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1 第 32 卷第 1 期分子催化 Vol.32ꎬNo 年 2 月 JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS(CHINA) Feb 文章编号 : (2018) 颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展 林惠颖 1 ꎬ 辛嘉英 1ꎬ2 ꎬ 李春雨 1 ꎬ 孙立瑞 1 2 ꎬ 夏春谷 (1. 哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室 ꎬ 黑龙江哈尔滨 ꎻ 2. 中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室 ꎬ 甘肃兰州 ) 摘要 : 颗粒性甲烷单加氧酶 (pmmo) 是甲烷氧化菌的特征酶之一 ꎬ 在生物催化方面具有广泛的应用前景 ꎬ 但由于其内膜蛋白的性质以及纯化过程中的不稳定性 ꎬ 使其生物化学性质 金属活性位点等方面仍存在许多未知和争议. 着重总结了颗粒性甲烷单加氧酶的分离纯化方法 ꎬ 并对其活性以及与甲烷氧化菌素 Cu( methanobactin Cu) 和其他物质之间的作用关系进行了概述 ꎬ 以促进颗粒性甲烷单加氧酶的深入研究和应用. 关键词 : 颗粒性甲烷单加氧酶 ꎻ 分离纯化 ꎻ 酶活 ꎻ 甲烷氧化菌素中图分类号 : O 文献标志码 : A 甲烷氧化菌 (Methanotrophs) 是一类以甲烷作为 唯一碳源和能源生长的革兰氏阴性菌 ꎬ 广泛存在于 湿地 [1] 土壤 [2] 水稻中 [3] ꎬ 在全球碳循环中扮演 着重要角色. 甲烷单加氧酶 ( methane monooxygen aseꎬ MMO)ꎬ 是甲烷氧化菌代谢途径中的重要酶之 一 ꎬ 它能够催化甲烷氧化成为甲醇 [4] ꎬ 而催化这一 反应过程的 MMO 有两种形式 : 可溶性 MMO( solu ble methane monooxygenaseꎬ smmo) 和位于细胞质内 膜的颗粒性甲烷单加氧酶 ( particulate methane mo nooxygenaseꎬ pmmo) [5-6]. 实际上 ꎬ 两种蛋白是不同 基因表达的产物 ꎬ 两者的表达受到培养基中不同程 度 Cu 2+ 浓度的限制 [7]. 当培养基中 Fe 3+ 充足而 Cu 2+ 有限时 ꎬ 甲烷氧化菌细胞仅表达 smmoꎻ Cu 2+ 浓度 相对较高时 ꎬ smmo 的表达就会切换成 pmmo. 除 此以外 ꎬ Cu 2+ 还能作为一种代谢激活剂 ꎬ 促进细胞 内膜上 pmmo 的高浓度水平合成. 研究发现 ꎬ 几近 所有的类型的甲烷氧化菌都能表达 pmmoꎬ 但仅有 一小部分甲烷氧化菌在无铜的环境下表达 smmo [8]. 由于 pmmo 存在范围广 且不受铜浓度 条件的制约 ꎬ 因此在生物修复方面具有较高的实际 应用价值和应用前景. 有学者将纯化得到的膜水平 pmmo 嵌入到易交联 生物兼容性良好的聚乙二醇 双丙烯酸酯水凝胶 ( PEGDA) 中 ꎬ 制成一种催化甲 烷转化为甲醇的新型生物催化材料 ꎬ 酶活保存率为 100%ꎬ 同时能作为 3D 打印的底物 ꎬ 为生物反应器的设计以及甲烷的工业化转换提供了新的思路 [9]. 研究发现 ꎬ pmmo 除能够氧化甲烷之外 ꎬ 还能氧化卤化烃 ꎬ 如三聚乙烯 (trichloroethylene ꎬ TCE) 等 [10]. TCE 是一类可疑性致癌物 ꎬ 也是地下水源的主要污染物之一 [11]. 由于 pmmo 氧化 TCE 的过程中不会有有毒中间产物生成 ꎬ 因此成为 TCE 生物修复的首选方案. 虽然 pmmo 广泛存在 ꎬ 但由于其内膜蛋白的性质以及纯化过程中的不稳定性 [12] ꎬ 使其生物化学性质 金属活性位点等方面仍存在许多未知和争议. 有一部分学者认为 pmmo 中含有 2 个铜原子和 1 ~ 2 个铁原子 [13]. 另有一部分人认为 ꎬ pmmo 是一种含有 15 ~ 21 个铜原子的金属酶. 铜原子被整合成 5 ~ 7 个自旋耦合的三核铜簇 ꎬ 其中 2 ~ 3 个铜簇参与到催化反应中来 ꎬ 另有 3 ~ 4 个铜簇与 NADH 到活性中心之间的电子传递有关 [4]. 还有一部分学者认为 pmmo 中含有 8 ~ 15 个铜原子和 2 个铁原子 ꎬ 其中的 6 ~ 13 个铜原子能够与一种荧光小肽 ( 甲烷氧化菌素 methanobactinꎬ mb) 结合 ꎬ 形成 mb Cuꎬ 参与电子与活性中心之间的交流 ꎬ 或在铜捕获机制中 ꎬ 起到维持氧化还原状态 抑制氧自由基的 收稿日期 : ꎻ 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) ( NNSF of China( ))ꎻ 哈尔滨商业大学创新团队项目 ( 2016TD006) ( The Support Project for Research Team of Harbin University of Commerce (2016TD006)). 作者简介 : 林惠颖 (1994-)ꎬ 女 ( 汉族 )ꎬ 在读硕士研究生 ꎬ 研究方向为发酵工程 ꎬE 126.com( Lin Hui ying( 1994-)ꎬFemaleꎬ graduate studentꎬresearch field:fermentation Engineering. E mail: 126.com). 通讯联系人 ꎬ E 163.com.

2 第 1 期 林惠颖等 : 颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展 91 作用 [13]. pmmo 的分离纯化是 pmmo 理化性质 金属活 性中心等各方面的研究与发展的前提条件 ꎬ 因此纯 化出稳定性较好 酶活力较高的 pmmo 显得至关重 要. 目前对 pmmo 纯化的研究主要集中在 Methylo coccus capsulatus ( Bath) 和 Methylosinus trichosporium (OB3b) 两种甲烷氧化菌上 [14] : Methylococcus capsu latus Bath 属 Ⅰ 型好氧甲基球菌属 ꎬ 是 γ 变形菌的 一种 ꎬ 利用磷酸核酮糖途径 (RuMP pathway) 同化甲 醛 ꎬ 胞内膜呈束状分布 [7] ꎻ Methylosinus trichospori um(ob3b) 属 Ⅱ 型好氧甲基弯菌属 ꎬ 主要代谢途径 为丝氨酸途径 (Serine pathway)ꎬ 其双层膜吸附于细 胞壁周围 [7]. 除利用这两种类型的甲烷氧化菌进行 pmmo 分离纯化外 ꎬ 也有一些学者选择了其他类型 的甲烷氧化菌 ꎬ 近年来都取得了不少应用进展. 1 pmmo 的分离纯化 为使 pmmo 高水平表达 ꎬ 甲烷氧化菌的培养一 般是在 NMS 培养基的基础上补充一定量的 Cu 2+ 和 Fe 3+ ꎬ 但不同实验室在 pmmo 分离纯化中选择的 Cu 2+ 和 Fe 3+ 浓度不同. 一部分人认为培养基中 Cu 2+ 终浓度为 60 μmol / L 时 ꎬ pmmo 表达水平最高 [15] ꎻ 终浓度为 80 μmol / L 时 ꎬ 细胞中 Cu 2+ 已饱和. 但也 有人认为培养基中 Cu 2+ 浓度为 30 ~ 35 μmol / L Fe 3+ 浓度为 18 μmol / L 时 ꎬ pmmo 表达水平最高 酶活 最好 [16]. 培养完成后的发酵液离心 ꎬ 收集菌体细胞 沉淀进行 pmmo 的纯化. 一般 pmmo 的分离纯化主 要分为细胞质膜的分离 pmmo 的解离以及 pmmo 的纯化这 3 个阶段. 细胞内膜的分离一般是通过机 械法破碎细胞 ( 如超声破碎 高压匀浆法 )ꎬ 超速离 心分离膜组分. pmmo 的解离是指在表面活性剂 ( 又称去垢剂 ) 的作用下 ꎬ 将 pmmo 等膜蛋白包裹 从细胞内膜中分离下来 ꎬ 再采用离心操作达到分离 的目的. 对于 pmmo 的纯化操作多采用 FPLC 层析 分离 离子交换柱层析以及凝胶过滤层析等手段. 对 pmmo 的分离纯化操作的核心在于细胞破碎方 式 表面活性剂在浓度以及用量以及离心分离条件 的控制 各种层析分离介质和洗脱液的选择等. 1.1 含 pmmo 细胞质膜的分离 pmmo 位于甲烷氧化菌的细胞质膜 ꎬ 嵌入脂质 双分子层的内部 [17] ꎬ 与膜结合紧密 ꎬ 而甲烷氧化菌 又是革兰氏阴性菌 [18] ꎬ 与其他革兰氏阳性菌相比 ꎬ 其细胞壁较为脆弱 ꎬ 因此需要采用专门的细胞破碎 方法. 一是利用超声波的空穴作用将细胞破碎. 破 碎时 ꎬ 超声波强度不宜太大 ꎬ 强度过高易引起蛋白 的失活 ꎬ 而且破碎时细胞浓度不宜过高 ꎬ 一般控制 在 20% 左右 ꎬ 除此之外超声的频率 处理时间以及 介质的离子强度 ph 等都会对破碎效果产生一定 的影响. 此种方法细胞破碎的效果较为明显 ꎬ 适用 于小规模的细胞菌悬液的处理 ꎬ 成本相对昂贵. [19] 1977 年 ꎬ Tonge 等首次利用超声破碎细胞 (150 Wꎬ 4 45 s)ꎬ 得到 Methylosinus trichosporium(ob3b) 细胞破碎物 ꎬ 比活力为 0.22 μmol / min mg( 甲烷氧 [20] 化反应表示 ). Masayuki Takeguchi 等在超声破碎 时 ꎬ 着重控制温度在 4 且破碎环境密闭无氧 ꎬ 并 发现适当的 Cu 2+ 能够提高 Methylosinus trichosporium (OB3b) 细胞破碎时 pmmo 活性 ꎬ 同时在破碎过程 中适当补充 PMSFꎬ 也能够起到防止蛋白降解的作 用 ꎻ 除超声外 ꎬ 也可以采用匀浆法 ꎬ 使细胞受到剪 切力而破坏. 影响匀浆破碎的主要因素有压力 温 度和通过匀浆阀的次数等. 一般通过高压匀浆的破 碎率可达 67%ꎬ 破碎率要达 90% 至少将菌悬液通过 匀浆法 2 次 ꎬ 但不能单纯追求高破碎率 ꎬ 最好是提 高操作压力 ꎬ 减少操作次数. 此法一般用于大规模 菌悬液的处理 ꎬ 且样品损失小 ꎬ 成本适中 年 ꎬ [21] Smith&Dalton 等利用高压匀浆法 ꎬ 使 Methylococ cus capsulatus( Bath) 在 140 MPa 压力下匀浆破碎. [15] Choi 等利用高压匀浆法 ( Ib / in 2 ) 在 4 厌氧 (95% 氩气 ꎬ 5% 氢气 ) 条件下对 Methylococcus capsulatus ( Bath ) 细胞进行破碎. Ashraf Kitmitto [22] 等采用连续破碎系统 ꎬ 4 25 MPa 连续破碎 3 次 ꎬ 分离得到的细胞质膜 ꎬ 以 5 mmol / L NADH 作还 原剂 ꎬ 比活力为 230 nmol / min mg( 丙烯环氧化反 应表示 ). Yu 等 [16] 在滤膜反应器的辅助作用下去 除培养基组分收集菌体沉淀 ꎬ 高压匀浆 ( Ib / in 2 ) 分离包浆与膜组分 ꎬ 超速离心收集膜组分 ꎬ 并 考察了培养基中铜浓度与细胞内膜中 pmmo 含量 及比活力之间的相互关系. 破碎后 ꎬ 沉降未破碎的细胞以及细胞碎片 ꎬ 超 速离心或透析收集细胞内膜. 用中性 ph 缓冲溶液 ( 含少量 NaCl 或 KCl) 盐洗 1 ~ 3 次 ꎬ 除去细胞外膜 [23] 可溶性蛋白以及质蛋白等. Lieberman 等用超声 破碎法将 Methylococcus capsulatus( Bath) 细胞裂解 ꎬ 超速离心收集膜组分. 选用含 NaCl 的 25 mmol / L Pipes 缓冲液反复重悬 3 次 ꎬ 终浓度为 10 ~ 20 mg / mlꎬ 并用液氮滴冻 ꎬ -80 储存. 膜水平下 ꎬ 四甲

3 92 分子催化第 32 卷 基对苯二酚和 NADH 为最有效的还原剂 ꎬ 酶活为 19.4 nmol / min mg( 丙烯环氧化反应表示 ). 研究发 现 ꎬ 盐洗细胞膜能够起到粗略去除外源金属离子以 及未紧密结合的蛋白等. [20] Takeguchi 等在 4 无氧条件下利用超声破 碎法对细胞进行破碎 ꎬ 缓冲液事先用纯净氮气脱 气. 用含 KCl 的 MOPS 缓冲液盐洗膜沉淀 ꎬ 离心收 集沉淀 ꎬ 即得到含有 pmmo 的细胞膜组分. 研究发 现 ꎬ EDTA 甲醇 硫脲 叠氮化物 乙炔等物质会 抑制细胞质内膜上 pmmo 的活性 ꎻ 同时对反应条件 进行考察 ꎬ 发现利用 55 mmol / L MOPS 缓冲液 (ph = 7) 45 下反应 ꎬ 细胞内膜上 pmmo 活性效 果最好. 细胞质内膜的存在为维持 pmmo 天然构象 催 化活性以及稳定性提供了最佳环境 ꎬ 而且内膜上含 有一系列电子传递链 ꎬ 虽然电子传递机制尚未明 确 ꎬ 这使得含 pmmo 的膜组分成为除含 pmmo 完 整细胞外酶活以及电子供体研究的最佳阶段. 1.2 pmmo 从细胞质膜中的解离 纯化中 ꎬ 无论是以改变 pmmo 天然构象或是阻 断 pmmo 与其他蛋白 脂质之间相互作用的方式 ꎬ 将 pmmo 从磷脂双分子层的疏水环境中分离都会 造成 pmmo 活性的丧失. 因此使用去垢剂解离是 pmmo 解离中使用次数最多 使用范围最广的一 种. 去垢剂 ( detergent) 又称表面活性剂 ꎬ 是一类同 时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性分 子 [24-25]. 在去垢剂的作用下 ꎬ 细胞膜解体 ꎬ pmmo 等膜蛋白释放 ꎬ 并在无膜状态下为 pmmo 等膜蛋白 提供相对稳定的疏水环境 ꎬ 起到维持和保护蛋白结 构和活性的作用. 去垢剂的选择较多 ꎬ 其中十二烷基 β D 麦芽糖 苷 (dodecyl β D maltosideꎬ DDM) 是使用最广的一 种 ꎬ 它是一种非离子型去垢剂 ꎬ 常用于膜研究中蛋 白的抽提和溶解 ꎬ 但在其浓度及用量的选择上存在 [26] 差异. Shiemke 等按质量分数为 10% ~ 20% 的量 向 10 mmol / L ph = 7.0 的 Pipes 缓冲液中加入 DDMꎬ 并向膜组分的悬浮液中逐滴加入并搅拌 ꎬ 3 下震 [27] 荡 15 ~ 45 min. Piku BASU 等按去垢剂 / 蛋白 = 1.5(W / W) 的比例 ꎬ 向冰上的膜蛋白组分中持续搅 拌逐滴滴加. 这一过程保留了原酶活的近 75% 的活 [20] 性. Choi 等研究发现去垢剂较少 0. 5 ~ (DDM / 膜蛋白 ꎬ mg / mg) 或较多 2 ~ 3 ( DDM / 膜蛋 白 ꎬ mg / mg) 时 ꎬ 都会造成 pmmo 提取物的失活. 向 纯化产物中额外添加 DDMꎬ 考察了去垢剂与金属 离子含量之间的关系 ꎬ 研究发现每毫克膜蛋白中 DDM 含量为 mg 时 ꎬ pmmo 活性及其金属 离子含量仍保持不变 ꎻ 当 DDM 含量大于 0.3 mg 时 ꎬ pmmo 丧失活性 ꎬ 每个 pmmoαβγ 亚基中 Cu 原子 数大约为 2. 为降低去垢剂 DDM 对 pmmo 活性的抑 [28] 制 ꎬ Miyaji 等向解离后的 pmmo 组分中加入吸附 剂 BioBeads SM 2ꎬ 除去溶解组分中过量的 DDMꎬ 并考察吸附时间对 pmmo 活性以及 DDM 含量的影 [21] 响. Smith 等将 DDM 解离并去除多余 DDM 后得 到的 pmmo 储存在卵磷脂中. 除 DDW 外 ꎬ Brij 58 和 Tween 20 也能解离 pmmoꎬ 解离中能够抑制蛋白 聚沉 ꎬ 但由于其水油度 ( hydrophile lipophile bal anceꎬ HLB) 较高 ꎬ 与磷脂双分子层的亲和性较差 ꎬ 限制了它们在 pmmo 解离中的应用. 此外选择去垢 剂时要注意 ꎬ 着重选择温和的两性去垢剂和非离子 去垢剂 ꎬ 它不会破坏后续纯化 ( 如离子交换 )ꎬ 但离 子交换剂会破坏去垢剂与 pmmo 之间的库仑力 ꎬ 使 纯化失效. [29] 除使用去垢剂之外 ꎬ XIN 等研究发现 ꎬ 低 Cu 2+ 浓度条件下培养 Methylosinus trichosporium IMV 3011 时 ꎬ pmmo 极易从细胞内膜中解离 ꎬ 因此并未 使用去垢剂而是采用超声的方式使 pmmo 脱落. 膜 水平状态下 ꎬ 以琥珀酸盐为还原剂时比活力最高 ꎬ 为 16.8 nmol / min mg( 丙烯环氧化反应表示 ). 1.3 pmmo 的纯化 对于解离后的 pmmo 等膜蛋白及其他组分 ꎬ 成 分复杂 ꎬ 研究者多选用几步柱层析方法相结合的方 式进行 pmmo 分离纯化 ꎬ 其中离子交换层析 凝胶 过滤层析的使用最为广泛 ꎬ 依据分子间的相互作 用 物质的大小以及性状等方面的差异将 pmmo 与 其他杂蛋白进行分离 ꎬ 达到纯化的目的. 离子交换 层析是 pmmo 纯化中常用的方法 ꎬ 它以离子交换剂 为固定相 ꎬ 特定的含离子溶液为流动相 ꎬ 利用离子 交换剂对分离物的各种离子结合力的差异 ꎬ 将混合 流动相中不同离子进行分离 ꎬ 具有分辨率高 分离 效果好的特点. 纯化时常采用阴离子交换剂 ꎬ 交换 剂类型不同 ꎬ 交换容量以及蛋白质吸着容量也会存 在差异 ꎬ 最常用的阴离子交换剂填料基质 DEAEꎬ 如 DEAE Sepharose CL 6B DEAE Sepharose FF 等. [30] Choi 等选择用 cm DEAE Sepharose FF 将 收集到的含 pmmo 的蛋白组分进行纯化 ꎬ 得到 NDH pmmo 的混合物 ꎻ 经 cm DEAE Sepha

4 第 1 期 林惠颖等 : 颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展 93 rose FF 得到 pmmoꎬ 厌氧条件下超滤浓缩. 纯化后 NDH pmmo 的混合物和 pmmo 的活性分别为 147± 43 nmol / min mg 和 134±36 nmol / min mg. 辛嘉英 [31] 等等研究发现低 Cu 2+ 浓度下 pmmo 极易从细胞 内膜上解离 ꎬ 利用 DEAE SepharoseCL 6B 离子交换 层析柱对 Methylosinus trichosporium IMV 3011 细胞 膜中 pmmo 和 NADH 脱氢酶进行了分离纯化 ꎬ 并 对不同状态下 pmmo 利用的电子供体进行研究 ꎬ 并 提出了 pmmo 可能的电子传递链. 除使用离子交换层析的方法外 ꎬ 多数 pmmo 纯 化采用混合层析的方式 ꎬ 即离子交换层析和凝胶过 滤层析相结合的方式. 凝胶过滤层析也叫凝胶排阻 层析 ꎬ 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相 使不同分子量的组分得以分离. 凝胶空隙的大小严 格决定了其分离范围 ꎬ 较大的分子由于受到空间的 阻碍作用未进入凝胶颗粒内部而沿凝胶空隙流出 ꎬ 停留时间短 ꎬ 因而最先被洗脱 ꎻ 小分子物质由于进 入凝胶介质内部 ꎬ 停留时间较长. 此方法只需要一 种缓冲溶液 ꎬ 且操作条件温和 ꎬ 凝胶介质为惰性载 体 ꎬ 常用 Superdex Sephacryl 等凝胶介质. 挪威学 [27] 者 Piku 等利用 FPLC 快速蛋白纯化系统对 pm MO 进行纯化. 解离后的 pmmo 超滤浓缩至 20 mg / mlꎬ 1.5 cm 68 cm Superdex 200 凝胶层析分离 ꎬ 流 速 1.5 ml / minꎬ 酶活测定确定 pmmo 组分 ꎬ 分离得 到含羟化酶 (pmmoh) 和还原酶 (pmmor) 的 pmmo 复合物 ( pmmo c )ꎻ 经 DEAE cellulose DE52 离子交 换柱 (1.5 cm 15 cm) 分离得到羟化酶和还原酶. 利 用四甲基对苯二酚作还原剂 ꎬ 对 pmmo c 及其个体 组分 (pmmoh pmmor) 的丙烯环氧化反应进行研 究 ꎬ 发现单独的 pmmoh 或 pmmor 均没有 MMO 活性 ꎬ 这也就说明二者在催化丙烯环氧化反应中都 是不可或缺的. 若将 pmmo c 中再次添加分离得到的 pmmoh 和 pmmorꎬ pmmo c 活性略有增加 ꎬ 但比活 力仍保持不变 ( 约为 28 nmol / min mg). Kitmitto [22] 等在 Piku 的基础上对 pmmo 进行调整 ꎬ 选择 MonoQ 10 阴离子交换柱纯化得到 pmmo 复合物 ꎬ Superdex 200 凝胶层析继续纯化 ꎬ 0 ~ 1 mol / L NaCl 梯度洗脱得到 pmmo 羟化酶. [23] 美国的科学家 Lieberman 等使用柱层析的方 法分离纯化了 M.capsulatus(Bath) 中的 pmmo 组分. 纯化过程如下 : 事先用柱平衡液稀释的膜蛋白组 分 ꎬ Source 30Q 阴离子交换柱 ꎬ NaCl 梯度洗提 ꎬ Centriprep 50 超滤浓缩 ꎻ Sephacryl S200 凝胶过滤层 析 ꎬ 最后浓缩至 5 ~ 10 mg / ml. 实验证明 ꎬ 大部分杂 蛋白以及脂质类物质都能通过 Source 30Q 除去 ꎬ 而 小分子蛋白不能 ꎬ 因此采用 Sephacryl S200 凝胶过 滤将其分离除去 ꎬ 纯化后的 pmmo 活性为 nmol / min mg( 四甲基对苯二酚为还原剂 ). [28] Miyaji 等利用 POROS 20 HQ 对解离后的组分 进行纯化后得到 4 个组分峰 ꎬ 四甲基对苯二酚存在 下组分 1 具有 pmmo 活性 ꎬ 活性为 3.4 nmol / min mgꎬ 与膜水平中酶活相比 (3.8 nmol / min mg)ꎬ 四 甲基对苯二酚存在下纯化后的 pmmo 保持了近 88% 的酶活. 纯化时除考虑柱层析类型以及填料种类外也要 在维持 pmmo 活性的基础上 ꎬ 考虑流速 洗脱液以 及其他因素的影响 : 流速要视柱填料类型 颗粒大 小以及洗脱液粘度等条件而定 ꎬ 填料的颗粒大 ꎬ 流 速快 ꎬ 反之则慢 ꎻ 洗脱液的粘度大 ꎬ 流速就慢 ꎬ 反 之则快 ꎬ 而且其他层析条件相同时 ꎬ 流速会受层析 柱的长度与横截面积的影响 ꎻ 此外 ꎬ 在缓冲液选择 时注意避免能与介质相互作用的缓冲盐类 ꎬ 避免因 平衡破坏而使 pmmo 解吸 ꎬ 常用的洗脱液有 MOPS PIPES 等 ꎬ 且缓冲液浓度一般控制在 10 ~ 50 mmol / Lꎬ ph 控制在 7 ~ 7.5ꎬ 采用梯度洗脱的方式 ( 一般是 NaCl 溶于稀缓冲溶液 ). 具体柱层析纯化 pmmo 的方法如表 1 所示. 2 pmmo 的活性 pmmo 能够氧化五碳以内的烷烃和烯烃 ꎬ 但不 能同 smmo 一样氧化环烃 芳香烃等物质 [7] ꎬ 因此 多采用丙烯环氧化反应对 pmmo 酶活进行测定 ꎬ 酶 活用 1 mg 干重细胞 1 min 产生环氧丙烷的纳摩尔 数表示 [24] ꎬ 单位 : nmol / min mgꎬ 也有一部分人选 择用甲烷氧化反应评价 pmmo 活性 [32]. 环氧化反 应中 ꎬ 需要辅酶 NADH 不断再生 ꎬ 因此在酶活测定 中采用 NADH 或四甲基对苯二酚作为还原剂 ꎬ 以维 持 pmmo 催化反应的持续进行. 整细胞以及膜水平 条件下 ꎬ 以 NADH 或对苯二酚作还原剂 ꎬ 都可检测 到 pmmo 活性 ꎻ 然而经 DDM 解离后 ꎬ NADH 作还 原剂几乎不能检测到 pmmo 活性 ꎬ 但对苯二酚可 以. 研究发现 ꎬ pmmo 的活性可能会受到以下几方 面的影响. 2.1 培养基成分的影响 培养基中 Cu 2+ 浓度是决定 pmmo 活性的直接 因素. Cu 2+ 浓度不仅能够作为切换 smmo 与 pmmo

5 94 分子催化第 32 卷 表 1 柱层析纯化 pmmo 的方法总结 Table 1 Summary on purification of pmmo by column chromatography Type of methanotrophs Column chromatography Buffer Activity ( purified pmmo) / (nmol / min mg) Reductant Reference Methylococcus Source 30Q 50 mmol / L Hepes capsulatus and Sephacryl (ph 7.5)(include 17.7 Duroquinol [23] Bath S200 DDM NaCl) Methylococcus capsulatus Bath cm DEAE Sepharose FF and cm DEAE Sepharose FF 30 mmol / L MOPS (ph 7.3)(include benzamidine KCl DDM) 134±36 Duroquinol+ NADH+NDH [30] Methylococcus capsulatus Bath 1.5 cm 68 cm Superdex mmol / L Pipes (ph 7.25)(include DDM benzamidine) 53 Duroquinol [27] Methylococcus capsulatus Bath S 300HR 50 mmol / L PIPES (ph 7.2)(include NaCl imidazole ascorbate DDM) Not Shown - [16] Methylosinus trichosporium OB3b Methylosinus trichosporium IMV 3011 POROS 20 HQ 25 mmol / L MOPS (ph 7)(include KCl Brij58) 3.4 Duroquinol [28] DEAE Sepharose PBS( include DTT) 6 quinol [31] 表达的枢纽 ꎬ 更重要的是 ꎬ 它能够激发 pmmo 的高 水平表达. 当培养基中 Cu 2+ 浓度为 4 μmol / L 时 ꎬ pmmo 开始表现出活性 ꎬ 并生成大量细胞质膜 [30]. [15] Masayuki 等研究发现 ꎬ M. trichosporiumob3b 中 pmmo 需要一定的 Cu(Ⅱ) 离子 ꎬ 但过量的 Cu(Ⅱ) 离子会抑制 pmmo 的活性 ꎻ 同时金属离子 牛血清 白蛋白 (BSA) 以及 PMSF 等都会对膜水平下 pmmo [15] 的活性产生一定的影响. Choi 等在对 Methylococ cus capsulatus Bath 的研究中发现 ꎬ 当 NMS 培养基中 Cu 2+ 浓度为 60 μmol / L 时 ꎬ 其膜水平 pmmo 的表达 效果最高 ꎬ 可达 75 ~ 230 nmol min -1 (mg protein) -1 ꎬ 而 mb Cu 以及 Cu(Ⅱ) 的添加更能提高 pmmo 的酶 活 ꎻ 当培养基中 Cu 2+ 浓度达 80 μmol / L 时 ꎬ 细胞中 Cu 2+ 浓度几近饱和. 此外 ꎬ pmmo 的高水平表达也 需要一定量的 Fe 3+. 当培养基中 Fe 3+ Cu 2+ = 时 ꎬ 无细胞状态下 pmmo 的活性较高 [23]. 但也有学 者研究发现 ꎬ 自然环境中铜含量很低时 ꎬ 仍能检测到大量 pmmo 的存在 [33]. 2.2 厌氧条件的影响厌氧条件对 pmmo 活性也会产生一定的影响. 为维持 pmmo 的稳定性 ꎬ 大多数的 pmmo 分离纯化都选择在 4 无氧条件下进行的 ꎬ 而且研究发现 ꎬ 膜水平下高活性 pmmo 就是在厌氧条件下分离得到的 [30] ꎬ 其比活力为 290 nmol 环氧丙烷 (mg pro tein min) 1. 但也有学者认为 ꎬ pmmo 并不是氧敏感型蛋白 [23] ꎬ 厌氧条件对 pmmo 活性的影响并不大. 2.3 mb Cu 对 pmmo 的作用甲烷氧化菌素 (methanobactinꎬ mb)ꎬ 是甲烷氧化菌分泌的一种能与 Cu 结合 分子量大小为 1218Da 的荧光小肽 [34] ꎬ 在甲烷氧化菌铜捕获体系中起着至关重要的作用 ꎬ 在食品添加剂 [35] 食品安

6 第1期 林惠颖等: 颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展 全快速检测 [36] 生物催化等 [37] 方面具有广泛的应 用前 景. 溶 液 中 的 mb 是 一 种 动 态 的 小 分 子ꎬ 与 95 Cu( Ⅱ) 离子结合( 如图 1 所示). 当甲烷氧化菌在 限铜条件下培养时ꎬmb会以分泌物的形式排放到 图 1 mb Cu 与 pmmo 的结构关系图 [26] Fig.1 Structural relationship between mb Cu and pmmo [26] 细胞外ꎬ 若培养基中 Cu 2 浓度达到一定时ꎬ mb 就 化得到的 mb 均能提高完整 Methylococcus capsulatus ꎬ 若将其从 pmmo 中 分 离ꎬ pmmo 酶活为 290 nmol / min mg( 环氧丙烷) 的细 会与铜结合以 mb Cu 的形式构成 pmmo 的结构组 分存在于细胞膜中 [38] 会造成 pmmo 的不可逆性失活 [39]. 研究发现ꎬ 从 Methylococcus capsulatus Bath Methylomicrobium al bum BG8 以及 Methylosinus trichosporium OB3b 中分 离得到的 mb Cu 都是具有氧化还原活性的分子ꎬ 具 有自由基清除剂的作用ꎬ 表现出氧化酶( Oxidase) 超氧化物歧化酶( Superoxide dismutaseꎬ SOD) 以及 过氧化氢还原酶( hydrogen peroxide) 活性ꎬ 其表现 出的 SOD 活性在无细胞水平下能够起到保护 pm MO 防止氧化对其造成损伤的作用 [39]. mb Cu 能够提高电子流向 pmmo 的速率ꎬ 对 Bath 细胞水平或膜水平状态下甲烷氧化速率ꎻ 若向 胞膜组 分 中 加 入 mb Cuꎬ 其 酶 活 显 著 增 加 ( 400 nmol / min mg) ꎬ 约为完整细胞酶活的 50 ~ 75. EPR 光谱表明ꎬ mb Cu 能够提高电子流向 pmmo 的 速率. 但 mb Cu( Methylosinus trichosporium OB3b) 对 pmmo( Methylosinus trichosporium OB3b) 以及 mb Cu ( Methylococcus capsulatus Bath ) 对 pmmo ( Methylo coccus capsulatus Bath) 的影响并没有报道ꎬ 有待进 一步研究. 2.4 其他物质 纯化过程中ꎬ 电子传递链中涉及的与 pmmo 相. 有的学者认为无 关的细胞色素 脱氢酶等物质的破碎都会造成 pm 下: NADH mb Cu Cu pmmo H Fe Fe pmmo 成一种活性中心复合物 [23]. 同时ꎬ 解离后 纯化后 pmmo 活性存在着一定的影响 [30] 细胞状态下ꎬ NADH 作为还原剂ꎬ 电子传递过程如 Hꎬ 其中 Cu pmmo H 为 pmmo 羟化酶的 Cu( Ⅱ) 金 属活性中心ꎬ Fe Fe pmmo H 为 pmmo 羟化酶的双 核铁活性中心 Choi 等 [20] [15]. 研 究 发 现ꎬ Methylococcus capsulatus Bath 中或 Methylosinus trichosporium OB3b 中分离纯 MO 的失活. 研究发现ꎬ 这些物质可能与 pmmo 构 pmmo 的不规 则 折 叠 都 会 影 响 pmmo 的 活 性. 此 外ꎬ Chen 等 [40] 在 Methylococcus capsulatus Bath 菌中 发 现 一 种 非 血 红 素 铁 蛋 白 ( bacteriohemerythrinꎬ McHr) ꎬ 并认为它能够作为分子氧的载体携带分子 氧到达细胞膜的微环境中参与环氧化反应的进行ꎬ

7 96 分子催化第 32 卷 在膜水平条件下具有显著提高 pmmo 催化丙烯环 氧化的能力. 3 结论及展望 pmmo 的纯化过程较为复杂 ꎬ 大部分研究都采 用两种或两种以上的操作步骤 ꎬ 包括细胞破碎 超 滤 表面活性剂解离 离子交换层析 凝胶过滤层 析等. 此外 ꎬ 其活性可能受到很多因素条件的限制 ꎬ 如 Cu 2+ 和 Fe 3+ 浓度 厌氧条件 折叠方式等. 只有 获得活性较高 稳定性较好的 pmmoꎬ 才能更深入 的了解 pmmo 的催化机理 生化性质以及金属活性 中心 ꎬ 才能更好的应用于环境保护 生物催化等各 个领域. 参考文献 : [1] Deng Yong cui( 邓永翠 )ꎬ Che Rong xiao( 车荣晓 )ꎬ Wu Yi bo( 吴伊波 )ꎬ et al. A review of the physiological and ecological characteristics of methanotrophs and metha notrophic community diversity in the natural wetlands( 好 氧甲烷氧化菌生理生态特征及其在自然湿地中的群 落多样性研究进展 ) [ J]. J Acta Ecologica Sin( China) ( 生态学报 )ꎬ 2015ꎬ 35(14): [2] Huang Meng qing( 黄梦青 )ꎬ Zhang Jin feng( 张金凤 )ꎬ YangYu sheng( 杨玉盛 )ꎬ et al. Advance in research method of soilmethanotrophs diversity( 土壤甲烷氧化菌 多样性研究方法进展 ) [ J]. J Sub Res Environ( China) ( 亚热带资源与环境学报 )ꎬ 2013ꎬ 8(2): [3] Zheng Yong( 郑勇 )ꎬ Zheng Yuan ming( 郑袁明 )ꎬ He Ji zheng( 贺纪正 ). Response of methanotrophic commu nity structure and oxidation potential to cadmium stress in a Chinese paddy soil( 水稻土甲烷氧化菌对镉胁迫的响 应 )[J]. J Ecol Environ Sci( China) ( 生态环境学报 )ꎬ 2012ꎬ 1(4): [ 4] Rosenzweig A C. The metal centres of particulate methane mono oxygenase[j]. Biochem Soc Transꎬ 2008ꎬ 36(6): [5] Wu Jun hua( 吴军华 ). Current research on methanotro phs and methane monooxygenase( 甲烷氧化菌及甲烷单 加氧酶的研究进展 )[J]. J Chin Brew(China)( 中国酿 造 )ꎬ 2011ꎬ 234(9): [6] Sirajuddin Sꎬ Rosenzweig A C. Enzymatic oxidation of methane[ J]. Biochemꎬ 2015ꎬ 54(14): [7] Hanson R Sꎬ Hanson T E. Methanotrophic bacteria.[ J]. Microbiol Revꎬ 1996ꎬ 60(2): [8] Hakemian Amanda Sꎬ Rosenzweig Amy C. The bioche mistry of methane oxidation[ J]. Ann Rev Biochemꎬ 2007ꎬ 76(1): [9] Blanchette C Dꎬ Knipe J Mꎬ Stolaroff J Kꎬ et al. Printa ble enzyme embedded materials for methane to methanol conversion[j]. Nat Communꎬ 2016ꎬ 7: 1-9. [10] Lontoh Sꎬ Dispirito A Aꎬ Semrau J D. Dichloromethane and trichloroethylene inhibition of methane oxidation by the membrane associated methane monooxygenase of Methylosinus trichosporium OB3b [ J ]. Arch Microꎬ 1999ꎬ 171(5): [11] Tsien H Cꎬ Brusseau G Aꎬ Hanson R Sꎬ et al. Biodegra dation of trichloroethylene by Methylosinus trichosporium OB3b[J]. Appl & Environ Microꎬ 1989ꎬ 55(12): [12] Zhang Sꎬ Karthikeyan Rꎬ Fernando S D. Low tempera ture biological activation of methane: structureꎬ function and molecular interactions of soluble and particulate methane monooxygenases[ J]. Rev Environ Sci & Biotech nolꎬ 2017ꎬ 16(4): [13] Antholine W Eꎬ Dispirito A A. Membrane associated methane monooygenase from type X and type I metha notrophs[j]. Off Sci & Techni Infor Techni Repꎬ 2009ꎬ 102(8): [14] Su Yao( 苏瑶 )ꎬ KongJiao yan( 孔娇艳 )ꎬ Zhang Xuan ( 张萱 ). Copper in methane oxidation:a review.( 甲烷氧化过程中铜的作用研究进展 ) [ J]. J Appl Ecolo (China)( 应用生态学报 )ꎬ 2014ꎬ 4(5): [15] Choi D Wꎬ Antholine W Eꎬ Do Y Aꎬ et al. Effect of methanobactin on the activity and electron paramagnetic resonance spectra of the membrane associated methane monooxygenase in Methylococcus capsulatus Bath [ J ]. Microbiolꎬ 2005ꎬ 151: [16] Yu S Sꎬ Chen K Hꎬ Tseng M Yꎬ et al. Production of high quality particulate methane monooxygenase in high yields from methylococcus capsulatus ( Bath) with a hol low fiber membrane bioreactor[ J]. J Bacterꎬ 2003ꎬ 185 (20): [17] Chan Sunny Iꎬ Chen Kelvin Hꎬ Yu Steve Sꎬ et al. To ward delineating the structure and function of the particu late methane monooxygenase from methanotrophic bacteri a[j]. Biochemꎬ 2004ꎬ 43(15): [18] Wei Cong( 魏聪 )ꎬ Liu Guo ren( 刘国生 ). Separation and identification of methanotrophs and study on its phy siological characteristics( 甲烷氧化菌的筛选与生理特性研究 )[J]. J Anhui Agricul Sci( China) ( 安徽农业科学 )ꎬ 2013ꎬ 2013(7): [19] Tonge G Mꎬ Harrison D Eꎬ Higgins I J. Purification and properties of the methane mono oxygenase enzyme system

8 第 1 期 林惠颖等 : 颗粒性甲烷单加氧酶分离纯化方法的研究进展 97 from Methylosinus trichosporium OB3b[ J]. Biochem Jꎬ 1977ꎬ 161(2): [20] Takeguchi Mꎬ Miyakawa Kꎬ Okura I. Purification and properties of particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporiumꎬ OB3b[ J]. Mol Catal Chemꎬ 1998ꎬ 132(2): [21] Smith D D Sꎬ Dalton H. Solubilisation of methane monoo xygenase from Methylococcus capsulatusꎬ ( Bath) [ J]. Eur J Biochemꎬ 2010ꎬ 182(3): [22] Ashraf Kitmittoꎬ Natalia Myronovaꎬ Piku Basuꎬ et al. Characterization and structural analysis of an active par ticulate methane monooxygenase trimer from methylococ cus capsulatus ( Bath) [ J]. Biochemꎬ 2005ꎬ 44 ( 33): [23] Lieberman R Lꎬ Rosenzweig A C. Biological methane oxi dation: Regulationꎬ biochemistryꎬ and activie site struc ture of particulate methane monooxygenase[ J]. Biochem Mol Biologyꎬ 2004ꎬ 39: [24] Eriks L Rꎬ Mayor J Aꎬ Kaplan R S. A strategy for identi fication and quantification of detergents frequently used in the purification of membrane proteins [ J ]. Analy Bio chemꎬ 2003ꎬ 323(2): [25] Shi C Wꎬ Shao Wꎬ Xiong Yꎬ et al. A gas chromatograp hic method for quantification of detergents frequently used in membrane protein structural studies [ J]. Analy Bio chemꎬ 2008ꎬ 383(2): [26] Shiemke A Kꎬ Cook S Aꎬ Miley Tꎬ et al. Detergent solu bilization of membrane bound methane monooxygenase re quires plastoquinol analogs as electron donors[ J]. Arch Biochem & Biophysꎬ 1995ꎬ 321(2): [27] Piku Basuꎬ Bettina Katterleꎬ K Kristoffer Anderssonꎬ et al. The membrane associated form of methane mono oxyge nase from Methylococcus capsulatus ( Bath) is a copper / iron protein[j]. J Biochem Socꎬ 2003ꎬ 8(2): [28] Miyaji Aꎬ Kamachi Tꎬ Okura I. Improvement of the puri fication method for retaining the activity of the particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b[ J]. Biotechnol Lettꎬ 2002ꎬ 24(22): [29] Xin Jia ying( 辛嘉英 )ꎬ Cui Jun ru( 崔俊儒 )ꎬ Hu Xiao xue( 胡霄雪 ). Study on the electron donors for particu late monooxygenase( 颗粒性甲烷单加氧酶的电子供体研究 )[J]. J Mol Catal(China)( 分子催化 )ꎬ 2002ꎬ 16 (3): [30] Choi D Wꎬ Kunz R Cꎬ Boyd E Sꎬ et al. The membrane associated methane monooxygenase( pmmo) and pmmo NADH: Quinone oxidoreductase complex from Methyloco cus capsulatus Bath[J]. J Bacterꎬ 2003ꎬ 6(10): [31] Xin J Yꎬ Cui J Rꎬ Hu X Xꎬ et al. Particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium is a cop per containing enzyme[ J]. Biochem & Biophys Res Com munꎬ 2002ꎬ 295(1): [32] Culpepper M Aꎬ Rd C Gꎬ Gunderson W Aꎬ et al. Identi fication of the valence and coordination environmentof the particulate methane monooxygenase copper centers by ad vanced EPR characterization [ J ]. J Amer Chem Socꎬ 2014ꎬ 136(33): [33] Semrau J Dꎬ Dispirito A Aꎬ Yoon S. Methanotrophs and copper[j]. Fems Microbiol Revꎬ 2010ꎬ 34 ( 4): [34] Choi D Wꎬ Semrau J Dꎬ Antholine W Eꎬ et al. Oxidaseꎬ superoxide dismutaseꎬ and hydrogen peroxide reductase activities of methanobactin from types I and II methanotro phs[j]. J Inorg Biochemꎬ 2008ꎬ 102(8): [35] Xing Hai li( 邢海丽 )ꎬ Xin Jia ying ( 辛嘉英 )ꎬ Wang Yan ( 王艳 )ꎬ et al. Optimization of combinations of methanobactinꎬ sodium benzoate and potassium sorbate for enhanced antibacterial effect by response surface methodology( 响应面优化甲烷氧化菌素 苯甲酸钠和山梨酸钾复配剂抑菌效果 ) [ J]. Food Sci( China) ( 食品科学 )ꎬ 2016ꎬ 37(18): 1-5. [36] ChenLin lin ( 陈林林 )ꎬ Zhang Wei ( 张伟 )ꎬ Wang Zhen xing( 王振兴 )ꎬ et al. Determination of superoxide dismutase activity in methanobactin copper complexes by pyrogallol autoxidation( 邻苯三酚自氧化法测定甲烷氧化菌素一铜配合物的超氧化物歧化酶活性 ) [ J]. J Food Saf & Qual( China) ( 食品安全质量检测学报 )ꎬ 2017ꎬ 8(9): [37] Xin Jꎬ Lin Kꎬ Wang Yꎬ et al. Improved biological syn thesis of gold nanoparticles using methanobactin [ J]. J Korean Soc Appl Biolo Chemꎬ 2015ꎬ 58(3): 1-9. [38] Xin Jia ying( 辛嘉英 )ꎬ Yan Ming fei( 阎明飞 )ꎬ Zhou Jie qiong( 周琦琼 )ꎬ et al. Copper capture mechanism of methanotrophs.( 甲烷氧化细菌的铜捕获机理 ) [ J]. J Mol Catal(China) ( 分子催化 )ꎬ 2009ꎬ 23( 5): [39] Pesch M Lꎬ Christl Iꎬ Barmettler Kꎬ et al. Isolation and purification of Cu free methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b[J]. Geochem Transꎬ 2011ꎬ 12(1): 2-9. [40] Chen K Hꎬ Wu H Hꎬ Ke S Fꎬ et al. Bacteriohemerythrin bolsters the activity of the particulate methane monooxy genase ( pmmo) in Methylococcus capsulatus ( Bath) [J]. J Inorg Biochemꎬ 2012ꎬ 111(6):

9 98 分子催化第 32 卷 Progress on Isolation and Purification of Particulate Methane Monooxygenase LIN Hui ying 1 ꎬ XIN Jia ying 1ꎬ 2 ꎬ LI Chun yu 1 ꎬ SUN Li rui 1 ꎬ XIA Chun gu 2 (1. Key Laboratory for Food Science and Engineeringꎬ Harbin University of Commerceꎬ Harbin ꎬ Chinaꎻ 2. State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidationꎬ Lanzhou Institute of Chemical Physicsꎬ Chinese Academy of Sciencesꎬ Lanzhou ꎬ China) Abstract: Particulate methane monooxygenase ( pmmo) is one of the main enzyme in methanotrophic bacteriaꎬ which has broad application prospect in biocatalysis. Howeverꎬ due to its characteristic of membrane protein and in stability in purification procedures ꎬ there are many controversies in its biological and chemical properties and metal active sites. Purification methods of particulate methane monooxygenase were summarized. Besidesꎬ its activity and the relationship with methanobactin Cu were introduced to improve the comprehensive research and application of particulate methane monooxygenase. Key words: particulate methane monooxygenaseꎻ isolation and purificationꎻ activityꎻ methanobactin «分子催化» 简介 «分子催化» 是由中国科学院兰州化学物理研究所主办 中国科学院主管 科学出版社出版的向国内外公开发行的学术性刊物. 主要报道有关分子催化方面最新进展与研究成果. 辟有学术论文 研究简报 研究快报及综合述评等栏目. 内容侧重于配位催化 酶催化 光助催化 催化过程中的立体化学问题 催化反应机理与动力学 催化剂表面态的研究及量子化学在催化学科中的应用等. 工业催化过程中的均相催化剂 固载化学的均相催化剂 固载化的酶催化剂等活化 失活和再生 ꎻ 用于新催化过程的催化剂的优选与表征等方面的内容 ꎬ 本刊亦有报道. 读者对象主要是科研单位及工矿企业中从事催化工作的科技人员 研究生 高等院校化学系和化工系的师生. «分子催化» 已被美国化学文摘 (CA) 俄罗斯化学文摘 中国科学引文数据库 中国化学文献数据库 中国学术期刊文摘 中国化工文摘等国内外文献数据库收录. «分子催化» 现为 «中文核心期刊要目总览» 的中国核心期刊和中国科技核心期刊. 曾荣获中科院和甘肃省科委 优秀期刊三等奖 和 优秀科技期刊 奖. «分子催化» 为双月刊 ꎬ 每逢双月末出版 ꎬ 大 16 开本 ꎬ 约 16 万字 ꎬ 每册定价 元. 中国标准刊号 : ISSN / CN / O6. 欢迎订阅 ꎬ 欢迎来稿.

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