限 291

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37 295 9 通氣與攪拌