中国农业科学 ZHONGGUO NONGYE KEXUE 2016 年第 49 卷第 19 期 目 次 作物遗传育种 种质资源 分子遗传学 3671 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 曾幼玲杨瑞瑞 3683 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 姚涵汤才国赵静郑琪李滨郝晨阳李振声张

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1 ዷ!!!!Պǖ ॺ!ዷ!Պǖጼ!! ਯ!!!!!!!!!!ࡓᇎᇮ!!!!Ⴝ ኴ ዷՊǖୟ ස ዐࡔ౫ᄽ ბ!! ISSN CODEN CKNYAR ᮎ ᎃᣣѢ ڠ ڦ ᥪஊᎃᆉ ព ᄽ Ꭹ ڦ ߔᥪ Ӿ ᜈᝠ ڍ ЮԦᛠ ᝠ ᠓ ܪ ڍ Ԧᛠ ڍ Ю ዐࡔ౫ᄽ ბ SCIENTIA AGRICULTURA SINICA ශ त ڼ 5: ਝ!!! ڼ 2: Wpm/5:!!!!!Op/2: Superintended by Ministry of Agriculture, P. R. China Sponsored by Chinese Academy of Agricultural Sciences Chinese Association of Agricultural Science Societies Published by Editorial Department of Scientia Agricultura Sinica Address No.12 South Street, Zhongguancun, Beijing Postcode Telephone Fax Website Issued by Beijing Newspapers and Periodicals Distribution Office Subscription Domestic Post Office Issued Abroad by International Book Trading Corporation, P.O.Box 399, Beijing, P.R. China Abroad Issued No. BM43 Price US$ / Issue ᥪԦ ՁṊ2-138 ڍ Ю МधԦᛠ CN /S ڍ ՁṊBM43 նፂᖸ Ժ Ṋ ๑ ߙ ኃ 0178 Ձ 19 Ͼ ᄍ Vol.49 No.19 October 1, 2016 ISSN 中国农业科学２０１６ (Semimonthly, Started in 1960) ӧ ඞР ڍ йˉᦉ ڍ йˉመߥᬒ ڍ йߥ Ǒ ڍ йˉመߥǒᎃᣣᦉ ӑ С Ӯ ᛣ 12 Ձ zgnykx@caas.cn ӑ ӑ Ӿ ԇ ӑ ઐѮԦᛠࡌ К ڍ Չ ڠ ᥪ ࡌ ڍڍ ڎ МՂ Ḹӑ 399 ζ ḹ Њ/య Њ/ ክ Ҩ ज़ ࡔ ၄ Scientia Agricultura Sinica Ё ݰ Ϯ ᄺ Ḹञ ߞˈ1960 ᑈ ߞḹ 2016 ᑈ 10 1 ᮹ ୲ ᣝ ヨ ᥦᑣ ቅ ҥ 䖲䫂 श ḍ श㡃ᘩ ܗ ৩亲ᵄ ӏ㒻 ẉ ӆᗔ ᯁ ᴅ㣅 ਈᯢ ਈᐌ ᓴᄤҾ ᓴ থ ᴢᤃໄ ᴳᗔ សढ 㤷ᰒ 䰜 ᮄ 䰜ᅫស 䰜 ሜ ހ ᅬ ѥ 㣗ѥ փ ዄ 㤷ᓋᰁ 㹕䱚ᑇ Ⲫ䩻䬦 ᓋ 乎 䇶㘨䕝 㖳㰢 䖰㨫 ᱃ ށ տ ᴢᆊ ҝ ށ տ 䍉ᮍ ᮍᱎ䖰 Michael T. Clegg ށ տ ᣝ ৡ㣅 ᄫ ᥦᑣ M. Alley, USA Bouzayen M, France Matthew J. W. Cock, Switzerland David A. Andow, USA John Bower, South Africa Nick Costa, Australia R. Appels, Australia Kenneth G. Cassman, USA Thomas Crenshaw, USA Jill Shore Auburn, USA Chen Xian-ming, USA Zhanao Deng, USA Bing Yang, USA Chen Z X, USA C. Robert Dove, USA Bas Bouman, IRRI Michael T. Clegg, USA Lester E. Ehler, USA Ḹᣀ ʻḹ ᎃ ᣣ ᦉ ᴢѥ䳲 ҝ ߛᭆॶ Ϙ ᎃ ᣣ ᡎ ဌጙᓤ ဌ Laurie Burkitt ڼ ݛ ljё ݰ Ϯ ᄺNJ㓪 Ӯ ᇗ US$ / year م µ ዐࡔ౫ᄽ ბᇾ ዷӸ ዐ ࡔ ౫ ბ , 2:53 PM

2 中国农业科学 ZHONGGUO NONGYE KEXUE 2016 年第 49 卷第 19 期 目 次 作物遗传育种 种质资源 分子遗传学 3671 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 曾幼玲杨瑞瑞 3683 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 姚涵汤才国赵静郑琪李滨郝晨阳李振声张学勇 3694 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 代攀虹孙君灵何守朴王立如贾银华潘兆娥庞保印杜雄明王谧 耕作栽培 生理生化 农业信息技术 3709 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 周振翔李志康陈颖王志琴杨建昌顾骏飞 3721 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 樊廷录李永平李尚中刘世新王淑英马明生 植物保护 3733 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 罗彦涛孟润杰赵建江韩秀英马志强王文桥张小风 3746 中国粗榧生物碱的除草活性 马树杰刘琳芦小鹏马志卿张兴 土壤肥料 节水灌溉 农业生态环境 3754 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响袁梅谭适娟孙建光 3769 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析朱开伟刘贞贺良萍林金钗 园艺 3786 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 袁月张亚光高世敏陶建敏 3798 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 余义和李秀珍郭大龙张会灵杨英军李学强张国海 3807 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 薄晓培王梦馨崔林王金和 韩宝瑜 - I -

3 中国农业科学 2016 年第 49 卷第 19 期 贮藏 保鲜 加工 3818 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 童鑫张瑞芬邓媛元肖娟刘磊张雁魏振承张名位 3831 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 贾丰郭玉蓉刘冬杨曦邓红孟永宏 畜牧 兽医 资源昆虫 3845 基于 F 2 群体的豁眼鹅豁眼性状遗传分析于金成李喆于宁赵辉 3852 中华蜜蜂气味结合蛋白基因 AcerOBP14 的克隆及时空表达杜亚丽张中印潘建芳王树杰 杨爽赵慧婷姜玉锁 - II -

4 SCIENTIA AGRICULTURA SINICA (19) CONTENTS CROP GENETICS & BREEDING GERMPLASM RESOURCES MOLECULAR GENETICS 3671 Biological Characteristics of Plant MicroRNAs and Actions in Environmental Stresses 3683 Isolation of Thinopyrum ponticum Genome Specific Repetitive Sequences and Their Application for Effective Detection of Alien Segments in Wheat 3694 Comprehensive Evaluation and Genetic Diversity Analysis of Phenotypic Traits of Core Collection in Upland Cotton ZENG You-ling, YANG Rui-rui YAO Han, TANG Cai-guo, ZHAO Jing, ZHENG Qi, LI Bin, HAO Chen-yang, LI Zhen-sheng, ZHANG Xue-yong DAI Pan-hong, SUN Jun-ling, HE Shou-pu, WANG Li-ru, JIA Yin-hua, PAN Zhao-e, PANG Bao-yin, DU Xiong-ming, WANG Mi TILLAGE & CULTIVATION PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY AGRICULTURE INFORMATION TECHNOLOGY 3709 Effects of Reduced Chlorophyll Content on Photoinhibition and Photosynthetic Electron Transport in Rice Leaves 3721 Grain Yield and Water Use Efficiency and Soil Water Changes of Dryland Corn with Film Mulching and Close Planting ZHOU Zhen-xiang, LI Zhi-kang, CHEN Ying, WANG Zhi-qin, YANG Jian-chang, GU Jun-fei FAN Ting-lu, LI Yong-ping, LI Shang-zhong, LIU Shi-xin, WANG Shu-ying, MA Ming-sheng PLANT PROTECTION 3733 Acquisition and Biological Characteristics of Fluopicolide-Resistant Isolates in Phytophthora infestans LUO Yan-tao, MENG Run-jie, ZHAO Jian-jiang, HAN Xiu-ying, MA Zhi-qiang, WANG Wen-qiao, ZHANG Xiao-feng 3746 Herbicidal Activities of Alkaloids from Cephalotaxus sinensis MA Shu-jie, LIU Lin, LU Xiao-peng, MA Zhi-qing, ZHANG Xing SOIL & FERTILIZER WATER-SAVING IRRIGATION AGROECOLOGY & ENVIRONMENT 3754 Isolation and Biological Properties of Endophytic Diazotrophs from Rice and Their Influences on Rice Seedling Cd Accumulation 3769 Eco-Economic Potential Analysis of Chinese Main Crops Bio-Energy Utilization Straw Resources YUAN Mei, TAN Shi-juan, SUN Jian-guang ZHU Kai-wei, LIU Zhen, HE Liang-ping, LIN Jin-chai HORTICULTURE 3786 Bioinformatics and Expression of the OVATE Gene Family in Grape YUAN Yue, ZHANG Ya-guang, GAO Shi-min, TAO Jian-min 3798 Characteristics and Expression of Calmodulin Like B Subunit Interaction Protein VvCIPK10 in Grapevine 3807 Evaluation on Correlations of Three Kinds of Osmoregulation Substances in Tea Fresh Leaves with Low Temperature During Winter and Spring Respectively and Their Difference Among Cultivars YU Yi-he, LI Xiu-zhen, GUO Da-long, ZHANG Hui-ling, YANG Ying-jun, LI Xue-qiang, ZHANG Guo-hai BO Xiao-pei, WANG Meng-xin, CUI Lin, WANG Jin-he, HAN Bao-yu - III -

5 SCIENTIA AGRICULTURA SINICA (19) STORAGE FRESH-KEEPING PROCESSING 3818 Separation and Purification of Polyphenols in Rice Bran by Macroporous Resins TONG Xin, ZHANG Rui-fen, DENG Yuan-yuan, XIAO Juan, LIU Lei, ZHANG Yan, WEI Zhen-cheng, ZHANG Ming-wei 3831 Effect of Fermentation on the Polysaccharides Processing Characteristics in Apple Pomace ANIMAL SCIENCE VETERINARY SCIENCE RESOURCE INSECT JIA Feng, GUO Yu-rong, LIU Dong, YANG Xi, DENG Hong, MENG Yong-hong 3845 Genetic Analysis of Huoyan Trait Based on F 2 Resource Population in Huoyan Goose 3852 Cloning and Expression Analysis of Odorant Binding Protein Gene AcerOBP14 from Apis cerana cerana YU Jin-cheng, LI Zhe, YU Ning, ZHAO Hui DU Ya-li, ZHANG Zhong-yin, PAN Jian-fang, WANG Shu-jie, YANG Shuang, ZHAO Hui-ting, JIANG Yu-suo - IV -

6 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 曾幼玲, 杨瑞瑞 ( 新疆大学生命科学与技术学院 / 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 ) 摘要 :MicroRNA(miRNA) 是一类在生物体内普遍存在的非编码 长度约为 21 nt 的小 RNA 分子, 一般由内源基因编码,RNA 聚合酶 Ⅱ 转录后, 经过 Dicer-Like 酶等一系列的蛋白复合物将 pre-mirna(precursor mirna) 剪切成成熟 mirna, 在转录及转录后水平介导靶 mrna 转录沉默 降解或翻译抑制来调控基因的表达, 是真核细胞基因表达的重要调控因子 第一个 mirna 是在秀丽隐杆线虫 (C. elegans) 中发现的 lin-4, 与 lin-14 mrna 3 UTR 的碱基序列部分互补, 降解 lin-14, 从而抑制 lin-14 的表达 lin-4 对靶基因 lin-14 的调控与线虫的生长发育密切相关 而第一个发现的植物 mirna 是拟南芥 mir171, 它靶向剪切编码基因 Scarecrow-Like(SCL) 家族的 mrna, 调控其基因的表达, 进而影响植物的生长发育 植物部分 mirna, 如 mir156 mir408 在各植物物种中相对保守, 而 mir408 以后的 mirna 具有物种特异性 植物在生长过程中会遭遇诸多不可预知 ( 如同盐碱 干旱 重金属以及害虫和病原菌的侵扰等 ) 的环境胁迫 固着生长的特性使得植物不能像动物那样通过移动来避免不利环境的影响, 因此, 需要自身特殊机制来应对这些环境胁迫 植物在长期逆境中已进化出极为精细复杂的生理和分子机制 mirna 与它作用的靶基因是响应环境胁迫的主要调控因子 mirna 参与了植物的生长发育 信号转导 蛋白质降解 营养胁迫 抗病原菌的入侵以及适应高盐和干旱等逆境胁迫过程, 对于调节内源抗性基因表达具有一定意义 目前通过高通量测序 实时定量 PCR 检测和转基因等技术已经发现了很多与环境胁迫相关的 mirna, 它们在逆境胁迫下的表达呈现显著差异性 ;mirna 的过表达植株经逆境胁迫处理可能表现出一定的抗逆或敏感性 同一家族的 mirna 不同成员在响应环境胁迫时具有物种特异性 新疆地区是典型的大陆性干旱气候, 降水量少, 盐碱荒漠化地区多 在这样严酷的环境中顽强生存着许多盐生旱生类植物, 这些植物的 mirna 如何在逆境中发挥调控作用, 依然需要更深入的探索 本文主要综述了现阶段植物 mirna 生物合成 与靶基因作用方式 生物功能以及不同环境胁迫下对 mirna 和作用的靶基因影响等方面的研究进展, 以便更好地利用 mirna 依据的生物技术开展研究和应用转化 关键词 : 植物 microrna; 生物合成 ; 作用机制 ; 环境胁迫影响 Biological Characteristics of Plant MicroRNAs and Actions in Environmental Stresses ZENG You-ling, YANG Rui-rui (College of Life Science and Technology, Xinjiang University/Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Urumqi ) Abstract: MicroRNA (mirna) is an extensive class of non-coding and small molecular RNA with length about 21 nt. It is encoded by the endogenous gene and transcribed by RNA polymerase II and the precursor mirna is processed into mature mirna by Dicer-Like and a series of the protein complexes. mirna mainly regulates its targets at the level of post-transcription mediated degradation of target mrna or translation inhibition. mirna is an important regulator of gene expression in eukaryotic cells. Lin-4 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 新疆维吾尔自治区自然科学基金 ( C274) 联系方式 : 曾幼玲, zeng_ylxju@126.com

7 3672 中国农业科学 49 卷 is the first animal mirna discovered in Caenorhabditis elegans (C. elegans). It is essential for the growth and development of C. elegans by negative controlling the expression level of target gene lin-14 with partial complementarity to lin-14 mrna in the 3 untranslated region (UTR), causing the degradation of lin-14 gene and thus inhibiting the expression of lin-14 gene. Arabidopsis mir171 is discovered as the first mirna in plant, which targets mrna of Scarecrow-Like (SCL) family, and thus mir171 can affect plant growth and development by negative regulating target gene expression. Plant partial mirnas (from mir156 to mir408) are relatively conserved among different species and other mirnas after mir408 are species-specific. Plants will encounter all kinds of unpredictably environmental stresses (salinity, drought, heavy metal, pest and pathogen infection), because of plant sessile growth, no moving to avoid the adversely environmental effects like animals. Therefore, it is necessary for plants to cope with these stresses with their special mechanisms. Actually, plants grown chronically in the stressed environments have evolved highly complicated and delicate physiological and molecular mechanisms. Studies have showed that mirna and its target genes are the main regulatory factors in response to various stresses. mirnas play important roles in regulating the expression of endogenous resistance genes by involving in plant growth and development, signal transduction, protein degradation, nutrient deficiency, preventing pathogen invasion and adapting to high salt- and drought-stressed environments as well. So far, lots of mirnas are identified and have significantly differential expression by next-generation deep sequencing, advanced bioinformatics and real-time quantitative PCR technologies in response to environmental stresses; and the plants show the resistant or sensitive phenotypes by microrna-based transformation. The different members of mirna family responding to environmental stresses are also taken on being species-specific. It is well-known that China s Xinjiang is a kind of typical continental arid climate with a low annual rainfall and more acid areas. In such harsh environments, some extremely salt- and drought-tolerant halophytes and xerophytes can still survive healthy and strong. It is very essential to study deeply how plant mirnas play regulatory roles in coping with environmental stresses. This paper mainly summarizes plant mirna biosynthesis, the modes of actions with target genes and research status of some mirnas involving in the abiotic and biotic stresses. Some prospects are expected by microrna-based biotechnology. Key words: plant micrornas; biosynthesis; mechanism; environmental stresses microrna(mirna) 连续在 2002 和 2003 年被 科学 杂志评为十大科技新闻, 目前成为生物研究领域的热点之一 20 年来,miRNA 的生物合成和功能研究方面已经取得令人瞩目的成就 mirna 是 3 类具有明显特征的小 RNA(microRNA sirna Piwi-interacting RNA) 中的一种 [1], 是一类约 21 nt 的单链 RNA, 它对编码蛋白的基因表达起到负调控作用 [2] [3] 1993 年,LEE 等在秀丽线虫中发现长度为 21 nt 的第 1 个 mirna(lin-4), 它能部分与 lin-14 的 mrna 3 UTR 的碱基互补, 起到抑制 lin-14 的表达 lin-14 是线虫由幼虫第一阶段向第二阶段转化调控通路中的重要基因, 而第一个被发现的植物 mirna 是拟南芥 mir171 [4], 它靶向编码基因 Scarecrow-Like(SCL) 家族, 该基因家族在光信号通路 赤霉素信号传导 分生组织形成 根和腋芽的发育等不同的生物代谢过程中起着重要作用 [5] 植物在生长发育过程中, 不可避免地受到多种逆境胁迫影响 为了应对植物固着生长而无法有效逃避胁迫这一缺点, 植物进化出成熟且错综复杂的分子调控网络, 涉及能量代谢 信号转导 mrna 转录 蛋白质生物合成及降解 细胞膜的物质交换 光合作用 等植物生物化学 细胞和生理学进程等, 而 mirna 介导的转录后调控在这些生物学过程中发挥着重要作用 [6-9] mirna 广泛存在于真核细胞中, 是最大的基因家族之一, 约占基因组 1% 植物中第二丰富的小 RNA 就是 mirna [10], 是通过 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录生成的小 RNA [11] 在不同植物中,miRNA 的保守性是不同的,miR156 mir408 在各个物种中相对保守且表达量较高, 而 mir408 之后的 mirna 的表达量很低, 具有物种的特异性, 并且它们仅在某些特殊条件下受到诱导 [12] mirna 具有 2 种主要的生物学作用 : 第一, 响应植物生长发育过程中内源性刺激诱导植物细胞的增殖 ; 第二, 响应外界环境胁迫的适应性反应 [13] 有研究表明 mirna 与它们作用的靶基因是响应各种胁迫的主要调控因子 [14] mirna 几乎调控着植物所有生物学和代谢过程 [15], 对于调节内源抗性基因的表达具有重要意义 [16] 新疆地区是典型的大陆性干旱气候, 降雨量少, 盐碱荒漠化地区多 在这样的严酷生境中顽强地生存着许多盐生旱生类植物,miRNA 如何调控这些植物的抗盐碱和耐旱性, 需要进行更深入的探讨 基于此, 本文主要综述了植物 mirna 的生物合成 与靶基因的作用方式 mirna 的生物功能以及不同环境胁迫下

8 19 期曾幼玲等 : 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 3673 mirna 和对所调控靶基因的作用和影响, 便于更好地利用 mirna 依据的生物技术开展深入研究和应用转化 1 植物 mirna 的生物合成及作用机制 1.1 植物 mirna 的生物合成 mirna 是一类保守的内源性小 RNA, 在真核生物基因转录后起重要调控作用 [17] 大多数后生动物的 mirna 基因存在于内含子或外显子中, 而植物 mirna 基因是存在于基因间的, 并且它们的二级结构和长度在不同植物种类中差异性也比较大 [10] 动物的 mirna 在基因组上是成簇存在的, 并且它们会通过多顺反子的形式进行共转录, 相比之下, 除大豆外, 植物 mirna 基因很少串联排列 [18-19] 植物 mirna 的生物合成是一个复杂而精细的过程 ( 图 1), 它最初由 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录生成大约 bp 具有颈环结构的内源性转录物 pri-mirna(primary mirna) [20-22],pri-miRNA 与 mrna 相似, 具有 5 端 帽子 结构,3 端 polya 尾巴 植物 pri-mirna 能够被 DCL(Dicer-Like) 酶剪切加工成双链 premirna(precursor mirna) Dicer-Like 酶具有一个位于氨基端的 DExH-box RNA 解旋酶结构域, pri-mirna 可以通过具有 ATP 依赖性的 RNase Ⅲ 活 性的 DCL-Like 蛋白配合不同的蛋白 (HYL1 和 SE 等 ) 进行剪切, 在细胞核和细胞质中剪切成不同长度的 dsrna [21] 不同类型的 DCL 蛋白剪切成 dsrna 的长度是不同的, 如 DCL1 可以产生 nt 的小 RNA, DCL2 DCL3 和 DCL4 可以产生 和 21 nt 的小 RNA mirna 双链从前体中剪切下来后, 细胞核中的 HEN1 蛋白会使 mirna/mirna* 双链两端的 3 末端进行甲基化修饰, 这种修饰会防止 mirna 降解, 使 mirna 顺利进入 RISC(RNA-induced silencing complex,rna 介导的沉默复合物 ) [23-24] mirna/ mirna* 被甲基化后, 通过转运蛋白 HST 将其由细胞核输送到细胞质中, 其中, 与成熟体 mirna 互补的 mirna* 链可能会进入降解途径, 但是在某些环境条件下,miRNA* 也可能不被降解 越来越多的研究表明 mirna* 也具有一定功能 [25] 而另一条链成熟体 mirna 则与 AGO(Argonaute, 具有 PAZ 结构域,2 个 RNase Ⅲ 结构域和一个碳端的 dsrna 结合结构域 [20] ) 蛋白结合形成 RNA 介导的沉默复合体 (RISC) [10], 最后,RISC 切割靶 mrna 分子或是抑制靶 mrna 翻译, 从而抑制编码基因的表达 [10,26] 目前, 新的 mirna 命名不再以 mirna 和 mirna* 表示, 而是以成熟体在前体上的位置命名为 mirna-3p 和 mirna-5p,mirna-3p 接近前体的 3 端, 而 mirna-5p 则接近前体的 5 端 [27] MIR gene RNA PolⅡ DCL1 HYL1 CBC SE HEN1 细胞核 Nucleus HASTY 细胞质 Cytoplasm 降解 Degradation mirna* mirna mirna 介导的靶 mrna 切割和翻译抑制 mirna-directed mrna cleavage or translational repression AGO1 mrna [28] 图 1 植物 mirna 的主要生物合成途径 Fig. 1 Major biogenesis pathways of plant mirnas

9 3674 中国农业科学 49 卷 1.2 植物 mirna 的特征和作用机制 mirna 作为一类调控基因表达的小 RNA, 具有自身独特性 首先表现为 mirna 是一类 nt 的单链非编码核酸 ; 其次, 所有 mirna 前体都能够形成可预测的颈环结构, 且其颈环结构具有较低的自由能 ; 第三, 成熟体 mirna 的 5 磷酸基团和 3 羟基基团使它们很容易从大部分的寡核苷酸中区分出来, 并且加工成具有功能的小 RNA; 第四, 很多 mirna 都是比较保守的, 且具有时间和空间特异性 [29] 虽然 mirna 具有以上一些共性, 但是植物和动物 mirna 还是存在一些区别, 首先, 动物 mirna 成熟体主要为 22 nt, 而植物 mirna 成熟体主要为 21 nt, 这一现象在许多保守 mirna 中都可以观察到 例如拟南芥中大约有 80% 的 mirna 成熟体为 21 nt [25] ; 其次, 动物 mirna 在前体和成熟体上都表现保守性, 而植物 mirna 只有成熟体才表现保守性 ; 第三, 植物 mirna 前体的颈环结构比动物的更大且可变性也更为多样, 其前体序列长度分布范围 bp, 这也比动物 mirna 前体 bp 的序列长度分布范围大 [20] ; 第四, 植 物和动物中 mirna 和靶 mrna 的结合程度及作用部位是不同的, 多数植物 mirna 与其作用的靶基因几乎完全互补在靶基因的编码区, 而动物 mirna 与其靶基因是以不完全配对的方式作用在靶基因的 3 UTR 区 [29-30] mirna 对靶基因的调控方式可以分为 3 种类型, 一是 mirna 对靶 mrna 的直接剪切 ( 图 2-A); 二是 mirna 结合靶 mrna, 抑制编码基因的翻译 ( 图 2-B); 三是在转录水平的另一种调控方式, 即 mirna 靶向靶 DNA, 在转录水平沉默基因的表达 ( 图 2-C) mirna 与靶基因之间这种调控方式的不同, 与 mirna 和靶基因的互补程度有关 在靶 mrna 与 mirna 完全互补的情况下,miRNA 则介导 mrna 特异性切割 ; 如果 mirna 与靶基因存在一定的错配碱基,miRNA 则抑制靶基因的翻译 大部分植物 mirna 对靶基因的调控主要以前者为主 [29] mirna 通过转录后水平调控靶基因的表达 [21,31-33], 当 mirna 在翻译水平上抑制靶 mrna 的翻译时, 就不能在转录水平上直接检测到靶基因变化, 而只能在蛋白水平上被观测 mirna 与靶基因 mrna 编码区 A B mirna 与靶基因 mrna 3 -UTR 区的不完全互补 C 和非编码区的完全互补 Short complementary segments in 3 -UTR Extensive complementarity in coding region or UTR Cap An Cap An RISC RISC RISC Cap P An RISC Cap RISC RISC An mirna 与靶 DNA 的作用 Interaction with DNA 组蛋白甲基化 Histone methylation 活性的染色质 Active chromatin 沉默的染色质 Silent chromatin [20] 图 2 mirna 的作用机制 Fig. 2 The actions of mirnas 2 植物 mirna 与环境胁迫 2.1 胁迫下部分 mirna 与靶基因的作用关系陆生植物在生长过程中会遭遇诸多不可预知的环境胁迫, 如盐碱 干旱 虫害及病害的侵扰 固着生长的特性使植物不能像动物那样通过移动来避免不利环境的影响, 需要自身特殊机制来应对这些胁迫, 已进化出极为精细复杂的生理和分子调控机制 比如, 植物自身会调控某些 mirna 的生成 与表达, 通过 mirna 精确靶向 mrna 分子在转录和翻译水平调控编码基因的表达, 并通过基因之间的相互作用, 最终抵抗逆境 图 3 所示, 植物对高盐 干旱 低温和重金属等非生物和生物胁迫的响应过程中涉及很多 mirna, 通过与靶基因作用对其胁迫过程中植物的生长发育进行调控, 进而应对环境中的各种胁迫 mir398 通过靶向调控 2 种超氧化物歧化酶 CSD1 与 CSD2, 参与植物的生物胁迫 重金属 高盐 干旱 紫外辐射等非生物胁迫 [34-35] ; 干

10 19 期曾幼玲等 : 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 3675 旱诱导马铃薯 (Solanum tuberosum)3 类 mir171 的表达, 其靶向转录因子 GRAS 家族基因 [36] ; 在拟南芥中过表达 mir156, 转基因植株表现出增强的抗盐与抗渗透胁迫的能力 [37] 由于大气臭氧层的破坏, UV-B 辐射对于植物的伤害越来越严重 在拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 杨树(Populus tremula) 和小麦 (Triticum aestivum) 等植物中鉴定了一些 UV-B 胁迫相关的 mirna mir156/157 mir159/319 mir160 mir165/ 166 mir167 mir169 mir170/171 mir172 mir393 mir398 及 mir401 在拟南芥和杨树中是上调表达的 [38-39], 而小麦 mir395 在 UV-B 照射下下调表达, 它的靶基因 APS(ATP sulfurylases) 是硫同化途径中第一个关键酶,miR395 的表达水平依赖植物体内硫的水平,miR395 上调会造成 APS 的表达下调, 表明 mir395 通过调控 APS 来调控硫的同化 所以在 UV-B 的胁迫下, 小麦 mir395 抑制表达会激发硫代谢途径以形成足够的硫代谢物用来保卫植物细胞逃避 UV-B 胁迫 [40] 叶 花生长发育 Development of leaves and flowers 活性氧 ROS 清除 生长发育和形态建成 Growth, development and morphogenesis 生长发育 Growth and development TCP CSD1/CSD2 GRAS ARF mir319 mir398 mir171 mir167 mir160 金属胁迫 Metal stress 低温 Cold 干旱 Drought 高盐 Salinity 生物胁迫 Biotic stress 紫外线 UV-B mir393 mir166 mir156 mir169 mir395 mir172 TIR, F-box family HD-ZIPⅢ SBP-Like NF-YA APS, SULTR1;1, AP2 SULTR2;1, SULTR2;2 生长发育 盐碱胁迫 Growth, development and saline-alkali stress 侧生器官的背腹轴极性建成 The polarization building of dorsal-ventral axis of lateral organ 调节叶与芽的发育及生长阶段间的转换 Controlling the development of leaf and bud and the conversion of different growth stages 调控干旱胁迫相关基因及气孔闭合 Regulating the droughtrelated genes and stomatal closure 硫同化与转运 Sulfur assimilation and transportation 花器官建成 The building of flower organ 图 3 不同胁迫下部分保守 mirna 与靶基因的关系 Fig. 3 The relationship of partial conserved mirnas and target genes under various stresses 2.2 植物 mirna 与盐胁迫大约 6% 的可耕地受到盐渍化危害 [41] 植物体内存在诸多抵制盐胁迫的机制, 其中很多 mirna 参与 [42] 盐胁迫 LIU 等研究拟南芥经 300 mmol L -1 盐胁迫处理下的 mir156 mir159 mir394 mir165 mir394 [43] mir393 的表达量都有 倍的增长 ;SI 等通过高通量测序技术鉴定了 300 mmol L -1 NaCl 处理 3 d 的杨树幼苗中 164 个保守的 mirna, 属于 44 个 mirna 家族, 在叶中有 95 个保守 mirna 具有显著地表达变化 (56 个上调,39 个下调 ), 在根中有 84 个上调,

11 3676 中国农业科学 49 卷 71 个下调的表达变化 peu-mir393 peu-mir645 peu-mir860 和 peu-mir1444 在杨树根中呈现显著下调, 但在叶中变化不大, 说明 mirna 在胁迫中的表达具有组织特异性 水稻 mir169 家族成员被证明参与盐胁迫,miR169g 和 mir169n ( 靶基因具有 CCAAT-box 的转录因子 NF-YA) 在盐胁迫下显著诱导 ; 拟南芥 mir169 家族中一些成员也受盐的诱导, 因此,miR169 被认为是盐响应的 mirna [42,44] 荧光定量 PCR 检测 NaCl 处理的棉花叶和根组织中的 mirna, 棉花叶组织中 mir156 mir157 mir159 mir172 和 mir397 等在 0.25% NaCl 低盐胁迫下呈现上调或下调的趋势, 而 0.5% NaCl 高盐胁迫下其全部表现为下调 ; 棉花根组织中 mir156 mir157 与 mir172 在低盐胁迫下表现为上调, 而高盐胁迫下表现为下调 棉花 mir397 在低盐浓度处理时, 表达水平达到最低, 随着盐浓度的升高其表达升高 总体来说, 在盐胁迫下, 棉花 mirna 的表达具有胁迫浓度依赖性 [45] 拟南芥 mir402 受盐诱导, 过表达 mir402 的拟南芥植株在盐胁迫下的种子萌 发率及植株生长都要好于非转基因植株 [46] 水稻 mir396c 在水稻和拟南芥中的转基因功能验证的结果表明转基因植株在盐胁迫下的耐受性都降低了, 而过表达拟南芥的 mir396a/b( 根据 mirbase 显示的结果, 水稻 mir396c 与拟南芥 mir396a/b 成熟体只差一个碱基 ) 转基因植株的耐盐性提高了, 这两种不同的转基因结果暗示同一 mirna 家族不同成员可能在不同的植物中对胁迫抗性发挥着不同作用 [47] 目前, 有超过 40 个家族的植物 mirna 与胁迫有关, 其中很多涉及盐和旱胁迫 ( 表 1), 并且一些 mirna 不止在一种植物中报道, 表明这些 mirna 在这些植物中可能具有保守功能 [28,48] ; 但同时也有发现 mirna 在不同物种中受到盐胁迫的表达模式存在差异, 表明 mirna 的表达具有物种特异性 ( 表 1) 2.3 植物 mirna 与干旱胁迫干旱是农业生产中经常发生的主要环境胁迫 植物主要通过调控一系列干旱响应的基因适应干旱环境 迄今为止, 已鉴定了大量的干旱响应基因, 这些 表 1 不同物种部分 mirna 和靶基因及盐胁迫下 mirna 的表达情况 Table 1 Partial mirnas and target genes in different species and the expression of these mirnas under salt stress mirna 靶基因 Target gene mirna 表达水平 Expression level of mirna 物种 Species 参考文献 Reference mir160 ARFs 上调 Up regulation 棉花 Gossypium spp [49] mir395 NADP-ME 上调 Up regulation 玉米 Zea mays [9] mir396 GRFs 上调 Up regulation 拟南芥 Arabidopsis thaliana [42] 下调 Down regulation 玉米 Zea mays [9] mir398 CSD1, CSD2 上调 Up regulation 欧洲山杨 Populus tremula [50] 下调 Down regulation 中间锦鸡儿 Caragana intermedia [51] mir408 Peptide chain release factor 上调 Up regulation 豇豆 Vigna unguiculata [52] mir393 TIR1/bHLH 上调 Up regulation 烟草 Nicotiana tabacum [53-54] mir319 TCP 上调 Up regulation 拟南芥 Arabidopsis thaliana [42] 下调 Down regulation 柳枝稷 Panicum virgatum [55] mir165 Class Ⅲ HD-ZIP 上调 Up regulation 拟南芥 Arabidopsis thaliana [42] mir166 HD-ZIP 下调 Down regulation 玉米 Zea mays [9] mir156 SBP 上调 Up regulation 胡杨 Populus euphratica [56] 下调 Down regulation 柳枝稷 Panicum virgatum [55] mir171 SCL 上调 Up regulation 拟南芥 Arabidopsis thaliana [42] 轻微下调 Slight down-regulation 棉花 Gossypium spp [49] mir172 AP2 上调 Up regulation 花椰菜 Brassica oleracea [57] mir169 NF-YA 上调 Up regulation 水稻 Oryza sativa [44] mir167 ARFs 上调 Up regulation 中间锦鸡儿 Caragana intermedia [51]

12 19 期曾幼玲等 : 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 3677 基因的编码产物不仅在保护植物细胞免受干旱影响, 而且有的会在信号转导过程中调控其他基因的表达来响应干旱胁迫 然而这些基因如何在转录及翻译水平组合在一起协调发挥功能等具体的调控机制, 当前研究的并不完全, 植物 mirna 的发现对回答这些问题提供了一些线索 众所周知,miRNA 介导的植物响应各种胁迫是通过调控它的靶基因 ( 主要是一些转录因子 ) 来实现的, 从而成为植物胁迫响应机制中的重要组成部分 [58] 土豆 [59] 棉花 [45] 大麦 [60] [61] 芥菜等植物受到干旱胁迫后, 其 mirna 的表达都会受到影响 ; 高通量测序干旱胁迫下的马铃薯小 RNA, 获得大量保守和特异的 mirna, 差异表达分析的结果显示 100 个已知 mirna 下调表达,99 个上调表达 ;119 个物种特异的 mirna 诱导表达,151 个下调表达 荧光定量 PCR 试验验证了这些与干旱相关的 mirna 与它们的靶基因呈现负相关, 与高通量测序的结果一致 [59] 此外, 通过转基因手段研究 mirna 的功能是一个更为直接有效的方法 水稻 mir319a 转入翦股颖, 转基因翦股颖的抗旱性提高 野生型植物缺水处理, 叶片与茎秆生物量明显少于转基因植物 [58] 有报道植物受到干旱胁迫, 会通过提前开花逃避胁迫, 但是这种自我保护的逃避方式会造成农业减产 有学者对这一过 程中的基因展开研究, 发现在拟南芥中 mir172e 受到光周期因子 GI( 光周期因子 ) 的调控 长期干旱状态下,GI 会促进 mir172e 的表达量升高, 进而抑制它的 2 个靶基因 WRKY44 与 TOE1( 调控开花模式 ) 的表达, 而 WRKY44 蛋白与 TOE1 蛋白之间会相互作用, mir172e 与靶基因以及这 2 个靶基因编码产物之间的相互调节的关系会影响糖信号通路 (sugar signalling), 造成植物的提前开花 同样, 过表达 mir172e 的拟南芥植物也会出现与干旱胁迫同样的表型, 表明通过一系列 mir172e 与靶基因以及靶基因与靶基因之间的正负调控, 最终导致植物在干旱状态下表现出提前开花的逃避现象 ( 图 4) [62] 植物 mir169 家族有许多成 [63] 员,WANG 等利用基因芯片筛选到的 199 个陆地棉 microrna 中,miRl69 可能与干旱应激反应有关 然而这些成员在不同物种的干旱胁迫下的表现是不一样的 拟南芥 mir169a 和 mir169c 在干旱胁迫下下调表达, 过表达 mir169a 和 mir169c 的转基因拟南芥植株较野生型表现出干旱更为敏感的表型 ; 然而, 番茄 mir169c 在干旱胁迫下上调表达, 转基因 mir169c 的番茄植株的抗旱性增强, 气孔导度与失水率较非转基因植株低 [64], 这些结果再次表明同一 mirna 家族成员在不同物种中具有不同的作用 SD 枯萎 Withered 干旱胁迫 Drought stress LD 光周期因子 GI DCL1 mir172 WRKY44 转录因子 WRKY44 TOE1 TOE1 糖信号途径 Sugar signalling 干旱防御 ( 渗透调节 ) 和干旱逃避 ( 提早开花 ) Drought defence (osmotic regulation) and drought escape (flowering) 图 4 拟南芥躲避干旱胁迫的调控方式 Fig. 4 The diagram of regulation mechanism of avoiding drought stress for A. thaliana 2.4 植物 mirna 与重金属胁迫一般情况下, 重金属以环境可适浓度广泛分布在自然界中 随着社会发展和人类活动的加剧, 包括采矿 废气和污水排放及重金属使用日益增多, 造成铅 汞 镉和钴等生物毒性显著的重金属元素及化合物进入到大气 水和土壤中 有些重金属对于植物是必要元素, 如 Fe Cu 和 Zn 等参与植物正常的生理生化过程, 而有些重金属元素是非必要的, 如 Cd Co Hg 和 Al 等, 但不论哪一种元素, 植物体内的重金属浓度过高会触发机体内活性氧的积累, 脂质 蛋白质以及 DNA 物质的损害, 导致机体代谢紊乱, 影响植物生长, 甚至死亡 [65-66] 植物在响应这些胁迫过程中涉及一些精确的转录及转录后水平调控 愈多的研究结果显示植物已进化出以信号转导 易位 滞留等特异的内在机制抵御重金属对植物的伤害 [67], 其中 mirna 的调 控占有重要地位 [68] [69] SUNKAR 等研究拟南芥在高铜

13 3678 中国农业科学 49 卷 和高铁胁迫下,miR398 的表达降低, 其所调控的 Cu/Zn 超氧化物歧化酶靶基因表达上调, 这种调控方式提高了拟南芥对重金属胁迫的耐受性 镉胁迫下水稻诸多 mirna 的表达发生变化, 微阵列芯片分离到了 19 个镉胁迫应答相关的 mirna, 除了 mir528 表达显著上升外,miR166 mir171 mir168 mir162 mir396 mir390 mir156 mir1432 mir444 等表达水平均下降 [70] 拟南芥 ABC 运输体对镉 (cadmium,cd) 和汞 (mercury,hg) 等重金属通过螯合作用运输并储存在植物细胞的液泡中来降低对植物的伤害, 同时 ABC 运输体基因缺失的拟南芥突变体会对 Cd 和 Hg 重金属相当敏感 [71] 而 mir192 靶向 ABC 运输体基因, 过表达 mir192 的水稻对 Cd 胁迫敏感 [72], 说明 mirna 在植物受到重金属胁迫时, 可以调节其作用的靶基因, 其表达产物在植物体内的含量以应对环境胁迫 2.5 植物 mirna 与生物胁迫动物 mirna 介导病毒感染的抗性增强或减弱 [73] 许多植物 mirna 与病毒 细菌 真菌 线虫等生物胁迫也是有相互联系的 草酸 (oxalic acid,oa) 是 [74] 多种植物病原真菌的致病因子 陈晓婷等利用植物 microrna 芯片获得了草酸胁迫下的拟南芥 3 个差异表达的 mir2988 mir3090 和 mir3131, 并鉴定了与靶基因的负相关性 烟草感染病毒后,miR156 mir160 和 mir164 被诱导表达 [75] 通过 mirna-microarray 方法比较小麦抗真菌和真菌敏感的 2 个品种在真菌感染后 mirna 的表达情况 抗性品种的小麦 mir2592s mir869.1 和 mir169b 等 mirna 较敏感型小麦品种具有显著的差异表达 (200 倍的差异变化 ), 并且某些 mirna 在真菌感染后第一时间产生 分析表明小麦中这些差异 mirna 的靶基因很多都是与抗真菌相关的编码基因 ( 葡萄糖醛酸转移酶,glucuronosyl transferase, LRR peroxidase 以及 Pto kinase) [76] [77] WU 等用类似方法检测到玉米经真菌 Exserohilum turcicum 感染后的某些 mirna(mir811 mir829 mir845 与 mir408) 差异性表达 在水稻中与水稻 - 稻瘟病菌互作相关的 mirl60a 和 mir398b 的靶基因表达与相应 mirna 累积量呈负相关性, 过表达 mirl60a 和 mir398b 的转基因水稻明显增强水稻对稻瘟病的抗性 [78] 几乎所有植物和动物都具有识别病原信号的病原识别受体 (pathogen recognition receptors,prrs) [21] [79] LI 等报道烟草的 2 个 mirna(mir6019 和 mir6020) 的靶基因是 TIR-NBLRR immune receptor N,miRNA 在抵御病原菌感染, 增强植物的生物抗性方面起调控 作用 来源于拟南芥的 mir159 前体被修饰成人造 mirna(artificial mirna 或 amirna), 靶向 2 个基因沉默抑制子 - 芜菁黄花叶病毒 (turnip yellow mosaic virus,tymv) 的 P69 以及芜菁花叶病毒 (turnip mosaic virus,tumv) 的 HC-Pro, 分别过表达 amir-p 和 amir-hc-pro 159 的转基因拟南芥呈现出特异性抵抗 TYMV 和 TuMV 的表型, 而同时拥有这 2 种人工 mirna 的过表达转基因植株表现出对这 2 种病毒的双抗性 [80-81] 此外,miRNA 也可能会通过某些信号转导通路以响应病原菌对植物的伤害 拟南芥 mir393 靶向生长素信号通路中的 F-box 生长素受体, 在受到丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 侵害后,miR393 被诱导表达, 使得生长素受体表达受到抑制, 从而抑制了细菌生长, 表明 mir393 可能通过生长素信号通路参与宿主抗菌进程 [21,82] 综上, 生物胁迫过程中存在 mirna 调节, 这种调控方式对于改良农作物性状, 抵御病害具有积极而重要的意义 3 展望 世界人口数量不断增加, 环境持续恶化, 对人类生存造成极大威胁 提高在逆境下粮食品种的抗逆性迫在眉睫 科学家们一直在努力阐释植物的抗逆机制, 但是这些研究成果依然不够成熟 mirna 在植物抗逆方面的研究和应用还有很长的路要走 首先, 过去十几年里, 计算机和深度测序技术的不断发展 [83-84], 越来越多的植物 mirna 相继被发现, 又多在逆境胁迫和发育方面对 mirna 表达水平进行鉴定, 而 mirna 的功能鉴定和调控机制方面的研究比较少 有很多植物成熟 mirna 如何通过转录后修饰和降解影响 mirna 的稳定性和活性, 进而调控植物胁迫响应的生物学过程都尚未解析 [85] 基于此, 未来对参与环境胁迫的 mirna 的探索是非常必要的 ; 其次, 对 mirna 研究广度的不断拓展, 发现了大量的 novel mirna, 但是这些 novel mirna 是如何进行调控的, 基本都是未知的 ; 第三, 对于已知保守的 mirna, 在表达上往往呈现物种和时空的特异性, 寻找出植物 mirna 这种特异性的原因对于深入了解 mirna 的调控机制意义重大, 所以现阶段对于 mirna 的研究只是冰山一角, 还有巨大的信息需要研究者去挖掘 ; 第四,miRNA 约占总基因的 1%, 这将意味着尚有许多 mirna 有待发现 由于很多植物没有基因组信息以及植物 mirna 前体结构的多变性, 使得植物 mirna 前体不容易获得, 这对于 mirna 的

14 19 期曾幼玲等 : 植物 mirna 的生物学特性及在环境胁迫中的作用 3679 功能研究是一个阻碍, 虽然人工 mirna 对于解决这一问题提供了一个不错的方法 迄今为止, 很多植物 mirna 的表达都与环境胁迫显著相关, 其相关研究越来越多 综上所述, 植物 mirna 的抗逆研究存在挑战性, 但其研究价值意义重大 References [1] DING J, ZHOU S, GUAN J. Finding microrna targets in plants: Current status and perspectives. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2012, 10(5): [2] GIELEN H, REMANS T, VANGRONSVELD J, CUYPERS A. MicroRNAs in metal stress: Specific roles or secondary responses? International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(12): [3] LEE R C, FEINBAUM R L, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75: [4] LLAVE C, XIE Z X, KASSCHAU K D, CARRINGTON J C. Cleavage of scarecrow-like mrna targets directed by a class of Arabidopsis mirna. Science, 2002, 297(5589): [5] GRIMPLET J, AGUDELO-ROMERO P, TEIXEIRA R T, MARTINEZ- ZAPATER J M, FORTES A M. Structural and functional analysis of the GRAS gene family in grapevine indicates a role of GRAS proteins in the control of development and stress responses. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 353. [6] LLAVE C. MicroRNAs: More than a role in plant development? Molecular Plant Pathology, 2004, 5(4): [7] KIM B H, KWON Y, LEE B, NAM K H. Overexpression of mir172 suppresses the brassinosteroid signaling defects of bak1 in Arabidopsis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 447(3): [8] SUNKAR R, ZHU J K. Novel and stress-regulated micrornas and other small RNAs from Arabidopsis. The Plant Cell, 2004, 16(8): [9] DING D, ZHANG L F, WANG H, LIU Z J, ZHANG Z X, ZHENG Y L. Differential expression of mirnas in response to salt stress in maize roots. Annals of Botany, 2009, 103(1): [10] VOINNET O. Origin, biogenesis, and activity of plant micrornas. Cell, 2009, 136(4): [11] ROGERS K, CHEN X M. Biogenesis, turnover, and mode of action of plant micrornas. The Plant Cell, 2013, 25: [12] TANG G. Plant micrornas: An insight into their gene structures and evolution. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2010, 21(8): [13] KRUSZKA K, PACAK A, SWIDA-BARTECZKA A, NUC P, ALABA S, WROBLEWSKA Z, KARLOWSKI W, JARMOLOWSKI A, SZWEYKOWSKA-KULINSKA Z. Transcriptionally and posttranscriptionally regulated micrornas in heat stress response in barley. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(20): [14] FANG Y J, XIE K B, XIONG L Z. Conserved mir164-targeted NAC genes negatively regulate drought resistance in rice. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(8): [15] ZHANG B H, WANG Q L. MicroRNA-based biotechnology for plant improvement. Journal of Cellular Physiology, 2015, 230(1): [16] LU Y D, GAN Q H, CHI X Y, QIN S. Roles of microrna in plant defense and virus offense interaction. Plant Cell Reports, 2008, 27(10): [17] VERMA S S, SINHA R, RAHMAN M H, MEGHA S, DEYHOLOS M K, KAV N N V. mirna-mediated posttranscriptional regulation of gene expression in ABR17-transgenic Arabidopsis thaliana under salt stress. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32(6): [18] KIM V N. MicroRNA biogenesis: Coordinated cropping and dicing. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2005, 6(5): [19] ZHANG B H, PAN X P, STELLWAG E J. Identification of soybean micrornas and their targets. Planta, 2008, 229(1): [20] BARTEL D P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116(2): [21] KUMAR R. Role of micrornas in biotic and abiotic stress responses in crop plants. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 174(1): [22] ZHOU M, LUO H. MicroRNA-mediated gene regulation: Potential applications for plant genetic engineering. Plant Molecular Biology, 2013, 83(1/2): [23] BOUTET S, VAZQUEZ F, LIU J, BECLIN C, FAGARD M, GRATIAS A, MOREL J B, CRETE P, CHEN X M, VAUCHERET H. Arabidopsis HEN1: A genetic link between endogenous mirna controlling development and sirna controlling transgene silencing and virus resistance. Current Biology, 2003, 13(10): [24] YU B, YANG Z Y, LI J J, MINAKHINA S, YANG M C, PADGETT R W, STEWARD R, CHEN X M. Methylation as a crucial step in plant microrna biogenesis. Science, 2005, 307(5711): [25] LIU Y X, WANG M, WANG X J. Endogenous small RNA clusters in plants. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2014, 12(2): [26] YU B, WANG H. Translational inhibition by micrornas in plants. Progress in Molecular and Subcellular Biology, 2010, 50: [27] KOZOMARA A, GRIFFITHS-JONES S. mirbase: Annotating high

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18 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 姚涵 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 1,2 1,2 1, , 汤才国, 赵静, 郑琪, 李滨, 郝晨阳, 李振声, 张学勇 ( 1 南京农业大学农学院, 南京 ; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 ; 3 中国科学院遗传与发育生物学研究所 / 植物细胞与 染色体工程国家重点实验室, 北京 ) 摘要 : 目的 偃麦草(Thinopyrum) 是小麦 (Triticum aestivum L.) 的多年生野生近缘植物, 具有许多可用于小麦品种改良的优异基因 利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系 绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质 克隆十倍体长穗偃麦草 (Th. ponticum (Host) Liu and Wang) 基因组特异重复序列, 可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质 方法 通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库, 并对文库进行高密度点杂交 (Dot-blot hybridization) 筛选, 结合荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技术, 获得偃麦草基因组特异的重复序列, 分析其在不同基因组及染色体上的分布特点 利用 Repeat Masker 在小麦族重复序列数据库 (Triticeae repeat sequence database,trep) 及 NCBI GenBank 对特异重复序列进行比对分析, 并设计偃麦草基因组特异重复序列的 PCR 引物 通过 FISH 分析和特异 PCR 引物扩增, 对小麦 - 偃麦草衍生后代进行鉴定和选择 结果 获得 7 条偃麦草基因组特异的重复序列 FISH 分析表明, 其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布, 且在不加小麦封阻 DNA 的情况下, 能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体 将其应用到小麦 - 偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中, 特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段, 而且信号相比基因组原位杂交 (genomic in situ hybridization,gish) 更加特异和清晰 基于偃麦草基因组特异重复序列开发了 90 对引物, 通过在中国春 十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析, 筛选出 36 对 (40%) 偃麦草基因组特异 PCR 标记 ; 利用这些特异引物对 109 份小麦 - 偃麦草衍生材料进行扫描, 发现 10 对扩增效果较好的特异引物, 其检测效率为 73.3% 95% 结论 获得偃麦草基因组特异的重复序列, 开发了特异 PCR 扩增引物, 可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪 关键词 : 小麦 ; 偃麦草 ; 特异重复序列 ; 荧光原位杂交 ;PCR Isolation of Thinopyrum ponticum Genome Specific Repetitive Sequences and Their Application for Effective Detection of Alien Segments in Wheat YAO Han 1, 2, TANG Cai-guo 1, 2, ZHAO Jing 1, 2, ZHENG Qi 3, LI Bin 3, HAO Chen-yang 2, LI Zhen-sheng 3, ZHANG Xue-yong 2 ( 1 College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing ; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing ; 3 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences/State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Beijing ) Abstract: Objective As a tertiary gene pool of wheat, Thinopyrum genus has many useful traits, such as tolerance to both abiotic and biotic stresses. DNA repetitive sequence is one major component for genomes of most eukaryotes. Isolation of genome 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 国家高技术研究发展计划 (2011AA1001) 国家小麦产业技术体系 (CARS-3-1-2) 联系方式 : 姚涵,Tel: ; nxzzyh0913@163.com 通信作者张学勇,Tel: ; zhangxueyong@caas.cn

19 3684 中国农业科学 49 卷 specific repeats is very helpful for understanding of sub-genome component of polyploid species, their evolution and utilization in crop improvement. To identify Th. ponticum chromatin in wheat genetic background more accurately and efficiently, genome specific repetitive sequences were cloned from Th. ponticum. Method Screening the plasmid library of Th. ponticum via dot-blot hybridization, combining with fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the wheat-th. ponticum partial amphiploids, Th. ponticum genome specific repetitive sequences were isolated and their distribution patterns on chromosomes were characterized by FISH. The Th. ponticum genome specific repeats were analyzed by Repeat Masker, Triticeae Repeat Sequence Database and NCBI. A set of PCR primers was designed for detecting Th. ponticum chromosomal fragments. Wheat-Th. ponticum hybrid derivatives were employed to testify the genome specificity and effectiveness of these repeats in identifying Th. alien fragments in wheat genetic background. Result Seven Th. ponticum genome specific repetitive sequences were obtained. Their FISH signals dispersively covered all chromosomes in Th. ponticum and Th. intermedium. Furthermore, they could discriminate chromosomes of Th. ponticum and Th. intermedium from wheat chromosomes without wheat DNA block by FISH. This was further proved in wheat-th. ponticum substitution lines and translocation lines. Ten PCR primers were developed for efficient amplification of Th. ponticum segments in wheat. Their detection efficiency ranged from 73.3% to 95% in 109 wheat-th. ponticum derivatives. Conclusion Th. ponticum genome specific repetitive sequences were isolated, which can be used for detection of wheatgrass fragments in wheat by FISH or PCR amplification. Key words: T. aestivum; Th. ponticum; genome specific repetitive sequences; FISH; PCR 0 引言 研究意义 在小麦种质资源中, 野生种的遗传多样性最丰富 [1], 蕴藏着大量的优异基因 [2-7], 因此, 远缘杂交是小麦品种改良的重要方法之一 基因组原位杂交具有直观 有效的特点, 已被广泛用于检测和鉴定小麦或其他栽培作物背景下的外源遗传物质 在育种工作中, 物种间亲缘关系越近, 越容易杂交成功, 但在外源片段检测时, 基因组之间的非特异交叉杂交就难以避免, 即使探针:封阻 DNA 达到 1:50 1 : 70, 基因组原位杂交 (genomic in situ hybridization, GISH) 也能够在小麦染色体上产生较强的信号 [8] 小 麦族植物基因组中重复序列含量高达 70% 以上 [9], 利 用基因组特异重复序列可以深入研究异源多倍体的构 成, 进行核型分析和染色体识别, 揭示基因组间相互 渗透的机理 [10-12] 因此, 分离筛选更多异源染色质特 异性序列, 用于外源遗传物质的追踪和鉴定 [13-17], 对 于提高小麦远缘杂交后代的选择效率和准确性具有重 要意义 前人研究进展 迄今, 偃麦草是小麦遗传 改良中利用最为成功的多年生野生近缘种 孙善澄先生从 20 世纪 50 年代就开始尝试将中间偃麦草的优良性状导入小麦中, 在国内首先创造和培育出中 1 中 5 等 5 个具有特殊抗性 品质优良的八倍体小偃麦, 其中, 中 4 和中 5 高抗黄矮病已成为全球小麦抗病育种的重要抗源材料, 先后被利用培育成龙麦 10 号 晋春 9 号 高优 503 等抗耐黄矮病新品种 [18-23] [24] 李振声等 将普通小麦与十倍体长穗偃麦草杂交选育出了丰产 抗病的冬小麦新品种小偃 6 号, 并已成为中国优质小麦的育种骨干亲本 随后, 他们又以小偃 6 号为基础材料, 选育出了面粉品质优良 抗逆与抗病性强 适应性广 产量稳定的小偃 54 小偃 81 等小麦新品种 [25] 夏光敏等利用不对称体细胞杂交技术, 将长穗偃麦草的染色体小片段导入济南 177, 最终获得了耐盐 高产的小麦新品种山融 3 号 总体来说, 偃麦草属作为普通小麦的三级基因源 [1], 随着表型 基因型鉴定技术的发展, 必将在小麦品种改良中发挥更重要的作用 目前, 在荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,fish) 检测中, 最常用的探针有 5S 和 45S rdna 基因 psc119.2 和 pas1 端粒区的串联重 复序列以及着丝粒特异重复序列等, 还有一些从各个 基因组中克隆的序列 [26] [27] 例如,KATO 等利用重复 序列在染色体上的分布特征, 建立了玉米染色体分子 核型模式图, 通过 FISH 的方法就能将玉米 10 对染色 [28] 体区分开 ZHANG 等通过回收 RAPD 扩增产物分 离出簇毛麦基因组特异的 Gypsy 类反转录转座子 C1-10, 可以将小麦 - 簇毛麦双二倍体和易位系中的簇 毛麦染色体及染色体片段鉴定出来 ; 同时, 将特异序 列转化为 SCAR 分子标记, 可用于追踪小麦 - 簇毛麦杂 [29] 交后代中的外源遗传物质 DENG 等通过微分离和 微克隆技术, 得到了黑麦 1RS 和 1R 染色体的 DOP-PCR 产物, 利用其对六倍体小黑麦进行 FISH 分析 ( 未加小麦封阻 ), 发现杂交信号只分布在 14 条黑麦染色体上 ; 而 GISH( 加封阻 ) 在小麦中产生非特 异杂交 说明得到的序列为 R 基因组特异, 可用于检

20 19 期姚涵等 : 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3685 测小麦背景下的黑麦染色体 本研究切入点 前人通过基因组文库法 分离基因组特异 RAPD 片段和 PCR 增效减法杂交等技术, 从长穗偃麦草 百萨偃麦草和二倍体拟鹅观草中克隆出一些 E 组 ( 包括 E e 和 E b ) 和 St 组特异的重复序列 [30-34], 可以用来检测导入到小麦背景中的偃麦草染色体 尚未见有分离十倍体长穗偃麦草基因组特异重复序列的研究报道 拟解决的关键问题 本研究通过点杂交和荧光原位杂交等方法, 获得十倍体长穗偃麦草基因组特异的重复序列, 将其用于 FISH 分析, 可以准确 高效地鉴定小麦 - 偃麦草杂交后代的外源染色体及染色体片段 同时, 利用这些特异重复序列设计 PCR 引物, 进一步丰富了偃麦草特异的分子标记, 为建立小麦 - 偃麦草系列导入系提供工具, 为导入性状的遗传解析提供方便 1 材料与方法 1.1 材料普通小麦中国春 (T. aestivum L.,2n = 42,ABD, Chinese Spring), 十倍体长穗偃麦草 (Th. ponticum (Host) Liu and Wang,2n = 70,StStE e E b E x,pi578682), 六倍体中间偃麦草 (Th. intermedium (Host) Barkworth and D. R. Dewey,2n =42, StE e E b,z1141), 黑麦 (Secale cereal L.,2n =14,R), 大麦 (Hordeum vulgare L., 2n = 14,H), 八倍体小偃麦小偃 693(2n = 56,ABDE) 和小偃 784(2n = 56,ABDSt(E)), 小麦 - 偃麦草杂交衍生系材料 1.2 高密度膜点杂交十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库 (1 5 kb) 高密度膜的制备过程如下 : 利用 HindⅢ 和 DpnⅡ 分别对十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 进行完全酶切, 同时分别对 puc19 载体进行完全酶切, 采用 T4 DNA 连接酶连接, 电转至大肠杆菌感受态细胞中, 将复苏好的菌液涂布到 LB 固体培养基 (Car./IPTG/X-gal) 方板中进行培养 用 Genetix QPix Robert (BioSurplus) 中的 Picking 挑取克隆 ; 通过 Genetix QPix Robert 中的 Gridding 将克隆转到 Biodyne plus 型印迹膜 (PALL) 待膜上的菌斑生长至大小合适后裂解膜上细菌并洗脱处理, 干燥后保存备用 用十倍体长穗偃麦草 (PI578682) 基因组 DNA 作探针, 将其用非接触式超声波破碎仪 (Diagenode SA) 打断至 500 bp 1 kb, 主要富集于 750 bp; 封阻为中国春基因组 DNA, 打断至 bp,-20 保存备用 使用 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2(TaKaRa) 试剂盒进行探针的标记, 采用 [α- 32 P] dctp 来标记 DNA 分别按照 1:35 和 1:50 的探针 / 封阻比例, 进行 2 次点杂交筛选, 具体方法同 Southern 杂交 [35] 用磷屏扫描仪 (BIO-RAD) 检测杂交膜信号, 根据信号的强弱, 选择适当的压屏时间 用 Quantityone 软件分析图像, 在 Photoshop CS6 中进行图像整理 1.3 荧光原位杂交挑选饱满的种子置于垫有双层湿滤纸的培养皿中 23 萌发, 露白后在 4 条件下作同步化处理 24 h, 然后转入 23 恒温培养 24 h, 剪取长度适宜的根尖, [36] 参考 HAN 等描述的方法进行有丝分裂中期染色体 [37] 的制备 原位杂交参考 LI 等的方法 以偃麦草特异序列为探针, 通过缺刻平移法用 Digoxigenin-11-dUTP 或 Biotin-16-dUTP(Roche) 标记, 二抗为 Anti-dig- Rhodamine 或 Avidin-FITC(Roche) 用 Axio Imager. Z2(Carl Zeiss) 荧光显微镜观察, 经 AxioCam HRc 高分辨彩色 CCD 进行图片的采集, 并用 ZEN 2012 软件分析处理图片 1.4 测序及序列分析使用通用引物 M13F(-47) 和 M13R(-48) 对特异序列进行测序, 在此基础上继续设计引物直至将序列测通 利用 Lasergene 软件中的 SeqMan 程序进行拼接组装, 并去除低质量序列和载体序列 利用 Repeat Masker 在线软件 ( repeatmasker.org/cgi-bin/webrepeatmasker) 和 TREP 数据库 [38] ( 对特异序列进行分析, 在 NCBI BLAST( ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 中进行同源比对 1.5 引物设计利用 URGI( php) 中的小麦 21 条染色体数据库 乌拉尔图小麦基因组数据库 拟斯卑尔脱山羊草基因组数据库以及粗山羊草基因组数据库进行比对, 选择相似性高的序列保存为.fas 格式的文件 用 DNAStar 中的 MegAlign 软件找到差异位点或低相似区开发特异分子标记 利用 primer 3.0( 在线软件设计引物, 引物编号为序列名称和扩增片段大小的组合 全部引物均由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 1.6 DNA 提取及特异标记的 PCR 检测按 CTAB 法提取材料基因组 DNA PCR 扩增体系为 15 µl, 包括模板 DNA 50 ng 左右 Primers(10

21 3686 中 国 农 µmol L µl 10 Taq buffer 1.5 µl Mg 业 科 学 49 卷 作探针 中国春基因组 DNA 作为封阻 对已构建的 mmol L 0.8 µl dntps 25 mmol L 0.1 µl Taqase 十倍体长穗偃麦草质粒文库进行筛选 通过首次点 5 U µl µl 加 ddh2o 至 15 µl PCR 反应程 杂交 探针 封阻=1 35 从 8 张高密度膜 共 序为 94 5 min s 根据引物调 计 个克隆 中筛选获得 个阳性克隆 整退火温度 45 s 72 1 min 33 个循环 有 439 个信号较强 图 1-A 在文库中挑取对应 min 4 保存 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 的克隆并提取质粒 将其集中在一张杂交膜上 进 2 行第二次点杂交 探针 封阻=1 50 筛选出 77 结果 个信号较强的阳性克隆 图 1-B 其中 19 个克 2.1 十倍体长穗偃麦草基因组特异序列的分离 利用十倍体长穗偃麦草 PI 基因组 DNA 隆在 2 次点杂交中信号均较强 为分离所得的偃麦 草特异序列 A 和 B 为 2 次点杂交 均以十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 作探针 普通小麦中国春基因组 DNA 作封阻 A 探针 封阻=1 35 B 探针 封阻 =1 50 Dot hybridization to screen out the candidate clones. Probe: Th. ponticum genomic DNA, Block: CS genomic DNA. A: Probe:Block=1:35; B: Probe: Block=1:50 图1 十倍体长穗偃麦草质粒文库高密度膜的点杂交结果 Fig. 1 Dot-blot hybridization of Th. ponticum plasmid library 2.2 通过 FISH 分析获得 7 条偃麦草基因组特异的重 复序列 倍体中间偃麦草 Z1141 分别进行 FISH 分析 发现 该序列比较均一地分布在所有染色体上 图 2-C 和图 由于八倍体小偃麦的细胞中同时含有偃麦草和小 2-D 其余 6 条特异序列的荧光原位杂交结果与 B11 麦的染色体 因此 首先将这 19 条序列对其进行荧光 一致 鉴于十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草 原位杂交 分析它们在不同基因组中的分布情况 均由 St Ee 和 Eb 3 个基因组构成 因此 说明分离到 FISH 试验结果显示 有 7 条序列能够在小麦背景下清 的 7 条序列为偃麦草基因组特异序列 并在小麦-中间 楚地区分小麦和偃麦草染色体 如 B11 在没有封阻 偃麦草衍生的八倍体小偃麦中 5 及小偃 中得到 DNA 的情况下 在小偃 693 和小偃 784 中分别有 16 验证 图片未显示 条和 14 条偃麦草染色体产生特异的杂交信号 图 2-A 2.3 七条特异重复序列均属于 LTR 类反转录转座子 和图 2-B 且在两臂上呈弥散型分布 而小麦染色 由测序结果可知 7 条偃麦草特异重复序列的片 体几乎没有分布 另外 12 条序列由于在小麦染色体上 段大小为 2 5 kb GC 含量均高于 50% 在小麦族重 也能观察到很明显的杂交信号 图片未显示 故不 复序列数据库 TREP 中比对发现 它们均与 LTR 作进一步研究 long terminal repeat 类反转录转座子中的 Gypsy 类 利用 B11 对十倍体长穗偃麦草 PI 和六 型存在同源性 具体结果如下 A05 和 D05 都与来

22 19 期 3687 姚涵等 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 A B C D A 小偃 693 B 小偃 784 C PI D Z1141 探针均为特异序列 B11 没有加封阻 绿色信号显示偃麦草染色体 图示标尺=10 μm A: Xiaoyan 693; B: Xiaoyan784; C: PI578682; D: Z1141. Th. ponticum chromosomes were stained by green signals using B11 as probe without block. Scale bar = 10 μm 图2 Fig. 2 特异序列 B11 在八倍体小偃麦和偃麦草上的分布情况 Distribution patterns of B11 on the chromosomes of wheat-th. ponticum partial amphiploids, Th. ponticum and Th. intermedium 表1 基于 NCBI 数据库的比对结果 Table 1 Result of alignment in NCBI 序列名称 登录号 长度 GC 含量 Sequence Accession Sequence GC 同源序列 Homologous sequence 登录号 相似度 备注 来源 name No. length (bp) content (%) Accession No. Identity (%) Repeat characterization Resource A05 KX EU E-genome specific Th. elongatum B08 KX CT LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum B11 KX EU E-genome specific Th. elongatum D05 KX HE Retrotransposon T. aestivum E04 KX AM LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum F05 KX EF LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum F08 KX FN LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum 自小麦 T. aestivum 的 TREP3203 同源 B08 B11 TREP253 同源 F05 与来自圆锥小麦 T. turgidum 和 F08 都与来自大麦 H. vulgare 的 TREP2357 同源 的 TREP1417 同源 E04 与 来 自 栽 培 一 粒 小 麦 T. monococcum 的 在 NCBI 网站分别进行 BlAST 将比对结果中相

23 3688 中 国 农 业 科 49 卷 学 似性高的同源序列进行了整理 表 1 以上结果表 特异性序列 B11 对小麦-中间偃麦草 4St(4D)代换系 明 这些特异重复序列很可能来自 Gypsy 类反转录转 原代号为 4Ei(4D) 和小麦-长穗偃麦草 4E(4D)代换 座子家族 系 原代号为 4Ee(4D) [39]进行 FISH 分析 结果显示 2.4 小麦-偃麦草代换系和易位系的 FISH 分析 特异探针可以区分偃麦草和小麦染色体 图 3-A 和图 获得的特异性序列能够覆盖偃麦草所有染色体 3-B 另外 6 条序列产生的杂交信号与 B11 一致 图 2-C 和图 2-D 使得利用其对小麦-偃麦草附加 将 7 条特异序列分别对创制的小麦-十倍体长穗偃麦 系 代换系及易位系进行 FISH 鉴定成为可能 利用 草广谱抗条锈易位系 GDR4[40] 进行 FISH 分析 发现 A B C A05 D E B08 G F B11 H E04 D05 I F05 F08 A 小麦-中间偃麦草 4St(4D)代换系 B 小麦-长穗偃麦草 4E(4D)代换系 探针均为 B11 绿色信号为偃麦草染色体 C I 均为小麦-十倍体长穗偃 麦草抗条锈易位系 GDR4 探针分别为 A05 B08 B11 D05 E04 F05 和 F08 红色信号为偃麦草易位片段 FISH 分析中均未加封阻 DNA 图 示标尺=10 μm A: Wheat-Th. intermedium 4St(4D) substitution, B: Wheat-Th. ponticum 4E(4D) substitution, C-I: Wheat-Th. ponticum translocation line GDR4. A and B: Probed by B11, C-I: Probed by A05, B08, B11, D05, E04, F05 and F08 respectively. No wheat blocking DNA was used in FISH hybridization. Scale bar = 10 μm 图3 Fig. 3 特异重复序列对偃麦草片段 FISH 检测能力的分析 FISH detection ability of Th. ponticum genome specific repetitive sequences

24 19 期姚涵等 : 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3689 所有探针均可以将偃麦草染色体片段检测出来 ( 图 3-C 图 3-I) 以上结果表明, 利用偃麦草基因组特异重复序列进行 FISH 分析, 能够产生类似 GISH 的杂交信号, 即使在不加小麦封阻 DNA 的情况下, 依然可以获得清晰的信号 2.5 PCR 特异扩增标记对小麦 - 偃麦草衍生后代的鉴定基于 7 条偃麦草特异序列开发了 90 对引物, 其中 36 对 (40%) 在十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中具有特异性扩增, 而在中国春 黑麦和大麦中均没有扩增出目的条带 ( 图 4) 通过对 109 份小麦 - 偃麦草衍生材料 (8 份材料经 GISH 分析没有检测到偃麦草染色体或染色体片段, 其余 101 份材料均检测到易位片段 ) 进行扫描, 发现有 10 个特异 PCR 标记 ( 表 2) 检测效率较高, 能鉴定出 73.3% 95% 有偃麦草染色体信号的材料 ( 图 5) 表 2 十对可在小麦背景下扩增偃麦草特异重复序列的引物信息 Table 2 Primer sequences to amplify Th. ponticum genome specific repeats in wheat background 引物名称 Primer name A F A R A F A R A F A R A F A R B F B R B F B R B F B R B F B R D F D R D F D R 序列 Sequence (5-3 ) GGATCTCTGGGTGAGGTTGAAACT CATCGGGGTAGTAGCAGCGA GCATTGTGTTGCTCATGTTAGTTG CTTCAGATAATCCAGCGAGGTAGT GTGACCCCACTTATCCCGACT CGTGCTGCGATGCTGAACT GGCACTGCGTTAGATCACCT AAATCATAGTGGACTAGGGGCTT AATCGTAGTGGACTAGGGGCTT CATACCGATATCGCCTACTCTTC CGGACTAATCCTATGCGCAAG GTGACCCCACTTATCCCGAC CAGACGATACAGCAGACGACCTT CTCGAAGCCCACACTTGAGAA CAGAACGACGAGCCGAGTCTA GGGACAAGTGGGTCTCTGACAT CGTAGCTCAGATTGAAAAGGTTAAA GAAACAGGTAAACATAATGCAAACAA CAGAACGACAAGACGAGTCTGATC CTCGAGGTCCACACTTGAGAA 退火温度 Tm ( ) A A B B B PI CS Rye Barley XY693 XY784 H 2 O 图 4 PCR 标记扩增特异性检测 Fig. 4 PCR-amplification profiles of Th. ponticum genome specific repeats 3 讨论 3.1 特异序列可应用于小麦 - 偃麦草杂交后代的规模化筛选利用外源基因组特异重复序列进行 FISH 分析效果优于 GISH [28-29] 本研究利用特异序列探针对八倍体小偃麦 小麦 - 偃麦草代换系和易位系进行 FISH 分析, 信号比 GISH 更加清晰, 而且减少了非特异交叉杂交 GISH 很大程度上是依赖基因组特异重复序列来区分不同基因组的, 因此, 以弥散重复序列作探针的 FISH 具有 GISH 检测的功能 [41-42], 由于免去了提取基因组总 DNA 以及对封阻和探针最佳比例的摸索, 重复性高, 提高了检测效率, 降低了试验成本 相比原位杂交对于技术的较高要求, 开发并利用基于特异序列的 PCR 标记不失为一种有效 快捷的鉴定外源遗传物质的方法 [17] 本研究筛选出的特异序列经过与小麦基因组序列比对, 提高了特异标记的开发效率,10 对引物的检测效率能达到 73.3% 95% 然而对于有些材料, 虽然 GISH 分析有外源染色体片段, 但是所有的引物都不能扩增出目的条带 ( 图 5), 说明开发的标记未能覆盖偃麦草染色体所有区域, 必要情况下需将分子标记与 GISH FISH 及多色荧光原位杂交 (multicolor fluorescent in situ hybridization, mc-fish) 等技术充分结合起来, 以确定外源染色体的具体身份 另外, 比较有趣的是, 有 4 份材料 GISH 没有检测到信号, 而 10 对引物全部扩增出特异条带, 考虑到这 4 份材料有明显的耐盐性状, 推测可能是因为偃麦草小片段遗传物质已渗入小麦基因组所 [43] 致, 这与王玉海等对高抗白粉病小麦 - 山羊草新种质的检测结果类似 小麦 - 偃麦草渐渗系由于携带的不利

25 3690 中 GISH分析未检 测到易位片段 No alien segments were detected by GISH 引物 Primers 国 农 业 科 学 49 卷 GISH分析检测到易位片段 Alien segments were detected by GISH 红色代表有特异扩增 灰色表示无特异扩增 左侧括号里为各引物的检测效率 Red indicated specific amplification, and gray indicated no specific amplification. Detection efficiency of each pair of primers was given in the bracket 图 5 PCR 特异扩增标记对 109 份小麦-偃麦草衍生材料的检测结果 Fig. 5 Summary of PCR-amplification results in 109 wheat-th. ponticum derivatives by 10 pairs of primers designed based on Th. ponticum genome specific repeats 基因较少 具有育种价值 利用特异 PCR 标记进行鉴 中分离出一个长度为 592 bp 的片段 UCM600 该 定能弥补原位杂交的不足 同时可以实现规模化高效 序列弥散分布于除近着丝粒区和近端粒区之外的所 筛选 有黑麦染色体上 结合已有的特异序列 Bilby 着丝 3.2 特异序列在偃麦草染色体的两臂上呈弥散型 粒区 和 psc200 近端粒区 绘制出了完整的黑 分布 麦核型模式图 本研究以十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 为探 3.3 偃麦草着丝粒区特异重复序列有待进一步发掘 针 中国春 DNA 为封阻 试图筛选出能覆盖偃麦草 LIU 等[47]利用水稻着丝粒特异重复序列 RCS1 和 全基因组的特异重复序列 由于串联重复序列主要 禾本科着丝粒共有序列 CCS1 筛选野生一粒小麦的 分布在着丝粒 端粒及次缢痕处 而弥散重复序列 BAC 文库 得到了小麦中 Cereba-like 的反转录转座 广泛分布在 基因组中 偃麦草和小 麦的着丝粒 在 子 CRW centromere retrotransposon of wheat 李葆 DNA 组成上有很高的相似性 很可能在点杂交过程 春等[37]证明了 CRW 和 Quinta 是普通小麦及其二倍体 中被封阻屏蔽 因此得到的特异序列主要富集在染 祖先种着丝粒的 2 个进化上最新的元件 并且和 [44] 通过相似的方法克隆到一个簇毛 CENH3 蛋白互作 是小麦着丝粒的主要功能序列 郝 麦基因组区域化连续高度重复序列 phvnau62 它 薇薇利用禾本科着丝粒特异序列 CCS1 对二倍体拟鹅 分布于 1V 6V 染色体的端部或近端部 同时可以 观草 BAC 文库进行筛选 获得一个长度为 500 bp 的 作为鉴定携带抗白粉病基因的 6VS 的有效工具 刘 串联重复序列 CentSt 进一步研究发现 在偃麦 色体两臂 LI 等 [45] 利用 RAPD 法筛选到黑麦基因组特异的重复序 草多倍体化的过程中 着丝粒的序列组成也在发生着 列 OPD15940 FISH 结果显示除端部区域外 pscd15940 急剧的变化 未发表 结合之前的工作 推测偃麦 弥 散 状 分 布 在 黑 麦 整 套 染 色 体 上 GONZÁLEZ- 草基因组中还有尚未被发现的着丝粒功能序列 前期 成等 [46] GARCÍA 等 从黑麦基因组特异重复序列家族 R173 利用小麦着丝粒反转录转座子 Unnamedfam6 中较为

26 19 期姚涵等 : 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3691 保守的 gag( 编码外壳蛋白的基因,group specific antigen gene) 序列作为探针, 对十倍体长穗偃麦草质粒文库进行筛选, 获得了偃麦草部分染色体着丝粒特异的重复序列 ( 汤才国等, 未发表 ) 进一步克隆偃麦草着丝粒 近着丝粒特异重复序列, 将有助于深入理解着丝粒的结构 功能和进化过程 ; 同时, 将分离得到的偃麦草基因组特异重复序列结合起来应用到育种工作中可以对小麦 - 偃麦草易位系或者杂交后代发生染色体重排的材料进行高效准确的鉴定 4 结论 从十倍体长穗偃麦草质粒文库中筛选到 7 条偃麦草基因组特异的重复序列, 可用作荧光原位杂交分析的特异探针, 检测小麦背景下的偃麦草染色体或染色体片段 ; 基于这些重复序列设计的特异扩增引物, 为小麦 - 偃麦草衍生后代的规模化鉴定和选择提供便利 References [1] 董玉琛. 小麦的基因源. 麦类作物学报, 2000, 20(3): DONG Y C. Gene pools of common wheat. Journal of Triticeae Crops, 2000, 20(3): (in Chinese) [2] CHAI J F, LIU X, JIA J Z. Homoeologous cloning of ω-secalin gene family in a wheat 1BL/1RS translocation. Cell Research, 2005, 15(8): [3] LUAN Y, WANG X G, LIU W H, LI C Y, ZHANG J P, GAO A N, WANG Y D, YANG X M, LI L H. Production and identification of wheat-agropyron cristatum 6P translocation lines. Planta, 2010, 232(2): [4] CAO A Z, XING L P, WANG X Y, YANG X M, WANG W, SUN Y L, QIAN C, NI J L, CHEN Y P, LIU D J, WANG X E, CHEN P D. Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(19): [5] KANG H Y, WANG Y, FEDAK G, CAO W G, ZHANG H Q, FAN X, SHA L N, XU L L, ZHENG Y L, ZHOU Y H. Introgression of chromosome 3Ns from Psathyrostachys huashanica into wheat specifying resistance to stripe rust. PLoS ONE, 2011, 6(7): e [6] LI H J, WANG X M. Thinopyrum ponticum and Th. intermedium: The promising source of resistance to fungal and viral diseases of wheat. Journal of Genetics and Genomics, 2009, 36(9): [7] NIU Z, KLINDWORTH D L, YU G, LFRIESEN T, CHAO S, JIN Y, CAI X, OHM J B, RASMUSSEN J B, XUSTEVEN S. Development and characterization of wheat lines carrying stem rust resistance gene Sr43 derived from Thinopyrum ponticum. Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(4): [8] 张学勇, 李大勇. 小麦及其近亲基因组中的 DNA 重复序列研究进展. 中国农业科学, 2000, 33(5): 1-7. ZHANG X Y, LI D Y. Repetitive DNA sequences in wheat and its relatives. Scientia Agricultura Sinica, 2000, 33(5): 1-7. (in Chinese) [9] FLAVELL R B, SMITH D B. Nucleotide sequence organization in the wheat genome. Heredity, 1976, 37(2): [10] DVOŘÁK J, ZHANG H B. Variation in repeated nucleotide sequences sheds light on the phylogeny of the wheat B and G genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87(24): [11] HESLOP-HARRISON J S. Comparative genome organization in plants: From sequence and markers to chromatin and chromosomes. The Plant Cell, 2000, 12(5): [12] BISCOTTI M A, OLMO E, HESLOP-HARRISON J S. Repetitive DNA in eukaryotic genomes. Chromosome Research, 2015, 23(3): [13] KATO A, VEGA J M, HAN F P, LAMB J C, BIRCHLER J A. Advances in plant chromosome identification and cytogenetic techniques. Current Opinion in Plant Biology, 2005, 8(2): [14] FU S L, TANG Z X, REN Z L, ZHANG H Q, YAN B J. Isolation of rye-specific DNA fragment and genetic diversity analysis of rye genus Secale L. using wheat SSR markers. Journal of Genetics, 2010, 89(4): [15] KOMURO S, ENDO R, SHIKATA K, KATO A. Genomic and chromosomal distribution patterns of various repeated DNA sequences in wheat revealed by a fluorescence in situ hybridization procedure. Genome, 2013, 56(3): [16] CAI Z X, LIU H J, HE Q Y, PU M W, CHEN J, LAI J S, LI X X, JIN W W. Differential genome evolution and speciation of Coix lacryma-jobi L. and Coix aquatica Roxb. hybrid guangxi revealed by repetitive sequence analysis and fine karyotyping. BMC Genomics, 2014, 15(1): [17] MEHROTRA S, GOYAL V. Repetitive sequences in plant nuclear DNA: Types, distribution, evolution and function. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2014, 12: [18] 孙善澄. 小偃麦类型与物种形成的探讨. 作物学报, 1980, 6(1): SUN S C. Research on Triticum Agropyron form and species formation. Acta Agronomica Sinica, 1980, 6(1): (in Chinese)

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28 19 期姚涵等 : 偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3693 草广谱抗锈易位系的鉴定及分析. 中国农业科学, 2012, 45(16): HAO W W, TANG C G, LI B C, HAO C Y, ZHANG X Y. Analysis of wheat-thinopyrum ponticum translocation lines with broad spectrum resistance to stripe rusts. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(16): (in Chinese) [41] FUCHS J, HOUBEN A, BRANDES A, SCHUBERT I. Chromosome painting in plants-a feasible technique?. Chromosoma, 1996, 104(5): [42] HESLOP-HARRISON J S. RNA, genes, genomes and chromosomes: Repetitive DNA sequences in plants. Chromosomes Today, 2000, 13: [43] 王玉海, 何方, 鲍印广, 明东风, 董磊, 韩庆典, 李莹莹, 王洪刚. 高抗白粉病小麦 - 山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究. 中国农业科学, 2016, 49(3): WANG Y H, HE F, BAO Y G, MING D F, DONG L, HAN Q D, LI Y Y, WANG H G. Development and genetic analysis of a novel wheat-aegilops germplasm TA002 resistant to powdery mildew. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(3): (in Chinese) [44] LI W L, CHEN P D, QI L L, LIU D J. Isolation, characterization and application of a species-specific repeated sequence from Haynaldia villosa. Theoretical and Applied Genetics, 1995, 90(3/4): [45] 刘成, 杨足君, 冯娟, 迟世华, 周建平, 任正隆. 黑麦染色体组中一个新重复序列的发现 定位与应用. 中国农业科学, 2007, 40(8): LIU C, YANG Z J, FENG J, CHI S H, ZHOU J P, REN Z L. Detection, mapping and application of a new repetitive DNA sequence in Rye (Secale cereale L.) genome. Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(8): (in Chinese) [46] GONZÁLEZ-GARCÍA M, CUACOS M, GONZÁLEZ-SÁNCHEZ M, PUERTAS M J, VEGA J M. Painting the rye genome with genome-specific sequences. Genome, 2011, 54(7): [47] LIU Z, YUE W, LI D Y, WANG R R C, KONG X Y, LU K, WANG G X, DONG Y S, JIN W W, ZHANG X Y. Structure and dynamics of retrotransposons at wheat centromeres and pericentromeres. Chromosoma, 2008, 117(5): ( 责任编辑李莉 ) 欢迎订阅 2017 年 中国草地学报 中国草地学报 是由中国农业科学院草原研究所和中国草学会共同主办的国家级草学学术期刊, 其宗旨是 : 立足全国, 面向世界, 积极宣传和报道中国草学研究领域的新理论与重要成果, 介绍新进展与发展动态, 内容以草学基础理论研究和应用理论研究为主, 兼纳高新技术研究和直接产生生态效益 经济效益的开发性研究, 主要包括草原学 牧草学 草地学和草坪学等学科领域内有关草地与牧草资源 草地经营管理与改良利用 牧草遗传育种与引种栽培 牧草生理生化 草地建设与生态保护 草地生产与饲草料加工调制 草坪绿地 草业经济与可持续发展战略等 栏目主要有 专题报告 研究报告 综述与专论 研究简报 等 读者对象为从事草业科研 教学 生产和管理的专家 学者 院校师生 领导及业内中高级科技人员, 也适合农学 畜牧学 林学 环境科学 地理科学等相关领域的科技人员阅读参考 本刊为中国草业领域创办最早的科技期刊, 自 1979 年创刊以来先后荣获内蒙古 中国农业科学院 华北地区和全国农业等优秀期刊或优秀科技期刊奖 9 次, 现为全国中文核心期刊 中国科技核心期刊 中国农业核心期刊 RCCSE 中国核心学术期刊 中国科学引文数据库来源期刊, 并被 中国知网 中国期刊网 中国核心期刊 ( 遴选 ) 数据库 万方数据 数字化期刊群 中文电子期刊资料服务库 中国科技论文与引文数据库 等多种数据库及二次文献收录 其影响因子达 以上,2013 年在中国科技期刊 CSCD 影响因子 300 名排行表中位居第 100 位 双月刊, 大 16 开 A4 版本,120 页, 国内外公开发行, 每册定价 元, 全年共 元 国内统一刊号 CN /S, 国内邮发代号 16-32, 全国各地邮局 ( 所 ) 均可订阅, 错过订期可直接向本刊编辑部补订 地址 : 呼和浩特市乌兰察布东街 120 号 ( 邮编 :010010) 电话 : ; 电子信箱 :zgcdxb@126.com

29 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 代攀虹 1, , 孙君灵, 何守朴, 王立如, 贾银华, 潘兆娥, 庞保印, 杜雄明, 王谧 ( 1 长江大学农学院, 湖北荆州 ; 2 中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室, 河南安阳 ) 摘要 : 目的 分析陆地棉核心种质的遗传多样性和表型性状遗传变异规律, 并探讨核心种质的综合评价方法 方法 利用 17 个表型性状数据分析 419 份陆地棉核心种质的遗传多样性 用 Shannon-weaver 信息多样性指数计算表型性状的遗传多样性, 用 Nei s 1973 法计算表型性状遗传距离, 并使用 NTSYS-pc 2.20q 软件对核心种质进行聚类分析 ; 用 SAS9.2 对表型性状数据进行最佳线性无偏估计 (BLUE), 然后根据最佳线性无偏估计值计算出表型性状的最佳值 同时, 结合主成分 回归和相关分析, 研究核心种质的综合评价指标和方法 结果 核心种质表型性状分析发现, 单株铃数 单铃重 衣分 子指等性状的变异系数均较大, 变异系数超过 10% 而断裂比强度 马克隆值以及上半部平均长度的变异程度较小, 变异系数均在 10% 以下 方差分析发现, 各表型性状地点间 年份间 地点和年份间 品种间均有极显著差异 ; 不同地理来源的种质表型性状差异较大, 长江流域地理来源的种质生育期 伸长率 上半部平均长度 衣分等性状均高于其他的地理来源, 西北内陆地理来源的种质纤维强度, 单铃重 整齐度指数 株高 纺纱均匀性指数等综合性状最好, 美国种质的产量和纤维品质的性状优于其他国家的总和 表型性状的遗传多样性指数范围为 , 平均为 分析不同地理来源种质的遗传多样性, 发现黄河流域的遗传多样性和遗传丰富度最高, 中国南部区域最低 类群聚类结果发现陆地棉整体分散, 没有比较明显的类群关系, 部分具有相似特点的种质聚类 13 个组群 核心种质综合评价表明在累计贡献百分比高于 85% 时, 共发现 7 个主成分, 陆地棉核心种质的表型性状综合值 (F 值 ) 平均为 1.740, 来自澳大利亚的 N74-250F 值最高 (2.302), 辽阳绿绒棉的 F 值最低 (0.624) 对 17 个表型性状与 F 值的相关分析, 发现除马克隆值 子指和黄度外, 单铃重 衣分 断裂比强度 上半部纤维长度等 14 个表型性状与 F 值间的相关性具有极显著差异, 最后构建了以吐絮期 单铃重 伸长率 花期 马克隆值 株高 果枝数 纺纱均匀性指数 8 个表型性状为自变量的回归方程, 综合评价核心种质资源 结论 中国保存的陆地棉核心种质具有较为丰富的遗传多样性, 不同地理来源遗传变异有较大的差异, 不同生态区的核心种质具有独特的性状特性 关键词 : 陆地棉 ; 核心种质 ; 表型性状 ; 遗传多样性 ; 综合评价 Comprehensive Evaluation and Genetic Diversity Analysis of Phenotypic Traits of Core Collection in Upland Cotton DAI Pan-hong 1,2, SUN Jun-ling 2, HE Shou-pu 2, WANG Li-ru 2, JIA Yin-hua 2, PAN Zhao-e 2, PANG Bao-yin 2, DU Xiong-ming 2, WANG Mi 1 ( 1 Agricultural College, Yangtze University, Jingzhou , Hubei; 2 Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang , Henan) Abstract: Objective The objective of this study is to analyze the genetic diversity and the law of genetic variation of phenotypic traits and explore the comprehensive evaluation techniques for core collection in upland cotton. Method The genetic diversity of 419 core collections in upland cotton was analyzed with 17 phenotypic traits. Genetic diversity of phenotypic traits was 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 农业部保种项目 (2015NWB039) 科技部 财政部国家科技基础条件平台项目 (NICGR ) 联系方式 : 代攀虹,Tel: ; daipanhong@126.com 通信作者王谧,Tel: ; cdwmi@126.com 通信作者杜雄明,Tel: ; dxm630723@163.com

30 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 3695 calculated using Shannon-weaver Information Index. Phenotypic distance was analyzed using Nei s 1973, and then NTSYS-pc 2.20q software was used for cluster analysis of core collections. With SAS9.2, the best linear unbiased estimate (BLUE) value was gotten from phenotypic trait data, and then the optimum value of phenotypic traits was calculated according to the best linear unbiased estimator. Meanwhile, the principal component, regression and correlation analysis were also used to study the comprehensive evaluation index and method of core collection. Result Based on the analysis of phenotypic traits of core collection, it was found that the variation of boll number, boll weight, lint percentage, seed index and other traits were greater with coefficient of variation over 10%, while the variation of fiber breaking strength, micronaire level and the upper half of the average length was smaller which their coefficient of variation was below 10%. Variance analysis found that there were significant differences in the phenotypic traits between various locations, between years, and between locations and years. The phenotypic traits of different geographical origin germplasms were quite different. The growing stage elongation, upper half mean length, lint percentage and other traits from the geographical origin of the Yangtze River areas were higher than those of other geographic origins, and the comprehensive properties including the fiber strength, boll weight, uniformity index, plant height, and spinning uniformity index from the Northwest areas were the best. The yield and fiber quality traits from the US germplasms were superior to the sum of the other countries. Genetic diversity indices of phenotypic traits were , with an average of The result of analysis on the genetic diversity of different geographical origins indicated that the genetic diversity and genetic richness in the Yellow River areas was the highest, but that in south China was the lowest. Cluster analysis showed that the upland cotton lines were overall dispersed with no obvious groups, but the partial accessions with similar characteristics can be clustered into 13 groups. After comprehensive evaluating these core collections, seven principal components were found when the cumulative contribution rate was more than 85%. The comprehensive value (F) of phenotypic traits of core collections averaged The highest F value (2.302) was from Australia s N74-250, and the lowest F value (0.624) was from Liaoyang green cotton. Correlation analysis between 17 phenotypic traits and their F values illuminated that 14 phenotypic traits including boll weight, lint percentage, fiber strength, upper half mean length, etc. were very significantly correlated with the F values, except micronaire, seed index and yellow givers. Finally, the regression equation was constructed for comprehensively evaluating the core collection with 8 phenotypic traits as the independent variables including boll opening stage, boll weight, elongation, flowering, micronaire, plant height, number of fruit branches, and spinning consistent index. Conclusion The core collection of upland cotton from China has a rich genetic diversity. The difference in genetic variation of the germplasms with different geographical origins is great. The accessions from different ecological zones have unique characteristics. Key words: upland cotton; core collection; clustering analysis; genetic diversity; comprehensive evaluation 0 引言 研究意义 棉花种质资源是棉花遗传改良的基础 [1-3], 其数量在一定程度上制约着品种改良的广度和深度 中国共收集和保存 份棉花种质资源, 其中, 陆地棉 份 陆地棉野生种系 350 份 海岛棉 633 份 亚洲棉 433 份 草棉 18 份 野生种 32 份, 种质资源的保存数量居世界第四位 [4-5] 随着棉花种质资源收集和保存数量的日益增加, 高效利用这些种质资源显得十分困难, 评价这些种质显得越来越重要 [6] [7] 前人研究进展 FRANKEL 等和 BROWN 等在此基础上提出了核心种质 (core germplam) 的概念, 意图以最少数量的遗传资源最大限度地保存整个资源群体的遗传多样性和整个群体的地理分布, 以此来提高种质资源的利用和基因挖掘的效率 目前, 小麦 [8] 水稻 [9] 玉米 [10] [11] 大豆等作物核心种质已构建完成, 大量作物的核心种质正在构建中 中国农业科学院棉 花研究所种质资源课题组依托国家棉花种质资源中期库保存的陆地棉种质资源优势, 已经初步完成了陆地棉核心种质的构建, 将进一步进行遗传多样性分析 遗传多样性分析方法有很多, 主要从形态学数据 ( 主要是表型数据 ) [12-14] 细胞水平 [15] [16] 生物化学记和 DNA 分子标记 [17-32] [12] 4 个方面进行分析 陈光等对 43 份陆地棉基础种质按照不同时期 来源 生态区分别进行了表型性状的遗传多样性研究, 发现基础种质间在农艺性状 品质 产量等表型性状上差异显著或极 [13] 显著 ; 卫泽等研究了国内外 57 份棉花种质的遗传多样性, 基于表型性状聚类结果和分子标记聚类的结 [14] 果大体一致, 但存在差异 ; 周忠丽等通过对 200 份不同地理来源的亚洲棉代表性样本进行了表型遗传多样性分析, 表明亚洲棉表型多样性丰富, 种质间表型性状差异显著或极显著 但是利用少量的棉花种质表型数据来了解种群的遗传变异状况是不够的, 必须扩大群体的数目以及多种特色的种质材料 ( 核心种质 )

31 3696 中国农业科学 49 卷 来分析比较可靠 关于细胞标记和生物化学标记研究较少且结果复杂, 限制其广泛应用 目前研究最广最常用的方法是相继发展的 DNA 分子标记技术, 如 RFLP [17] RAPD [18-20,22] ISSR [19-21] AFLP [22-24] SSR [25-30] SCAR [31] SNP [32] 等, 这些分子标记技术已经被广泛地应用到棉花种质资源遗传多样性研究中 本研究切入点 陆地棉是中国栽培面积最大 产量最高的栽培种, 因其庞大的种质资源数目给研究带来不便, 其多达几十种的表型性状给田间调查和研究均带来较大困难, 国内对于陆地棉核心种质多样性的研究和综合评价尚未见报道 拟解决的关键问题 本研究利用表型性状对现有陆地棉核心种质进行遗传多样性分析, 以揭示陆地棉核心种质的表型遗传规律及筛选出相对合理的表型评价指标, 为陆地棉育种和基础的研究提供一定的参考和依据 1 材料与方法 1.1 试验材料按照品种特性 农艺性状以及广泛的地理来源差异, 从中国农业科学院棉花研究所中期库中保存的 份陆地棉种质中根据品种主要突变性状和品种类型分为 11 组群, 在分组的基础上利用 21 个表型性状, 用非加权类平均聚类分析法, 构建了 281 份陆地棉核心种质, 占全部种质资源总量的 4.71% 利用不同性状的均值 t 测验 方差 F 测验 变异系数 多样性指数 t 检验 均值 极差 表型方差 变异系数 均值差异百分率 方差差异百分率 极差符合率 变异系数变化率 表型变异百分率及主成分分析等参数进行核心种质代表性检验和评价, 所构建的陆地棉核心种质的表型变异解释率达到 80.67%, 利用相似的原理, 构建了 419 份陆地棉核心种质 [4] ( 植物资源遗传学报已接受 ) 这些种质来自中国 美国等 17 个国家 ( 电子附表 1), 其中, 国内材料分别来自 23 个省 ( 市 ) 为了便于分析, 根据材料地理来源将材料划分为 7 个生态区 : 长江流域棉区 (100 份 ) 黄河流域棉区(164 份 ) 西北内陆棉区(28 份 ) 北部早熟棉区(19 份 ) 中国南部棉区(9 份 ) 美国(55 份 ) 以及其他国家 (44 份 ) 1.2 试验设计田间试验于 2014 年和 2015 年连续两年分别在河南安阳中国农业科学院棉花研究所实验农场 湖北荆州长江大学实验基地和甘肃敦煌甘肃省农业科学院经济作物研究所实验基地进行 小区面积 6 m 2, 每小区 1 行, 行距 0.8 m 株距 0.3 m, 观测道 0.8 m, 隔离道 1.2 m, 每重复 20 株 试验采取完全随机区组设计,3 次重复, 正常的大田栽培管理 1.3 数据采集根据陆地棉材料的特点, 由于试验材料多, 小区多, 为了控制田间试验系统误差一方面选择肥力相差不大的试验田, 另一方面种植方式和调查方法均需要统一规范, 最后要增加调查株数, 选取每小区 10 株 ( 不包括两端植株 ) 作调查, 生育期按小区调查, 其他性状调查在取样行中调查 测定性状包括 : 株高 (plant height,ph,cm) 果枝数(sympodial brand number, SBNU) 果枝节位(sympodial brand type,sbt) 单株铃数 (bolls per plant,bpp) 开花期(flowering date,fd) 吐絮期(boll open date,bod) 每行收取植株中部完全吐絮铃 50 个, 室内测定衣分 (lint percentage,lp,%) 单铃重(boll weight,bw,g) 子指 (seed index,si,g) 伸长率(elongation,EL, %) 断裂比强度(fiber strength,fs,cn/tex) 整齐度指数 (length uniformity, LU ) 马克隆值 (micronaire,mic) 反射率(reflectance rate,fr, %) 纺纱均匀性指数(spinning consistent index,sci) 上半部平均长度 (upper half mean length,uhml, mm) 黄度(yellowness,YD) 等数据 皮棉样品送河北农业大学进行纤维品质检测 数据采集时期和采集方法均参照棉花种质资源描述规范 [33] 1.4 数据分析 表型性状的描述性统计方法用 SAS9.2 对 419 份陆地棉种质群体 17 个表型性状进行描述性统计,SAS 规定当样本含量 n 2000 时, 结果以 Shapiro-Wilk(W 检验 ) 为准, 根据样本量计算一个统计量, 即检验统计量 W 把样本分布的形状和正态分布进行比较, 比较得出一个数值 P w (0<P w <1, 及即实际的显著水平 ) 来描述对这个想法的可疑程度, 即当 P w <W 时数据符合正态分布 表型性状的遗传多样性指数及遗传丰富度计算模糊隶属函数计算出各个表型性状的隶属函数值, 及将各个表型性状定义到 [0,1] 闭区间 [34] U(x j )=(x j -x jmin )/(x jmax -x jmin ) (j=1, 2, 3, 419) 式中,U(x j ) 为某种质第 j 个表型性状的隶属函数值, x j 为某种质的第 j 个表型性状的最大值和最小值, 每一级别性状的相对频率用于计算遗传多样性指数 [23] 表型性状遗传多样性分析用 Shannon-weaver 信息多样性指数 (index of genetic diversity,h) 来表示, 其计

32 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 3697 算公式 : H = PLnP, 表示任一组中某一性状的 j j 多样性程度 其中 P j 为某性状第 j 级别的种质份数占总种质材料的百分比,Ln 表示自然对数 平均遗传多样性指数 : n H = H / n ( j=1, 2, 3,n) j 遗传丰富度 (genetic richness index,r) 是指全部性状的级别总数, 计算公式 :R= j/ m, 其中 m 为全部种质的某一性状的级别总数, j 为某一组该性状的级别总数 [35] 表型性状的遗传距离计算采用 Nei 1973 [36] 方法计算 Nei 式遗传距离 : D= ln J / J J ( 其中 2 J X J y i j xy x y 2 2 = Y J XY 2 ij xy ij ij i j x = = ) 式中,X ij 是 X 群体第 i 个性状第 j 个级别的分布频率 聚类分析采用高伟 [37] [38] 刘方等的方法, 使用软件为 NTSYS-pc 2.20q 核心种质资源表型性状的综合评价为了得到基因型的最佳表现值, 尽可能地减小因不同时间和不同地点所引起的误差, 用 SAS9.2 通过混合线性模型 :y ijkl =u+x i +z j +v jk +ε ijk, 其中 y ijkl 是田间试验 j 某群体 i 中第 l 个材料在第 k 个矩阵模块中的表型值 ;ε ijk 是整体均值 u 和残差误差的综合值 ; 某种质资源群体 x i 田间试验数据 z j 与 v jk 矩阵作为随机效应模型 ; 对于某个种质资源群体中某个材料 i 的某个性状的最佳线性无偏估计值 (the best linear unbiased estimate,blue) 为 uˆ + xˆ i, 对 419 份陆地棉核心材料的表型性状数据进行最佳线性无偏估计 (BLUE), 进而计算出两年三地 17 个表型性状的最佳线性无偏估计值, 利用最佳线性无偏估计值进行描述性统计 方差分析 相关分析 聚类分析及主成分分析 核心种质的综合评价方法 [34] :(1) 将标准化的核心种质表型数据代入每个主成分中, 计算各主成分的得分, 再利用模糊隶属函数对各主成分归一化处理, 计算出各主成分的权重系数, 最后计算各个核心材料的综合得分 (F 值 ) (2) 以综合得分 (F 值 ) 为依变量, 以 17 个表型性状作为自变量, 并通过逐步回归分析构建回归方程, 进一步筛选核心种质资源的综合评价指标 i j ij 2 结果 2.1 陆地棉核心种质表型性状的遗传多样性分析 陆地棉核心种质间表型性状差异对 19 份陆地棉种质群体 17 个表型性状进行描述性统计 ( 表 1), 发现全部数据均符合正态分布, 单株铃数 (BPP) 变幅 个, 均值为 个 ; 单铃重 (BW) 变幅 g, 均值 5.27 g; 衣分 (LP) 变幅 14.99% 49.64%, 均值 40.41%; 子指 (SI) 变幅 g, 均值 g 研究表明, 单株铃数 单铃重 衣分 子指等性状的变异系数均较大, 变异系数超过 10%, 如无极一枝花的单铃重 7.45 g, 南丹巴地大花单铃重为 3.43 g; 美国材料 V 衣分高达 49.64%, 而稀絮 H10 衣分只有 14.99%; 无极一枝花子指 g, 中 6331 子指 7.83 g 而断裂比强度 马克隆值以及上半部平均长度的变异程度较小, 变异系数均在 10% 以下, 说明供试材料中纤维品质性状的变异程度低于产量性状的变异 方差分析后发现 ( 表 1), 各表型性状地点间 年份间 地点和年份间 品种间均有极显著差异, 表明供试的种质群体间的遗传变异极其丰富, 有利于表型性状的优异基因位点的发掘, 同时说明各表型性状受环境影响较大 不同地理来源核心种质的表型性状差异 9 份陆地棉种质中美国材料占 13.13%, 其他国家的材料占 10.50%, 而中国自育的材料中长江流域棉区材料占 23.63%, 黄河流域棉区占 39.14%, 西北内陆地理来源占 6.68%, 北部特早熟棉区占 4.53%, 南方地理来源占 2.15% 通过比较从不同国家引进的材料, 发现不同来源的种质间的表型性状差异明显,17 个表型性状中, 除子指和黄度 2 个性状差异不显著外, 其他 15 个性状差异均达到极显著或显著水平 ( 表 2), 说明不同地理来源间种质的表型性状存在较大的差异 其中, 长江流域地理来源的生育期 伸长率 上半部平均长度 衣分等性状均高于其他的地理来源, 马克隆值与西北内陆地理来源一样均低于其他地理来源 ; 北部早熟区的生育期最短, 第一果枝节位最小, 说明该地理来源的早熟性好 ; 西北内陆地理来源纤维强度 单铃重 整齐度指数 株高 纺纱均匀性指数等综合性状最好 ; 南方地理来源单株铃数 果枝数最多, 马克隆值最大 ; 长江流域种质的产量和纤维品质大部分性状均优于其他国家 以上结果表明不同陆地地理来源的表型性状差异较大, 受地理影响和种质适应性选择变异, 不同生态区种质具有独特性的形状特性

33 表 1 陆地棉核心种质 17 个表型形状的差异 方差分析及正态分布 Table 1 ANOVA analysis, normal distribution and difference in 17 phenotypic traits of core collection in upland cotton 指标 Parameter 吐絮期 BOD 单株铃数 BPP 单铃重 BW 伸长率 EL 开花期 FD 断裂比强度 衣分 LP 整齐度指数 马克隆值 MIC 株高 PH 反射率 RR 果枝节位 SBN 果枝数 SBNU 纺纱均匀性指数 子指 SI 半部平均长度 黄度 YD FS LU SCI UHML 均值 Mean 方差 SD 最小值 Minnus 最大值 Maxnus 中间值 Medium 变异系数 CV (%) 上四分之一位数 Q 下四分之一位数 Q Shapiro-Wilk 正态性检验 W 正态性检验 P 值 P w 地点 S ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** 年份 Y ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** 4.09 ** 地点和年份间 S Y ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** 6.74 品种 V ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** 品种与地点 V S ** ** ** 0.60 ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** 2.59 品种与年份 V Y ** ** ** 0.61 ** 3.66 ** ** ** ** 8.78 ** ** ** ** ** 2.35 品种与地点, 年份之间 V S Y ** ** ** 0.63 ** 4.43 ** ** ** ** ** 3.11 * ** ** ** 2.48 误差 Error 26.86** 9.03** 0.33** 0.61** 6.70** 3.63** 3.46** 2.82** 0.20** 65.19* * 6.64* 1.43** 1.73** ** 0.45** 1.61** 2.57** 决定系数 R 2 of model BOD: 吐絮期 ;BPP: 单株铃数 ;BW: 单铃重 ;EL: 伸长率 ;FD: 开花期 ;FS: 断裂比强度 ;LP: 衣分 ;LU: 整齐度指数 ;MIC: 马克隆值 ;PH: 株高 ;RR: 反射率 ;SBN: 果枝节位 ;SBNU: 果枝数 ; SCI: 纺纱均匀性指数 ;SI: 子指 ;UHML: 上半部平均长度 ;YD: 黄度 * 或 **: 表示不同地点 (S) 不同年份(Y) 地点和年份间(S Y) 品种间(V) 品种和地点间(V S) 品种与年份间(V Y) 品种和不同年份不同地点间(V S Y) 的方差分析的均方值差异显著或极显著 W:Shapiro-Wilk 正态性检验 ;Pw:W 正态性检验 P 值 ;Q1: 上四分之一位数 ;Q3: 下四分之一位数 下同 BOD: Boll open date; BPP: Bolls per plant; BW: Boll weight; EL: Elongation; FD: Flowering date; FS: Fiber strength; LP: Lint percentage; LU: length uniformity; MIC: Micronaire; PH: Plant height; RR: Reflectance rate; SBN: Sympodial brand type; SBNU: Sympodial brand number; SCI: Spinning consistent index; SI: Seed index; UHML: Upper half mean length; YD: Yellowness. ** Significant at P<0.01, * Significant P<0.05 for the effect of site(s), year (Y), site by year interaction(s Y), variety (V), variety by site interaction(v S), variety by yearinteraction (V Y), variety by site andyear interactionon phenotypic variance estimate by two years and three locations mean squares of ANOVA. W: Stands for W values of the Shapiro Wilk test; P w : Stands for P values of the Shapiro-Wilk test ; Q1: Quantile 25%; Q2: Quantile 75%. The same as below

34 表 2 不同地理来源的核心种质表型性状差异 Table 2 Differences in the phenotypic traits of core germplasms from different areas 性状 Traits 长江流域 Yangtze River valley 黄河流域 Yellow River valley 西北内陆地理来源 Northwest of China 美国 America 中国北部 North of China 中国南部 South of China 其他国家 Other countries F 值 F value 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 均值 Mean 变异系数 Variation coefficient 吐絮期 BOD ** 单株铃数 BPP ** 单铃重 BW ** 伸长率 EL * 开花期 FD ** 断裂比强度 FS ** 衣分 LP ** 整齐度指数 LU ** 马克隆值 MIC ** 株高 PH ** 反射率 RR ** 果枝节位 SBN ** 果枝数 SBNU ** 纺纱均匀性指数 ** SCI 子指 SI 半部平均长度 ** UHML 黄度 YD

35 3700 中国农业科学 49 卷 不同地理来源核心种质的多样性及遗传丰富度遗传多样性指数涵盖了遗传丰富度, 但多样性更侧重于性状的等级分布均匀度, 单纯地用它去衡量种质群体的遗传多样性的程度是不全面的, 因此, 在评价种质资源群体的遗传多样性时, 需要对这两个指标进行权衡分析 [4] 通过分析不同地理来源的遗传多样性和遗传丰富度 ( 表 3), 发现平均遗传多样性指数分布范围为 , 平均遗传丰富度分布在 , 而黄河流域的遗传多样性和遗传丰富度最高, 中国南部区域最低 中国长江流域和西北 2 个主产棉区, 以及来自美国的种质的多样性也较好 黄河 长江流域和西北 3 个地理来源的棉花是中国陆地棉的主产区, 上百年以来经过多种途径的品种改良, 不但提高了品种的综合性能, 而且丰富了品种的遗传变异 美国种质是中国早期引种较多的, 中国大部分自育品种多来源于此, 有较为丰富的遗传变异, 其遗传变异处在 , 最小的遗传变异是伸长率, 只有 0.335, 而 最大的遗传变异则是达到了 的纺纱均匀性指数, 整个遗传变异性较好 北部早熟地理来源以早熟品种为主, 南方地理来源因环境因素所育品种相对较少, 美国以外的其他国家初期引种材料并没有较多的衍生品种, 因此, 中国北部特早熟 南部山地棉区和除美国以外地理来源的种质遗传多样性和遗传丰富度均不高 型遗传距离与聚类表型性状对 419 份陆地棉核心种质进行聚类 ( 图 1), 结果表明, 中国的陆地棉种质在表型性状上的聚类整体分散没有比较明显的类群关系, 部分具有相似特点的材料聚在一起, 说明这些种质之间可能具有独特的遗传背景, 涵盖比较丰富的遗传变异 所有种质的相似系数变动范围是 , 平均为 在相似系数 处可将 419 份材料分为 13 类, 聚类的结果与生态区的关系并不明显 第 Ⅰ 类有 22 份材料 ; 第 Ⅱ 类中有辽阳绿绒棉 绿絮 1 号和 Greenlint 3 份种质, 均为绿色棉材料,419 表 3 不同地理来源的核心种质遗传多样性指数和遗传丰度 Table 3 Genetic diversity and richness index of of core germplasms from different areas 性状 Phenotypic traits 长江流域 Yangtze river 黄河流域 Yellow river 西北 Northwest of 美国 America 北部 North of China 南部 South of China 其他国家 Other countries valley valley China 吐絮期 BOD 单株铃数 BPP 单铃重 BW 伸长率 EL 开花期 FD 断裂比强度 FS 衣分 LP 整齐度指数 LU 马克隆值 MIC 株高 PH 反射率 RR 果枝节位 SBN 果枝数 SBNU 纺纱均匀性指数 SCI 子指 SI 半部平均长度 UHML 黄度 YD 平均遗传多样性指数 Average of genetic diversity (H) 遗传丰富度 Genetic richness (R)

36 19 期 3701 代攀虹等 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ Ⅻ 遗传相似性 Coefficient 图1 Fig 份种质基于 17 个形态性状的聚类图 Clusters of 419 accessions based on 17 morphological traits 份陆地棉材料中全部的绿絮的材料都聚在了一起 大 生育期比较短 纤维品质也比较好 第Ⅹ类是纤维品 部分材料都聚集在第Ⅲ类 这组材料没有明显的特点 质好的种质如苏优系列材料 川 206 蔡科 510 J 包含大铃 军棉 1 号 无极一枝花 苏远 04-3 等 等 第Ⅺ类中仅有稀絮 H10 一份材料 第Ⅻ类材料的 高衣分 泗棉 3 号 荆 苏棉 12 等 等丰产性 纤维品质较差 马克隆值较大 纤维短粗 红鸡脚叶 较好的材料 高产 优质的材料岱红岱 洞庭 1 号等 单独分在第ⅩⅢ类 抗性较强的材料 Miscot 泗阳 630 苏抗 陆地棉核心种质表型性状综合评价 等 陆地棉标准系 TM-1 纤维高比强材料 J 表型性状的相关性及主成分分析 对 17 个表 第Ⅳ类种质均是早熟陆地棉 如酒棉 8 号 新陆早 3 型性状进行相关性分析 表 4 结果表明 性状间 号等 第Ⅴ类只有 3 份材料 均来自黄河流域地理来 存在不同程度相关性且绝大部分为显著或极显著相 源 第Ⅵ类是棕色棉 如 CC28 第Ⅶ类是丰产 广 关 吐絮期与花期 果枝节位呈显著正相关 单株铃 适 推广面积大的品种 第Ⅷ类是 15 份材料 是一些 数与果枝数呈显著正相关 而与子指呈显著负相关 与抗逆性状有关的材料 第Ⅸ类中新疆的材料居多且 单铃重与子指 长度整齐度呈显著正相关 伸长率与

37 表 4 陆地棉产量和纤维品质性状间的相关分析 Table 4 Correlation coefficients among characters related to fiber yield and quality of upland cotton 性状 Traits 单株铃数 BPP 单铃重 BW 伸长率 EL 开花期 FD 断裂比强度 FS 衣分 LP 整齐度指数 LU 马克隆值 MIC 株高 PH 反射率 RR 果枝节位 SBN 果枝数 SBNU 纺纱均匀性指数 SCI 子指 SI 半部平均长度 UHML 黄度 YD 吐絮期 BOD 单株铃数 BPP 单铃重 BW 伸长率 EL ** -0.22** 0.18** 0.19 ** 0.26** 0.81** 0.25** 0.15** 0.20** 开花期 断裂比 衣分 整齐度 马克 株高 FD 强度 LP 指数 隆值 PH FS LU MIC 反射率 果枝节位 果枝数 纺纱均匀 子指 半部平均 RR SBN SBNU 性指数 SI 长度 SCI UHML 0.13** ** 0.67 ** ** 0.29 ** 0.32 ** 0.20** 0.22 ** ** 0.42 ** 0.64 ** 0.13 ** 0.65 ** 0.50** -0.12* 0.28** * * 0.14* 0.36** 0.18 ** 0.24 ** 0.32 ** 0.12 * 0.27 ** 0.26 ** 0.12 * * 0.21** 0.16 ** 0.12* 0.20 ** 0.24 ** 0.22 ** * ** 0.27 ** 0.16 ** 0.22 ** 0.80 ** ** 0.19 ** ** ** 0.45 ** ** ** ** 0.25** ** ** 0.65 ** 0.15** 0.89 ** 0.27 ** 0.79 ** ** 0.16** 0.32 ** 0.15 ** -0.12* 0.19** ** 0.54 ** ** ** ** ** ** 0.25** 0.21** ** 0.63 ** 0.23 ** 0.83** 0.35** 0.75 ** -0.17** 0.18** 0.35 ** 0.21** ** 0.18 ** 0.17** ** 0.17 ** ** ** ** 0.12* ** **

38 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 3703 断裂比强度 长度整齐度 纺纱均匀性指数 上半部分长度都呈显著正相关 ; 花期与果枝数呈显著正相关 ; 断裂比强度与长度整齐度 纺纱均匀性指数 上半部分长度显著正相关 ; 衣分与长度整齐度 子指均显著相关 ; 长度整齐度与纺纱均匀性指数 上半部分长度显著正相关 ; 第一果枝节位与上半部分长度显著正相关 ; 纺纱均匀性指数与上半部分长度显著正相关 ; 以上信息表明这些性状之间存在或大或小的相关性, 因此如果直接依据这些信息评价这些核心种质材料特性会影响其真实性 为了消除这类不利因素的影响, 用主成分分析对核心种质综合评价, 在累计贡献百分比高于 85% 时, 共发现 7 个主成分 ( 表 5) 其主成分的特征值分别为 : 和 0.74; 主成分贡献率分别为 29.03% 16.46% 14.86% 8.19% 6.95% 5.85% 和 4.36% 前 7 个主成分的累计贡献率达到 85.70%, 可以解释不同陆地棉品种的主要表型性状的大部分信息 第一主成分的特征值及方差贡献率 最大, 所包含的表型形状信息也比较多, 但其贡献率只有 29.03%, 可能的原因是这 17 个表型性状包括了农艺性状 产量性状以及纤维品质性状等, 这些性状间的差异较大, 线性关系比较少 第一主成分的伸长率 断裂比强度 整齐度指数 纺纱均匀性及上半部平均长度的特征向量值最大, 且均为正值, 可以理解为第一主成分是跟纤维品质相关的综合指标, 第一主成分的值越高, 供试陆地棉的纤维品质就越好 第二主成分的单株铃数 花期 衣分 第一果枝节位等特征向量值较大, 其次子指的特征向量为负值且绝对值较大, 说明第二主成分是与产量相关的综合指标 第三主成分是跟生育期有关的因子 第四主成分是控制反射率的因子 第五主成分是与单铃重有关的因子 第六主成分是控制果枝数的因子 第七主成分是与马克隆值有关的因子, 控制棉花纤维的粗细 以上结果说明中国陆地棉核心种质资源群体纤维品质的多样性较高, 其次是产量 表 5 17 个表型性状前 7 个主成分的特征向量 特征根 方差贡献率及累计贡献率 Table 5 Power vector (PV), eigenvalues (E), contribution rate (CR) and cumulative contribution rate (CCR) of first seven principal components based on 17 phenotypic traits 性状 特征向量 1 特征向量 2 特征向量 3 特征向量 4 特征向量 5 特征向量 6 特征向量 7 Traits PV1 PV2 PV3 PV4 PV5 PV6 PV7 吐絮期 BOD 单株铃数 BPP 单铃重 BW 伸长率 EL 开花期 FD 断裂比强度 FS 衣分 LP 整齐度指数 LU 马克隆值 MIC 株高 PH 反射率 RR 果枝节位 SBN 果枝数 SBNU 纺纱均匀性指数 SCI 子指 SI 半部平均长度 UHML 黄度 YD 特征值 E 方差贡献率 CR (%) 累计贡献率 CCR (%)

39 3704 中国农业科学 49 卷 核心种质的表型性状综合评价将标准化的核心种质表型数据代入上述 7 个主成分中, 可得各个种质资源 7 个主成分的得分 ( 电子附表 2), 其中第一主成分的线性方程为 : y 1j =0.347x 1j x 2j x 3j x 4j x 5j x 6j x 7j x 8j x 9j x 10j x 11j x 12j x 13j x 14j x 15j x 16j x 17j 用模糊隶属函数将 7 个主成分的得分进行归一化处理后, 计算出 7 个主成分的权重系数为 : 和 0.051, 再利用各核心材料的综合得分 (F 值 ), 对核心种质进行综合评价 结果表明, 陆地棉核心种质的表型性状综合值 (F 值 ) 平均为 1.740, 来自澳大利亚的 N 的 F 值最高 (2.302), 中国北部特早熟地理来源的辽阳绿绒棉的 F 值最低 (0.624), 说明 N 的综合性能最好, 其单铃重 衣分 上半部平均长度 断裂比强度 马克隆值分别为 6.42 g 40.98% mm 29.71(cN/tex) 和 4.32; 而辽阳绿绒棉的综合性能最差 对 17 个表型性状与 F 值的相关分析 ( 表 6), 结果表明, 除马克隆值 子指和黄度外, 单铃重 衣分断裂比强度 上半部纤维长度等 14 个表型性状与 F 值间的相关性具有极显著差异, 其中 F 值与果枝数为负相关, 与其余 13 个性状为极显著正相关 表 6 17 个表型性状与表型综合值 (F) 的相关系数 Table 6 Correlation coefficients between 17 phenotypic traits and comprehensive value (F-value) 性状 Traits 相关系数 Correlation coefficient value 性状 Traits 相关系数 Correlation coefficient value 吐絮期 BOD 0.630** 株高 PH 0.477** 单株铃数 BPP 0.262** 反射率 RR 0.275** 单铃重 BW 0.474** 果枝节位 SBN 0.714** 伸长率 EL 0.645** 果枝数 SBNU ** 开花期 FD 0.734** 纺纱均匀性指数 SCI 0.681** 断裂比强度 FS 0.600** 子指 SI 衣分 LP 0.454** 半部平均长度 UHML 0.722** 整齐度指数 LU 0.660** 黄度 YD 马克隆值 MIC 同时, 用已经求出的综合得分 (F 值 ) 与表型性状构建回归方程, 筛选核心种质资源的综合评价指标 构建回归方程为 : y= x x x x x x x x 14 式中 x 1 x 3 x 4 x 5 x 9 x 10 x 12 x 14 等分别代表吐絮期 单铃重 伸长率 花期 马克隆值 株高 果枝数 纺纱均匀性指数 8 个表型性状 综合得分 (F 值 ) 与表型性状的回归分析结果表明吐絮期 单铃重 伸长率 花期 马克隆值 株高 果枝数 纺纱均匀性指数 8 个表型性状回归方程的通径系数分别为 和 0.112, 其决定系数 R 2 为 0.991,8 个表型性状可决定 F 值的总变异为 99.1%,F 值为 , 方程结果极显著, 表明以上所述表型性状可以作为核心种质的综合评价指标 主成分综合值与该回归方程预测值的相关系数 r=0.995**, 这说明该方程可以用来综合评价陆地棉核心种质群体, 且可靠性达到 99.1% 3 讨论 3.1 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性对表型性状的统计发现, 单株铃数 单铃重 衣分 子指等性状的变异系数均大于 10%, 而断裂比强度 马克隆值以及上半部平均长度的变异系数在 10% 以下, 变异的程度较小, 说明供试材料的纤维品质性 [39] 状有关的变异程度低于产量性状的变异, 这与钱能陆地棉遗传多样性与育种目标性状基因 (QTL) 的关联分析的研究结果是一致的 ; 不同地理来源的变异系数存在同样的规律 ; 产生这种现象的原因可能是产量性状的地理和生态变异引起的遗传变异较大, 而纤维品质较小 419 份陆地棉核心种质聚类结果表明, 虽然大部分种质之间没有明显的分类, 但局部具有相似特点的材料依然聚成了一类, 如高产 早熟 棕色棉 绿色棉 优异纤维 稀絮等材料, 通过表型性状的遗传分析, 一方面说明陆地棉种质的遗传基础较为狭窄, 中国初期引进的基础陆地棉栽培种主要从美国引进 [25], 然而近期的研究表明美国陆地棉栽培种同样存在遗传多样性变小, 遗传基础狭窄等问题 [40] 另一方面, 部分材料之间有明晰的类群特征表明这些材料间有较大的遗传变异, 在后续的研究工作中可以通过分子标记分析基因间的遗传规律两者结合能更加全面地解释中国陆地棉种质资源的遗传变异, 更好地为现代育种服务 遗传多样性为种质资源优异基因资源的挖掘提供了重要信息, 表型性状是育种工作者进行棉花育种研

40 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 3705 究的重要依据 [12-14,41-42] 国外对陆地棉种质遗传多样 [43] 性研究的报道很多,FANG 等利用 193 份陆地棉栽培种进行表型性状遗传多样性及其关联分析研究 ; [44] ALVES 等对巴西本土陆地棉的遗传多样性和种群 [45] 结构进行了分析 ;BADIGANNAVAR 等分析了与种 [40] 子性状有关性状的遗传多样性 ;TYAGI 等用 SSR 对 381 份美国陆地棉的种群结构和遗传多样性进行了 [25] 分析 陈光等用 43 份中国陆地棉基础种质, 分析了中国不同地理来源及其衍生品种的遗传多样性 ; [46] ZHAO 等利用分子标记技术对 157 份陆地棉材料的 [47] 种群结构和遗传多样性进行分析 ; 赵战胜等分析了中国北疆早熟陆地棉的遗传多样性 本研究对中国已构建陆地棉核心种质的表型性状进行了遗传多样性分析, 表明中国收集保存的陆地棉核心种质遗传多样性较高, 在不同地理来源的种质在遗传多样性的表现上有差异 所选用的材料为中国现有陆地棉的核心材料, 为后续的育种工作奠定了坚实的基础 3.2 核心种质表型性状的综合评价表型性状是结构基因的功能表现, 是功能基因的产物, 是长期自然和人工选择的结果, 易受时间 环境因素影响, 但表型性状是种质资源收集 保存 鉴定和利用的基础, 其观察结果是直观的, 利用表型性状进行多样性分析是最直接的 分子标记是在基因组水平上对个体基因结构差异的部分揭示 本研究结合了隶属函数法与主成分分析法综合评价了陆地棉核心种质, 这一方法已在植物的遗传多样性评价中得到应用 [48], 方法比较可靠, 不仅可以评价各个品种的综合表现的高低, 同时能将推断出评价某个种质群体中的关键性状 [34] 结果表明, 来自澳大利亚的 N 的 F 值最高, 中国北部特早熟地理来源的辽阳绿绒棉的 F 值最低, 表型性状的综合值与吐絮期 单铃重 伸长率 花期 断裂比强度 衣分 长度整齐度 株高 第一果枝节位 纺纱均匀性指数及上半部分纤维长度与 F 值之间极显著相关, 因此综合值也越高, 上述各个性状的表型值也较高, 这为育种工作中亲本的选择提供了依据 由于陆地棉的表型性状较多, 且各性状间存在不同程度的相关, 阻碍了棉花种质资源高效的研究与利用, 因此, 有必要筛选出相对重要的性状进行重点研究, 加速在育种和农业生产上的应用 本研究结合主成分分析和逐步回归分析, 筛选出陆地棉种质资源的评价方程及综合指标 研究结果表明吐絮期 单铃重 伸长率 花期 马克隆值 果枝数 纺纱均匀性指数 8 个表型性状为陆地棉种质资源的重要性状, 可以作为核心种质综合评价的指标, 在棉花性状考察及育种时间中应着重这 8 个性状 生育期, 产量性状, 品质性状本研究对中国陆地棉核心种质表型性状进行遗传多样性评价, 为深入解析和阐明中国陆地棉核心种质的重要复杂性状的基因遗传机理奠定了基础, 进而促进这些种质更加高效地为现代育种服务 3.3 核心种质在育种上的运用随着时间的推移, 遗传多样性不断地降低 现代品种较之早期和中期品种的遗传多样性较低 随着现代育种商业化的发展, 在实际育种中, 人们更注重的市场需要的品种和尽可能快的育出商业化的品种而忽略了品种的遗传多样性, 这些商业化品种的遗传多样性越来越低的问题越来越严重, 在品种改良过程中由于现代品种改良注重产量 品质, 目标单一, 遗传背景狭窄, 从而导致多样性差, 最终导致遗传多样性降低 为解决这一问题, 从遗传多样性好的早期和中期品种中, 筛选资源, 转育到近现代品种中, 如本研究构建的核心种质群体, 不仅代表了 80% 以上的遗传变异, 且有较多可供选择的优异资源, 如较好的伸长率 马克隆值 纺纱均匀性指数, 较多的果枝数 较多的棉铃和较大的单铃重等, 都可以作为改良现有品种, 选育新品种的资源 同时也可以进行远缘杂交, 选育出较好的品种, 但远缘杂交虽然有利于提高遗传多样性, 选育出较好的品种, 但由于杂交后代的疯狂分离而使育种周期就更长, 成本更高, 这与现代育种理念不符, 特别是现有的育种, 相当一部分是由种业公司完成, 不可能允许这样做 再者, 也可以采用 MAGIC (multiparent advanced generation inter-cross) 群体等方法,MAGIC 即多亲本高级世代互交系, 是一种比通常用的 F 2 RIL CSSLs(2 个亲本获得 ) 等作图群体更为复杂的群体, 由于 MAGIC 群体应用了多亲本互交, 其后代不会出现多态性下降, 后代衰退的现象, 该群体可以聚合多样性的种质资源, 增加多样性 但这样的群体结构比较难于把握, 而且获得这样一个作图群体也需要耗费多年的时间才能完成 以上各种方法各有优缺点, 但核心种质库的构建是非常必要的, 不管是改良现有品种, 进行远缘杂交, 或是构建 MAGIC 群体, 都需要好的种质资源做支撑 4 结论 中国陆地棉核心种质的遗传多样性较高, 不同地

41 3706 中国农业科学 49 卷 理来源遗传变异有较大的差异, 黄河流域棉区整体遗传多样性最好, 其次是美国 ; 吐絮期 单铃重 伸长率 花期 马克隆值 株高 果枝数 纺纱均匀性 8 个指标可以作为核心种质评价的综合指标 References [1] ZHAO K Y, TUNG C W, EIZENGA G C, WRIGHT M H, ALI L M, PRICE A H, NORTON G J, ISLAM M R, REYNOLDS A, MEZEY J, MCCLUNG A M, BUSTAMANTE C D, MCCOUCH S R. Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nature Communication, 2011, 2: [2] GLASZMANN J C, KILIAN B, UPADHYAYA H D, VARSHNE R K. Accessing genetic diversity for crop improvement. Current Opinion in Plant Biology, 2010, 13: 1-7. [3] HAJJAR R, JARVIS D I, GEMMILL-HERREN B. The utility of crop genetic diversity in maintaining ecosystem services. Agriculture Ecosystems & Environment, 2008, 123: [4] 杜雄明, 孙君灵, 周忠丽, 贾银华, 潘兆娥, 何守朴, 庞宝印, 王立如. 棉花资源收集 保存 评价与利用现状及未来. 植物遗传资源学报, 2012, 13(2): DU X M, SUN J L, ZHOU Z L, JIA Y H, PAN Z E, HE S P, PANG B Y, WANG L R. Current situation and the future in collection, preservation, evaluation and utilization of cotton germplasm in China. Journal of Plant Genetic Resources, 2012, 13(2): (in Chinese) [5] 杜雄明, 周忠丽, 贾银华, 刘国强. 中国棉花种质资源的收集与保存. 棉花学报, 2007, 19(5): DU X M, ZHOU Z L, JIA Y H, LIU G Q. Collection and conservation of cotton germplasm in China. Cotton Science, 2007, 19(5): (in Chinese) [6] FRANKEL O H, BROWN A H D. Current plant genetic resources: A critical appraisal//chopra V L, JOSHI B C, SHARMA R P, BANSAL H C. Genetics: New Frontiers, Vo1. IV. New Delhi: Oxford and IBH Publishing, 1984: [7] BROWN A H D. The case for core collections//brown A H D, FRANKEL O H, MARSHALL D R, WILLIAMS J T. The Use of Plant Genetic Resources. Cambridge, England: Cambridge University Press, 1989: [8] HAO C Y, ZHANG X Y, WANG L F, DONG Y S, SHANG X W, JIA J Z. Genetic diversity and core collection evaluations in common wheat germplasm from the northwestern spring wheat region in China. Molecular Breeding, 2006, 17: [9] YAN W G, RUTGER J N, BRYANT R J, BOCKELMAN H E, FJELLSTROM R G, CHEN M H, TAI T H, MCCLUNG A M. Development and evaluation of a core subset of the USDA rice (Oryza sativa L.) germplasm collection. Crop Science, 2007, 47: [10] COIMBRA R R, MIRANDA G V, CRUZ C D, SILVA D J H, VILELA R A. Development of a Brazilian maize core collection. Genetic Molecular Biology, 2009, 32: [11] 邱丽娟, 李英慧, 关荣霞, 刘章雄, 王丽侠, 常汝镇. 大豆核心种质和微核心种质的构建 验证与研究进展. 作物学报, 2009, 35(4): QIU L J, LI Y H, GUAN R X, LIU Z X, WANG L X, CHANG R Z. Establishment, representative testing and research progress of soybean core collection and mini core collection. Acta Agronomica Sinica, 2009, 35(4): (in Chinese) [12] 陈光, 杜雄明. 我国陆地棉基础种质表型性状的遗传多样性分析. 西北植物学报. 2006, 26(8): CHEN G, DU X M. Genetic diversity of basal germplasm phenotypes in upland cotton in China. Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica, 2006, 26(8): (in Chinese) [13] 卫泽, 孙学振, 柳宾, 张兴居, 王芳, 马军, 刘庆彩, 郭海刚, 宋宪亮. 国内外 57 份棉花种质资源的遗传多样性研究. 山东农业科学, 2010(6): WEI Z, SUN X Z, LIU B, ZHANG X Z, WANG F, MA J, LIU Q C, GUO H G, SONG X L. Genetic diversity of 57 cotton germplasm resources from China and overseas. Shandong Agricultural Sciences, 2010(6): (in Chinese) [14] 周忠丽, 吴仕勇, 孙君灵, 贾银华, 潘兆娥, 何守朴, 杜雄明. 我国现存亚洲棉的表型多样性分析. 植物遗传资源学报, 2011,12(6): ZHOU Z L, WU S Y, SUN J L, JIA Y H, PAN Z E, HE S P, DU X M. Phenotypic diversity analysis of G. arboreum L. germplasm resources conserved in China. Journal of Plant Genetic Resources, 2011, 12(6): (in Chinese) [15] 郭旺珍, 彭锁堂. 陆地棉与毛棉杂种性状遗传学和细胞学研究. 棉花学报, 1997, 9(1): GUO W Z, PENG S T. The traits genetics and cytology study of Gossypium hirsutum hybrids with Gossypium tomentosum. Cotton Science, 1997, 9(1): (in Chinese) [16] BRUBAKER C L, WENDEL J F. Reevaluating the origin of domesticated cotton (Gossypium hirsutum; Malvaceae) using nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). American Journal of Botany, 1994, 81(10): [17] SHU B, FENLING K, YAO Z Y, MEI Z G, YUAN Z Q, GANG W X.

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44 19 期 代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 附表 份陆地棉核心种质来源 Schedule 1 The original of 419 core collections in upland cotton 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 1 美多毛 Meiduomao 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 2 CC28 美国 America 美国 America 3 反帝棉 Fandimian 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 4 豫棉 1 号 Yumian1 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 5 宛 3396 Wan 3396 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 6 汤棉 7401 Tangmian 7401 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 7 冀棉 8 号 Jimian 8 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 8 大泽棉 Dazemian 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 9 鲁棉 1 号 Lumian 1 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 10 运安 4 号 Yunan 4 黄河流域 Yellow river valley 中国 China 11 莘 547 Xin 547 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 12 岱红岱 Daihongdai 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 13 湘选 2 号 Xiangmian 2 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 14 洞庭 3 号 Dongting 3 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan China 15 南瓜棉 Nanguamian 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 16 枣阳不落蕾 Zaoyangbuluolei 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 17 垂铃棉 Chuilingmian 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 18 徐州 1818Xu Zhou 1818 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 19 沪棉 204Hu Mian 204 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 长江流域 Yangtze river valley 中国浙江 Zhejiang, China 21 慈棉 9 号 Cimian 9 长江流域 Yangtze river valley 中国浙江 Zhejiang, China 22 彭泽 4 号 Pengze 4 长江流域 Yangtze river valley 中国江西 Jiangxi, China 南部 South of China 中国云南 Yunnan, China 24 邵阳大桃 Shaoyangdatao 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 25 延 64-1 Yan 64-1 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 26 中 521 Zhong 521 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 27 枝 6705 Zhi 6705 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 28 咸棉 858 Xianmian 858 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 29 鄂沙 28 Esha 28 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 30 徐州 514 Xuzhou 514 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 31 徐州 142 Xuzhou 142 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 32 泗棉 2 号 Simian 2 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 33 肖县 133 长绒 Xiaoxian 133 changrong 长江流域 Yangtze river valley 中国安徽 Anhui, China 34 陕岱系 Shandaixi 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 35 宝山大桃 Baoshandatao 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 36 保 6716 BGR 6716 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 37 中棉所 12 号 Zhongmiansuo 12 黄河流域 Yellow river valley 中国安阳 Anyang, China 38 无极一枝花 Wujiyizhihua 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 39 冀棉 12 号 Jimian12 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 40 鄂棉 12 号 Emian 12 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China

45 中国农业科学 49 卷 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 41 岱 15 鸭棚棉 Dai 15 Yapengmian 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 42 中棉所 19 号 Zhongmiansuo 19 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 43 中 Zhong 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 44 科远 1Keyuan 1 黄河流域 Yellow river valley 中国北京 Beijing, China 45 科远 4 Keyuan 4 黄河流域 Yellow river valley 中国北京 Beijing, China 46 临清 201 Linqing 201 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 47 宛早 686 Wanzao 686 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan China 48 宛 231 Wan 231 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 49 中棉所 23 号 Zhongmiansuo 23 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 50 南丹巴地大花 Nandanbadidahua 南部 South of China 中国广西 Guangxi, China H-1 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 52 苏棉 1 号 Sumian 1 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 53 晋远 1081 Jinyuan 1081 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 54 八农 212 Banong 212 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang China 55 吐 Tu 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 56 布 3363 Bu 3363 美国 America 美国 America 57 中植 BD13 Zhongzhi BD13 黄河流域 Yellow river valley 中国北京 Beijing, China 58 临清 2350 Linqing 2350 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 59 华中 106 Huazhong 106 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 60 中棉所 10 号 Zhongmiansuo 10 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 61 黑山棉 1 号 Heishanmian 1 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 62 锦棉 2 号 Jinmian 2 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 63 聊 113 Liao 113 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 64 Chirpan996 其他国家 Other countries 保加利亚 Bulgaria 65 辽棉 9 号 Liaomian 9 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 66 中棉所 16 号 Zhongmiansuo 16 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 67 豫职师 84-1 Yuzhishi 84-1 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 68 辽 Liao 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 69 冀 Ji 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 70 陕 2754 Shan 2754 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 71 陕 2812 Shan 2812 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 72 达棉 20 号 Damian 20 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 73 冀合抗烟 Jihekangyan 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 74 鄂 Q872 E Q872 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 75 豫早 275 Yuzao 275 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 76 运早 219 Yunzao 219 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 77 运 93 抗 354 Yun 93 Kang 354 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 78 运 94H-32 Yun 94H-32 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 79 辽锦棉 3 号 Liaojinmian 3 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 80 库车 Kuche 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 81 喀什 736 Kashi 736 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 82 库车 T94-4 Kuche T94-4 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China

46 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 83 邯 241 Han 241 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 84 豫棉 19 Yumian 19 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 85 奎屯系 353 Kuitunxi 353 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 86 邯 284 Han 284 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 87 双价 321 Shuangjia 321 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 88 新陆早 10 号 Xinluzao 10 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 89 老杨棉 Laoyangmian 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 90 灵宝棉 Lingbaomian 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 91 郑州 -385 Zhengzhou -385 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 92 罗甸铁籽 Luodiantiezi 南部 South of China 中国贵州 Guizhou, China 93 莎陆 1 号 Shalu 1 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 94 秦荔 514 Qinli 514 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 95 运 K1505 Yun K1505 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 96 宁棉 18 号 Ningmian 18 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 97 桂都安县五仁乡白子 Guiduanxianwurenxiangbaizi 南部 South of China 中国广西 Guangxi, China 98 桂罗成大棉 Guiluochengdamian 南部 South of China 中国广西 Guangxi, China 99 滇丽江县巨甸乡苗花 Dianlijiangxianjudianxiangmiaohua 南部 South of China 中国云南 Yunnan, China 100 新陆中 5 号 Xinluzhong 5 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 101 苏抗 310 Sukang 310 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 102 豫棉 18 Yumian 18 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 103 国欣棉 3 号 Guoxinmian 3 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 104 晋棉 38 Jinmian 38 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 105 中植 86-6 Zhongzhi 86-6 北部 North of China 中国北京 Beijing, China 106 红狮 5 号 Hongshi 5 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 107 简阳 303 Jianyang 303 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 108 宁棉 9 号 Ningmian 9 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 109 新陆早 36 Xinluzao 36 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 110 博乐 34 号 Bole 34 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang China 111 陕 4080 Shan 4080 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 112 赣棉 12 号 Ganmian 12 长江流域 Yangtze river valley 中国江西 Jiangxi, China 113 中遗红 2 Zhongyihong 2 北部 North of China 中国北京 Beijing, China 114 苏远 04-3 Suyuan 04-3 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 115 苏远 Suyuan 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 116 J02508 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 117 中 R1052 Zhong R1052 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 118 中 R2058 Zhong R2058 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 119 辽 4853 Liao 4853 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 120 鲁 890 Lu 890 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 121 辽 2277 Liao 2277 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 122 太原 4 号 Taiyuan 4 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 123 中棉所 49 Zhongmiansuo 49 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 124 河南 79 号 Henan 79 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China

47 中国农业科学 49 卷 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 125 酒棉 2 号 Jiumian 2 西北 Northwest of China 中国甘肃 Gansu, China 126 晋棉 36Jinmian 36 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 127 中 2201Zhong 2201 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 128 新陆早 21 号 Xinluzao 21 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 129 新陆早 28 号 Xinluzao 28 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 130 晋 7 Jin 7 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 131 新陆中 34 Xinluzhong 34 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 132 一束红 Yishuhong 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 134 荆州退化棉 Jingzhoutuihuamian 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 135 陕 689 Shan 689 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 136 河大 Heda 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 137 陕 954 Shan 954 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 138 仁洞 Rendong 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 139 江苏棉 1 号 Jiangsumian 1 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 140 陕三原 Shansanyuan 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 141 平塘老洋花 Pingtanglaoyanghua 南部 South of China 中国贵州 Guizhou, China 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 143 北京 432 Beijing 432 黄河流域 Yellow river valley 中国北京 Beijing, China 144 北褚公社棉 Beichugongshemian 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 145 抗 5 Kang 5 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 146 邢台 W-2 Xingtai W-2 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 147 赣早 032 Ganzao 032 长江流域 Yangtze river valley 中国江西 Jiangxi, China 148 中 5765 Zhong 5765 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 149 中 6331 Zhong 6331 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 150 冀农 355 Jinong 355 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 151 川 Chuan 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 152 鄂 E 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 153 军棉 1 号 Junmian 1 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 154 上海 368 Shanghai 368 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 155 岱 4554 Dai 4554 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 156 湖南麻阳洋棉花 Hunanmayangyangmianhua 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 157 巴马那良大棉 Bamanaliangdamian 南部 South of China 中国广西 Guangxi, China 158 川 206 Chuan 206 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 159 南丹里湖大棉 Nandanlihudamian 南部 South of China 中国广西 Guangxi, China 160 苏远 7252 Suyuan 7252 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 161 华中远 Huazhongyuan 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 162 鄂 E901 E E901 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 163 三湖 84-1 San Hu 84-1 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 164 川 3593 Chuan 3593 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 165 鄂棉 19 号 Emian 19 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 166 鄂 4396 E 4396 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China

48 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 167 辽 7003 Liao 7003 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 168 锦 417 Jin 417 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 169 南通 Nantong 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 170 吐 Tu 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 171 中沪植 PI3910a Zhonghuzhi PI3910a 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 172 鄂棉 21 E Mian 21 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 173 孝 2168 Xiao 2168 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 174 中棉所 30 Zhongmiansuo 30 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 175 JCG82 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 176 石河子 913 Shihezi 913 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 177 中 Zhong 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 178 新研 Xinyan 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 179 科遗 7 号 Keyi 7 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 180 新陆中 8 号 Xinluzhong 8 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 181 红鸡脚叶白绒 Hong Ji Jiao Ye Bai Rong 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 182 石远 345Shiyuan 345 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 183 巴棉 1 号 Bamian 1 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 184 洞庭 1 号 Dongting 1 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 185 Ⅵ 3221 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 186 辽阳绿绒棉 Liaoyanglürongmian 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 187 泗阳 630 Siyang 630 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 选系 Xuanxi 733 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 189 荆 Jing 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 190 鲁原 343 Luyuan 343 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 191 苏远 Suyuan 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 192 中棉所 50 Zhongmiansuo 50 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 193 新陆早 31 Xinluzao 31 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 194 中远 0114 Zhongyuan 0114 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 195 中沪植 PI9321 Zhonghuzhi PI9321 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 196 河南大铃大斯棉 Henandalingdasimian 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 197 辉县一窝猴 Huixianyiwohou 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 198 大桃棉 Dataomian 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 199 运 1812 Yun 1812 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 200 徐州 6 号 Xuzhou 6 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 201 岱字棉短果枝 Daizimianduanguozhi 美国 America 美国 America 202 新陆早 7 号 Xinluzao 7 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 203 一把鞭 Yibabian 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 204 鲁棉 2 号 Lumian 2 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 205 中棉所 17 号 Zhongmiansuo 17 黄河流域 Yellow river valley 中国安阳 Anyang, China 206 鲁 1138Lumian 21 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 207 中植 86-1 Zhongzhi 86-1 北部 North of China 中国北京 Beijing, China 208 鄂抗棉 8 号 Ekangmian 8 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China

49 中国农业科学 49 卷 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 209 陕 416 Shan 416 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 210 鲁棉 6 号 Lumian 6 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 211 中棉所 35 Zhongmiansuo 35 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 212 新棉 33B Xinmian33B 美国 America 美国 America 213 泗棉 3 号 Simian 3 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 214 宿棉 9108 Sumian 9108 长江流域 Yangtze river valley 中国安徽 Anhui, China 215 中棉所 41 Zhongmiansuo 41 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 216 泗 168 Si 168 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 217 临清 2352 Linqing 2352 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 218 乍得 3 号 Chad 3 其他国家 Other countries 乍得 Chad 219 中 206 Zhong 206 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 220 农光一号 Nongguang 1 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 221 土库曼陆地棉 Turkmen Upland 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 222 酒棉 8 号 Jiumian 8 西北 Northwest of China 中国甘肃 Gansu, China 223 晋棉 46 Jinmian 46 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 224 BJA592 其他国家 Other countries 乌干达 Uganda 225 苏联棉 78 系 USSR Str.78 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 226 MAR-7A-3 美国 America 美国 America 227 快车棉 Express Kuaichemian Express 美国 America 美国 America 228 King 美国 America 美国 America 229 美 B-35 US B-35 美国 America 美国 America 230 С1835 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 231 保 2367 BGR2367 其他国家 Other countries 保加利亚 Bulgaria 232 无酚 1 号 Wufen 1 长江流域 Yangtze river valley 中国浙江 Zhejiang, China 233 农大棉 8 号 Nongdamian 8 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 234 晋棉 49 Jinmian 49 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 235 非洲棉 E-40 Africa E-40 其他国家 Other countries 苏丹 Sultan 236 GP203 美国 America 美国 America 237 苏联棉 156 系 USSR Str.156 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 238 德州 973 Texas 973 美国 America 美国 America 239 澳 V2/757 Australia V2/757 其他国家 Other countries 澳大利亚 Australia 240 F281 其他国家 Other countries 法国 France 241 绿絮 1 号 Lüxu 1 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 242 中棉所 60 Zhongmiansuo 60 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 243 Miscot 美国 America 美国 America 244 冀丰 908 Jifeng 908 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 245 鲁棉研 28 号 Lumianyan 28 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 246 GP135 美国 America 美国 America 247 鄂 0908 E 0908 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 248 阿肯色 971 Arkansas 971 美国 America 美国 America 249 棕絮 1 号 Zongxu 1 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 250 晋棉 34 Jinmian 34 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China

50 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 251 岱字棉 16 号 D.P.L.16 美国 America 美国 America 252 澳 SiV2 Australia SiV2 其他国家 Other countries 澳大利亚 Australia 253 Delcot277-5 美国 America 美国 America 254 棕 2-63 Zong 2-63 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 255 司 C-6524 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 256 GZNn 美国 America 美国 America 257 湘棉 13 号 Xiangmian 13 长江流域 Yangtze river valley 中国河北 Hebei, China 258 爱字棉 Aizimian 美国 America 美国 America 259 AC321 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 260 V1 美国 America 美国 America 261 BP52 其他国家 Other countries 乌干达 Uganda 262 超鸡脚德字棉 Chaojijiaodezimian 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 263 湘棉 18 Xiangmian 18 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 264 PD2165 美国 America 美国 America 265 石抗 39 Shikang 39 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 266 稀絮 H10 Xixu H10 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 267 银棉 1 号 Yinmian 1 黄河流域 Yellow river valley 中国北京 Beijing, China 268 苏优 6036 Suyou 6036 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 269 花斑叶 Huabanye 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 270 农大棉 7 号 Nongdamian 7 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 271 博乐 Bole 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 272 中棉所 81 Zhongmiansuo 81 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 273 DES926 美国 America 美国 America 274 PD3246 美国 America 美国 America 275 N 其他国家 Other countries 澳大利亚 Australia 276 M 美国 America 美国 America 277 中 RI015 Zhong R1015 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 278 PD6186 美国 America 美国 America 279 美 US 美国 America 美国 America 国外引 Guowaiyin-14 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 281 HF5RUP 美国 America 美国 America 282 C3210 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 283 哥伦比亚 Columbia 美国 America 美国 America 284 德字棉 2404Delfos 2404 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 285 Pilose-3 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 286 Qik 美国 America 美国 America 287 辽无 1201 Liaowu 1201 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 288 CF-43/2 其他国家 Other countries 土耳其 Turkey 289 布哈拉 6 号 Bukhara 6 其他国家 Other countries 乌兹别克斯坦 Uzbekistan 290 超鸡脚 Chaojijiao 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 291 M 美国 America 美国 America 292 Z37less 美国 America 美国 America

51 中国农业科学 49 卷 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 293 Babshaw1 美国 America 美国 America 294 苏 BR6202Bt Su BR6202Bt 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 295 PD97072 美国 America 美国 America X 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 297 Delfos9169A 美国 America 美国 America 298 Desmotada 其他国家 Other countries 西班牙 Spain 299 晋农大远 3-1 Jinnongdayuan 3-1 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 300 苏联棉 35 系 USSR Str.35 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 国外引 Guowaiyin-17 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 302 美 87-2 US 美国 America 美国 America 303 St213RNR 美国 America 美国 America 304 群科棉 Qunkemian 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 305 L-5F45 美国 America 美国 America 306 MSCO-8 美国 America 美国 America 307 安集延 -60 Anjiyan-60 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 308 DP90 美国 America 美国 America 309 密斯柯特 8711ne Miscot 8711ne 美国 America 美国 America 310 EmpireStrN2-4 美国 America 美国 America 311 V 美国 America 美国 America 312 Cestam86-1 其他国家 Other countries 墨西哥 Mexico 313 PD0113 美国 America 美国 America 314 苏联棉 118 系 USSR Str.118 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 315 中植棉 2 号 V53-19 北部 North of China 中国北京 Beijing, China 316 Rowden 美国 America 美国 America 317 费尔干 175 Fergana 175 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 国外引 Guowaiyin-4 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 319 巴西 006 Brazil 006 其他国家 Other countries 巴西 Brazil 320 中无 372 Zhongwu 372 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 321 Cook1627 美国 America 美国 America 322 Greenlint 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 323 新陆中 35 号 Xinluzhong 35 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 324 农林 1 号 Nonglin 1 其他国家 Other countries 日本 Japan 325 宁 523 Ning 523 长江流域 Yangtze river valley 中国南京 Nanjing, China 326 Local Cotton 其他国家 Other countries 俄罗斯 Russia 327 苏联棉 12 系 USSR Str.12 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 328 辽阳多毛棉 Liaoyangduomaomian 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 329 蔡科 510 CHACO510 美国 America 美国 America 330 鸡脚红叶棉 Jijiaohongyemian 长江流域 Yangtze river valley 中国四川 Sichuan, China 331 澧 Li 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China B006 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 333 邓恩 HS120 Dengen HS120 美国 America 美国 America 334 苏联 8909 USSR 8909 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union

52 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 335 百棉 1 号 Baimian 1 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 336 TYJ 其他国家 Other countries 苏联 Soviet Union 337 GP81 美国 America 美国 America 338 岱字棉 15 号 D.P.L.15 美国 America 美国 America 339 LambrightGL-N 美国 America 美国 America F 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 341 波棉 3 号 Bomian 3 长江流域 Yangtze river valley 中国江西 Jiangxi, China 342 斯字棉 453 Stonville 453 美国 America 美国 America 343 gl2gl3 美国 America 美国 America 344 紫褐陆地棉 Ziheludimian 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 345 FH682 其他国家 Other countries 巴基斯坦 Pakistan 346 N73DeltapineNGF 其他国家 Other countries 澳大利亚 Australia 347 Local cotton 其他国家 Other countries 俄罗斯 Russia 348 中 Zhong21371 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 349 冀 169 Ji169 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 350 Ari1327 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 351 Ari971 美国 America 美国 America 352 A41772BBt 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 353 SGK9708 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 354 大铃棉 69 号 Dalingmian 69 长江流域 Yangtze river valley 中国湖南 Hunan, China 355 辽阳多毛棉 Liaoyangduomaomian 北部 North of China 中国辽宁 Liaoning, China 356 中 Arc73 Zhong Arc73 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 357 R01 三都 85 R01 Sandu 85 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 358 SA1064B1 美国 America 美国 America 359 K8J508 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 360 中 R Zhong R 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 361 中 R Zhong R 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 362 中 1138E24 Zhong 1138E24 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 363 R8166S91 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 364 中棉所 43 Zhongmiansuo 43 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 365 苏优 6108 Suyou 6108 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 366 望江长绒棉 Wangjiangchangrongmian 长江流域 Yangtze river valley 中国安徽 Anhui, China 367 原 Yuan 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 368 Ari3696 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 369 苏优 6003 Suyou 6003 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 370 秦远 Qinyuan 黄河流域 Yellow river valley 中国陕西 Shaanxi, China 371 A971Bt 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 372 RT 白絮 RT white cotton fiber 美国 America 美国 America 373 苏远 7235 Suyuan 7235 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 374 五三长绒 Wusanchangrong 长江流域 Yangtze river valley 中国上海 Shanghai, China 375 RTN78 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 376 Ari3697 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China

53 中国农业科学 49 卷 编号 Code 品种名称 Name 生态区 Ecological zone 来源地 Original 377 中 1421 Zhong1421 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China Bt 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 379 中 1441 Zhong1441 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 380 棕 1-61 Zong 1-61 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 381 棕 128 Zong 128 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 382 中棉所 82 Zhongmiansuo 82 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 383 棕 S9B11 Zong S9B11 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 384 棕 S9B12 Zong S9B12 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 385 冀 668 Ji 668 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 386 新陆早 3 号 Xinluzao 3 西北 Northwest of China 中国新疆 Xinjiang, China 387 廊黄 F10 Langhuang F10 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 388 苏棉 12 Sumian 12 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 389 乌干达 3 号 Uganda 3 其他国家 Other countries 乌干达 Uganda 390 常抗棉 Changkangmian 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 北部 North of China 中国北京 Beijing, China 392 中无 378 Zhongwu 378 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 393 徐州 553 Sumian 2 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 394 鄂光棉 D.P.L.smooth leaf 美国 America 美国 America 395 冀棉 11 号 Jimian 11 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 396 TM-1 美国 America 美国 America 397 双桃棉 Shuangtaomian 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 398 芽黄 Li Yahuang Li 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 399 渝棉 1 号 Yumian 1 长江流域 Yangtze river valley 中国重庆 Chongqing, China 400 廊黄 10 Langhuang 10 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 401 冀棉 20 Jimian 20 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 402 J 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 403 CZA(70)33 其他国家 Other countries 澳大利亚 Australia 404 邯郸 333 Handan 333 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 405 晋棉 33 号 Jinmian 33 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 406 中棉所 36 Zhongmiansuo 36 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 407 豫棉 8 号 Yumian 8 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 408 豫棉 21 号 Yumian 21 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 409 晋棉 20 号 Jinmian 20 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 410 赣棉 11 号 Ganmian 11 长江流域 Yangtze river valley 中国江西 Jiangxi, China 411 苏棉 22 号 Sumian 22 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 412 苏棉 9 号 Sumian 9 长江流域 Yangtze river valley 中国江苏 Jiangsu, China 413 银山 6 号 Yinshan 6 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 414 鲁棉研 16 号 Lumianyan 16 黄河流域 Yellow river valley 中国山东 Shandong, China 415 晋棉 25 号 Jinmian 25 黄河流域 Yellow river valley 中国山西 Shanxi, China 416 鄂抗棉 10 号 Ekangmian 10 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China 417 中 078 Zhong078 黄河流域 Yellow river valley 中国河南 Henan, China 418 冀棉 17 号 Jimian 17 黄河流域 Yellow river valley 中国河北 Hebei, China 419 鄂棉 20 Emian 20 长江流域 Yangtze river valley 中国湖北 Hubei, China

54 19 期 代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 附表 份核心种质资源 7 个主成分得分 Schedule 2 The seven principal components score of 419 core collections in upland cotton 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 1 美多毛 Meiduomao CC 反帝棉 Fandimian 豫棉 1 号 Yumian 宛 3396 Wan 汤棉 7401 Tangmian 冀棉 8 号 Jimian 大泽棉 Dazemian 鲁棉 1 号 Lumian 运安 4 号 Yunan 莘 547 Xin 岱红岱 Daihongdai 湘选 2 号 Xiangmian 洞庭 3 号 Dongting 南瓜棉 Nanguamian 枣阳不落蕾 Zaoyangbuluolei 垂铃棉 Chuilingmian 徐州 1818Xu Zhou 沪棉 204Hu Mian 慈棉 9 号 Cimian 彭泽 4 号 Pengze 邵阳大桃 Shaoyangdatao 延 64-1 Yan 中 521 Zhong 枝 6705 Zhi 咸棉 858 Xianmian 鄂沙 28 Esha 徐州 514 Xuzhou 徐州 142 Xuzhou 泗棉 2 号 Simian 肖县 133 长绒 Xiaoxian changrong 34 陕岱系 Shandaixi 宝山大桃 Baoshandatao

55 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 36 保 6716 BGR 中棉所 12 号 Zhongmiansuo 无极一枝花 Wujiyizhihua 冀棉 12 号 Jimian 鄂棉 12 号 Emian 岱 15 鸭棚棉 Dai 15 Yapengmian 中棉所 19 号 Zhongmiansuo 中 Zhong 科远 1Keyuan 科远 4 Keyuan 临清 201 Linqing 宛早 686 Wanzao 宛 231 Wan 中棉所 23 号 Zhongmiansuo 南丹巴地大花 Nandanbadidahua H 苏棉 1 号 Sumian 晋远 1081 Jinyuan 八农 212 Banong 吐 Tu 布 3363 Bu 中植 BD13 Zhongzhi BD 临清 2350 Linqing 华中 106 Huazhong 中棉所 10 号 Zhongmiansuo 黑山棉 1 号 Heishanmian 锦棉 2 号 Jinmian 聊 113 Liao Chirpan 辽棉 9 号 Liaomian 中棉所 16 号 Zhongmiansuo 豫职师 84-1 Yuzhishi 辽 Liao 冀 Ji 陕 2754 Shan 陕 2812 Shan 达棉 20 号 Damian

56 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 73 冀合抗烟 Jihekangyan 鄂 Q872 E Q 豫早 275 Yuzao 运早 219 Yunzao 运 93 抗 354 Yun 93 Kang 运 94H-32 Yun 94H 辽锦棉 3 号 Liaojinmian 库车 Kuche 喀什 736 Kashi 库车 T94-4 Kuche T 邯 241 Han 豫棉 19 Yumian 奎屯系 353 Kuitunxi 邯 284 Han 双价 321 Shuangjia 新陆早 10 号 Xinluzao 老杨棉 Laoyangmian 灵宝棉 Lingbaomian 郑州 -385 Zhengzhou 罗甸铁籽 Luodiantiezi 莎陆 1 号 Shalu 秦荔 514 Qinli 运 K1505 Yun K 宁棉 18 号 Ningmian 桂都安县五仁乡白子 Guiduanxianwurenxiangbaizi 98 桂罗成大棉 Guiluochengdamian 滇丽江县巨甸乡苗花 Dianlijiangxianjudianxiangmiaohua 100 新陆中 5 号 Xinluzhong 苏抗 310 Sukang 豫棉 18 Yumian 国欣棉 3 号 Guoxinmian 晋棉 38 Jinmian 中植 86-6 Zhongzhi 红狮 5 号 Hongshi 简阳 303 Jianyang 宁棉 9 号 Ningmian

57 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 109 新陆早 36 Xinluzao 博乐 34 号 Bole 陕 4080 Shan 赣棉 12 号 Ganmian 中遗红 2 Zhongyihong 苏远 04-3 Suyuan 苏远 Suyuan J 中 R1052 Zhong R 中 R2058 Zhong R 辽 4853 Liao 鲁 890 Lu 辽 2277 Liao 太原 4 号 Taiyuan 中棉所 49 Zhongmiansuo 河南 79 号 Henan 酒棉 2 号 Jiumian 晋棉 36Jinmian 中 2201Zhong 新陆早 21 号 Xinluzao 新陆早 28 号 Xinluzao 晋 7 Jin 新陆中 34 Xinluzhong 一束红 Yishuhong 荆州退化棉 Jingzhoutuihuamian 陕 689 Shan 河大 Heda 陕 954 Shan 仁洞 Rendong 江苏棉 1 号 Jiangsumian 陕三原 Shansanyuan 平塘老洋花 Pingtanglaoyanghua 北京 432 Beijing 北褚公社棉 Beichugongshemian 抗 5 Kang

58 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 146 邢台 W-2 Xingtai W 赣早 032 Ganzao 中 5765 Zhong 中 6331 Zhong 冀农 355 Jinong 川 Chuan 鄂 E 军棉 1 号 Junmian 上海 368 Shanghai 岱 4554 Dai 湖南麻阳洋棉花 Hunanmayangyangmianhua 157 巴马那良大棉 Bamanaliangdamian 川 206 Chuan 南丹里湖大棉 Nandanlihudamian 苏远 7252 Suyuan 华中远 Huazhongyuan 鄂 E901 E E 三湖 84-1 San Hu 川 3593 Chuan 鄂棉 19 号 Emian 鄂 4396 E 辽 7003 Liao 锦 417 Jin 南通 Nantong 吐 Tu 中沪植 PI3910a Zhonghuzhi PI3910a 172 鄂棉 21 E Mian 孝 2168 Xiao 中棉所 30 Zhongmiansuo JCG 石河子 913 Shihezi 中 Zhong 新研 Xinyan 科遗 7 号 Keyi 新陆中 8 号 Xinluzhong

59 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 181 红鸡脚叶白绒 Hong Ji Jiao Ye Bai Rong 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 石远 345Shiyuan 巴棉 1 号 Bamian 洞庭 1 号 Dongting Ⅵ 辽阳绿绒棉 Liaoyanglürongmian 泗阳 630 Siyang 选系 Xuanxi 荆 Jing 鲁原 343 Luyuan 苏远 Suyuan 中棉所 50 Zhongmiansuo 新陆早 31 Xinluzao 中远 0114 Zhongyuan 中沪植 PI9321 Zhonghuzhi PI 河南大铃大斯棉 Henandalingdasimian 辉县一窝猴 Huixianyiwohou 大桃棉 Dataomian 运 1812 Yun 徐州 6 号 Xuzhou 岱字棉短果枝 Daizimianduanguozhi 新陆早 7 号 Xinluzao 一把鞭 Yibabian 鲁棉 2 号 Lumian 中棉所 17 号 Zhongmiansuo 鲁 1138Lumian 中植 86-1 Zhongzhi 鄂抗棉 8 号 Ekangmian 陕 416 Shan 鲁棉 6 号 Lumian 中棉所 35 Zhongmiansuo 新棉 33B Xinmian33B 泗棉 3 号 Simian 宿棉 9108 Sumian 中棉所 41 Zhongmiansuo 泗 168 Si

60 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 217 临清 2352 Linqing 乍得 3 号 Chad 中 206 Zhong 农光一号 Nongguang 土库曼陆地棉 Turkmen Upland 酒棉 8 号 Jiumian 晋棉 46 Jinmian BJA 苏联棉 78 系 USSR Str MAR-7A 快车棉 Express Kuaichemian Express 228 King 美 B-35 US B С 保 2367 BGR 无酚 1 号 Wufen 农大棉 8 号 Nongdamian 晋棉 49 Jinmian 非洲棉 E-40 Africa E GP 苏联棉 156 系 USSR Str 德州 973 Texas 澳 V2/757 Australia V2/ F 绿絮 1 号 Lüxu 中棉所 60 Zhongmiansuo Miscot 冀丰 908 Jifeng 鲁棉研 28 号 Lumianyan GP 鄂 0908 E 阿肯色 971 Arkansas 棕絮 1 号 Zongxu 晋棉 34 Jinmian 岱字棉 16 号 D.P.L 澳 SiV2 Australia SiV Delcot

61 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 254 棕 2-63 Zong 司 C GZNn 湘棉 13 号 Xiangmian 爱字棉 Aizimian AC V BP 超鸡脚德字棉 Chaojijiaodezimian 湘棉 18 Xiangmian PD 石抗 39 Shikang 稀絮 H10 Xixu H 银棉 1 号 Yinmian 苏优 6036 Suyou 花斑叶 Huabanye 农大棉 7 号 Nongdamian 博乐 Bole 中棉所 81 Zhongmiansuo DES PD N M 中 RI015 Zhong R PD 美 US 国外引 Guowaiyin HF5RUP C 哥伦比亚 Columbia 德字棉 2404Delfos Pilose Qik 辽无 1201 Liaowu CF-43/ 布哈拉 6 号 Bukhara 超鸡脚 Chaojijiao

62 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 291 M Z37less Babshaw 苏 BR6202Bt Su BR6202Bt PD X Delfos9169A Desmotada 晋农大远 3-1 Jinnongdayuan 苏联棉 35 系 USSR Str 国外引 Guowaiyin 美 87-2 US St213RNR 群科棉 Qunkemian L-5F MSCO 安集延 -60 Anjiyan DP 密斯柯特 8711ne Miscot 8711ne EmpireStrN V Cestam PD 苏联棉 118 系 USSR Str 中植棉 2 号 V Rowden 费尔干 175 Fergana 国外引 Guowaiyin 巴西 006 Brazil 中无 372 Zhongwu Cook Greenlint 新陆中 35 号 Xinluzhong 农林 1 号 Nonglin

63 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 325 宁 523 Ning Local Cotton 苏联棉 12 系 USSR Str 辽阳多毛棉 Liaoyangduomaomian 蔡科 510 CHACO 鸡脚红叶棉 Jijiaohongyemian 澧 Li B 邓恩 HS120 Dengen HS 苏联 8909 USSR 百棉 1 号 Baimian TYJ GP 岱字棉 15 号 D.P.L LambrightGL-N F 波棉 3 号 Bomian 斯字棉 453 Stonville gl2gl 紫褐陆地棉 Ziheludimian FH N73DeltapineNGF Local cotton 中 Zhong 冀 169 Ji Ari Ari A41772BBt SGK 大铃棉 69 号 Dalingmian 辽阳多毛棉 Liaoyangduomaomian 中 Arc73 Zhong Arc R01 三都 85 R01 Sandu SA1064B

64 19 期代攀虹等 : 陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 359 K8J 中 R Zhong R 中 R Zhong R 中 1138E24 Zhong 1138E R8166S 中棉所 43 Zhongmiansuo 苏优 6108 Suyou 望江长绒棉 Wangjiangchangrongmian 367 原 Yuan Ari 苏优 6003 Suyou 秦远 Qinyuan A971Bt RT 白絮 RT white cotton fiber 苏远 7235 Suyuan 五三长绒 Wusanchangrong RTN Ari 中 1421 Zhong Bt 中 1441 Zhong 棕 1-61 Zong 棕 128 Zong 中棉所 82 Zhongmiansuo 棕 S9B11 Zong S9B 棕 S9B12 Zong S9B 冀 668 Ji 新陆早 3 号 Xinluzao 廊黄 F10 Langhuang F 苏棉 12 Sumian 乌干达 3 号 Uganda 常抗棉 Changkangmian 中无 378 Zhongwu

65 中国农业科学 49 卷 编号 Code 名称 Name 第一主成分得分 The first principal component score 第二主成分得分 The second principal component score 第三主成分得分 The third principal component score 第四主成分得分 The fourth principal components score 第五主成分得分 The fifth principal components score 第六主成分得分 The sixth principal components score 第七主成分得分 The seventh principal component score 综合得分 (F) Comprehensive score (F) 393 徐州 553 Sumian 鄂光棉 D.P.L.smooth leaf 冀棉 11 号 Jimian TM 双桃棉 Shuangtaomian 芽黄 Li Yahuang Li 渝棉 1 号 Yumian 廊黄 10 Langhuang 冀棉 20 Jimian J CZA(70) 邯郸 333 Handan 晋棉 33 号 Jinmian 中棉所 36 Zhongmiansuo 豫棉 8 号 Yumian 豫棉 21 号 Yumian 晋棉 20 号 Jinmian 赣棉 11 号 Ganmian 苏棉 22 号 Sumian 苏棉 9 号 Sumian 银山 6 号 Yinshan 鲁棉研 16 号 Lumianyan 晋棉 25 号 Jinmian 鄂抗棉 10 号 Ekangmian 中 078 Zhong 冀棉 17 号 Jimian 鄂棉 20 Emian

66 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 周振翔, 李志康, 陈颖, 王志琴, 杨建昌, 顾骏飞 ( 扬州大学农学院 / 江苏省作物遗传生理国家重点实验室培育点 / 江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏扬州 ) 摘要 : 目的 水稻突变体叶片叶绿素含量显著低于其野生型, 但其光合电子传递效率与净光合值显著高于对照, 文章旨在阐明其生理学机理并探讨其在高光效育种中的潜在应用价值 方法 通过人工气候室的盆栽试验设置高光强 ( 光照强度为 µmol m -2 s -1 ) 与低光强 ( 光照强度约为 µmol m -2 s -1 )2 个处理, 并结合大田试验, 观测突变体与野生型的叶绿素荧光 超氧阴离子含量 丙二醛含量 SOD 酶活性 叶绿体超微结构 叶片荧光显微结构与冠层温度 结果 突变体材料叶绿素含量显著低于其野生型, 并且光照强度对其叶绿素含量的效应也不相同 随着光照强度的增强, 突变体叶片叶绿素含量增加 60%, 而野生型品种叶片叶绿素含量却降低 20% 以上 光反应曲线表明, 突变体光合值显著高于野生型, 尤其在 µmol m -2 s -1 光照下, 低光强与高光强处理中低叶绿素含量突变体光合值分别比野生型高 9.4% 和 46.5% 叶绿素荧光数据也表明, 水稻突变体的电子传递速率 (ETR) 光系统 Ⅱ 的量子产量 (ΦPSⅡ) 光化学淬灭(qP) 光下最大光化学效率(F v/f m) 显著高于其野生型 在高光强处理下, 野生型材料中的应激活性氧超氧阴离子与丙二醛 (MDA) 含量受到光抑制 叶绿体超微结构与荧光显微结构表明, 野生型材料叶绿体受到一定程度的损伤, 且其维管束间距离显著大于突变体, 其维管束面积小于突变体, 不利于水分在叶片中的传输 田间冠层热力学图像表明中午高温 高光照条件下, 突变体冠层温度显著低于其野生型 综合以上结果, 野生型叶片叶绿素含量高, 在高光强下会导致过量光吸收, 光系统 Ⅱ 电子传递效率下降, 超氧阴离子与丙二醛累计, 导致叶绿素结构与功能的破坏, 因此, 其光合值显著低于突变体材料 同时过量光吸收会导致叶片与冠层温度上升, 不利于冠层群体光合 结论 在未来高光效育种中选育叶绿素含量适当降低的品种, 有助于避免高光强下叶片的过量光吸收, 从而缓解活性氧的产生与光抑制, 并有利于降低冠层温度从而缓解水稻群体光合 午休 现象 关键词 : 水稻 ; 光合速率 ; 叶绿素 ; 叶绿素荧光 ; 光抑制 Effects of Reduced Chlorophyll Content on Photoinhibition and Photosynthetic Electron Transport in Rice Leaves ZHOU Zhen-xiang, LI Zhi-kang, CHEN Ying, WANG Zhi-qin, YANG Jian-chang, GU Jun-fei (College of Agriculture, Yangzhou University/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province, Yangzhou , Jiangsu) Abstract: Objective The chlorophyll content of a chlorophyll-deficit rice mutant (YL) is significantly lower than its wild type (WT), but its photosynthetic electron transport rate and net photosynthetic rate are significantly higher than its WT. The aim of this study is to understand the physiological basis, and its potential use in high photosynthetic efficiency breeding was prospected. Method A pot experiment in the climate chamber at high light intensity (HL) and low light intensities (LL), and a field experiment were conducted. Chlorophyll fluorescence, the concentration of super oxygen anion and malodialdehyde, superoxide dismutase activity, light fluorescent and electron micrographs, canopy temperature were investigated. Result The results show 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 973 计划 (2015CB150400) 国家自然科学基金 ( , ) 江苏省自然科学基金 (BK ) 中国博士后基金 (2014M550312,2015T80590) 江苏省高校优势学科建设项目联系方式 : 周振翔, zhouzhenxiang91@163.com 通信作者顾骏飞,Tel: ; gujf@yzu.edu.cn

67 3710 中国农业科学 49 卷 that the chlorophyll content was significantly lower in the mutant than its WT, and the light treatment had different effects on chlorophyll content in the mutant and its WT. When compared the HL and LL treatments, the chlorophyll content was increased by 60% in the mutant, but decreased by 20% in the WT. The light response curves showed that the mutant has a higher photosynthetic capacity than its WT. At the irradiance of µmol m -2 s -1, the photosynthetic rate was 46.5% and 9.4% higher in the mutant than its WT, in HL and LL treatments, respectively. The chlorophyll fluorescence measurements indicate that the photosynthetic electron transport rate (ETR), photosystem Ⅱ efficiency (ΦPSⅡ), photosynthetic quenching (qp), and maximum efficiency of open photosystem Ⅱ in the light (F v /F m) were significantly higher in mutant than its WT. The content of oxygen anion and malondialdehyde were higher in WT than the mutant, especially in HL treatment, indicating photoinhibition in WT. The electron micrographs and light fluorescent micrographs of the mutant and its WT indicated that the chloroplast was to some extent harmed. The inter-vein distance was also found larger in WT than in the mutant, and the area of vascular bundle is smaller in WT than in the mutant, indicating a better water status in mutant than in its WT. The thermal image indicated that the canopy temperature was significantly lower in mutant than in its WT at noon with high irradiance. All the results suggested that the high chlorophyll content in the WT excessively absorbed light energy, causing photoinhibition (high oxygen anion and malondialdehyde content, reduced photosystem Ⅱefficiency and decreased SOD activity), and had a lower photosynthetic rate than the mutant. The excessively absorbed light energy also contributed the higher canopy temperature in WT than in mutant, which is adverse for canopy photosynthesis. Conclusion All these results implicate that selecting for moderate chlorophyll content in breeding would help avoiding the generation of reactive oxygen species and alleviating the photoinhibition, improving photosynthesis, especially at noon under high solar radiation. Key words: rice; photosynthetic rate; chlorophyll; chlorophyll fluorescence; photoinhibition 0 引言 研究意义 人口增加和经济发展给中国粮食增产带来了巨大压力 预计到 2030 年, 中国人口将达到 16 亿, 中国农作物的单产需在现有的基础上提高 50% 以上才能满足粮食的安全供给 [1] 水稻作为中国主要的粮食作物, 其产量提高显得尤为迫切 在 绿色革命 中, 随着水稻矮秆耐肥新品种的选育和氮肥的施用, 水稻产量增加了近一倍 [2] 然后在过去的十年间, 水稻产量几乎没有提高, 人们迫切希望有第二次 绿色革命 来提高水稻的产量 前人研究进展 LONG [3-4] [5] 等和 VON CAEMMERER 等认为第二次 绿色革命 的希望在于提高水稻的光合作用 光合作用是植物将光能转化为化学能的过程 天线色素分子吸收的光能用于反应中心的光化学反应 [6] 在现代大气条件下, 植物吸收的光能远远超过了植物生理代谢的需求, 过量吸收的光能需要通过热耗散等途径来消除, 从而避免产生活性氧等有害物质 [7] [8] ZHU 等研究表明 C 3 作物只能利用 1.9% 的光能 而现代水稻品种对光合有效辐射波段 ( nm) 的光吸收率在 80% 以上, 从而易导致产生 PSⅡ 效率下降 光抑制 光氧化, 甚至 PSⅡ 反应中心的破坏, 表现早衰 [9] 这些过量吸收的能量需要通过各种保护机制来消耗掉 [7], 同时这些保护机制也大大浪费了能量 [10] 本研究切入点 ORT [10-11] 等提出如果能够降低植物叶片中叶绿素 ( 如天线 色素 反应中心色素 ) 的含量, 将有利于减少光抑制, 提高光能利用效率 相关研究已在藻类与蓝藻细菌中取得了进展 [12-13] 而在水稻中鲜有相关报道 拟解决的关键问题 本文拟通过研究在不同光强水平处理下, 一个叶绿素含量降低的水稻突变体叶绿素降低对水稻光合 叶绿素荧光 光胁迫的影响, 旨在为缓解光抑制, 改善水稻光合性能, 最终提高产量提供理论依据 1 材料与方法 1.1 试验材料与栽培概况试验于 2014 年在扬州大学实验农场进行 前茬作物为小麦, 土壤类型均为沙壤土, 土壤含有机质 22.7 g kg -1 速效氮 96.5 mg kg -1 速效磷 20.4 mg kg -1 速效钾 mg kg -1 试验材料为低叶绿体含量突变体 (YL) 与其野生型 (WT, 浙辐 802) 低叶绿体含量突变体由籼稻品种浙辐 802 经物理辐射诱变而成, 由浙江大学程方民教授提供 该突变体已多年种植, 株型形态等遗传性状已经稳定 大田试验于 5 月 12 日播种育秧,6 月 7 日插秧, 株行距为 25 cm 15 cm, 每穴 2 苗 全生育期施纯氮 240 kg N hm -2 小区面积为 15 m 2, 重复 3 次 氮肥作基肥 ( 移栽前 1 d 施 ) 分蘖肥( 移栽后 7 d 施 ) 穗肥 ( 约移栽后 40 d 施 ) 的比例分别为 50% 20% 和 30% 移栽前各小区施用过磷酸钙 ( 含 P 2 O %)300

68 19 期周振翔等 : 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 3711 kg hm -2 和氯化钾 ( 含 K 2 O 52%)195 kg hm -2 按照常规高产栽培管理水分, 全生育期严格控制杂草与病虫害 盆栽试验于 5 月 12 日播种, 大田育秧,6 月 12 日移栽至盆钵, 盆钵直径 25 cm, 高 30 cm, 内装过筛土 18 kg( 取自大田 ) 每盆 3 穴, 每穴 2 苗 共 80 盆, 施氮量为 3.6 g 尿素 / 盆, 尿素施用比例为移栽前:移栽后 7 d :穗分化期( 抽穗前 d)=50% : 20% : 30% 所有处理施 0.5 g 磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 作基肥 5 叶期移入人工气候室生长 d 同时设置 2 个光照处理, 即高光强 ( 光照强度为 µmol m -2 s -1 ) 和低光强 ( 光照强度为 µmol m -2 s -1 ) 人工气候室白天 28 (12 h), 晚上 23 (12 h), 相对湿度 65% 5 叶期黄绿突变体各处理移入 20 盆 取样与光合生理测量时间为七叶期 1.2 取样与测定 叶绿素含量的测定取新鲜叶片 100 mg, 加少量石英砂和少量碳酸钙粉末,7 ml 95% 乙醇研磨呈匀浆状, 倒入带塞试管中, 置于 的温箱中保温浸提, 叶色变白后取出过滤至棕色瓶, 将滤纸洗净, 在暗处贮存或稀释, 以 95% 乙醇为空白, 分别在 和 470 nm 下测定吸光度, 并计算叶绿素含量 [14] 吸收光谱的测定取大田新鲜无病害 无机械损伤 长势相同的叶片, 去除表面灰尘, 保证表面干净无水层, 并用保鲜膜包好, 带回实验室, 用 Ava Spec-2048 型光纤光谱仪 ( 波长 nm, 分辨率 nm) 测量每个时期每个品种每个处理 5 10 株, 选择叶片中部, 每片叶测 3 次, 取平均值 光合响应曲线与荧光参数测定于五叶期将盆栽水稻移入人工气候室, 人工气候室温度设定为白天 28 (12 h), 晚上 23 (12 h), 相对湿度 65%, 光照强度分别为 µmol m -2 s -1 和 µmol m -2 s -1 至第七叶时, 使用 LI-6400 便携式光合测定仪测定光响应曲线, 叶室内初始光照强度设为 µmol m -2 s -1, 叶片温度和叶室内空气湿度分别控制在 25 和 65% 将叶片夹入叶室约 10 min 后调用自动程序, 叶室内光强梯度设定为 µmol m -2 s -1 和 0 测定时间为 3 4 min, 整个程序约 40 min 叶绿素荧光参数使用 MINI-PAM-II( 德国 WALZ 公司生产 ) 测定叶片叶绿素荧光参数 作用光 µmol m -2 s -1, 饱和脉冲 >4 000 µmol m -2 s -1, 闪光 (0.9 µmol m -2 s -1 [15-16], 间隔 30 s) 参照 GENTY 等方法测定并计算光适应状态下电子传递速率 (electron transport rate,etr) 光化学效率(F v /F m) 光化学淬灭 (photochemical quenching,qp) 光适应状态下 PS Ⅱ 的实际量子产量 (the actual photochemical efficiency of PSⅡ,Φ PS Ⅱ) 超氧阴离子红色荧光测定使用上海哈灵生物技术公司试剂盒, 按照使用说明方法并稍做修改, 先加 100 μl 清理液 (Reagent A) 在载玻片上, 选取新鲜叶片的同一部位, 避开大叶脉, 使用国产 ZQP-86 振动切片机切取宽为 50 μm 的横切面, 放入清理液中, 用解剖针小心压碎, 移去清理液, 然后再加入 1 ml 清理液, 同时加入 10 μl 荧光染色剂二氢溴化乙啶 (dihydroethidium,dhe), 放入 37 培养箱孵育 20 min, 取出后, 移去 DHE, 使用清理液清洗, 即可在荧光显微镜 (Axio Imager D2, ZEISS, Germany) 下观察, 设置激发波长 540 nm, 散发波 [17] 长 590 nm 并参考 RODRÍGUEZ-SERRANO 等 方法添加叠氮化钠 (N 3 Na) 对照处理 超氧化物歧化酶 (superoxyde dismutase, SOD) 活性和丙二醛 (malonaldehyde,mda) 含量测定待人工气候室盆钵植株第七叶完全展开时, 摘取置液 [18] 氮冷冻,-70 保存备用 采用 NBT 光化还原法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性, 利用 SOD 酶抑制氮基四唑的光化还原特性, 且抑制强度与酶活性在一定范围内成正比, 并将抑制 NBT 光化还原 50% 的酶量 [19] 定为 1 个酶活力单位 ; 采用硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量 重复 3 次, 取平均值 利用丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成红棕色三甲川在 532 nm 具有最大光吸收的原理, 测量丙二醛含量, 同时试验过程中要排除可溶性糖的干扰 叶片的荧光显微结构与叶绿体的超微结构观察将用于光学显微镜观察的材料使用国产 ZQP-86 振动切片机切取宽为 100 μm 的横切面, 在荧光显微镜 (Axio Imager D2,ZEISS,Germany) 下观察 叶绿体超微结构的观测步骤如下 : 用锋利刀片分别截取叶片的同一个部位, 尽量避开大叶脉, 材料离体后立即投入到预冷的 2.5% 戊二醛中进行固定 2 h; 用 0.1 mol L -1 ph 7.2 磷酸缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) 清洗 3 次, 每次 15 min; 再用 1% OsO 4 固定 2 h; PBS 清洗 3 次, 每次 15 min; 再经梯度浓度乙醇脱水

69 3712 中国农业科学 49 卷 环氧丙烷过渡 环氧树脂浸透和包埋, 聚合成包埋块, 用 Ultra-Jung 超薄切片机切成 nm 的切片, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色, 最后置于透射电子显微镜 (Philips, CM100, 荷兰 ) 下观察, 拍照并做记录 热力学照相于植株的不同生育时期, 挑选晴朗白天的早中晚 3 个时间段, 使用 FLIR ThermaCAM TM S65 系列红外热像仪拍摄大田不同处理的冠层热力学图片, 该摄像机的波长范围为 mm, 可侦测温度范围为 选取 株水稻剑叶中段温度, 取其平均值 1.3 数据处理用 Microsoft Excel 软件整理数据,SPSS16.0 软件统计分析数据,Sigmaplot 10.0 绘图 2 结果 2.1 突变体与野生型叶片叶绿素的含量及吸收光谱由图 1 可知, 突变体叶片叶绿素含量显著低于野生型, 在低光强 ( µmol m -2 s -1 ) 处理下, 突变体叶片叶绿素含量比野生型降低约 73%; 在高光强 ( µmol m -2 s -1 ) 处理下, 比野生型降低约 45% 随着光照强度的增强, 突变体叶片叶绿素含量增加了 60%, 而野生型品种却减少 20% 以上 表明在 叶绿素含量 Chlorophyll content (mg g -1 FW) b a LL HL 光照处理 Light treatment b a YL WT LL: 低光处理 ( µmol m -2 s -1 );HL: 高光处理 ( µmol m -2 s -1 ) 图柱上不同小写字母表示叶绿素含量在 0.05 水平上差异显著 下同 LL: Low Light Intensity( µmol m -2 s -1 ); HL: High Light Intensity ( µmol m -2 s -1 ). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level among chlorophyll contents. The same as below 高光强条件下, 可能由于吸收了过多强光, 导致野生型品种叶绿体结构的破坏和功能的丧失 野生型品种叶片对光合有效辐射波段 ( nm) 的光吸收率显著高于突变体 ( 图 2), 进一步证明了这一结果 2.2 突变体与野生型光反应曲线虽然突变体叶片叶绿素含量显著低于野生型, 但并没有抑制其光合速率 ( 图 3) 尤其在高光强的处理下, 突变体光合速率显著高于野生型, 在饱和光强 (1 000 µmol m -2 s -1 ) 条件下, 经过低光强与高光强处理, 低叶绿素含量突变体光合值分别比野生型高 9.4% 和 46.5% 野生型在饱和光强(1 000 µmol m -2 s -1 ) 条件下, 高光强处理比低光强处理的光合值降低了 19.1%, 然而突变体的光合值增加了 8.3%( 图 3-A 和 3-B) 这说明野生型在高光强环境下发生了光抑制, 低叶绿素含量突变体在高光强条件下有优势 2.3 突变体与野生型的荧光参数由图 4 可知, 在光照强度为 µmol m -2 s -1 时, 突变体水稻的电子传递速率 (ETR) 光系统 Ⅱ 的量子产量 (Φ PS Ⅱ) 光化学淬灭(qP) 光下最大光化学效率 (F v /F m) 显著高于对照 随着环境光照强度的增加, 荧光参数也出现了一定程度的下降, 但并不显著, 野生型的下降幅度更为明显 这可能与野生型较高的光吸收有关 ( 图 2), 其吸收的光能超出了叶绿体本身的负荷, 使光系统发生了损伤, 导致其电子传递速率与光系统 Ⅱ 效率显著下降 2.4 突变体与野生型的超氧阴离子 丙二醛 (MDA) 含量及超氧化物歧化酶 (SOD) 活性植物体内氧化应激活性氧超氧阴离子极不稳定, 吸收光谱值 Absorptance (%) 图 1 在不同光照条件下突变体 (YL) 和野生型 (WT) 叶绿素含量的变化 Fig. 1 Changes of chlorophyll content of the mutant (YL) and its wild type plant (WT) under different irradiances 图 2 突变体 (YL) 与野生型 (WT) 的吸收光谱 Fig. 2 Percentage of absorptance spectra of the mutant (YL) and its wild type plant (WT)

70 19 期周振翔等 : 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 3713 光合值 Photosynthesis (mmol m -2 s -1 ) A YL WT 光照强度 Light intensity (mmol m -2 s -1 ) LL 35 B HL 光照强度 Light intensity (mmol m -2 s -1 ) 图 3 突变体 (YL) 与野生型 (WT) 在不同光照条件下的光反应曲线 Fig. 3 Light response curves of the mutant (YL) and its wild type plant (WT) acclimated to different light densities A a b a b YL WT B a b a b C a LL b a HL b D a LL b a HL b LL HL 0 LL HL 光照处理 Light treatment 光照处理 Light treatment A: 电子传递速率 ;B: 光系统 II 效率 ;C: 光化学淬灭 ;D: 光下光化学效率 A: Electron transport rate; B: PSⅡ efficiency; C: Photochemical quenching; D: The photochemical efficiency under the light Fig. 4 图 4 突变体 (YL) 及其野生型 (WT) 在 µmol m -2 s -1 光强下叶绿素荧光参数的测定 The measurement of chlorophyll fluorescence parameter of the mutant (YL) and its wild type (WT) under irradiance of µmol m -2 s 难以测定, 需要二氢溴化乙啶 (DHE) 特异性染料产生荧光用于观察 [20] 图 5 显示, 相较于对照处理, 随着光照强度的增强, 突变体与野生型的红色荧光信号显著增加, 证明其超氧阴离子显著增多, 同时, 低光强处理下, 野生型的荧光信号略高于突变体, 随着光照的增强, 这种差异逐渐增大 在高光强环境下, 野生型品种吸收了较多的光能 ( 图 2), 但其实际光系统 Ⅱ 的效率少于 30%, 说明只有 <30% 的叶片吸收的光能被用于驱动光合电子传递, 其余一部分过量吸收的能量产生超氧阴离子 ( 图 5-F), 导

71 3714 中 国 农 致光抑制 超氧阴离子自由基可以使细胞的膜相系 [21] 业 科 49 卷 学 体与野生型材料叶片丙二醛含量显著增加 高光照 而脂质过氧化的结果导致丙 处理下 野生型材料叶片内膜脂过氧化的程度显著 二醛 MDA 的形成 随着光照强度的增大 突变 高于突变体 图 6-A 同时 作为机体内天然存在 统发生脂质过氧化 A B +N3Na +N3Na 100 μm 100 μm C D 100 μm 100 μm E F 100 μm 100 μm A B 对照处理 添加 N3Na O2-清洗剂 C D 低光强 LL, µmol m-2 s-1 处理 E F 高光强 LL µmol m-2 s-1 处理 标尺为 100 μm A, B: Negative controls, with N3Na (O2- scavenger); C, D: Low light density treatment (LL, µmol m-2 s-1); E, F: High light density treatment(ll, µmol m-2 s-1). Bar=100 μm 图5 Fig. 5 突变体 A C E 与野生型 B D F 超氧阴离子的形成 Imaging of reactive oxygen species (O2-) production in the mutant (A, C, E) and its wild type plant (B, D, F) under the effect of O2--dependent DHE fluorescence dyes b 3 a b a YL WT A 超氧化物歧化酶 SOD (U g-1 FW h-1) 丙二醛 MDA (nmol g-1 FW) 5 B a b a b LL HL 光照处理 Light treatment 0 LL HL 光照处理 Light treatment A 丙二醛 B 超氧化物歧化酶 A: Malodialdehyde; B: Superoxide Dismutase 图6 Fig. 6 突变体 YL 与野生型 WT 在不同光照下丙二醛含量与超氧化物歧化酶的活性测定 Malodialdehyde (MDA, A) content and superoxide dismutase (SOD, B) activity of the mutant (YL) and its wild type plant (WT) under different irradiances

72 19 期 周振翔等 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 3715 的超氧自由基清除因子 SOD 酶 其活性也随着光 变体与野生型水稻的叶绿体超微结构 可以看出二者 照强度的增加而显著提高 突变体叶片内 SOD 酶活性 的叶绿体整体结构无明显差异 图 7-A 与图 7-C 显著高于野生型 突变体的叶绿体内部垛叠紧密而清晰 基质片层连接 2.5 突变体与野生型水稻的叶绿体超微结构及荧光 形成连续的膜体系 而野生型的叶绿体内部片层结构 显微结构 模糊 嗜锇体的数目增多 这表明类囊体膜系统发生 -2 结合大田常规施氮水平 240 kg N hm 下的突 了一定程度的损伤 A C 图中标尺为 5 µm B D 图中标尺为 1 µm Th 类囊体 OB 嗜锇体 Bar (A, C) = 5 µm; Bar (B, D) = 1 µm; Th: Thylakoid lamellae; OB: Osmiphilic body 图7 Fig. 7 突变体 A B 与野生型材料 C D 的叶绿体发育情况 Electron micrographs of chloroplasts in the mutant (A, B) and its wild type plant (C,D) 随着光照强度的增加 突变体叶绿素含量增加 提高叶片的气孔导度 最终导致突变体具有较高的 野生型叶绿素含量减少 图 8 与图 1 结果一致 光合能力 高光强条件下 野生型品种叶片维管束间距离 inter- 2.6 突变体与野生型水稻的热力学图像 vein distance IVD 比突变体增加了 7.1% 而低光强 在水稻生产中 中午气温高 光照强度强 冠层 条件下增加了 10.2% 同时 相较于低光强处理 温度高 不利于冠层光合 常常表现为水稻的 光合 突变体与野生型叶片在高光强处理下的维管束间距 午休 现象 图 9 是一天之中冠层温度的变化趋势 离分别提高了 8.0%与 5.0% 然而荧光显微结构中 可见中午突变体冠层温度显著低于野生型 这是因为 显示 高光强环境下的突变体叶片内大维管束面积 叶绿素含量降低之后 光吸收减少 有益于冠层光合 为 ±120.3 µm² 相较于低光强环境下的 也可能与其较高的叶片水势有关 大维管束面积 ±59.1 µm² 增加 30.2%左 右 维管束面积和维管束密度的增加 意味着木质 部更加发达 使得突变体的叶片维持较高的水势 3 讨论 光合作用是一系列复杂的代谢反应总和 [22] 因

73 3716 中 国 农 业 科 A B C D E F G H 49 卷 学 IVD A C E G 低光强 LL µmol m-2 s-1 处理 B D F H 高光强 LL µmol m-2 s-1 处理 A B C D 图中标尺为 100 µm E F G H 图中标尺为 50 µm 图中箭头指向为维管束 IVD 维管束间距离 A, C, E, G: Low light density treatment (LL, µmol m-2 s-1) B, D, F, H: High light density treatment (LL, µmol m-2 s-1). Bar= 100 µm in A, B, C and D, and 50 µm in E, F, G and H. Arrows indicate the localization of vein; IVD: Inter-vein distance 图 8 突变体 A B E F 与野生型 C D G H 叶片横切面荧光显微结构 Fig. 8 Light fluorescent micrographs of the mutant (YL, A, B, E and F) and its wild type (WT, C, D, G and H) 此 单单维持叶片高叶绿素含量并不是提高有效光 1 与图 2 单位叶绿素吸收的光能上升 这表明 合速率的必要条件 本研究中相较于野生型 突变 野生型水稻叶绿素含量过量 [23] YIN 等 [24] 研究表 体中 50%左右的叶绿素吸收了 80%以上的光能 图 明 C3 作物光能利用效率只有 2.2% 这意味着植物

74 19 期 3717 周振翔等 叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响 A B C D E F YL 温度 Temperature ( ) G WT a 32 b a a a b :00 13:00 17:00 时间 Time (h) A B 早上 9 点 C D 中午 1 点 E F 下午 5 点 A and B shooting at 9:00 am; C and D shooting at 1:00 pm; E and F shooting at 5:00 pm 图9 Fig. 9 突变体 A C E 与野生型 B D F 的冠层热力学温度日变化 Canopy thermodynamic temperature changes of the mutant (A, C, E) and its wild type plant (B, D, F)

75 3718 中国农业科学 49 卷 实际用于光化学反应的能量只有一小部分, 大部分 [25-26] 甚至需要通过热耗散 荧光等保护机制来消除 ( 图 5) 早有研究表明过量的光吸收会对植物造成潜在的伤害, 这是因为强光会抑制光合作用, 降低最大光合速率 ( 图 3-B), 发生光抑制现象 [27-28] 光抑制的机理主要表现为 2 个方面 :(1) 光合机构的破坏,(2) 热耗散的增加 [29-30] [30-31] 较多研究已经证明光抑制对于光合结构破坏的主要部位在 PSⅡ, 主要指 PSⅡ 反应中心复合体中核心组分 D1 蛋白的破坏 降解和净损失, 具体表现为荧光产额与电子传递活性的大幅度下降 但事实上,PSⅠ 与 PSⅡ 均容易受到光抑制伤害 [32-34] 由于产物和反应物之间存在巨大的氧化还原电势差, 以及一些激发态中间产物的生成, 所以光化学反应过程中就会产生活性氧族 (ROS) 或氧化性较强的分子, 例如梅勒反应的产物 超氧阴离子自由基 (O - 2 ) [35], 对 PSⅠ 的抑制主要来自于在其附近产生的活性氧族 本试验中, 野生型品种在高光处理下超氧阴离子的浓度显著增加, 然而作为专职保护 PSⅠ 的活性氧清除机制 SOD 酶的增量并不足以抵消由于活性氧增加而带来的损伤, 这可能是造成野生型品种电子传递速率显著下降的原因之 [36-37] 一 与本试验的结果一致,ORT 等提出通过降低植物叶片中叶绿素 ( 如天线色素 反应中心色素 ) 的含量, 而减少光抑制, 提高光合 MELIS [38-39] 等在绿藻 Chlamydomonas reinhardtii 中通过 tla 突变减小叶绿素含量, 从而缓解光抑制, 提高了 3 倍光合效率 [40-42] 诸多研究已表明在各种营养条件充足的前提下, 饱和光下的光合速率主要受暗反应中固碳作用的影响, 而不是电子传递速率 那么, 在不改变 Rubisco 酶含量与活性的前提下, 改善叶绿体内 CO 2 浓度就是提高光合速率的最有效途径 [43] 在本试验中, 相较于野生型, 突变体具有更为密集的维管束结构, 更大的维管束面积, 有利于维持较高的叶片水势, 提高气孔导度 ( 图 8) 同时, 突变体具有一定的冠层温度缓冲能力, 可以自动调节剑叶温度维持在光合适宜的温度范围内, 减少夏季正午时分由于高温而引起的光合 午休 现象, 提高气孔开放时间 ( 图 8) 4 结论 在高光强条件下, 适当降低叶绿素含量, 有利于 缓解因过量光吸收而导致的活性氧的产生以及对光系统的破坏, 缓解光抑制, 提高光系统 Ⅱ 光电转化效率与光合电子传递效率, 提高光合能力 同时降低叶绿素含量可以降低午间高光强下冠层温度, 有利于冠层光合 叶绿素含量降低突变体在高光效育种中具有潜在的应用价值 References [1] MURCHIE E H, PINTO M, HORTON P. Agriculture and the new challenges for photosynthesis research. New Phytologist, 2009, 181(3): [2] PENG S, KHUSH G S, VIRK P, TANG Q, ZOU Y. Progress in ideotype breeding to increase rice yield potential. Field Crops Research, 2008, 108: [3] LONG S P. We need winners in the race to increase photosynthesis in rice, whether from conventional breeding, biotechnology or both. Plant, Cell & Environment, 2014, 37(1): [4] LONG S P, MARSHALL-COLON A, ZHU X G. Meeting the global food demand of the future by engineering crop photosynthesis and yield potential. Cell, 2015, 161(1): [5] VON CAEMMERER S, QUICK W P, FURBANK R T. The development of C4 rice: Current progress and future challenges. Science, 2012, 336(6089): [6] KRAUSE G H, WEIS E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annual Review of Plant Biology, 1991, 42(1): [7] MURCHIE E H, NIYOGI K K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology, 2011, 155: [8] ZHU X G, LONG S P, ORT D R. Improving photosynthetic efficiency for greater yield. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: [9] DEMAO J, XIA L, XUEQING H, WEI C, TINGYUN K, MAURICE S B K. The characteristics of CO 2 assimilation of photosynthesis and chlorophyll fluorescence in transgenic PEPC rice. Chinese Science Bulletin, 2001, 46(13): [10] ORT D R, MERCHANT S S, ALRIC J, BARKAN A, BLANKENSHIP R E, BOCK R, CROCE R, HANSON M R, HIBBERD J M, LONG S P. Redesigning photosynthesis to sustainably meet global food and bioenergy demand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2015, 112: [11] ORT D R, ZHU X G, MELIS A. Optimizing antenna size to maximize photosynthetic efficiency. Plant Physiology, 2011, 155: [12] NAKAJIMA Y, ITAYAMA T. Analysis of photosynthetic productivity

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77 3720 中国农业科学 49 卷 STYRING S, TIKKANEN M, ARO E M. Photodamage of ironsulphur clusters in photosystem I induces non-photochemical energy dissipation. Nature Plants, 2016, 2: [35] CLARKE J E, JOHNSON G N. In vivo temperature dependence of cyclic and pseudocyclic electron transport in barley. Planta, 2001, 212(5/6): [36] ORT D R, MERCHANT S S, ALRIC J, BARKAN A, BLANKENSHIP R E, BOCK R, CROCE R, HANSON M R, HIBBERD J M, LONG S P, MOORE T A, MORONEY J, NIYOGI K K, PARRY M A J, PERALTA-YAHYA P P, PRINCE R C, REDDING K E, SPALDING M H, VAN WIJK K J, VERMAASW F J, CAEMMERER S V, WEBWE A P M, YEATES T O, YUAN J S, ZHU X G. Redesigning photosynthesis to sustainably meet global food and bioenergy demand. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 2015, 112: [37] ORT D R, ZHU X G, MELIS A. Optimizing antenna size to maximize photosynthetic efficiency. Plant Physiology, 2011, 155: [38] POLLE J E, KANAKAGIRI S D, MELIS A. tla1, a DNA insertional transformant of the green alga Chlamydomonas reinhardtii with a truncated light-harvesting chlorophyll antenna size. Planta, 2003, 217: [39] MELIS A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: Minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science, 2009, 177: [40] SUKENIK A, BENNETT J, FALKOWSKI P. Light-saturated photosynthesis limitation by electron transport or carbon fixation? Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1987, 891(3): [41] LONG S P, ZHU X G, NAIDU S L, ORT D R. Can improvement in photosynthesis increase crop yields? Plant, Cell & Environment, 2006, 29(3): [42] GU J, YIN X, STRUIK P C, STOMPH T J, WANG H. Using chromosome introgression lines to map quantitative trait loci for photosynthesis parameters in rice (Oryza sativa L.) leaves under drought and well-watered field conditions. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(1): [43] GRIFFITHS H. Plant biology: Designs on Rubisco. Nature, 2006, 441(7096): ( 责任编辑李莉 ) 欢迎订阅 2017 年 蚕业科学 蚕业科学 是由中国科学技术协会主管, 中国蚕学会 中国农业科学院蚕业研究所共同主办的蚕丝学专业学术期刊 本刊主要刊载蚕丝学科在应用基础理论和应用技术研究方面的学术论文 专题研究报告 研究简报 国内外研究进展综述 学术动态 研究简讯等, 主要读者群为从事蚕丝业的科研人员 大专院校师生 生产部门的技术人员和管理人员 本刊是美国 化学文摘 (CA) 日本科学技术振兴机构数据库(JST) 中国科技论文统计源期刊( 中国科技核心期刊 ) 北京大学图书馆 中文核心期刊要目总览 中国农业核心期刊 中国学术期刊综合评价数据库 中国科学引文数据库 (CSCD) 等重要检索刊物及数据库的入选期刊 本刊 年获全国优秀农业期刊一等奖,2007 年获江苏省科技类期刊封面设计和编校质量奖 本刊为双月刊, 逢双月 25 日出版, 大 16 开本, 全铜版纸彩色印刷,128 页 / 期 定价 16 元 / 期 (96 元 / 年 ), 全国各地邮局均可订阅 ( 邮发代号 28-23), 亦可直接向编辑部订阅 本刊承接蚕丝业的各类广告业务, 欢迎洽谈 编辑部地址 : 江苏省镇江市四摆渡中国农业科学院蚕业研究所 ( 邮编 :212018) 电话 ( 传真 ): 网址 :http:

78 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 樊廷录 1, , 李永平, 李尚中, 刘世新, 王淑英, 马明生 ( 1 甘肃农业大学农学院, 兰州 ; 2 甘肃省农业科学院旱地农业研究所, 兰州 ; 3 宁夏农林科学院固原分院, 宁夏固原 ) 摘要 : 目的 干旱缺水是黄土高原旱作农业最大的限制因素, 研究覆膜 增密和品种对旱作玉米增产和水分利用的影响, 有助于揭示未来旱作粮食持续增产与水环境的关系 方法 试验于 年在黄土高原丘陵沟壑区的宁夏彭阳进行, 在全膜双垄沟 (FPRF) 和半膜平铺盖 (HPFC)2 种种植方式下, 选择耐密中晚熟先玉 335 和吉祥 1 号及不耐密早熟酒单 4 号 3 个杂交种, 低密度 (4.5 万株 /hm 2 ) 中密度(6.75 万株 /hm 2 ) 和高密度 (9.0 万株 /hm 2 )3 个水平, 随机区组设计, 玉米连作定位观测 采用烘干法监测不同降水年型玉米生育时期 cm 土层土壤水分, 通过 Surfer 软件绘制土壤水分等值线图, 研究旱作覆膜连作玉米产量 水分利用效率 (WUE) 及土壤水分时空变化 结果 在地膜覆盖条件下各因素对旱作玉米产量和水分利用的影响达到极显著或显著水平, 对籽粒产量和 WUE 的影响顺序依次为降水年型 > 密度 > 覆膜方式 > 品种, 降水年型从干旱 正常 丰水年的变化, 玉米产量由 7.72 和 8.79 t hm -2 增加到 和 t hm -2, 但 WUE 最高值并不在降水较多的年份, 而在正常年型 密度由 4.5 万株 /hm 2 增加到 6.67 万株 /hm 2, 耗水量 产量 WUE 增加 10.6 mm 20.0% 和 3.45 kg mm -1 hm -2, 但密度从 6.67 万株 /hm 2 增加到 9.0 万株 /hm 2 时, 耗水量不再增加, 而产量和 WUE 提高 12.0% 和 2.97 kg mm -1 hm -2 ; FPRF 处理较 HPFC 处理平均增产 15.72%,WUE 提高 21.09%; 耐密中晚熟品种吉祥 1 号和先玉 335 较耐密性弱早熟品种酒单 4 号增产 15.46% 24.45%,WUE 提高 13.35% 15.55% 在全膜双垄沟种植条件下, 玉米生育期内土壤剖面水分含量始终高于半膜平覆盖种植, 尤其是玉米灌浆期 cm 土层多蓄积了 mm 的土壤水分, 在严重伏旱年份发挥了明显的抗旱增产作用 不论降雨年型如何,4 年期间全膜双垄沟播玉米产量增加和 WUE 提高并没有多消耗土壤水分, 土壤深层未形成低湿层, 也未观察到增密增产对土壤剖面水分循环的负效应, 而干旱年份半膜平铺盖形成了一个土壤水分 <8% 的明显干土层, 并且随着玉米生长时间的推后干土层厚度增加 范围扩大 结论 在目前地膜覆盖和生产平均密度 5.3 万株 /hm 2 基础上, 全膜双垄沟播 + 耐密品种 + 增密 1.5 万株 /hm 2 是年降雨 450 mm 以上旱作区玉米持续增产和水分高效利用的技术关键, 增密增产不会导致土壤深层形成干土层 关键词 : 旱作玉米 ; 覆膜 ; 密植增产 ; 水分利用效率 ; 土壤水分 Grain Yield and Water Use Efficiency and Soil Water Changes of Dryland Corn with Film Mulching and Close Planting FAN Ting-lu 1,2, LI Yong-ping 3, LI Shang-zhong 2, LIU Shi-xin 3, WANG Shu-ying 2, MA Ming-sheng 2 ( 1 Agronomy College, Gansu Agricultural University, Lanzhou ; 2 Dryland Agriculture Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou ; 3 Guyuan Branch of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry, Guyuan , Ningxia) Abstract: Objective Drought and water shortage are the main limiting factors for dryland agricultural production on Loess Plateau of China, and studies of the effects of film mulching and close planting and hybrids on dryland corn yield and water use efficiency (WUE) are of benefit to understand the relationship of future grain yield increase and water environment safety. Method 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 十二五 科技支撑计划 (2012BAD09B03,2015BAD22B0-2 和 2013AA102902) 国家公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( 和 ) 甘肃省重大科技专项 (143NKDJ018) 联系方式 : 樊廷录,Tel: ; fantinglu3394@163.com

79 3722 中国农业科学 49 卷 A 4-year field experiment with three replications was conducted in Pengyang county, Ningxia, a hilly and gully region on China s Loess Plateau, in continuous spring corn seasons from the year 2012 to 2015, and a randomized design was used with full film ridge-furrow cover (FPRF) and half film-flat cover (HPFC), three corn hybrids of XY335 and JX1 with close planting and mid-late mature, and JD4 with spaced planting and early mature, and three plant densities of (Low), (Middle) and (High) plants/hm 2. The area of each plot was 6.5 m 3.3 m. Soil water contents were determined at main crop stages in soil depths of a 200 cm with 20 cm depth as a soil lyer. Seasonal ET amounts were calculated with growing season precipitation (precipitation received from planting to harvesting) and soil water changes. Grain yields in all plots were determined by hand-harvesting 12 m 2. Soil moisture contour maps of were drawn using SURFER V11 software. Result Experimental factors highly affected dryland film mulched corn yield and water use, but the order of influence on grain yield and WUE was corn density > film mulching pattern > corn variety. With year s type from dry years to normal and rainy years, grain yield increased from 7.72 and 8.79 t hm -2 to to t hm -2, but the highest WUE value was obtained in normal year not in rainy year. When corn density increased from to plants/hm 2, ETs, grain yield and WUE increased by 10.6 mm, 20.0% and 3.45 kg mm -1 hm -2, and the density improved from to plants/hm 2, ETs did not increase again and grain yield and WUE increased by 12.0% and 2.97 kg mm -1 hm -2, respectively. Average grain yield of corn and WUE in FPRF increased by 15.72% and 21.09% compared with that in HPFC. Grain yield and WUE of JX1 and XY335 hybrids, with close planting and middle-late mature, increased by 15.46% % and 13.35% % compared with that of JD4 hybrid with low density and early mature. Whatever rainfall in the four years, profile soil water content at cm layers during crop growing season was always higher in the FPRF than in the HPFC treatment, particularly the FPRF stored more than mm soil water at the layers in grain filling period, which played an important role in drought-resistance and WUE increase during serious summer drought. More importantly, the FPRF with significant corn yield increase by close planting did not deplete much soil water, yet not resulted in deep dry soil layers formation whether normal and rainy or dry year, and negative effects on soil water cycle were not observed in the FPRF. However, a dry soil layer with less than 8% of soil water was formed significantly in the HPFC treatment at deep layers in dry years, and dry soil thickness increased and it s scope extended as corn growth. Conclusion On the basis of film mulching with density of plants/hm 2 currently, the package of full ridge-furrow film mulching and close planting hybrids and density improvement of plants/hm 2 will be a key technique for sustainable grain yield increase of dryland corn and high efficient use of water in dryland area of annual rainfall over 450 mm, and the yield-increasing techniques with close planting did not cause deep dry soil layers formation. Key words: dryland corn; film mulching; close planting and grain yield increasing; water use efficiency; soil water 0 引言 研究意义 玉米已成为黄土高原旱作区粮食增产的主体, 但受干旱缺水制约, 产量水平一直较低, 高效蓄保降水和提高水分利用效率无疑是旱作玉米长期研究的重大问题 [1], 对确保粮食生产具有十分重要的意义 前人研究进展 国内外长期关注旱作区农田水分的利用 [2-5], 尤以美国大平原秸秆覆盖与少免耕 [6] 印度和以色列微集水种植著称 [7] 近 20 年来, 中国农田垄沟覆膜集雨种植研究与应用取得了重大突破, 特别是全膜双垄沟集雨种植实现了农田垄面集流 覆膜抑蒸 沟垄种植集水保水用水的一体化 [8], 旱作玉米产量提高 30% [9] 垄膜沟种在改善旱作农田土壤水分环境和增粮节水中扮演着非常重要的角色 [10] 玉米生产是群体条件下的生产, 密度是影响其籽粒产量的重要因素之一, 选择紧凑型耐密品种来增大群体密度是获得高产的关键措施 [11-14] 当玉米种植密度成等差级数增加时, 穗粒数成等比级数下降 [15], 粒重随密 度增加呈直线下降 [16] 在充分灌溉或补充条件下密度与籽粒产量 水分利用效率呈二次曲线关系 [17-20] 增加玉米密度群体蒸腾耗水增加, 加剧对土壤水分消耗, 增加密度提高了耗水量 [21] 不论什么降水年型, 密度从 6.0 万株 /hm 2 增加到 10.5 万株 /hm 2 时, 旱作玉米生育期总耗水量差异不明显 [13] 然而, 黄土高原旱作玉米持续高产可能引起深层土壤水分过耗和土壤干燥化 [22-23], 长期应用全膜双垄沟技术会导致土壤水分负平衡和作物早衰, 产量增幅降低 [24-25] 本研究切入点 目前, 关于旱作玉米全膜双垄沟种植的研究集中在土壤水温效应与增产方面, 增加密度与耗水量 水分利用效率的研究仍然不充分, 连续多年的定位研究并不多见 [26], 难以回答全膜双垄沟平均的增产效应和高强度用水对土壤水分盈亏的影响 拟解决的关键问题 本研究通过旱作覆膜玉米连作定位试验, 系统研究全膜双垄沟种植农田土壤水分蓄保和循环利用特征 增密高产与水分利用等问题, 为探明旱作农田水分持续高效利用机理 制定玉米稳定增产技术提供参考依据

80 19 期樊廷录等 : 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 材料与方法 1.1 试验设计试验在黄土丘陵沟壑区宁夏彭阳县白阳镇崾岘村进行 ( 北纬 , 东经 ) 试验所在地海拔 m, 年均降水量 460 mm, 主要集中在 7 月 8 月和 9 月, 季节和年际间降水分配不均, 年均蒸发量 mm, 年均气温 7.4, 0 积温 , 无霜期 d, 属典型温带 半干旱大陆性季风气候, 黄绵土, 肥力中等 根据玉米生育期 (4 9 月 ) 降水量与对应期间降水分析,2012 年为正常年 2013 年为丰水年 2014 年和 2015 年为干旱年 ( 表 1), 其中,2015 年夏秋连旱 特别是 2014 年 5 月 6 月和 7 月降水量明显偏少,2014 年和 2015 年 7 月正值玉米授粉灌浆前期, 降雨量仅是多年同期平均值的 31.7% 和 36.5%, 玉米严重受旱 ;2013 年 7 月 17 日 2014 年 9 月 18 日一日降水分别为 190 和 mm, 形成径流损失, 利用率不高 ( 图 1) 表 年试验期间降水量 Table 1 Rainfall amount in the experimental years of 年份 Year 4 月 April 玉米生育期月降雨 Monthly rainfall in growth periods (mm) 5 月 May 6 月 June 7 月 July 8 月 August 9 月 September 生育期 (4 9 月 ) 降雨量 年降水量 Rainfall in growth Annual periods (mm) rainfall (mm) 降水年型 * Year s type 正常年 Normal 丰水年 Rainy 干旱年 Dry 干旱年 Dry 多年平均 Long-time average annual value *( 生育期降水 - 对应期间多年平均降水 )/ 对应期间多年平均降水 >25% 为丰水年 <-25% 为干旱年 -10% 10% 为正常年 The difference of monthly rainfall to long-time average rainfall divided by long-time average rainfall is more then 25% for rainfall year and less than -25% for dry year and -10% to 10% for normal year 降水量 Rainfall (mm) 图 年试验期间降雨变化 Fig. 1 Monthly rainfall from the year 2012 to 2015 试验以覆膜方式为主处理, 玉米品种为副处理, 密度再裂区, 随机区组设计 主处理 P 为全膜双垄沟覆盖 (P 1 :full plastic ridge-furrow cover,fprf) 和半膜平铺盖 (P 2 :half plastic-flat cover,hpfc)2 种, P 1 大垄宽 70 cm 垄高 10 cm 小垄宽 40 cm 垄高 15 cm, 大小垄交替排列, 玉米种在小垄沟内,P 2 田间地膜宽 60 cm, 地膜与裸地 (50 cm 宽 ) 交替排列, 玉米种在地膜上, 地膜为 mm 厚度的聚乙烯薄膜 ; 副处理 H 为 3 个玉米杂交种, 吉祥 1 号 (JX1, 耐密中等中晚熟 ) 酒单 4 号 (JD4, 耐密性弱早熟 ) 和先玉 335(XY335, 耐密性强中晚熟 ); 再裂区 D 为 3 个密度,D 1 D 2 和 D 3 分别为 万株 /hm 2,

81 3724 中国农业科学 49 卷 当地生产平均密度 5.3 万株 /hm 2 试验处理 18 个, 重复 3 次, 共 54 个小区, 小区面积长 宽 =6.5 m 3.3 m=21.45 m 2, 行距 55 cm, 密度依株距调整 试验每年 4 月 15 日播种, 先玉 335 和吉祥 1 号同期收获,2012 年 10 月 10 日 2013 年 10 月 13 日 2014 年 10 月 18 日 2015 年 10 月 11 日, 酒单 4 号早 10 天收获 每公顷施尿素 525 kg( 其中 300 kg 播前 20 d 撒施翻耕整地覆膜,225 kg 拔节期按株追施 ), 覆膜前每公顷基施过磷酸钙 750 kg,5 6 叶期去除分蘖定苗 当年玉米收获后留茬留膜保墒, 次年 3 月下旬揭膜整地重新覆膜施氮肥 田间管理同大田, 玉米生长期不灌溉 1.2 土壤水分及贮水量的测定在播前 苗期 灌浆和收获时每 20 cm 为一个土层单位, 用土钻采集 cm 土样, 烘干法测定土壤水分 各测定时期土壤贮水量 (mm ) SW = h d w 100%, 式中,h 为土层深度 (mm),d 为土壤容重 (g cm -3 ),w 为土壤重量含水量 (%) 1.3 耗水量及作物水分利用效率的测定旱作农田作物耗水量 (evapotranspiration,et) 由水分平衡方程计算,ET(mm)=(SW 2 -SW 1 )+SR, 式中 SW 1 和 SW 2 为收获和播种时 cm 土壤贮水量, SR 为生育期降雨量 作物水分利用效率 (water use efficiency,wue,kg mm -1 hm -2 )=Y/ET, 式中,Y(yield) 为含水量 14% 时玉米籽粒产量 1.4 数据分析采用 Microsoft Excel 2010 整理数据, 以试验年份 ( 和 2015 年 )Y(4 水平 ) 覆膜方式 P(2 水平 ) 品种 H(3 水平 ) 密度 D(3 水平 ) 为 4 个因素, 用 SAS V8.1 统计处理软件进行多因素方差分析 (ANVOA), 利用 LSD 法多重比较 (α=0.05 和 0.01), 检验 4 个处理因素对产量 耗水量和水分利用效率平均值的差异, 并分析交互作用 依据 4 个试验年份玉米不同时期 cm 土层剖面水分实测值, 利用 Surfer 软件绘制土壤水分等值线图, 揭示试验期间土壤剖面水分的时空变化特征 2 结果 2.1 旱作地膜玉米籽粒产量的变化连续 4 年玉米产量的综合分析表明, 降水年型 (P <0.0001) 地膜覆盖方式(P<0.0001) 品种类型 (P<0.0001) 和种植密度 (P<0.0001) 对旱作玉米产量 (Y) 的影响达到极显著水平 ( 表 2) 在地膜覆 盖条件下, 各因素对玉米产量的影响顺序为降水年型 > 密度 > 覆膜方式 > 品种 随着降水年型从干旱 (2015 年和 2014 年 ) 正常(2012 年 ) 丰水(2013 年 ) 年的变化 ( 表 3), 籽粒产量 (grain yield,gy) 由 7.72 和 8.79 t hm -2 增加到 和 t hm -2, 正常年较干旱年增产 34.92% 53.36%, 较丰水年增产 6.38%( 与 2013 年 7 月份大暴雨造成的部分倒伏有关 ) 密度从 4.75 和 6.0 万株 /hm 2 增加到 9.0 万株 /hm 2, 产量分别达到 和 t hm -2 ( 表 3), 低密度到中密度产量提高 20.62%, 中密度到高密度产量提高 12.03% 覆膜方式由半膜平铺盖到全膜双垄沟, 产量从 9.16 t hm -2 增加到 t hm -2, 提高 15.72%; 品种耐密性由弱 ( 酒单 4 号 ) 到中 ( 吉祥 1 号 ) 产量增加 15.46%, 由中到强 ( 先玉 335) 增加 7.79% 除覆膜方式 年份对产量的交互作用不显著外, 其余两因素交互作用均显著或极显著 品种 密度 覆膜 年型 覆膜 密度及四因素交互作用对产量影响不显著, 而品种 密度 年份 品种 覆膜方式 年份的三因素交互作用达到显著水平 这与年际间降水变异大有关 2.2 旱作地膜玉米水分利用效率的变化在地膜覆盖前提下, 与玉米籽粒产量变化一样, 各因素同样极显著地影响水分利用效率的大小 ( 表 2), 顺序依然是降水年型 > 密度 > 覆膜方式 > 品种 4 个降水年型中, 玉米 WUE 最高值并不在降水较多的年份, 正常年型 WUE 最高 (28.4 kg mm -1 hm -2 ), 较夏秋连旱的 2015 年提高 51.22% 夏季干旱的 2014 年提高 22.89%, 降水较多的 2013 年 WUE 却与 2014 年相当 玉米 WUE 随着密度的增加而提高, 密度由低到中增加 2.25 万株 /hm 2 时 WUE 提高 17.35%, 再由中到高增加同等数量的密度 WUE 提高 12.73% 全膜双垄沟较半膜平铺种植 WUE 提高 21.08% 随着玉米品种耐密性的提高 WUE 增加, 吉祥 1 号较酒单 4 号增加 13.35%, 先玉 335 较吉祥 1 号增加 1.98% 旱作玉米 WUE 除受降水年型 密度 覆膜方式 品种单一因素的显著影响外, 其两因素 三因素 四因素的互作效应同样达到极显著水平, 但密度 覆膜方式 年份的互作效应不显著 2.3 旱作地膜玉米田间耗水量的变化旱作玉米地膜覆盖种植下, 各因素对田间耗水量变化的影响, 同产量 WUE 变化有相似的地方, 但也有不同之处 降水年型 密度 品种对 ET 的影响达到极显著水平 (P<0.0001), 大小顺序为降水年型 >

82 19 期樊廷录等 : 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 3725 表 2 品种 (H) 密度(D) 覆膜方式(P) 和年份 (Y) 对玉米籽粒产量 (GY) 耗水量(ET) 和水分利用效率 (WUE) 的方差分析 Table 2 Analysis of variance on corn hybrids (H), density (D), plastic cover (P), years (Y) on grain yield (GY) and evaportranspiration (ET) and water use efficiency (WUE) 变异来源 Source of variance 籽粒产量 GY 耗水量 ET 水分利用效率 WUE 自由度 F 值 P 值 自由度 F 值 P 值 自由度 F 值 P 值 df F-value P-value df F-value P-value df F-value P-value 年份 Years (Y) *** < *** < *** < 密度 Density (D) *** < *** < *** < 覆膜方式 Plastic cover (P) *** < *** < 品种 Hybrids (H) *** < *** < *** < 品种 密度 H D *** < *** < 品种 覆膜方式 H P * * 密度 覆膜方式 D P *** ** 品种 年份 H Y ** *** < *** < 密度 年份 D Y *** < *** < *** < 覆膜方式 年份 P Y *** < ** 品种 密度 覆膜方式 H D P *** ** 品种 密度 年份 H D Y *** *** < ** 品种 覆膜方式 年份 H P Y *** *** *** < 密度 覆膜方式 年份 D P Y * 品种 密度 覆膜方式 年份 H D P Y *** *** * ** *** 分别表示差异达到 5% 1% 0.1% 显著水平 ** Significant at the and probability level, respectively 表 3 品种 (H) 密度(D) 覆膜方式(P) 和年份 (Y) 对玉米籽粒产量 (Y) 耗水量(ET) 和水分利用效率 (WUE) 平均值的多重比较 Table 3 Multiple comparison of mean value of grain yield (GY), evaportranspiration (ET) and water use efficiency (WUE) affected by corn hybrids (H), density (D), plastic cover (P) and years (Y) 处理 Treatments 品种 H 籽粒产量 GY (t hm -2 ) 耗水量 ET (mm) 水分利用效率 WUE (kg mm -1 hm -2 ) 平均值 P=0.05 P=0.01 平均值 P=0.05 P=0.01 平均值 P=0.05 P=0.01 先玉 335 XY a A a A a A 吉祥 1 号 JX b B a A b B 酒单 4 号 JD c C b B c C 密度 D a A a A a A ( 万株 /hm 2 ) b B a A b B c C b B c C 覆膜方式 P 全膜双垄沟 FPRF a A a A a A 半膜平覆盖 HPFC 9.16 b B a A b B 年份 Y 2012( 正常年 ) Normal year 2013( 丰水年 ) Rainy year 2014( 干旱年 ) Dry year 2015( 干旱年 ) Dry year a A b B a A b B a A b B 8.79 c C d D b B 7.72 d D c C c C 表中同列数据后对应的大 小写字母分别表示在 P=1% 和 P=5% 水平由 LSD 法比较的差异显著性 Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant differences at P=5% and 1% level by LSD, respectively

83 3726 中国农业科学 49 卷 品种 > 密度 田间耗水量随降水量的增加而增加, 而覆膜方式对 ET 影响不显著 (P=0.4176), 全膜双垄沟 ET mm, 半膜平覆盖 mm, 即旱作玉米田间耗水量 ( 包括作物蒸腾耗水与棵间蒸发 ) 与地膜覆盖方式关系并不密切 ( 表 3), 增加地膜覆盖面积主要是减少了土壤水分无效蒸发损失, 提高了蒸腾耗水比例, 降水量多少 品种水分利用能力 群体大小是旱作玉米耗水增产的主要驱动因子 然而, 密度由低到中 ET 增加 10.6 mm, 达到极显著水平, 中密度与高密度之间 ET 差异不显著 中晚熟耐密品种先玉 335 与吉祥 1 号之间 ET 无明显差异, 而较早熟耐密性弱的酒单 4 号 ET 增加 mm, 差异极显著 就各因素对 ET 的互作而言, 降水年型 密度 覆膜方式 品种三要素之间互作效应和四要素互作效应, 以及降水年型与品种 密度 覆膜方式二因素之 间的互作效应, 均达到显著或极显著水平, 这与年际间降水变异大有关 但品种 密度 覆膜方式二因素之间的互作效应不显著 2.4 降水 密度 品种对旱作全膜双垄沟玉米产量和水分效率的协同影响旱作玉米地膜覆盖下的单因素主效应和多因素互作效应分析表明, 全膜双垄沟较半膜平铺种植以相近的田间耗水量显著提高了产量和 WUE, 选择耐密品种和增加密度是协同提高产量与 WUE 的关键 无论是正常年份 湿润年份还是干旱年份, 全膜双垄沟种植下 3 个玉米品种产量 WUE 耗水量均随密度的增加而提高 ( 图 2)(2013 年先玉 335 高密度下 ET 例外 ), 不同密度之间 ET 增加幅度显著小于产量 WUE 增幅, WUE 与产量的变化趋势一致, 即地膜覆盖条件下增密是旱作玉米增产节水农艺措施调控的关键 旱作玉米 吉祥 1 号 JX1 吉祥 1 号 JX1 吉祥 1 号 JX1 耗水量 ET (mm) 年 2013 年 2014 年 2015 年 年 2013 年 2014 年 2015 年 年 2013 年 2014 年 2015 年 产量 Yield (t hm -2 ) 水分利用效率 WUE (kg mm -1 hm -2 ) 耗水量 ET (mm) 酒单 4 号 JD 年 2013 年 2014 年 2015 年 年 2013 年 2014 年 2015 年 年 2013 年 2014 年 2015 年 产量 Yield (t hm -2 ) 酒单 4 号 JD 水分利用效率 WUE (kg mm -1 hm -2 ) 酒单 4 号 JD 先玉 335 XY335 先玉 335 XY335 先玉 335 XY335 耗水量 ET (mm) 年 2013 年 2014 年 2015 年 产量 Yield (t hm -2 ) 年 2013 年 2014 年 2015 年 年 2013 年 2014 年 2015 年 水分利用效率 WUE (kg mm -1 hm -2 ) 密度 Density (10 4 plant/hm 2 ) 图 年降水年型密度对全膜双垄沟玉米耗水量 产量和水分利用效率的影响 Fig. 2 Effects of corn density on ET, corn yield and WUE in FPRF treatment from 2012 to 2015

84 19 期樊廷录等 : 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 3727 产量和 WUE 与降水量有关, 但与生育期降雨的季节分配更密切,2013 年为丰水年, 生育期降雨最多 (594.1 mm), 较 2012 年正常年增加 mm, 但不同密度 不同品种下的 WUE 值在 2013 年低于 2012 年, 主要是 2013 年 7 8 月高强度降雨利用率低 尽管 2014 年生育期降雨与 2012 年相近 (410 mm 左右 ), 但 2014 年是干旱年份,4 月和 9 月降雨占生育期降雨的 68.5%, 而 5 6 月苗期 7 月需水关键期降雨量仅是多年平均值的 36.3% 和 31.7%, 导致产量和 WUE 明显降低 2015 年生育期降水量最少且夏秋连旱, 在 4 个试验年份中产量和 WUE 均最低 先玉 335 和吉祥 1 号耐密中晚熟, 生育期较耐密性弱的酒单 4 号长 7 10 d, 不论降水年型如何, 随着品种耐密性增强和密度增加, 产量和 WUE 同步提高, 品种与密度对产量和 WUE 协同作用丰水年份和正常年份大于干旱年份, 但随着降水量的减少品种与密度的协同效应降低 ( 图 2) 2.5 旱作地膜玉米生育期土壤水分变化及其垂直分布从试验开始的 2012 年 4 月到试验结束的 2015 年 10 月, 通过对玉米主要生育时期 cm 土壤水分的测定 ( 图 3), 不论降水年型如何, 旱作农田全膜双垄沟集雨种植 (FPRF) 土壤水分始终高于半膜平铺盖种植 (HPFC) 无论全膜双垄沟还是半膜铺盖, 土壤中保蓄水分的多少 ( 图 3) 与季节性降水量高低基本一致 ( 图 1),2013 年丰水年保蓄的土壤水分高于 2012 年正常年, 正常年高于 2014 年和 2015 年的干旱年 特别是试验进行到 2014 年 2015 年时, 玉米整个生育期降水减少,7 8 月共降雨 90 mm 左右, 是多年同期平均降水量的 47.9%, 大约是 2012 年同期降水的 50% 和 2013 年的 30% 2014 年 8 月 4 日和 8 月 20 日 FPRF 处理土壤平均水分达到了 12.50% 和 12.37%, 较 HPFC 处理增加 2.66 和 1.98 个百分点, 2015 年 7 月 30 日和 8 月 30 日同样处理的土壤水分为 15.66% 和 13.55%, 较 HPFC 处理增加 3.49 和 3.39 个 cm 土壤水分 Soil water (%) 沟垄全膜 FPRF 半膜平覆 HPFC 日期 ( 月 - 日 ) Date (month-day) 图 年全膜双垄沟与半膜平铺盖种植 cm 土层平均土壤水分变化 Fig. 3 Average soil water changes in the cm soil layers for FPRF and HPFC treatments from the year 2012 to 2015 百分点, 即全膜双垄沟种植在玉米灌浆期 cm 土层多蓄积了 mm 的土壤水分, 在严重伏旱年份发挥了明显的抗旱增产作用 同半膜平铺盖相比, 试验期间全膜双垄沟玉米不同生育期土壤贮水量也明显增加 年早春播前 cm 土层贮水量 FPRF 处理较 HPFC 处理分别增加 和 63.2 mm, 苗期干旱季节分别增加 和 mm, 到玉米收获后仍然增加 和 58.0 mm 经过连续 4 年玉米耗水与降水补给的消长, 全膜双垄沟集雨种植 cm 剖面土壤水分垂直分 布发生了明显变化 ( 图 4) 在 4 年试验期间,FPRF 处理 cm 土壤剖面水分始终高于 HPFC 处理, 随着土层深度的增加或玉米生育进程的推进,2 种覆膜种植方式之间土壤水分趋势性接近, 但这种变化趋势在不同气候年份间不尽一致 正常年份 2012 年和丰水年份 2013 年土壤水分剖面分布特征基本相似,7 8 月份降雨量是多年平均值的 1 3 倍, 土壤水分得到恢复补偿, 到玉米灌浆后期 100 cm 以下两种覆膜种植方式土壤水分趋于一致, 两年收获时土壤水分都维持在相对较高的水平,2012 年 14% 15%,2013 年 18% 20%; 但在干旱的 2014 年和 2015 年明显不一样,

85 3728 中国农业科学 49 卷 土壤水分 Soil moisture (%) 年 4 月 11 日 April 年 4 月 11 日 April 年 4 月 11 日 April 年 3 月 24 日 March 土层深度 Soil depth (cm) 年 6 月 14 日 June 年 6 月 14 日 June 年 6 月 14 日 June 年 6 月 11 日 June 年 9 月 13 日 Sept 年 9 月 16 日 Sept 年 9 月 18 日 Sept 年 9 月 18 日 Sept 全膜双沟垄 FPRF 半膜平覆盖 HPFC 图 年玉米生长期间 cm 土层土壤水分的垂直分布 Fig. 4 Vertical changes of soil moisture during corn growth season from the year 2012 to 2015 特别是 2014 年玉米苗期 (6 月 4 日 ) 半膜平覆盖 cm 土壤剖面水分已降低到 8.31% 9.20%, 全膜双垄沟种植 10.4% 14.3%, 到灌浆后期 (9 月 18 日 ) cm 土层土壤含水率全膜覆盖和半膜覆盖平均为 12% 和 10.6%, 特别是 cm 土壤水分半膜覆盖下降到 8.2%, 较全膜覆盖的 11.7% 低 3.5 个百分点, 接近土壤萎蔫湿度, 而 cm 土层 2 种覆膜方式土壤水分接近 夏秋连旱的 2015 年,9 月 15 日整个剖面土壤水分全膜双垄沟覆盖较半膜平覆盖平 均高 4.1 个百分点, cm 土层土壤水分高 个百分点 因此, 无论降雨年型如何, 全膜双垄沟种植均能有效保蓄生育期降水, 使土壤剖面水分高于半膜平覆盖, 干旱年份蓄水保水效果尤其明显 2.6 旱作地膜玉米农田土壤水分利用恢复的时空变化特征在 年期间, 玉米生育期遇到了 1 个正常年份 1 个丰水年份和 2 个干旱年份, 覆膜农田水分不仅在土壤垂直剖面空间上明显不同, 而且在试验

86 19 期 3729 樊廷录等 旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化 期间形成了鲜明的时空差异特征 4 年期间 全膜双 度增加 范围扩大 因此 不同降雨年份全膜双垄沟 垄沟覆盖与半膜平覆盖 cm 土层土壤剖面水分 集雨种植产量的增加 并没有多消耗土壤水分 也未 等值线图形成了鲜明的对照 图 5 和图 6 半膜平 在土壤深层形成水分低湿层 尚未观察到对土壤剖面 覆盖种植下农田土壤剖面水分均明显降低 特别是干 水分循环的负面影响 从农田水分平衡来看 4 年全膜覆盖连作玉米总 层 并且低湿层厚度加深 持续时间延长 在半膜平 耗水 mm 比半膜覆盖 mm 减少 覆盖种植中 2012 年 9 月中旬 cm 土壤水分 56.9 mm 而玉米生育期间 2012 年 4 月 2015 年 降低到 11.1% 12.5% 2013 年 6 月上旬 cm 9 月 和生产年度 2012 年 1 月 2015 年 12 月 下降到 11.8% 12.7% 2014 年 9 月中旬 cm 总降水 mm 和 mm 因此 在年均降水 土层降低到 7.9% 8.7% 2015 年同时期 cm 450 mm 以上地区 连作 4 年的旱作玉米全膜双垄 土层土壤水分下降到 6.7% 9.5% 干旱年形成了一个 沟 播 半 膜 覆 盖 种 植 降 雨 利 用 率 达 到 87.5% 和 土壤水分 8%的干土层 并且随着时间推移干土层厚 90.5% 4 年总耗水/4 年生产年度总降水 前者 WUE 土层深度 Soil depth (cm) 旱年份 2014 年和 2015 年 形成了土壤水分的低湿 图5 Fig 年旱作全膜双垄沟集雨种植玉米农田土壤水分时空分布图 Temporal and spatial distribution of corn field soil moisture with FPRF treatment from 2012 to 土层深度 Soil depth (cm) /4 17/6 13/9 14/ 年 14/6 31/7 2013年 图6 Fig. 6 11/4 16/8 10/10 16/4 4/8 20/8 18/9 17/10 24/3 25/6 2014年 30/7 30/8 2015年 年旱作半膜平铺盖种植玉米农田土壤水分时空分布图 Temporal and spatial distribution of corn field soil moisture with HPFC treatment from 2012 to /9 10/10

87 3730 中国农业科学 49 卷 kg mm -1 hm -2, 后者 kg mm -1 hm -2, 即全膜双垄沟集雨种植降低了土壤水分的非生产性消耗, 将土壤蒸发耗水转化为玉米蒸腾耗水, 提高了水分利用效率 3 讨论 目前, 国内所有旱作农田集雨种植研究中, 垄膜沟种能最大限度蓄保降雨和提高作物水分利用效率的结论是毋容置疑的 [8-10], 但产量和 WUE 增加幅度区域间差异很大 本研究 4 年连作玉米试验, 全膜双垄沟播较半膜平辅盖种植平均增产 15.72%,WUE 提高 4.42 kg mm -1 hm -2, 其产量和 WUE 提高幅度首先与降水直接有关, 其次是种植密度和品种耐密特性 在 万株 /hm 2 密度范围内, 随着密度增加, 旱作覆膜玉米产量 耗水量 WUE 同步增加, 主要是增加密度提高了玉米群体叶面积和蒸腾耗水量 [11], 但耗水量增加幅度远小于产量和 WUE 提高幅度, 当密度超过 6.75 万株 /hm 2 后, 耗水量却变化较小而产量和 WUE 仍然增加, 即使严重干旱的 2014 年和 2015 年, 产量和 WUE 也是如此 在山西中部同样降水量的旱作区, 在密度 万株 /hm 2 范围内, 受干旱影响玉米产量随密度先增加后减少, 呈现抛物线型 [13-14], 这可能与本研究密度范围设定上限偏低有关 在旱作农田增加玉米种植密度必然加剧种内竞争, 却对耗水量影响不大, 并且受土壤可供水量有限的影响, 不同密度玉米总耗水量无差异, 极差值仅 4.1 mm [13], 旱作玉米合理密度应根据土壤底墒情况及降水进行预测 4 年平均, 本试验全膜双垄沟与半膜平辅盖玉米耗水量也无明显差异, 这与年降水 400 mm 黄土高原半干旱地区同类试验耗水量增加 6.8% 12.1%, 尤其是灌浆期耗水增加 237.3% 的结论不一致 [27], 也有研究证实玉米耗水量在一定产量水平和一定地区内是相对稳定的数值, 由叶面蒸腾量与棵间蒸发量两部分组成, 栽培措施仅改变棵间蒸发量与叶面蒸腾量比例 [12,28] 作物高产导致旱作农田土壤干层化 [23], 特别是玉米全膜双垄沟种植可能过度消耗土壤水分, 技术的可持续性和密植高产受到质疑 [24] 本研究结果却不然, 全膜双垄沟种植在 4.5 万株 /hm 2 基础上增加 2.25 万株 /hm 2 玉米产量提高 20.62% 再增加同等数量密度继续增产 12.03%,4 个不同降水年型期间全膜双垄沟播土壤水分始终高于半膜平覆盖种植, 增密增产后并没有 [26] 导致土壤剖面形成干土层, 这与白翔斌等在陕西渭北旱塬全膜双垄沟高产栽培玉米整个生育期不仅没有 导致土壤剖面土壤水分降低, 在 cm 土层未形成干土层的研究结论一致, 但干旱年份半膜覆盖玉米灌浆期土壤水分降低到了凋萎含水量以下, 出现了明显的干土层 因此, 在年降水 450 mm 以上的半干旱区, 全膜双垄沟播增密种植不会加剧土壤剖面水分的过度消耗, 反而有利于持续增产和土壤水分蓄保利用 4 结论 在完全依靠有限降雨的黄土高原旱作覆膜集雨种植系统中, 全膜双垄沟集雨保墒种植是旱作玉米增密增产和提高水分利用效率的前提, 选择耐密品种是增大群体持续增产的关键 半干旱区旱作玉米全膜双垄沟种植较半膜平铺盖平均增产 15.72% 和水分利用效率提高 21.09% 在一定密度范围内, 产量 耗水量 水分利用效率与密度同步增加, 但耗水量增加幅度较小, 密度超过一定值后, 产量和水分利用效率提高并不多消耗土壤水分, 增密增产节水效果显著 不论降雨年型如何, 全膜双垄沟种植总能高效蓄保降水,4 年期间农田土壤剖面水分始终高于半膜平铺盖种植, 增密高产后土壤深层没有形成干土层, 而干旱年份半膜平铺盖土壤深层形成了明显的干土层 在目前生产密度 5.3 万株 /hm 2 基础上, 全膜双垄沟 + 耐密品种 + 密度增加 1.5 万株 /hm 2 是旱作玉米持续增产和提高水分利用效率的关键 References [1] HATFIELD J L, SAUER T J, PRUCEGER J H. Managing soils to achieve greater water use efficiency: A review. Agronomy Journal, 2001, 93(2): [2] DAVID C N, PAUL W U, MILLER P R. Efficient water use in dryland cropping systems in the Great Plains. Agronomy Journal, 2005, 97(2): [3] 韩思明. 黄土高原旱作农田降水资源高效利用的技术途径. 干旱作区农业研究, 2002, 20(1): 1-9. HAN S M. Technical channels of high-efficient utilization of precipitation resources on dry-farming lands in Loess Plateau. Agricultural Research in the Arid Areas, 2002, 20(1): 1-9. (in Chinese) [4] LI F M, GUO A H, WEI H. Effects of clear plastic film mulch on yield of spring wheat. Field Crops Research,1999, 63(1): [5] FAN T L, STEWART B A, PAYNE W A, WANG Y, SONG S Y, LUO J J, ROBINSON C A. Supplemental irrigation and water-yield relationships for plasticulture crops in the Loess Plateau of China.

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90 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 罗彦涛 1,2, 孟润杰 1, 赵建江 1, 韩秀英 1, 马志强 1, 王文桥 1, 张小风 1 ( 1 河北省农林科学院植物保护研究所, 河北保定 ; 2 河北农业大学植物保护学院, 河北保定 ) 摘要 : 目的 研究抗氟吡菌胺突变体对不同杀菌剂的交互抗性并评估马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险 方法 通过紫外线照射菌丝体 紫外线照射孢子囊和药剂驯化的方法获得抗氟吡菌胺的马铃薯晚疫病菌突变体, 计算突变体的突变频率, 测定抗性突变体的抗性水平, 研究突变体在无药条件下继代培养 10 代后抗性能否稳定遗传, 测定突变体在 RSA 培养基和离体叶片上的适合度 ( 菌丝生长速率 产孢子囊能力及复合适合度指数 ), 比较抗性菌株与其亲本敏感菌株的竞争力, 分析对氟吡菌胺表现不同敏感性的菌株对不同药剂的交互抗性, 并通过笔者实验室建立的抗性风险量化标准评定马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险 结果 共获得 21 个抗性菌株, 抗性水平介于 倍, 紫外线诱导孢子囊的突变率为 ; 大多数抗性突变体的适合度与其亲本菌株无显著性差异 ; 竞争力测定试验中,2 株突变体的第 代的共 18 次抗药频率测定中, 有 3 次测定的抗药频率显著低于初始频率, 有 4 次测定的抗药频率显著高于初始频率, 其余 11 次测定的抗药频率与初始频率均无显著性差异 ; 所有突变菌株的抗药性均能稳定遗传 ; 抗氟吡菌胺菌株及其亲本菌株对氟吡菌胺的 lgec50 与这些菌株对嘧菌酯 吡唑醚菌酯 霜脲氰 烯酰吗啉 双炔酰菌胺 甲霜灵 氟醚菌酰胺的 lgec50 之间的相关系数 (r) 分别为 0.104(P =0.654) 0.311(P =0.170) 0.228(P =0.081) 0.376(P =0.093) 0.214(P =0.351) 0.122(P =0.599) 0.963(P =0.000); 致病疫霉对氟吡菌胺基本抗性风险值为 15 结论 氟吡菌胺与氟醚菌酰胺之间存在交互抗性, 与嘧菌酯 吡唑醚菌酯 霜脲氰 烯酰吗啉 双炔酰菌胺 甲霜灵之间无交互抗性, 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的固有抗性风险为高度, 应加强马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险管理, 建议生产上将氟吡菌胺与其他类药剂交替或混合使用 关键词 : 马铃薯晚疫病菌 ; 氟吡菌胺 ; 抗性突变体 ; 生物学性状 ; 交互抗性 ; 基本风险 Acquisition and Biological Characteristics of Fluopicolide-Resistant Isolates in Phytophthora infestans LUO Yan-tao 1,2, MENG Run-jie 1, ZHAO Jian-jiang 1, HAN Xiu-ying 1, MA Zhi-qiang 1, WANG Wen-qiao 1, ZHANG Xiao-feng 1 ( 1 Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural&Forestry Sciences, Baoding , Hebei; 2 College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding , Hebei) Abstract: Objective The objectives of this study are to research the cross resistance between fluopicolide and the other fungicides and assess the resistance risk of Phytophthora infestans to fluopicolide. Method The fluopicolide-resistant mutants were acquired by UV irradiating sporangia, UV irradiating mycelia and fungicide taming. The mutation frequency was calculated, the resistance levels were measured, whether the resistance could be inherited stably under the condition of no fungicide after 10 generations was studied, the fitness (including mycelial growth rates, sporulation capacity, and comprehensive fitness index) on RSA medium and detached leaves were measured and the competitiveness of those resistant mutants and their parental isolates were 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( , ) 联系方式 : 罗彦涛, yantaoluo@sina.cn 通信作者王文桥,Tel: ; wenqiaow@163.com 通信作者张小风, zbs1103@163.com

91 3734 中国农业科学 49 卷 studied. Cross resistance between fluopicolide and other fungicides were analyzed. The resistance risk of P. infestans to fluopicolide was assessed by the resistance risk quantitative evaluation criteria which was created by the authors lab. Result Twenty-one fluopicolide-resistant mutants were acquired in this study. The resistance levels of those resistant mutants ranged from 61 to and the mutation frequency of UV irradiating sporangia was The fitness of most of the tested resistant mutants showed no significant difference with their respective parental isolates. In the test of competitiveness, among the 18 resistance frequency measurements of 1st, 3rd and 7th generations of two fluopicolide-resistant mutants, 3 were significantly lower than their parental isolates, 4 were significantly higher than their parental isolates, while the other 11 showed no difference. The resistance of all those 21 fluopicolide-resistance mutants could be inherited stably. The resistance of all those 21 fluopicolide-resistance mutants could be inherited stably. The correlation coefficient (r) between the lgec 50 of the fluopicolide-resistant mutants and the fluopicolide-sensitive isolates to fluopicolide and the lgec 50 of those isolates to azoxystrobin, pyraclostrobin, cymoxanil, dimethomorph, mandipropamid, metalaxyl and fluoride ether bacteria amide were (P =0.654), (P =0.170), (P =0.081), (P =0.093), (P =0.351), (P =0.599), (P =0.000). The inherent resistance risk value of P. infestans to fluopicolide was 15. Conclusion The cross-resistance relationship was found between fluopicolide and fluoride ether bacteria amide. No cross-resistance relationship was found between fluopicolide and azoxystrobin, pyraclostrobin, cymoxanil, dimethomorph, mandipropamid and metalaxyl. There could be high inherent risk of P. infestans developing resistance to fluopicolide. The risk management of P. infestans to fuopicolide should be enhanced. It is suggested that the fluopicolide should be used alternately or in mixture with other not cross-resistant fungicides. Key words: Phytophthora infestans; fluopicolide; resistant mutants; biological characteristics; cross resistance; inherent risk 0 引言 研究意义 马铃薯是世界上第四大粮食作物, 在保障粮食安全 促进农民增收 消除贫困方面具有重要的战略意义 中国逐步推进的马铃薯主粮化战略推动了马铃薯产业的发展 [1-2] 由致病疫霉 (Phytophthora infestans) 引起的马铃薯晚疫病是一种毁灭性的病害, 每年在全世界范围内造成的经济损失约为 67 亿美元 [3-4], 曾造成历史上著名的爱尔兰大饥荒 [5], 是阻碍中国马铃薯产业发展的重要因素 化学防治是目前的马铃薯生产上控制马铃薯晚疫病的重要手段 氟吡菌胺在马铃薯晚疫病防治中广泛应用, 且效果良好 [6-7] 通过评估马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险, 进而指导氟吡菌胺在马铃薯晚疫病防治中的合理使用, 对减缓抗性产生, 延长农药生命周期具有重要意义 前人研究进展 氟吡菌胺是拜耳公司研发的新型药剂, 对卵菌纲特效, 对病菌的各生长期均有抑制作用, 其作用机理为通过作用于一种特异性蛋白 类血影蛋白, 影响细胞的有丝分裂, 破坏病原菌细胞结构而表现杀菌活性 [8-10] 马铃薯晚疫病菌经风雨传播, 再侵染频繁, 被杀菌剂抗性行动委员会 (FRAC) 划定为高抗药性风险病原菌, 已对甲霜灵产生了严重的抗性, 因此需重视马铃薯晚疫病的抗药性研究和治理工作 [11-13] FRAC 尚未确定氟吡菌胺抗性风险的高低 [14-15] [16] WANG 等发现黄瓜霜霉病菌 (Pseudoperonospora cubensis) 对氟吡菌胺存在中到 [17-18] 高度抗性风险,LU 等发现辣椒疫霉 (Phytophthora capsici) 对氟吡菌胺存在中到高度抗性风险 黄瓜霜霉病菌 辣椒疫霉和马铃薯晚疫病菌都有不同交配型 [19-22], 有性生殖为病原菌提供了遗传变异的重要来源 由于寄主作物的种植模式 用药习惯 生长条件等各不相同, 且病原菌具有不同遗传特性, 因此, 研究马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险具有重 [23] 要意义 GISI 等将杀菌剂的抗性风险分为基本风险和治理风险, 并分别赋予相应的风险值, 靶标菌对杀菌剂的全部抗性风险值为基本风险值与治理风险值之积 该评分标准过于复杂, 实用性较差 [24] BRENT 等简化了 GISI 的方法, 认为植物病原菌对杀菌剂的基本抗性风险由药剂和病害决定, 并提出由药剂和病害决定的抗性风险特征, 并根据药剂基本风险和病害决定的基本风险严重程度赋予相应的风险值, 病害对杀菌剂的基本风险值为病害基本风险值与药剂基本风险值之积 该方法将杀菌剂和病原菌进行分类概括, 不便于评估特定病原菌对特定药剂的风险 本研究切入点 目前尚无马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性风险评估的报道, 很少有氟吡菌胺与其他药剂存在交互抗性的报道 拟解决的关键问题 在实验室条件下获得抗氟吡菌胺突变体, 研究所获抗性突变体的生物学性状以及氟吡菌胺与其他杀菌剂的交互抗性, 并量化评估马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险, 为氟吡菌胺的合理使用和制定其抗药性治理策略提供理论依据

92 19 期罗彦涛等 : 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 材料与方法 试验于 2014 年 6 月至 2015 年 12 月在河北省农林科学院植物保护研究所杀菌剂组完成 1.1 试验材料 供试亲本菌株 ( 野生敏感菌株 ) 马铃薯晚疫病菌从田间采集并分离 ( 表 1) 供试药剂 95% 氟吡菌胺原药, 拜耳作物科学公司 ;95% 嘧菌酯原药, 南京金土地化工有限公司 ; 98% 氟醚菌酰胺原药, 山东联合农化有限公司 ;98% 吡唑醚菌酯原药, 巴斯夫欧洲公司 ;98% 霜脲氰原药, 杜邦公司 ;95% 双炔酰菌胺原药, 先正达作物保护有限公司 ;97% 甲霜灵原药, 沈阳化工研究院 ;97.6% 烯酰吗啉原药, 河北冠龙农化有限公司 表 1 供试亲本菌株的采集时间及地点 Table 1 Origins and collecting date of tested parental isolates 菌株 Isolate 采集时间 Collecting date 采集地点 Locality NL 内蒙古自治区锡林郭勒盟正蓝旗 Zhenglanqi, Xilin Gol League, Inner Mongolia DD 吉林省敦化市大桥乡 Daqiao, Dunhua, Jilin DD 吉林省敦化市大桥乡 Daqiao, Dunhua, Jilin DD 吉林省敦化市大桥乡 Daqiao, Dunhua, Jilin DG 吉林省敦化市官地镇 Guandi, Dunhua, Jilin ZC 河北省张家口市崇礼市狮子沟乡 Shizigou, Chongli, Zhangjiakou, Hebei 供试培养基黑麦蔗糖琼脂培养基 (rye sucrose agar,rsa): 黑麦 80 g, 琼脂 10 g, 蔗糖 20 g, 蒸馏水定容至 1 L 供试仪器恒温生化培养箱, 超净工作台, 电热恒温水浴锅, 移液枪等 1.2 试验方法 抗氟吡菌胺突变菌株的获得 UV 诱导菌丝体 : 黑暗条件下将预培养好的敏感菌株置于紫外灯 (15 W,254 nm, 预热 30 min) 下方垂直距离 25 cm 处照射亚致死时间 (30 min), 红光条件下从菌落边缘切取 10 mm 10 mm 3 mm 的菌块, 移入含最低抑制浓度 (MIC,15 mg L -1 ) 氟吡菌胺的 RSA 平板上, 每个菌株转接 10 皿, 每皿 4 块,18 黑暗培养 7 10 d, 若能在含 MIC 及以上浓度氟吡菌胺的 RSA 平板上生长, 表明该野生敏感菌株对供试药剂产生了抗药性, 按公式 (1) 计算抗性突变频率 [25] 抗性突变频率 (%)=( 出现突变的菌饼数 / 供试的菌饼总数 ) 100 (1) UV 诱导孢子囊 : 将野生敏感菌株在 RSA 平板上培养 7 d 后产生大量孢子囊, 用无菌水洗下, 用双层纱布过滤, 在显微镜下调至 个 /ml 的孢子囊悬浮液 在无菌操作条件下, 取上述孢子囊悬浮液 5 ml 置于距紫外灯 (15 W,254 nm, 预热 30 min) 下方垂直距离 25 cm 处, 振荡条件下照射亚致死时间 (3 min), 红光条件下将照射后的孢子囊悬浮液涂布在含 MIC 氟吡菌胺的直径 9 cm 的 RSA 平板上, 每菌株接种 20 皿, 每皿 0.1 ml, 黑暗 18 培养 7 10 d, 若能在含 MIC 及以上浓度氟吡菌胺的 RSA 平板上生长, 表明该野生敏感菌株对供试药剂产生了抗药性, 按公式 (2) 计算突变频率 [26] 抗性突变频率 = 抗性突变菌株数 / 受紫外线照射的孢子囊数 (2) 药剂驯化 : 将敏感菌株接种到含系列浓度氟吡菌胺的 RSA 平板上, 培养观察菌丝生长情况, 确定氟吡菌胺对马铃薯晚疫病菌的 亚致死浓度 为 10 mg L -1 在含 10 mg L -1 氟吡菌胺的 RSA 培养基平板上培养对氟吡菌胺敏感的菌株, 每隔 10 d 将菌丝生长相对较快的菌株转移至含度氟吡菌胺的平板上, 逐渐加大氟吡菌胺的浓度, 直至其能在含有大于或等于最低抑制浓度氟吡菌胺的 RSA 培养基上生长 抗氟吡菌胺突变体的抗性水平测定采用菌 [27] 丝生长速率法分别测定抗药性突变体和亲本菌株的 EC 50 用丙酮溶解氟吡菌胺原药, 分别配制为 mg L -1 和 mg L -1 的系列浓度, 分别用于测定不同抗性水平的突变体, 各处理及对照含等浓度的丙酮 ; 测定亲本敏感菌株 EC 50 的系列浓度为 mg L -1, 设空白对照 将培养好的菌株用打孔器沿菌落边缘打取直径为 5 mm 的菌块, 分别移到含系列浓度氟吡菌胺的培养基平板中央, 每处理浓度接种 3 皿,18 左右黑

93 3736 中国农业科学 49 卷 暗培养 8 d, 当对照 ( 即不含杀菌剂的培养基平板 ) 的菌落直径至少达 3 cm 时, 用十字交叉法测量菌落直径, 计算抑制率, 求出各菌株的毒力回归方程 相关系数和 EC 50, 然后求出各抗药突变体的抗性倍数 (resistance ratio,rr), 即 RR=EC 50 ( 抗药突变体 ) / EC 50 ( 亲本敏感菌株 ) 抗氟吡菌胺突变体的稳定性测定将得到的抗性突变体在无药 RSA 平板上通过菌丝体连续转接 10 代, 然后测定第 10 代的 EC 50, 根据敏感性变化指数 ( 第 10 代 EC 50 与第 1 代 EC 50 的比值 ) 来判断其抗药稳定性 抗氟吡菌胺突变体适合度的测定参照朱志 [28] 峰的方法, 测定各抗药突变体及其亲本菌株在 RSA 平板上的菌丝生长速率, 并用血球计数板测定各抗药突变体及其亲本菌株的产孢子囊总数 [29] 参照侯淑英等的方法, 将供试抗性突变体及其亲本菌株接种在 RSA 培养基上,18 黑暗培养 15 d, 用无菌水洗下孢子囊制成 个 /ml 孢子囊悬浮液,4 诱发游动孢子释放, 制成游动孢子悬浮液, 备用 采摘马铃薯植株中部长势一致 大小适中的叶片, 摆放在铺有湿滤纸的培养皿 (φ=15 cm) 中, 每皿中放置一片复叶 (5 个小叶 ), 每个处理重复 3 次 在叶背主叶脉旁接种 10 μl 游动孢子悬浮液,18 (16 h 光照,8 h 黑暗 ) 保湿培养 4 d, 检查叶片发病情况 病斑大小 产孢量, 计算侵染率 病斑面积 产孢能力和复合适合度指数 抗氟吡菌胺突变体的竞争力测定参照 [30-31] KADISH 等的方法, 将抗性菌株与敏感菌株的孢子囊以不同比例 (4:1 1:1 1:4) 混合成孢子囊悬浮液 ( 个 /ml), 在未用药的叶片上继代培养 采用液滴法将 代的孢子囊悬浮液分别接种于未经药剂处理和经亲本敏感菌株 MIC 浓度氟吡菌胺处理的叶片背面, 每个处理 10 个叶片, 重复 3 次,18 (16 h 光照,8 h 黑暗 ) 保湿培养 4 6 d, 检查叶片发病情况, 按 (3) 式估算 代的抗性菌株频率 [32] 抗药性突变体的频率 (%)=( 药剂处理叶片上的发病面积 / 未用药剂处理叶片的发病面积 ) 100 (3) 抗氟吡菌胺突变体对不同药剂的交互抗性测定选取 15 个突变菌株及其 6 个亲本敏感菌株, 采用菌丝生长速率法分别测定这些菌株对霜脲氰 嘧菌酯 吡唑醚菌酯 烯酰吗啉 双炔酰菌胺 甲霜灵及氟醚菌酰胺的敏感性, 分析抗性突变体对 7 种药剂的交互 抗性情况 使用 SPSS 软件分析对氟吡菌胺敏感和抗性的各供试菌株 EC 50 的对数值与供试各菌株对嘧菌酯 吡唑醚菌酯 霜脲氰 烯酰吗啉 双炔酰菌胺 甲霜灵 氟醚菌酰胺 EC 50 的对数值之间的相关性, 如果 P>0.05, 即在 P=0.05 的水平下差异不显著, 则两种药剂之间无相关性, 不存在交互抗性关系 ; 如果 P <0.05, 表明两种药剂有相关性, 此时相关系数 (r) 越高, 相关性越大, 通常认为 r>0.75 时, 两种药剂之间存在交互抗性关系 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性风险的量化评估本实验室在前人的研究基础上, 建立了新的抗性风险量化评估体系, 将基本风险分为 7 个风险因素, 分别赋予 个风险值, 各风险值之和即为病原菌对药剂的基本风险值 基本风险值为 0 7 为低度风险,8 14 为中度风险,15 21 为高度风险 具体标准见表 数据分析采用 DPS 7.05 SPSS 21.0 及 Microsoft Excel 软件对试验数据进行统计分析 2 结果 2.1 抗氟吡菌胺突变体的获得通过紫外线诱导菌丝体共获得 13 个抗氟吡菌胺突变体, 突变频率为 1.8%; 通过紫外线诱导孢子囊共获得 5 个抗氟吡菌胺突变体, 突变频率为 ; 通过药剂驯化共获得 3 个抗氟吡菌胺突变体, 药剂驯化的抗性水平变化见图 抗氟吡菌胺突变体的抗性水平获得的 21 个抗氟吡菌胺突变体的抗性水平较高, 介于 倍 ( 表 3) 2.3 抗氟吡菌胺突变体的抗性稳定性所得抗氟吡菌胺的突变体在不含药的 RSA 平板上继代培养 10 代后, 测定其对氟吡菌胺的敏感性 结果表明, 抗性突变体 DD10 UVM2 DD10 FT DD18 UVM1 DD18 UVM2 ZC10 UVM1 ZC10 UVM2 NL12 UVM1 NL12 UVS NL12 UVS2 DG21 UVM1 DG21 UVM2 DG21 UVS 继代培养 10 代后对氟吡菌胺敏感性无明显变化, 表明其对氟吡菌胺的抗药性可以稳定遗传 ; 抗性突变体 DD8 UVM1 DD10 UVM1 DD10 UVS DD18 UVM3 DD18 UVS NL12 FT NL12 UVM2 NL12 UVM3 ZC10 FT 继代培养 10 代后对氟吡菌胺敏感性上升明显, 但抗性水平依然很高 ( 表 4) 2.4 抗氟吡菌胺抗性突变体的适合度 抗性菌株 DG21 UVM 和 DG21 UVS 的菌丝生长速率

94 19 期罗彦涛等 : 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 3737 表 2 植物病原菌对杀菌剂的基本抗性风险量化评估标准 Table 2 Inherent resistance risk quantitative evaluation criteria of plant pathogenic bacteria to fungicides 基本风险 Inherent risk 风险值 Risk value 田间是否检测到抗性菌高抗菌株为主株 Mainly were high resistant Whether the resistant isolates were detected in the field 2 目标药剂与现用药剂之与作用位点单一且已发生抗间是否存在交互抗性性问题的现用药剂之间有交 Whether cross-resistant 互抗性 were existed between target Cross-resistant were existed fungicide and current between target fungicide and fungicides current fungicides which had single application point and already had occurred resistant 3 实验室是否易获得抗性紫外诱变或药剂驯化容易获菌株得抗性菌株, 突变率 >10-6 Whether it was easy to It was easy to obtain the obtain the resistant mutants resistant mutants by UV in the lab irradiating and fungicide taming with a mutation frequency > 抗药性是否符合单基因符合, 实验室获得高抗菌株突变特征占优势 Whether the fungicide The obtained mutants were resistant correspond to the dominant feature of monogenic mutation 无高抗菌株, 中低抗菌株为主 未发现中高抗菌株, 低抗菌株未发现抗性菌株, 只有敏感 No high resistant and mainly were 为主 菌株 resistant or low resistant No high resistant and moderate resistant isolates and mainly were low resistant No resistant but sensitive isolates 与作用位点单一 尚未发生抗性与多作用位点 尚未发生抗性无交互抗性 问题的现用药剂之间有交互抗性 Cross-resistant were existed between target fungicide and those current fungicides which had single application point and had not occurred resistant yet 问题的现用药剂之间有交互抗 No cross-resistant existed 性, 或作用机理未知 Cross-resistant were existed between target fungicide and those current fungicides which had multiple application point and had not occurred resistant problem yet, or the mechanism of action was unknown 紫外诱变获得抗性菌株, 突变率紫外诱变获得抗性菌株, 突变紫外诱变或药剂驯化未得到 , 药剂驯化未得到抗性率 <10-7, 药剂驯化未得到抗性抗性菌株 菌株 The resistant mutants could be 菌株 The resistant mutants could be Resistant mutants could not be obtained by UV irradiating obtained by UV irradiating with a obtained by UV irradiating with and fungicide taming mutation frequency between , resistant mutants could not be obtained by fungicide a mutation frequency <10-7, resistant mutants could not be obtained by fungicide taming taming 实验室获得高抗菌珠 中抗菌株 低抗菌株 The obtained mutants were resistant, moderate resistant and low resistant 获得中抗菌株及低抗菌株, 或不符合, 实验室获得低抗菌未知株 The obtained mutants were The obtained mutants were moderate and low resistance or low resistance unknown 5 抗性突变体适合度是否抗性菌株适合度不下降下降 The fitness of resistant Whether the fitness of mutants did not declined resistant mutants declined 6 与亲本菌株竞争力抗性突变体竞争力强 Competitiveness with their Stranger than their parental parental isolates isolates 7 在无药条件下继代培养抗性菌株稳定遗传后抗药性能否稳定遗传 Inherited stably Whether the resistance of resistant mutants could be inherited stably under the condition of no fungicide 大部分抗性突变体适合度不下 大部分抗性突变体适合度下 抗性菌株适合度下降 降, 少数抗性菌株适合度下降 降, 少数抗性菌株适合度不下 The fitness of resistant Most resistant mutants did not declined while few declined 降, 或未知 Most resistant mutants declined while few did not or unknown mutants declined 大多数抗性突变体竞争力强, 少大多数抗性突变体竞争力较 抗性突变体竞争力弱 数竞争力较弱 弱, 少数竞争力较强, 或未知 Weaker than their parental Most were stranger and few were Most were weaker and few were isolates weaker than their parental isolates stronger than their parental isolates or unknown 大多数抗性菌株稳定遗传, 少数大多数抗性菌株不能稳定遗抗性突变菌株不能稳定遗传不能稳定遗传传, 少数能稳定遗传, 或未知 Could not be inherited stably Most could be inherited stably Most could not be inherited and few could not stably and few could or unknown

95 3738 中国农业科学 49 卷 抗性倍数 Resistance ratio 图 1 马铃薯晚疫病菌经药剂驯化 18 代对氟吡菌胺抗性水平变化 Fig. 1 Variation in resistance level of resistant mutants acquired by fungicide taming parent isolates of P. infestans for 18 generations 表 3 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的抗性水平 Table 3 Resistance level to fluopicolide of the fluopicolide-resistant mutants of P. infestans 菌株 毒力回归方程 相关系数 EC 50 (mg L -1 ) 抗性倍数 Isolate Toxicity regression equation (y=) r (95%CL) RR DD10* 1.794x ( ) DD10 UVM x ( ) 2006 DD10 UVM x ( ) 258 DD10 UVS 2.254x ( ) 367 DD10 FT 0.670x ( ) 80 DD18* 2.454x ( ) DD18 UVM x ( ) 248 DD18 UVM x ( ) 338 DD18 UVM x ( ) 3157 DD18 UVS 1.832x ( ) 1077 ZC10* 1.505x ( ) ZC10 UVM x ( ) 364 ZC10 UVM x ( ) 461 ZC10 FT 1.004x ( ) 141 DD8* 1.765x ( ) DD8 UVM 1.505x ( ) 423 NL12* 2.118x ( ) NL12 UVM x ( ) 426 NL12 UVM x ( ) 1200 NL12 UVM x ( ) 314 NL12 UVS 1.270x ( ) 1467 NL12 UVS x ( ) 348 NL12 FT 1.246x ( ) 61 DG21* 1.473x ( ) DG21 UVM x ( ) 219 DG21 UVM x ( ) 406 DG21 UVS 2.036x ( ) 530 *: 亲本敏感菌株 Parental isolates;uvm: 紫外线诱导菌丝块所得突变菌株 Resistant mutants acquired by UV irradiating sporangia;uvs: 紫外线诱导孢子囊所得突变菌株 Mutants acquired by UV irradiating mycelium;ft: 药剂驯化所得突变菌株 Resistant mutants acquired by fungicide taming 下同 The same as below

96 19 期罗彦涛等 : 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 3739 表 4 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的抗性稳定性 Table 4 Resistance stability of the fluopicolide-resistant mutants of P. infestans 菌株 Isolate 第 1 代 The 1st generation 第 10 代 The 10th generation EC 50 (mg L -1 ) (95%CL) 抗性倍数 RR EC 50 (mg L -1 ) (95%CL) 抗性倍数 RR 敏感性变化指数 FSC DD8 UVM ( ) ( ) DD10 UVM ( ) ( ) DD10 UVM ( ) ( ) DD10 UVS ( ) ( ) DD10 FT ( ) ( ) DD18 UVM ( ) ( ) DD18 UVM ( ) ( ) DD18 UVM ( ) ( ) DD18 UVS ( ) ( ) ZC10 UVM ( ) ( ) ZC10 UVM ( ) ( ) ZC10 FT ( ) ( ) NL12 UVM ( ) ( ) NL12 UVM ( ) ( ) NL12 UVM ( ) ( ) NL12 UVS ( ) ( ) NL12 UVS ( ) ( ) NL12 FT ( ) ( ) DG21 UVM ( ) ( ) DG21 UVM ( ) ( ) DG21 UVS ( ) ( ) FSC 是第 10 代 EC 50 与第 1 代 EC 50 的比值 FSC=Factor of sensitivity change for fluopicolide mutants, a ratio of EC 50 values of the10th /1st transferred culture 显著大于其亲本菌株 DG21, 亲本菌株 DD10 DD18 ZC10 和 NL12 的菌丝生长速率分别显著大于其抗性突变体 DD10 FT DD18 UVS ZC10 UVM ZC10 FT 和 NL12 FT, 其余抗性菌株菌丝生长速率与亲本菌株无显著差异 ; 亲本菌株 DD10 ZC10 和 NL12 的产孢子囊能力分别显著大于其抗性菌株 DD10 FT ZC10 FT NL12 UVS2 NL12 FT, 抗性菌株 DD18 UVM 和 DD18 UVS 的产孢子囊能力显著大于亲本菌株 DD18, 其余抗性菌株的产孢子囊能力与其亲本菌株无显著差异 ( 表 5) NL12 UVS2 马铃薯晚疫病菌的亲本敏感菌株和抗氟吡菌胺突变体在马铃薯叶片上的侵染率均为 100%; 亲本菌株 ZC10 NL12 DD10 和 DG21 的病斑面积分别显著大于其抗性菌株 ZC10 FT NL12 UVM NL12 UVS2 NL12 FT DD10 FT 和 DG21 UVM, 抗性菌株 DD18 UVM 和 DD10 UVM 分别显著大于其亲本菌株 DD18 和 DD10, 其余抗性菌株的病斑面积与其亲本菌株无显著性差异 ; 亲本菌 株 ZC10 DD18 NL12 DD10 和 DG21 的产孢子囊能力分别显著强于其抗性菌株 ZC10 FT DD18 UVM NL12 FT DD10 UVM DD10 UVS DD10 FT DG21 UVS, 抗性菌株 DG21 UVM 的产孢子囊能力显著强于其亲本菌株 DG21, 其余抗性菌株的产孢子囊能力与亲本菌株无显著性差异 ; 亲本菌株 ZC10 DD18 NL12 DD10 DG21 的复合适合度指数显著高于 ZC10 FT DD18 UVS NL12 UVM NL12 FT NL12 UVS2 DD10 UVS DD10 FT DG21 UVS, 其余抗性菌株的复合适合度指数与其亲本菌株无显著性差异 ( 表 6) 2.5 抗氟吡菌胺突变体的竞争力抗性菌株 ZC10 UVM1 和 NL12 UVS1 分别与其亲本敏感菌株以不同比例混合接种, 在第 代的共 18 次抗药频率测定中, 有 3 次测定的抗药频率显著低于初始频率, 有 4 次测定的抗药频率显著高于初始频率, 其余 11 次测定的抗药频率与初始频率均无显著性差异 ( 表 7)

97 3740 中国农业科学 49 卷 表 5 抗氟吡菌胺突变体及亲本菌株的菌丝生长速率及产孢子囊能力 Table 5 Mycelial growth rates and sporulations of fluopicolide-resistant mutants and their parent isolates of P. infestans 菌株 Isolate 菌落直径 Colony diameter (mm) 产孢子囊量 Sporulation ( 10 4 个 /ml) DG21* 63.17±1.04g 13.50±1.32abcde DG21UVM 74.17±1.53a 14.83±2.47ab DG21UVS 68.17±0.29cdef 11.50±0.50efg DD10* 67.50±1.80def 12.33±1.76cdef DD10UVM 66.67±0.76ef 12.50±0.87cde DD10FT 54.83±0.76h 7.33±0.58i DD18* 70.00±2.60bc 11.67±1.04defg DD18UVM 68.00±1.50cdef 15.33±1.44a DD18UVS 66.50±0.50ef 14.50±0.50abc ZC10* 70.67±0.29b 12.67±0.29bcde ZC10UVM 66.00±0.50f 11.50±2.29efg ZC10UVS 69.17±1.04bcd 13.83±0.76abcd ZC10FT 51.83±0.58i 8.67±0.29hi NL12* 69.33±0.29bcd 14.00±1.73abc NL12UVM 69.50±0.87bcd 14.17±0.58abc NL12UVS 68.50±0.87bcde 12.67±0.29bcde NL12UVS ±0.76ef 10.17±0.29fgh NL12FT 55.83±1.89h 9.50±0.50gh 根据 DMRT 分析, 表中同列数据后相同小写字母表示在 P=0.05 的水平下差异不显著 下同 Figures in the same column followed by the same lowercases were not significantly different using DMRT (P=0.05). The same as below 表 6 抗氟吡菌胺抗性突变菌株及亲本菌株的复合适合度指数 Table 6 Fitness parameters of fluopicolide-resistant mutants and their parent isolates of P. infestans 菌株 Isolate 侵染率 Infection rate (%) 病斑面积 Lesion expansion area (cm 2 ) 产孢子囊能力 Sporulation capacity sporangia ( 10 3 个 /cm 2 ) 复合适合度指数 CFI ( 10 5 ) ZC10* ±0.09a 11.03±0.46fg 6.83±0.38cde ZC10 UVM ±0.33a 10.37±0.67fghi 6.42±0.14de ZC10 FT ±0.39e 8.35±0.56i 3.25±0.50g DD18* ±0.21cd 16.82±1.57bc 7.67±0.38b DD18 UVM ±0.10a 11.89±0.53ef 7.50±0.25bc DD18 UVS ±0.42cd 15.28±2.25cd 6.92±0.38cde NL12* ±0.14b 16.23±0.93bc 8.83±0.29a NL12 UVM ±0.24f 17.72±0.76b 5.50±0.66f NL12 UVS ±0.84ab 15.13±2.10cd 8.67±0.29a NL12 UVS ±0.34cd 15.19±0.84cd 6.92±0.14cde NL12 FT ±0.43de 8.64±0.63hi 3.42±0.14g DD10* ±0.39b 13.60±0.80de 7.17±0.14bc DD10 UVM ±0.16a 11.38±0.50f 7.00±0.25cd DD10 UVS ±0.29ab 10.77±0.56fgh 6.25±0.25e DD10 FT ±0.30de 8.92±0.69ghi 3.67±0.38g DG21* ±0.16b 17.14±1.68bc 9.00±0.66a DG21 UVM ±0.24ef 25.03±1.97a 9.17±0.29a DG2 UVS ±0.60bc 10.46±0.50fghi 5.42±0.38f

98 19 期罗彦涛等 : 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 氟吡菌胺与其他药剂的交互抗药性通过 SPSS 软件计算不同马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性突变体及其亲本菌株的 lgec 50 与这些菌株对嘧菌酯 吡唑醚菌酯 霜脲氰 烯酰吗啉 双炔酰菌胺 甲霜灵 氟醚菌酰胺的 lgec 50 之间的相关系数 (r) 分别为 0.104(P=0.654) 0.311(P=0.170) 0.228(P=0.081) 0.376(P=0.093) 0.214(P=0.351) 0.122(P=0.599) 0.963(P=0.000), 表明氟吡菌胺与嘧菌酯 吡唑醚菌酯 霜脲氰 烯酰吗啉 双炔酰 菌胺 甲霜灵无交互抗性关系, 与氟醚菌酰胺之间存在交互抗性关系 ( 图 2) 2.7 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险量化评估根据笔者实验室建立的标准, 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险值量化如下 :(1) 田间能检测到低抗菌株, 田间抗性菌株出现引起的风险值为 1;(2) 氟吡菌胺与氟醚菌酰胺存在正交互抗性, 交互抗性引起的风险值为 1;(3) 实验室条件下通过紫外线诱导 y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide y = 0.047x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide 3 2 y = x r = 氟吡菌胺 Fluopicolide 坐标值均为 lgec 50 值 Coordinate values were lgec 50 values 图 2 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺及其他 7 种杀菌剂的交互抗性 Fig. 2 Cross-resistance pattern of P. infestans to fluopicolide and the other 7 fungicides

99 3742 中国农业科学 49 卷 表 7 抗性突变菌株及其亲本菌株竞争力的比较 Table 7 Competition between the resistant isolates of P. infestans and their parental isolates 抗性菌株 Resistant isolates ZC10 UVM NL12 UVS 敏感菌株 Sensitive isolates ZC10 NL12 继代培养后抗药频率 Resistance frequency after subculture (%) F0 F1 F3 F7 20b 17.3±4.2c 24.4±1.6a 22.6±2.2ab 50a 51.1±4.2a 53.5±3.3a 42.4±2.3b 80a 81.6±4.1a 82.0±4.8a 81.1±3.5a 20b 25.2±0.7a 19.1±2.7b 15.5±1.5c 50c 54.2±2.1ab 55.2±1.7a 50.7±2.9bc 80a 82.8±2.1a 83.7±3.3a 81.7±2.7a 同行数据后不同字母表示同一菌株各代敏感性之间存在显著差异 (P<0.05) The different letters in the same row indicated significant differences in different progenies of the same isolate (P<0.05) 和药剂驯化均获得抗氟吡菌胺突变体, 紫外线诱导孢子囊的突变频率为 , 实验室抗性突变引起的风险值为 3;(4) 实验室获得的抗性突变体抗性水平介于 倍, 以高抗菌株为主, 抗药性符合单基因突变特征, 引起的抗性风险值为 3;(5) 大部分抗性突变体适合度不下降, 少数抗性菌株适合度下降, 抗性菌株适合度引起的风险值为 2;(6) 大多数抗性突变体竞争力强, 少数竞争力较弱, 抗性菌株竞争力引起的风险值为 2;(7) 所有抗性菌株在无药条件下继代培养后, 其抗药性均能稳定遗传, 抗性菌株遗传稳定性引起的风险值为 3 上述 7 个方面的风险值累加得到致病疫霉对氟吡菌胺的全部基本抗性风险值为 15, 因此, 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的基本抗性风险为高度 3 讨论 按照本文中的抗性风险量化评估标准, 氟吡菌胺的全部基本抗性风险值为 15, 是高度风险的最下限 室内抗药性风险评估是抗药性风险评价的重要组成部分, 但不能完全取代田间抗药性风险评价, 本标准更侧重于实验室条件下的抗性风险, 即固有风险, 药剂的使用方式 年限 次数等因素对田间抗性的发生发展有重要的作用, 因此应加强田间抗药性的发展动态, 笔者实验室连续多年监测了多个地区田间马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的敏感性 ( 结果待发表 ) 由于氟吡菌胺的制剂为混剂, 且当前有多种化学药剂用于防治马铃薯晚疫病, 减缓了田间抗性的发生和发展趋势, 因此, 虽然田间尚未发现中高抗菌株, 但是必须高度重视马铃薯晚疫病菌 对氟吡菌胺的抗性风险管理工作 适合度是抗性菌株和亲本敏感菌株单独存在时生存或致病能力的反映, 竞争力反映了抗性菌株与敏感菌株共存时彼此的消长或竞争情况 本试验中多数突变体的菌丝生长速率 产孢子囊能力 复合适合度指数和竞争力与其亲本菌株无显著差异, 部分突变体的适合度和竞争力强于或弱于其亲本菌株, 因此, 抗性菌株有在田间发展成优势种群的可能, 需加强抗性的监测和治理 当前的抗药性风险评估中主要通过紫外线诱导和药剂驯化来获得抗性突变体 本文通过紫外线诱导菌丝体 紫外线诱导孢子囊和药剂驯化分别获得 13 5 和 3 个抗性突变体 3 种方法各有利弊 : 紫外线诱导菌丝体试验中, 由于菌饼中含有的菌丝及孢子囊数量很大, 菌丝有一定的厚度且表面参差不齐, 因此不同部位的菌丝和孢子囊受接收到紫外线照射的能量也各不相同, 产生突变体的可能性就相对较大, 缺点在于所得出的突变频率误差较大, 不能量化的评价病菌产生抗性的难易程度 ; 紫外诱导孢子囊试验中, 需要较准确的找出紫外线照射孢子囊的亚致死时间, 且由于孢子囊悬浮液的浓度相对较小, 需要很大的工作量才能得到足够数量的突变体, 优点在于能够准确得出突变频率, 能够量化的评价病菌产生抗性的难易程度 ; 药剂驯化试验中, 需要找出药剂对病菌的亚致死浓度且浓度需要逐步提高, 且需连续驯化多代, 所需时间较长, 而且无法准确得出突变频率, 优点在于与实际田间用药情况更相似, 更接近于田间抗药性的发生情况 氟醚菌酰胺是山东省联合农药工业有限公司与

100 19 期罗彦涛等 : 马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状 3743 山东农业大学合作, 于 2010 年创制的一种新型含氟苯甲酰胺类杀菌剂,2015 年获药检所临时登记 与氟吡菌胺相比, 氟醚菌酰胺在结构上减少了 2 个氯原子, 增加了 4 个氟原子和 1 个甲氧基 [33], 是一种广谱高效的杀菌剂 本研究证明氟吡菌胺与氟醚菌酰胺存在较强的正交互抗性, 这对以后研究这两种药剂的作用机制或病菌的抗药机制以及开展抗药性治理具有重要的参考价值 由于马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺存在高度抗性风险, 且氟吡菌胺与氟醚菌酰胺之间存在交互抗性, 因此建议在应用中避免氟吡菌胺与氟醚菌酰胺同时或交替使用, 并限制此 2 种药剂在同一生长季节的用药次数不超过 2 次, 应与其他类药剂 ( 如烯酰吗啉 嘧菌酯 双炔酰菌胺 霜脲氰等 ) 混用或交替使用, 以减缓病菌抗药性的产生 [18] 翟明涛等通过紫外诱导和药剂驯化各获得 1 个抗氟吡菌胺的辣椒疫霉突变体, 并通过这 2 株突变体分析与其他药剂的交互抗性, 得出抗氟吡菌胺突变体与甲霜灵和霜脲氰之间存在交互抗性的结论, 与本文结果不同, 究其原因有以下两点 : 第一, 翟明涛的试验中获得的抗性菌株数量少, 得出结论的误差可能性较大 ; 第二, 翟明涛的试验中直接通过 2 株突变体对不同药剂的抗性倍数得出结论, 与本文的比较方法不同 当前的马铃薯防治中, 多次重复使用单一药剂和随意增加用药量的现象普遍发生, 这样容易导致药剂对病菌的选择压力居高不下, 加快了抗性的产生 因此, 应当混用和交替使用不同作用机理的农药, 减小药剂的选择压力, 减缓抗性的产生, 延长药剂的使用寿命 4 结论 氟吡菌胺与氟醚菌酰胺之间存在交互抗性, 应避免 2 种药剂的混用或交替使用 根据笔者实验室建立的抗性风险量化评估标准, 评估马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺存在高度抗性风险, 在使用氟吡菌胺防治马铃薯晚疫病时应控制同一生长季的使用次数不超过 2 次, 并严格按照药剂的推荐用量使用 References [1] 王希卓, 朱旭, 孙洁, 孙海亭, 张凯, 沈瑾. 我国马铃薯主粮化发 展形势分析. 农产品加工, 2015(2): WANG X Z, ZHU X, SUN J, SUN H T, ZHANG K, SHEN J. The potato staple foods development situation analysis in China. Farm Products Processing, 2015(2): (in Chinese) [2] 卢肖平. 马铃薯主粮化战略的意义 瓶颈与政策建议. 华中农业大学学报 ( 社会科学版 ), 2015(3): 1-7. LU X P. Strategy of potato as staple food: significance, bottlenecks and policy suggestions. Journal of Huazhong Agricultural University (Social Sciences Edition), 2015(3): 1-7. (in Chinese) [3] NOWICKI M, FOOLAD M R, NOWAKOWSKA M, KOZIK E U. Potato and tomato late blight caused by Phytophthora infestans: An overview of pathology and resistance breeding. Plant Disease, 2012, 96(1): [4] CHOWDAPPA P, NIRMAL KUMAR B J, MADHURA S, MOHAN KUMAR S P, MYERS K L, FRY W E, COOKE D. Severe outbreaks of late blight on potato and tomato in South India caused by recent changes in the Phytophthora infestans population. Plant Pathology, 2015, 64(1): [5] FRY W E, GOODWIN S B. Re-emergence of potato and tomato late blight in the United States. Plant Disease, 1997, 81(12): [6] 杨兰芳, 吴德喜, 赵剑锋, 任国敏, 陈齐斌. 不同杀菌剂对马铃薯晚疫病的田间防效试验. 中国马铃薯, 2014, 28(3): YANG L F, WU D X, ZHAO J F, REN G M, CHEN Q B. Control efficacy of different fungicides on potato late blight in field. Chinese Potato Journal, 2014, 28(3): (in Chinese) [7] 殷红清, 吴承金, 瞿勇, 李大春. 不同药剂对马铃薯晚疫病的防治效果. 植物保护, 2012, 38(5): YIN H Q, WU C J, QU Y, LI D C. The control efficacy of different fungicides to potato late blight. Plant Protection, 2012, 38(5): (in Chinese) [8] TOQUIN V, BARJA F, SIRVEN C, BEFFA R. Fluopicolide, a new anti-oomycetes fungicide with a new mode of action inducing perturbation of a spectrin-like protein//kramer W, SCHIRMER U. Modern Crop Protection Compounds. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007: [9] TAFFOREAU S, BARDSLEY E, LATORSE M P, FABRÈGES C, SCHIRRINGS A, WEGMANN T. Infinito: profile of a novel potato late blight fungicides. Summary of three years of development trials in Europe//WESTERDIJK C E, SCHEPERS H T. PPO-Special Report, 2006: [10] 杨吉春, 吴峤, 刘允萍, 刘长令. 含氟农药开发的新进展. 农药, 2011, 50(4): YANG J C, WU Q, LIU Y P, LIU C L. Recent advance of flourine-containing pesticides. Agrochemicals, 2011, 50(4): (in Chinese)

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103 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 中国粗榧生物碱的除草活性 马树杰 ,2 1,2, 刘琳, 芦小鹏, 马志卿, 张兴 ( 1 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心, 陕西杨凌 ; 2 陕西省生物农药工程技术研究中心, 陕西杨凌 ) 摘要 : 目的 明确中国粗榧(Cephalotaxus sinensis) 的除草活性成分, 为进一步深入研究中国粗榧的除草作用打下基础 方法 采用种子萌发法评价中国粗榧乙醇提取物 中国粗榧总生物碱及从中分离得到的 8 种生物碱 ( 桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 cephalotaxine β-n-oxide 4- 羟基三尖杉碱 台湾三尖杉碱和三尖杉碱 ) 对红三叶 (Trifolium pratense) 反枝苋(Amaranthus retroflexus) 黑麦草 (Lolium perenne) 及高丹草 (Sorghum sudanense)4 种杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用 ; 采用盆栽法测定中国粗榧乙醇提取物 中国粗榧总生物碱及各生物碱的鲜重抑制率 结果 种子萌发试验表明, 中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对红三叶种子具有较强的抑制作用, 对幼根的有效中浓度 (EC50) 分别为 和 mg L -1, 对幼芽的 EC50 分别为 和 mg L -1 ; 中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对反枝苋种子具有较强的抑制作用, 对幼根的 EC50 分别为 和 mg L -1, 对幼芽的 EC50 分别为 和 mg L -1 ; 仅中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草种子具有抑制作用, 对幼根的 EC50 分别为 和 mg L -1, 对幼芽的 EC50 分别为 和 mg L -1 ; 仅中国粗榧提取物 cephalotaxine β-n-oxide 及桥氧三尖杉碱对黑麦草种子具有抑制作用, 对幼根的 EC50 分别为 和 mg L -1, 对幼芽的 EC50 分别为 和 mg L -1 ; 盆栽试验表明, 中国粗榧提取物 总生物碱及 3 种生物碱 ( 桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱 ) 对双子叶杂草红三叶和反枝苋表现出了一定的苗前除草作用, 其中桥氧三尖杉碱的活性最高, 以 mg L -1 浓度进行土壤处理后,14 d 的鲜重抑制率分别为 78.89% 和 81.11%, 但对禾本科的高丹草和黑麦草的鲜重抑制率较低, 均在 25% 以下 ; 茎叶喷雾处理显示,5 种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋的生长表现出一定的抑制作用, 但抑制率均在 30% 以下, 而对 2 种单子叶杂草基本无效果 结论 中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性, 其主要活性成分为桥氧三尖杉碱, 且主要作用方式为抑制幼芽 ( 根 ) 的生长, 具有进一步研究及开发潜力 关键词 : 中国粗榧 ; 桥氧三尖杉碱 ;cephalotaxine β N oxide; 除草活性 ; 植物源农药 Herbicidal Activities of Alkaloids from Cephalotaxus sinensis MA Shu-jie 1, LIU Lin 1, LU Xiao-peng 1, MA Zhi-qing 1,2, ZHANG Xing 1,2 ( 1 Research & Development Center of Biorational Pesticides, Northwest A&F University, Yangling , Shaanxi; 2 Technology and Engineering Centre of Biopesticide, Yangling , Shaanxi) Abstract: Objective The objective of this study is to evaluate herbicidal activity of alkaloids from Cephalotaxus sinensis against four species of weeds and provide a basis for its further study. Method C. sinensis extract, total alkaloids, and eight 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 863 计划 (2011AA10A202) 联系方式 : 马树杰, mashujie89@126.com 通信作者马志卿,Tel: ; mazhiqing2000@126.com

104 19 期马树杰等 : 中国粗榧生物碱的除草活性 3747 alkaloids (drupacine, 11-hydroxycephalotaxine, cephalancetine A, isocephalotaxine, cephalotaxine β-n-oxide, 4-hydroxycephalotaxine, wilsonine and cephalotaxine) were measured by seed germination method and pot experiments, with Trifolium pretense, Amaranthus retroflexus, Lolium perenne and Sorghum sudanense as indicators. Result Seed germination experiment showed that C. sinensis extract, total alkaloids, drupacine, 11-hydroxycephalotaxine, cephalotaxine and cephalotaxine β-n-oxide had strong inhibiting effects on the growth of T. pretense with the EC 50 values of , , 69.47, 71.21, and mg L -1 against roots growth, and , , 68.52, , and mg L -1 against stems growth, respectively. C. sinensis extract, total alkaloids, drupacine, 11-hydroxycephalotaxine, cephalotaxine and cephalotaxine β-n-oxide showed strong inhibiting effects on the growth of A. retroflexus with the EC 50 values of , 29.69, 21.01, 48.08, and mg L -1 against roots growth, and , 46.20, 25.51, 47.85, and mg L -1 against stems growth, respectively. Only C. sinensis extract, total alkaloids and drupacine showed inhibiting effects on the growth of S. sudanense with the EC 50 values of , and mg L -1 against roots growth, and , and mg L -1 against stems growth, respectively. Only C. sinensis extract, cephalotaxine β-n-oxide and drupacine showed inhibiting effects on the growth of L. perenne with the EC 50 values of , and mg L -1 against roots growth, and , and mg L -1 against stems growth, respectively. The pot experiments showed that C. sinensis extract, total alkaloids, drupacine, 11-hydroxycephalotaxine and cephalotaxine had strong herbicidal effect in soil treatment against dicotyledon weeds T. pretense and A. retroflexus, and drupacine showed the strongest herbicidal effect with inhibitory rates of 78.89% and 81.11%, but low inhibitory rate of less than 25% against S. sudanense and L. perenne. Spraying treatment showed that the five samples had a weak herbicidal effect against dicotyledon weeds T. pretense and A. retroflexus with an inhibitory rate of less than 30%, and had no effect against S. sudanense and L. perenne. Conclusion C. sinensis alkaloids has potential herbicidal activities against dicotyledon weeds, and its main active constituent is drupacine, with an inhibiting effect on young buds growth. Key words: Cephalotaxus sinensis; drupacine; cephalotaxine β-n-oxide; herbicidal activity; botanical pesticide 0 引言 研究意义 植物源除草剂具有选择性强 环境安全性高等特点, 符合可持续农业发展的要求, 因此, 近些年来植物源除草剂的研制和开发已成为国内外众多研究机构和农药公司的关注重点 [1-2] 目前已发现 30 多科的植物含有近百种具有除草作用的天然化合物, 其中有些已被开发成天然除草剂, 如三氟羧草醚 磺草酮和环庚草醚等 [3-5] 中国粗榧(Cephalotaxus sinensis) 隶属三尖杉科 (Cephalotaxaceae) 三尖杉属 (Cephalotaxus), 为中国特有植物, 常被作为消积驱虫药, 同时具有消炎 润肺的功能, 主治蛔虫病 钩虫病 食积等病症 [6-7] 已有研究表明, 中国粗榧提取物对多种植物种子萌发及生长具有抑制作用 [8], 而生物碱为该植物中的特征性次生代谢物质, 因此, 通过室内和盆栽试验相结合的方法探究中国粗榧生物碱的除草活性, 可为进一步深入研究该植物的除草作用打下基础, 为新型植物源除草剂的开发提供依据 前 [9] 人研究进展 20 世纪 70 年代,POWELL 等首次发现三尖杉属植物中的三尖杉酯碱类化合物具有抑制小鼠白血病细胞生长作用, 之后国内外对三尖杉属植物的化学成分 药用活性及活性化合物的合成开展了广泛研究 [10-12] 目前, 在三尖杉属植物农用活性研究方 面, 已经发现中国粗榧丙酮提取物具有较好的杀虫活性 [13] ; 三尖杉 (Cephalotaxus fortunei) 中的桥氧三尖杉碱具有杀线虫作用 [14] ; 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心 ( 以下简称 中心 ) 在对西北地区除草活性植物筛选时发现中国粗榧对多种植物种子萌发及生长有明显的抑制作用 [15], 且从中国粗榧枝叶中分离得到桥氧三尖杉碱 三尖杉碱及 11- 羟基三尖杉碱等 3 种活性化合物 [16] 本研究切入点 中心 在研究中国粗榧农用活性成分时分离得到 8 种生物碱类化合物, 包括桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 cephalotaxine β-n-oxide 4- 羟基三尖杉碱 台湾三尖杉碱和三尖杉碱 然而, 目前有关该类化合物的除草活性尚未开展系统研究, 也未对其进行田间验证, 其主要活性成分及作用方式也不清楚 拟解决的关键问题 采用室内生测与盆栽试验相结合的方法系统评价中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及 8 种生物碱 ( 桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 cephalotaxine β-n-oxide 4- 羟基三尖杉碱 台湾三尖杉碱和三尖杉碱 ) 对红三叶 (Trifolium pratense) 反枝苋(Amaranthus retroflexus) 黑麦草(Lolium perenne) 及高丹草 (Sorghum sudanense) 等 2 种双子叶杂草和 2 种单子叶杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用及苗前苗后除

105 3748 中国农业科学 49 卷 草活性, 以进一步确定中国粗榧的除草作用, 并明确其主要活性成分及作用方式 1 材料与方法 1.1 供试植物中国粗榧于 2013 年 8 月采自陕西省眉县营头林场 ( 由西北农林科技大学生命学院李琰博士鉴定 ), 取其枝叶, 置于室内通风处阴干后, 于 40 恒温烘干, 粉碎后过 40 目筛, 放入密封袋中备用 红三叶 黑麦草及高丹草等 3 种杂草种子购自杨凌种子市场 ; 反枝苋种子于 2014 年 8 月采自西北农林科技大学实验田 1.2 供试药剂中国粗榧乙醇提取物及其总生物碱由 中心 从中国粗榧中制备得到 ; 桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 cephalotaxine β-n-oxide 4- 羟基三尖杉碱 台湾三尖杉碱和三尖杉碱等 8 种生物碱由 中心 从中国粗榧中分离得到 1.3 除草活性测定方法 室内除草活性测定采用种子萌发法 [17] 将中国粗榧乙醇提取物 总生物碱及 8 种生物碱配制成相应浓度梯度的乙醇溶液 在试验前 1 d 浸泡杂草种子, 使其吸足水分, 然后置于 25 恒温箱中催芽 24 h 至种子露白 在培养皿 (D=9 cm) 中铺两层滤纸, 准确加入供试药剂乙醇溶液 1.0 ml, 对照加入乙醇 1.0 ml, 待乙醇完全挥发后, 加入蒸馏水 5 ml, 再将 10 粒供试植物种子在滤纸上摆成一行, 置于 (25±1) 温室中黑暗培养, 期间适时补充水分,3 7 d 后 ( 依据幼苗生长速度 ) 测量种子主根 ( 最长根 ) 及芽长, 按照以下公式计算根 ( 芽 ) 生长抑制率 (%) 所有处理均重复 3 次 根 ( 芽 ) 生长抑制率 (%)= 对照根 ( 芽 ) 长度 处理根 ( 芽 ) 长度 100 对照根 ( 芽 ) 长度 [18] 盆栽除草活性测定采用砂土栽培法测定苗前除草活性 挑选大小一致, 外形饱满的杂草种子用 1% 的次氯酸钠水溶液表面消毒后用无菌水漂洗干净 将砂土过筛漂洗晒干后定量装至营养钵 (H=15 cm) 的 2/3 处, 再将供试杂草种子均匀撒播于砂土表面, 之后将 5 ml 供试药剂 (1 000 mg L -1 乙醇溶液 ) 加入 30 g 砂土, 搅拌均匀置于通风阴凉处, 含待测药剂的砂土干透后均匀覆盖到种子上 所有处理均重复 3 次 将营养钵放于恒温培养箱中培养 ( 培养温度为 21 26, 光周期为 16 h/8 h), 培养期间通过底部渗漏法补水, 培养 14 d 后, 称取地上部分鲜重并计算抑制率 公式如下 : 鲜重抑制率 (%)= 对照杂草鲜重 处理杂草鲜重 100 对照杂草鲜重 [19] 采用茎叶喷雾法测定苗后除草活性 以营养钵 (H=15 cm) 栽种杂草, 至杂草 2 3 叶期时以 5 ml 药液进行喷雾处理, 每处理 3 盆, 重复 3 次 ; 各药剂均以乙醇溶解后, 再以 0.05% TW-80 水溶剂稀释至终浓度为 mg L -1, 以等量 0.05% 吐温 -80 水溶剂作为空白对照 处理后移入温室常规培养, 以盆钵底部渗漏法补水 定期观察记载供试杂草的生长状态,21 d 后称取地上部分鲜重并计算抑制率 1.4 数据处理采用 SPSS 16.0 软件的机率值分析法求出 EC 50 及 95% 的置信限, 采用 Duncan s 新复极差法 (P=0.05) 进行差异显著性检验 2 结果 2.1 供试药剂对杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用 中国粗榧生物碱对红三叶幼苗生长的影响中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对红三叶幼根具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 >11- 羟基三尖杉碱 > 三尖杉碱 > cephalotaxine β-n-oxide> 提取物 > 总生物碱, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 ; 中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对红三叶幼芽也具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 >11- 羟基三尖杉碱 > 三尖杉碱 > 提取物 > 总生物碱 >cephalotaxine β-n-oxide, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 而贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 4- 羟基三尖杉碱和台湾三尖杉碱等 4 种生物碱对红三叶幼苗的生长基本无影响 ( 表 1) 中国粗榧生物碱对反枝苋幼苗生长的影响中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对反枝苋幼根具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 > 总生物碱 >11- 羟基三尖杉碱 >cephalotaxine

106 19 期马树杰等 : 中国粗榧生物碱的除草活性 3749 β-n-oxide> 提取物 > 三尖杉碱, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 ; 中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对反枝苋幼芽也具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 > 总生物碱 >11- 羟基三尖杉碱 > 三尖杉碱 >cephalotaxine β-n-oxide> 提取物, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 而贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 4- 羟基三尖杉碱和台湾三尖杉碱等 4 种生物碱对反枝苋幼苗的生长基本无影响 ( 表 2) 中国粗榧生物碱对高丹草幼苗生长的影响仅中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草幼根具有抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 > 总生物碱 > 提取物, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 ; 中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草幼芽具有抑制作 用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 > 总生物碱 > 提取物, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 而其他 7 种生物碱对高丹草幼苗生长基本无影响 ( 表 3) 中国粗榧生物碱对黑麦草幼苗生长的影响中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对黑麦草幼根具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 >11- 羟基三尖杉碱 > 总生物碱 > cephalotaxine β-n-oxide> 提取物 > 三尖杉碱, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 ; 仅中国粗榧提取物 桥氧三尖杉碱及 cephalotaxine β-n-oxide 对黑麦草幼芽具有较强的抑制作用, 活性排序为桥氧三尖杉碱 >cephalotaxine β-n-oxide> 提取物, 其 EC 50 分别为 和 mg L -1 而贡山三尖杉碱 A 异三尖杉碱 4- 羟基三尖杉碱和台湾三尖杉碱等 4 种生物碱对黑麦草幼苗的生长基本无影响 ( 表 4) 表 1 中国粗榧生物碱对红三叶种子幼根和幼芽的生长抑制作用 Table 1 Growth inhibition of C. sinensis alkaloids on the root and stem of T. pratense 供试药剂红三叶幼根 The root of T. pratense 红三叶幼芽 The stem of T. pratense Sample 毒力回归方程 The regression equation (y=) 有效中浓度 卡方值 (95% 置信限 ) Chi-Square EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) (χ 2 ) 毒力回归方程 有效中浓度 The regression (95% 置信限 ) equation (y=) EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) 卡方值 Chi-Square (χ 2 ) 中国粗榧提取物 C. sinensis extract 0.59x ( ) x ( ) 2.67 中国粗榧总生物碱 Total alkaloids 0.51x ( ) x ( ) 1.26 桥氧三尖杉碱 Drupacine 1.56x ( ) x ( ) 羟基三尖杉碱 11-Hydroxycephalotaxine 1.06x ( ) x ( ) 1.15 三尖杉碱 Cephalotaxine 0.78x ( ) x ( ) 2.35 Cephalotaxine β-n-oxide 0.87x ( ) x ( ) 1.25 χ =7.81, 若所测方程 χ 2 小于该值则方程符合实际, 否则不符合 下同 Equation fits the fact unless the χ 2 was less than The same as below 表 2 中国粗榧生物碱对反枝苋种子幼根和幼芽的生长抑制作用 Table 2 Growth inhibition of C. sinensis alkaloids on the root and stem of A. retroflexus 供试药剂反枝苋幼根 The root of A. retroflexus 反枝苋幼芽 The stem of A. retroflexus Sample 毒力回归方程 The regression equation (y=) 有效中浓度 (95% 置信限 ) EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) 卡方值 毒力回归方程 Chi-Square The regression (χ 2 ) equation (y=) 有效中浓度 卡方值 (95% 置信限 ) Chi-Square EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) (χ 2 ) 中国粗榧提取物 C. sinensis extract 1.99x ( ) x ( ) 4.25 总生物碱 Total alkaloids 1.98x ( ) x ( ) 4.00 桥氧三尖杉碱 Drupacine 2.22x ( ) x ( ) 羟基三尖杉碱 11-Hydroxycephalotaxine 1.75x ( ) x ( ) 1.27 三尖杉碱 Cephalotaxine 0.98x ( ) x ( ) 1.63 Cephalotaxine β-n-oxide 1.07x ( ) x ( ) 1.69

107 3750 中国农业科学 49 卷 表 3 中国粗榧生物碱对高丹草种子幼根和幼芽的生长抑制作用 Table 3 Growth inhibition of C. sinensis alkaloids on the root and stem of S. sudanense 供试药剂 高丹草幼根 The root of S. sudanense 高丹草幼芽 The stem of S. sudanense Sample 毒力回归方程 The regression equation (y=) 有效中浓度 (95% 置信限 ) EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) 卡方值 Chi-Square (χ 2 ) 毒力回归方程 The regression equation (y=) 有效中浓度 (95% 置信限 ) EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) 卡方值 Chi-Square (χ 2 ) 中国粗榧提取物 C. sinensis extract 0.87x ( ) x ( ) 1.45 总生物碱 Total alkaloids 1.20x ( ) x ( ) 0.65 桥氧三尖杉碱 Drupacine 1.68x ( ) x ( ) 3.27 表 4 中国粗榧生物碱对黑麦草种子幼根和幼芽的生长抑制作用 Table 4 Growth inhibition of C. sinensis alkaloids on the root and stem of L. perenne 供试药剂黑麦草幼根 The root of L. perenne 黑麦草幼芽 The stem of L. perenne Sample 毒力回归方程 The regression equation (y=) 有效中浓度 (95% 置信限 ) EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) 卡方值 毒力回归方程 Chi-Square The regression (χ 2 ) equation (y=) 有效中浓度 卡方值 (95% 置信限 ) Chi-Square EC 50 (95% FL) (mg L -1 ) (χ 2 ) 中国粗榧提取物 C. sinensis extract 1.18x ( ) x ( ) 1.35 总生物碱 Total alkaloids 1.50x ( ) 1.21 桥氧三尖杉碱 Drupacine 1.91x ( ) x ( ) 羟基三尖杉碱 11-Hydroxycephalotaxine 3.34x ( ) 2.28 三尖杉碱 Cephalotaxine 1.08x ( ) 3.37 Cephalotaxine β-n-oxide 1.05x ( ) x ( ) 2.15 代表无活性 No inhibition 下同 The same as below 2.2 供试药剂的盆栽除草活性依据室内生测结果, 选择活性相对较好的中国粗榧提取物 总生物碱及 3 种生物碱 ( 桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱 ) 进行了盆栽试验 结果表明, 这 5 种处理对红三叶 反枝苋 黑麦草及高丹草均表现出了一定的除草活性 土壤处理后,5 种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋均表现出了一定的除草活性, 其中桥氧三尖杉碱的活性最高, 鲜重抑制率分别为 78.89% 和 81.11%, 但对禾本科的高丹草和黑麦草的鲜重抑制率较低, 均在 25% 以下 ; 茎叶喷雾处理表明,5 种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋的生长表现出一定的抑制作用, 但抑制率均在 30% 以下, 而对 2 种单子叶杂草基本无效果 可见, 中国粗榧中的主要除草活性物质为桥氧三尖杉碱, 且主要作用方式为抑制种子萌发及幼芽生长 ( 表 5) 3 讨论 3.1 中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性本研究表明中国粗榧提取物 中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱 11- 羟基三尖杉碱 三尖杉碱和 cephalotaxine β-n-oxide 对单子叶和双子叶杂草均表现出一定的除草活性, 但对双子叶杂草的活性明显高于单子叶杂草 从室内种子萌发试验可以看出, 中国粗榧对双子叶杂草种子幼根和幼芽的有效中浓度明显低于对单子叶杂草 ; 盆栽试验也表明, 对双子叶杂草的鲜重抑制率较好, 对单子叶杂草基本无 [15] 效果 郝双红等在对中国粗榧除草活性研究时发现在 1.00 mg ml -1 的供试浓度下, 桥氧三尖杉碱对反枝苋种子根 茎生长的抑制率分别为 86.1% 和 82.4%, 而对单子叶杂草的活性较弱 可见, 中国粗榧及其活性成分主要对双子叶杂草表现出良好的抑制作用 当然, 该结果也与多种生物源除草剂的作用特点较为一致, 如灰葡萄孢毒素对反枝苋和牵牛花等双子叶杂草幼苗的杀伤活性达 100%, 对禾本科作物和杂草苗后生长影响很小 [20] ; 同一质量浓度的仁用杏叶片提取液对禾本科杂草和阔叶杂草的化感效果有差异, 阔叶杂草更加敏感 [21] 鉴于中国粗榧为中国特有植物, 植物资源丰富, 且为传统中药材之一 [22], 因此, 有必要对该植物的除草活性进一步深入探讨, 有可能开发成为一类新型 安全 高效的植物源除草剂

108 19 期马树杰等 : 中国粗榧生物碱的除草活性 3751 表 5 中国粗榧生物碱对 4 种杂草的防治效果 ( 盆栽试验 ) Table 5 Control effects of C. sinensis alkaloids on 4 species of weeds (pot experiments) 供试药剂 Sample 抑制率 Inhibition rate (%) 红三叶 T. pratense 反枝苋 A. retroflexus 高丹草 S. sudanense 黑麦草 L. perenne 土壤处理 Soil treatment 茎叶喷雾处理 Spray treatment 土壤处理 Soil treatment 茎叶喷雾处理 Spray treatment 土壤处理 Soil treatment 茎叶喷雾处理 Spray treatment 土壤处理 Soil treatment 茎叶喷雾处理 Spray treatment 中国粗榧提取物 45.56±2.57c 16.67±4.78b 55.56±5.09c 16.67±1.78b 13.78±1.92c 11.56±0.95b C. sinensis extract 总生物碱 50.00±1.05c 20.00±1.32ab 65.56±4.93b 18.89±3.85ab 18.44±3.09b 16.22±1.92a Total alkaloids 桥氧三尖杉碱 78.89±3.45a 26.89±1.92a 81.11±5.09a 28.33±2.24a 23.33±1.73a 18.89±3.85a Drupacine 11- 羟基三尖杉碱 61.11±1.92b 16.67±2.88b 70.00±1.73b 21.11±1.92a 8.89±1.92b 11-Hydroxycephalotaxine 三尖杉碱 Cephalotaxine 32.22±4.19d 17.78±1.92b 36.67±3.14d 11.11±3.09c 表中数据为 3 次重复的平均值, 不同小写字母表示差异显著 (P=0.05) Values were averages of three replications, values followed by different lowercases indicated significantly different at P=0.05 level 3.2 桥氧三尖杉碱是中国粗榧的主要除草活性成分本研究中室内种子萌发和盆栽试验结果均表明, 中国粗榧各生物碱中桥氧三尖杉碱的除草活性最强, [14] 该结果也与之前报道基本一致 另外, 与同类研究相比, 桥氧三尖杉碱的除草活性较强, 如绒叶泡桐 (Paulownia tomentosa) 中除草成分对乙氧基苯甲醛对反枝苋种子胚根生长抑制的 EC 50 为 mg L -1[23] ; 从灰葡萄孢 BC4 诱变菌株中分离得到的灰葡萄孢毒素, 在 100 mg L -1 浓度下对反枝苋种子幼根和幼芽的抑制率在 80% 以下 [24] ; 而桥氧三尖杉碱对反枝苋幼根和幼芽生长抑制的 EC 50 分别仅为 和 mg L -1 可见, 相比而言, 从中国粗榧中提取分离得到的桥氧三尖杉碱的除草活性有进一步研究价值 3.3 中国粗榧生物碱及桥氧三尖杉碱的主要除草方式为抑制杂草幼芽 ( 根 ) 生长现有除草剂的作用方式按其作用特点可分为两类, 一类为抑制杂草种子萌发或抑制幼芽 ( 根 ) 生长, 常采用土壤处理方式施药, 如乙草胺和甲草胺等 [25] ; 另一类主要影响杂草植株的生长, 常用茎叶喷雾法施药, 如 2, 4- 滴丁酯和草甘膦等 [26] 本研究中, 盆栽试验分别采用了土壤处理和茎叶喷雾处理两种方法来测定其苗前苗后除草活性, 结果表明土壤处理的鲜重抑制率明显优于茎叶喷雾处理, 且种子萌发试验也表明中国粗榧及桥氧三尖杉碱对杂草种子幼根和幼芽具有很强的抑制作用 可见, 中国粗榧及桥氧三尖杉碱应 作为土壤处理剂来应用, 其主要除草方式为抑制杂草幼芽 ( 根 ) 的生长 4 结论 中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性, 其主要活性成分为桥氧三尖杉碱, 且主要作用方式为抑制幼芽 ( 根 ) 的生长, 具有进一步研究及开发潜力 References [1] 刘双清, 张亚, 廖晓兰, 柏连阳. 我国植物源农药的研究现状与应用前景. 湖南农业科学, 2016(2): LIU S Q, ZHANG Y, LIAO X L, BAI L Y. Research status and application prospects of botanical pesticides in China. Hunan Agricultural Sciences, 2016(2): (in Chinese) [2] 马瑞君, 朱慧, 陈丹生, 徐国熙, 吴干添. 入侵杂草五爪金龙的除草剂植物筛选. 中国生态农业学报, 2008, 16(2): MA R J, ZHU H, CHEN D S, XU G X, WU G T. Screening botanical herbicide for invasive plant Ipomoea cairica. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2008, 16(2): (in Chinese) [3] 李效飞. 治理杂草的天然化合物. 世界农药, 2000, 22(3): LI X F. Natural compounds of weeds control. World Pesticides, 2000, 22(3): (in Chinese) [4] SINGH H P, BATISH D R, SETIA N, KOHLI R K. Herbicidal activity of volatile oils from Eucalyptus citriodora against Parthenium hysterophorus. Annals of Applied Biology, 2005, 146(1):

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110 19 期马树杰等 : 中国粗榧生物碱的除草活性 ZOU X J, SUN Z X, YU T, YANG N, JIANG A L, JIANG M. Allelopathy of aqueous extracts from kernel apricot leaves on seed germination and seedling growth of 8 types of weeds. Agrochemicals, 2013, 52(6): (in Chinese) [22] 浙江省三尖杉研究协作组. 三尖杉属植物生物碱的临床研究. 浙江肿瘤通讯, 1976, 8(2): Research Group of Cephalotaxus. The clinical research of the alkaloids from Cephalotaxus. Zhejiang Tumor Communication, 1976, 8(2): (in Chinese) [23] 袁忠林, 罗兰, 臧爱梅, 孟昭礼. 绒叶泡桐花中除草活性成分的分离与除草活性. 农药学学报, 2009, 11(2): YUAN Z L, LUO L, ZANG A M, MENG Z L. Isolation and bioassay of herbicidal active ingredient from Paulownia tomentosa. Chinese Journal of Pesticide Science, 2009, 11(2): (in Chinese) [24] 张金林, 徐扩, 李川, 马娟, 董金皋. 灰葡萄孢诱变菌株毒素的除草活性研究. 中国农业科学, 2005, 38(6): ZHANG J L, XU K, LI C, MA J, DONG J G. The bioactivity of mutant isolates from Botrytis cinerea. Scientia Agricultura Sinica, 2005, 38(6): (in Chinese) [25] ARMEL G R, WILSON H P, RICHARDSON R J, HINES T E. Mesotrione, acetochlor, and atrazine for weed management in corn (Zea mays). Weed Technology, 2003, 17(2): [26] MYERS J P, ANTONIOU M N, BLUMBERG B, CARROLL L, COLBORN T, EVERETT L G, HANSEN M, LANDRIGAN P J, LANPHEAR B P, MESNAGE R, VANDENBERG L N, VOM SAAL F S, WELSHONS W V, BENBROOK C M. Concerns over use of glyphosate-based herbicides and risks associated with exposures: a consensus statement. Environmental Health, 2016, 15(1): 19. ( 责任编辑岳梅 ) 欢迎订阅 2017 年 中国土壤与肥料 双月刊 1964 年创刊, 是农业部主管 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所和中国植物营养与肥料学会主办的全国性专业科技期刊 为全国中文核心期刊 中国科技核心期刊 中国农业核心期刊 RCCSE 中国核心学术期刊 被中国科学引文数据库 (CSCD) 中国学术期刊综合评价数据库 中国学术期刊文摘 CA 化学文摘 ( 美 ) CBST 科学技术文献速报 ( 日 ) CAB 农业与生物科学研究中心文摘 ( 英国 ) 等收录 以促进土肥学科的发展为宗旨, 加快成果转化 推动技术进步为目标 面向科研 教学和生产实践 主要刊登土壤资源与利用 植物营养与施肥 农业水资源利用 农业微生物 分析测试 环境保护 生态农业等方面的新理论 新技术 新产品的试验研究成果与动态 辟有专家论坛 专题综述 研究报告 调查研究 分析方法 简报等栏目 读者对象为农业科研 教学 推广 环保及肥料生产 经营部门的科技 管理人员及农民技术员 本刊为双月刊, 大 16 开本, 双月 10 日出版, 国内标准刊号 CN /S, 国际标准刊号 ISSN 每期 15 元, 全年 90 元, 邮发代号 2-559, 全国各地邮局均可订阅, 漏订者可与本刊编辑部联系 地址 : 北京市海淀区中关村南大街 12 号中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ( 邮编 :100081) 电话 : ; 传真 : 网址 :

111 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 袁梅 1, 谭适娟 2, 孙建光 1 ( 1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 / 农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室, 北京 ; 2 湖南省郴州桂阳县农业局, 湖南郴州 ) 摘要 : 目的 分离鉴定湖南水稻内生固氮菌, 研究水稻内生固氮菌的系统发育, 分析测定分离菌株的生物学特性, 探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗镉 (Cd) 吸收的影响 方法 表面灭菌水稻植株样品后采用低氮培养法分离水稻内生细菌, 采用 PCR 扩增 测序检测菌株 nifh 基因确认分离物是固氮菌, 通过 16S rrna 基因序列测定 比对初步鉴定菌株, 分析菌株系统发育, 通过温室盆栽试验探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗 Cd 吸收的影响 结果 从 8 个湖南水稻植株样品中分离到 19 株内生固氮菌, 这些菌株在系统发育地位上属于 Bacillus aryabhattai B. cereus B. idriensis B. indicus B. licheniformis B. megaterium B. methylotrophicus B. subtilis B. tequilensis Brevibacterium halotolerans Fictibacillus phosphorivorans Paenibacillus barcinonensis P. lautus 4 属 13 种 分离到的 19 株内生固氮菌中有大约 1/3 的菌株产生蛋白酶和纤维素酶的能力较强, 在 48 生长良好, 在产孢液体培养基上生长良好 (OD>1.0), 在固体产孢培养基上产孢率高 (60% 90%), 产碱能力也相对较强 (ph ) 有 1/6 的内生固氮菌 (3 个菌株 ) 分别对立枯丝核菌 禾谷镰孢 拟枝孢镰孢具有拮抗性, 抑菌率为 42% 55% 有大约 2/3 的菌株对抗生素相对比较敏感, 对杀菌剂耐性强 测定的 4 个代表菌株对检测过的 78 种碳源中的 7 种利用较好, 它们是乳酸钠 蔗糖 葡萄糖 甘油 苹果酸 丙氨酸 葡萄糖醛酰胺 试验的 19 株内生固氮菌中有 6 个菌株促进水稻苗期 Cd 吸收, 与对照相比植株 Cd 含量增加 6.41% 38.45%; 其他 13 个菌株抑制水稻苗期 Cd 吸收, 与对照相比植株 Cd 含量减少 2.06% 34.46% 结论 从湖南水稻分离到 19 株内生固氮菌, 系统发育地位属于 Bacillus Brevibacterium Fictibacillus Paenibacillus 4 属 13 种 部分菌株产碱能力强, 产孢率高, 可在 48 高温下生长, 产蛋白酶 纤维素酶, 拮抗立枯丝核菌 禾谷镰孢 拟枝孢镰孢, 具有良好应用前景 接种水稻内生固氮菌可以显著影响水稻苗期 Cd 吸收, 提示采用微生物方法阻控稻田 Cd 污染是一个非常值得研究 探讨的途径 关键词 : 水稻 ; 内生固氮菌 ; 生物特性 ;Cd Isolation and Biological Properties of Endophytic Diazotrophs from Rice and Their Influences on Rice Seedling Cd Accumulation YUAN Mei 1, TAN Shi-juan 2, SUN Jian-guang 1 ( 1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Microbial Resources, Ministry of Agriculture, Beijing ; 2 Guiyang Agricultural Bureau, Chenzhou , Hunan) Abstract: Objective The objective of this study is to isolate, identify and analyze phylogenetics of endophytic diazotrophs from rice planted in Hunan province, test the biological characteristics of the isolates, and to explore the influences of diazotroph inoculation on rice seedlings Cd accumulation. Method Surface sterilization and low nitrogen medium were used to isolate endophytic diazotrophs. nifh detection was conducted based on PCR amplification to confirm the isolates as nitrogen-fixing bacteria. 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ) 联系方式 : 袁梅, yuanmei1010@163.com 通信作者孙建光,Tel: ; jgsun@caas.ac.cn

112 19 期袁梅等 : 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 S rrna was amplified with PCR, blasted in EzTaxon after sequencing, and analyzed with Clustalx-MEGA to make phylogenetic tree. Greenhouse trials were conducted to investigate the influence of diazotroph inoculation on rice seedling Cd accumulation. Result Nineteen endophytic diazotrophs were isolated from root, stem and leaf of 8 rice samples. These 19 strains phylogenetically belong to 4 genus 13 species of Bacillus aryabhattai, B. cereus, B. idriensis, B. sindicus, B. licheniformis, B. megaterium, B. methylotrophicus, B. subtilis, B. tequilensis, Brevibacterium. halotolerans, Fictibacillus phosphorivorans, Paenibacillus barcinonensis, P. lautus. Biological tests showed that about 1/3 of the 19 strains produce protease and cellulose, grow well at 48, form spores well with percentage 60%-90%, produce alkali with final ph About 1/6 of the 19 strains are antagonistic against plant pathogenic Rhizoctonia solani ACCC36246, Fusarium graminearum ACCC36249 and Fusarium sporotrichioides ACCC37402 with rate of 42%-55%. About 2/3 of the 19 strains showed sensitive to antibiotics and resistant to fungicide. Four representative strains of the 19 could utilize 7 of the 78 carbon sources, sodium lactate, sucrose, dextrose, glycerol, malic acid, alanine and glucuronic acid amide. Greenhouse trials showed that 6 of the 19 strains promoted rice seedling Cd absorption with increase of 6.41%-38.45%, and other 13 strains decreased rice seedling Cd absorption with 2.06%-34.46% compared with control. Conclusion Nineteen endophytic diazotrophs were isolated from rice planted in Hunan. These 19 strains phylogenetically belong to 4 genus 13 species of Bacillus, Brevibacterium, Fictibacillus and Paenibacillus. Partial strains produce protease and cellulose, grow well at 48, form spores well, antagonistic against plant pathogenic Rhizoctonia solani, Fusarium graminearum and Fusarium sporotrichioides, have good prospects of application. Inoculation of diazotroph can significantly affect rice seedling Cd absorption. The results suggest that application of microbial method to control paddy Cd is a very worthwhile pathway. Key words: rice; endophytic diazotrophs; biological property; Cd 0 引言 研究意义 水稻植株体内栖息着大量内生菌, 对于植株健康生长起着重要作用 [1] 内生固氮菌是植物内生菌的一个主要类群, 不仅有固氮作用, 还能促进植物生长, 提高植物抗病 抗逆 [2] 矿山开采 不洁肥料等原因造成了稻田 Cd 污染, 影响食品安全和生态安全 [3-4] 研究发现内生菌能够提高水稻幼苗对 Cd 胁迫的抗性 [5], 探索内生固氮菌对稻苗 Cd 吸收的影响, 对于防控稻田 Cd 污染具有积极意义 前人研究进展 水稻是内生固氮菌研究相对较多的作物, 许多年前人们就已经建立了有效的水稻内生固氮菌分离方法, 并且测得水稻内生固氮菌的数量在 cfu/g DW [6] 近年来, 水稻内生菌成为研究热点, 水稻内生固氮菌的分离鉴定工作得到加强, 新的水稻内生固氮菌也不断被发现 [7-8], 接种固氮菌对于水稻氮素营养改善等具有生产实际意义的研究结果得到证实 [9] 目前, 对水稻内生固氮菌进行批量分离鉴定和较为系统的生物特性研究较少, 也未见到内生固氮菌对水稻植株 Cd 吸收的报道 本研究切入点 从 Cd 污染较重的地区湖南郴州桂阳县采集水稻植株样品, 批量分离 鉴定内生固氮菌, 分析菌株间的系统发育关系, 系统研究菌株产碱 产孢 高温生长, 产蛋白酶 纤维素酶, 拮抗病原真菌, 对抗生素 杀菌剂耐性, 碳源发酵利用等与农业生产应用密切的生物特性, 探索菌株对水稻苗期生长及植株 Cd 吸收的影响 拟解决的关键问题 探讨水稻内生固氮菌的系统发育关系 生物特性及其对水稻苗期 Cd 吸收的影响 1 材料与方法 试验于 2014 年 1 月至 2015 年 12 月在北京和湖南省郴州桂阳县完成 1.1 样品 试剂 培养基 样品 试剂 2014 年 9 月 17 日从湖南省郴州桂阳县水稻田采集到水稻植株样品 8 份, 水稻为当地品种明珠丝苗, 处于近成熟期 采样方法为选择不同水稻田块的健壮植株带根土整穴拔起, 每个田块采集 2 份, 装入塑料袋带回实验室保存在 4, 尽快进行菌株分离 病原真菌靶标菌株立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani ) ACCC36246 禾谷镰孢(Fusarium graminearum)accc36249 拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)accc37402 由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所邓晖提供 试验所用试剂购自北京化学试剂公司和 Sigma 公司 培养基分离固氮菌多碳源低氮培养基 (CCM) [10] : 溶液 Ⅰ:KH 2 PO g,nacl 0.1 g, K 2 HPO g,na 2 FeEDTA 28 mg, 钼酸钠 25 mg, 酵母浸膏 100 mg, 甘露醇 5 g, 蔗糖 5 g, 乳酸钠 0.5 ml, 蒸馏水 900 ml 溶液 Ⅱ:MgSO 4 7H 2 O 0.2 g, CaCl 2 2H 2 O 0.06 g, 蒸馏水 100 ml 将溶液 Ⅰ Ⅱ 分

113 3756 中国农业科学 49 卷 别灭菌, 冷却至 50 左右混合, 加入生物素 (5 µg L -1 ) 和维生素 (10 µg L -1 ) 各 0.5 ml 分离固氮菌无氮培养基 [11] : 蔗糖 10 g,nacl 0.12 g,k 2 HPO 4 3H 2 O 0.5 g, CaCO 3 1 g,mgso 4 7H 2 O 0.2 g, 蒸馏水 1 L,pH 7.2 LB 培养基 : 酵母膏 5 g, 蛋白胨 10.0 g,nacl 10.0 g, 蒸馏水 1 L,pH 7.0 牛肉膏蛋白胨培养基( 液体 ): 牛肉膏 5.0 g, 蛋白胨 10.0 g,nacl 5.0 g, 蒸馏水 1 L, ph 7.0 产孢液体培养基:(NH 4 ) 2 SO 4 2 g,nacl 1 g, K 2 HPO 4 1 g,mgso 4 7H 2 O 1 g,mnso g, 淀粉 10 g,caco 3 1 g, 蒸馏水 1 L,pH 7.0 产孢固体培养基: 麦麸 1 kg, 豆粉 400 g( 预先混合 ), 牛肉膏 200 g, 可溶淀粉 10 g, 酵母粉 3 g, 蔗糖 20 g, 磷酸二氢钾 20 g, 尿素 3 g( 用 400 ml 蒸馏水溶解后加入 ),MnSO 4 2 g( 用 100 ml 蒸馏水单独溶解后加入 ), 蒸馏水 2.5 L,pH 7.2 测定蛋白酶脱脂牛奶培养基: 脱脂奶粉 5 g 溶于 50 ml 蒸馏水, 琼脂 1.5 g 溶于 50 ml 蒸馏水, 两者分别灭菌 待冷至 时, 两液混匀倒平板 测定纤维素酶 CMC 培养基 :(NH 4 ) 2 SO 4 2 g,mgso g,kh 2 PO 4 l g,nacl 0.5 g,cmc-na 10 g, 琼脂 20 g, 蒸馏水 1 L, 自然 ph 耐药性检测培养基: 蔗糖 10 g, NaCl 0.12 g,k 2 HPO 4 3H 2 O 0.5 g,caco 3 1 g, MgSO 4 7H 2 O 0.2 g, 酵母粉 0.5 g, 蒸馏水 1 L,pH 水稻内生固氮菌分离采用上述多碳源低氮培养基和无氮培养基对采自湖南郴州桂阳县的水稻植株样品进行了内生固氮菌分离, 方法参考文献 [12] 1.3 菌株 16S rrna 基因序列测定与初步鉴定固氮菌分离物的 16S rrna 基因扩增方法参考文献 [13], 序列测定委托北京博迈德生物技术公司完成, 基于 16S rrna 基因序列的初步鉴定采用 EzTaxon 和 NCBI 数据库在线比对完成 1.4 菌株 nifh 基因检测与序列测定方法参考文献 [14], 序列测定委托生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司完成 1.5 水稻内生固氮菌系统发育分析在上述 16S rrna 基因序列测定和 nifh 基因检测的基础上, 采用 Mega 软件分析水稻内生固氮菌的系统发育 [15] 1.6 菌株产碱 产孢 高温生长测定采用牛肉膏蛋白胨培养基测定菌株产碱和高温生长能力 方法如下 : 首先在 LB 培养基平板上培养活化备测菌株, 然后将备测菌株接种在盛有 5 ml 牛肉膏蛋白胨培养基的试管中, 每种培养基 3 次重复 ( 设 置不接种空白对照 ), 然后分别放置在 28 和 48 恒温培养箱中静置培养 48 h 后观察记录菌株生长情况, 同时用精确试纸测定培养液 ph 采用液体和固体 2 种产孢培养基测定菌株产生芽孢的能力 液体培养测定方法 : 用 LB 平板培养基培养活化备测菌株, 然后将备测菌株接种在盛有 5 ml 产孢液体培养基的试管中,3 次重复 ( 设置不接种空白对照 ),28 恒温摇床振荡培养 6 d 后镜检观察菌体形态和芽孢形成情况, 记录视野中芽孢比例 固体培养测定方法 : 首先用 LB 平板培养基培养活化备测菌株, 然后接种在 50 ml LB 液体培养基中 28 恒温摇床振荡培养 24 h 制成种子液 将配制好的产孢固体培养基放入布袋, 湿热灭菌后趁热加入预先干热灭菌的 500 ml 烧杯中, 装量 300 ml, 双层纱布封口, 冷至室温后接种 50 ml 上述种子液, 置于 30 恒温培养箱中静置培养 72 h 后检测芽孢形成 : 称取固体培养物 50 g 放入匀浆机中, 加水 250 ml, 匀浆 2 min, 吸取 100 μl 菌液, 涂片, 染色, 镜检观察菌体形态和芽孢形成情况, 记录视野中芽孢比例 1.7 菌株产蛋白酶 纤维素酶测定定性测定了菌株产生蛋白酶和纤维素酶的能力 测定菌株产生蛋白酶的方法 : 用 LB 平板培养基培养活化备测菌株, 然后将备测菌株接种在脱脂牛奶培养基平板上,28 培养 3 d 后, 观察 记录菌落周围透明圈大小, 判断菌株产蛋白酶能力 测定菌株产生纤维素酶的方法 : 用 LB 平板培养基培养活化备测菌株, 然后将备测菌株接种在 CMC 培养基平板上,28 培养 3 d 后, 在长出菌落的培养基上覆盖浓度 4 mg ml -1 的刚果红溶液,1 h 后倾去, 加入浓度 l mol L -1 的 NaCl 溶液,1 h 后倾去, 加入 5% 的醋酸 此时, 产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈 观察 记录菌落周围透明圈大小, 判断菌株产生纤维素酶能力 1.8 菌株拮抗病原真菌采用两点对峙法测定了分离菌株对立枯丝核菌 ACCC36246 禾谷镰孢 ACCC36249 拟枝孢镰孢 ACCC37402 这 3 株病原真菌的拮抗特性, 方法参考文献 [16] 抑制率(%)=( 对照半径 r 0 - 对峙培养病原真菌菌落半径 r 1 )/ 对照半径 r 菌株对抗生素 杀菌剂耐性用平板培养法测定了分离菌株对抗生素 杀菌剂的耐性 测试的抗生素和杀菌剂有氨苄青霉素 噻孢霉素 氯霉素 硫酸卡那霉素 硫酸新霉素 青霉素 G 钠盐 硫酸链霉素 盐酸四环素, 戊唑醇 敌克松

114 19 期袁梅等 : 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 3757 甲霜灵 咯菌腈 恶霜灵 福美双等 测试方法为 : 将抗生素和杀菌剂配成母液, 加入到灭菌后正处于冷却阶段 (50 左右 ) 的耐药性检测培养基中, 使抗生素终浓度为 0.25 g L -1 ( 杀菌剂终浓度 1.0 g L -1 ), 充分混匀, 倒于灭菌平皿中制成检测平板 用 LB 平板培养基培养活化备测菌株, 然后接种在 50 ml LB 液体培养基中 28 恒温摇床振荡培养 24 h 制成种子液 用无菌水调节种子液浓度为 OD 600 =1.0, 接种 20 μl 至耐药性检测平板,28 培养 4 d, 记录菌株生长情况 1.10 菌株对碳源发酵利用测定采用 BIOLOG 试剂盒 ( 美国 Biolog 公司, 仪器型号 :GENⅢ) 测定了分离菌株对碳源的发酵利用, 测定碳源共计 78 种, 方法参照 BIOLOG 实验手册 1.11 菌株对水稻苗期生长及植株 Cd 吸收的影响试验于 2015 年 4 月 15 日至 7 月 7 日在温室完成 供试菌株为上述 19 株水稻内生固氮菌, 试验土壤取自湖南省郴州桂阳县, 含 Cd 约 6 mg kg -1 水稻品种为湖南省郴州桂阳县当地品种明珠丝苗 2 号 育秧盘为 4 8 孔, 面积 m 2, 购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所 步骤 : 将土壤风干, 磨碎, 过 2 mm 筛, 按照 1:10 加入生物有机肥 ( 市售 ), 同时按照每平方米育秧盘加入 185 g 水稻育秧调理剂 ( 调理剂组成 : 磷酸一铵 65 g, 过磷酸钙 100 g, 硫酸铵 422 g, 硫酸钾 40 g, 硫酸锌 7 g, 填料 366 g), 混匀装盘, 每盘装土 3.3 kg 挑选饱满种子, 浸种 5 d, 每穴播种 20 粒种子 出苗后, 在 2 叶期接种固氮菌, 每穴接种 OD 600 =1.0 的固氮菌培养液 1 ml, 设置不接菌处理为阴性对照, 每个处理 8 次重复 日常管理按常规进行 2 个月后收获, 测定稻苗根长 株高 鲜重等生长性状, 同时将样品送普尼测试中心测定 Cd 含量 采用 SAS 软件进行统计分析 2 结果 2.1 水稻内生固氮菌分离 nifh 检测及基于 16S rrna 基因序列的初步鉴定采用多碳源低氮培养基和无氮培养基从 8 个水稻植株样品的根 茎 叶共分离到内生固氮菌 19 株, 全部菌株检测到了固氮基因 nifh, 经过 16S rrna 基因序列分析比对确定了菌株的分类地位 新分离菌株的编号 来源及最大相似性模式种如表 1 所示 2.2 新分离水稻内生固氮菌的系统发育分析 16S rrna 基因序列比对结果显示, 从湖南水稻植株分离到的 19 株内生固氮菌与已知模式种的最大相 似性均在 99% 以上 (sd194 为 98.83%), 说明新分离内生固氮菌的科学分类地位比较明确 按照 16S rrna 基因序列相似性,19 株水稻内生固氮菌在系统发育地位上属于 4 属 13 种, 分别为 Bacillus aryabhattai B. cereus B. idriensis B. indicus B. licheniformis B. megaterium B. methylotrophicus B. subtilis B. tequilensis Brevibacterium halotolerans Fictibacillus phosphorivorans Paenibacillus barcinonensis P. lautus 它们的系统发育关系如图 1 所示 2.3 菌株产碱 产孢 高温生长性能分离到的 19 株水稻内生固氮菌在细菌常规培养基牛肉膏蛋白胨上生长良好, 细胞密度均在 OD 1.0 以上, 多数菌株具有产碱能力, 培养液最终 ph 在 高温生长试验结果显示 sd010 sd032 sd037 sd039 sd232 sd372 6 株菌能够在 48 生长, 细胞密度达到 OD 1.0 以上, 而且这些菌株的产碱能力相对强于其他菌株 产孢试验结果显示, 菌株在产孢液体培养基上产孢较少, 多数菌株的芽孢形成率不足 10%; 而在产孢固体培养基是生长良好, 菌数密度达到 cfu/g 以上, 多数菌株的芽孢形成率达到了 60% 90%( 表 2) 2.4 菌株产蛋白酶 纤维素酶性能及其对病原真菌的拮抗蛋白酶和纤维素酶测定结果显示, 菌株 sd032 sd037 sd039 sd250 sd372 sd373 具有较好的产酶能力, 其他菌株产酶能力较弱, 或者不产生 同时发现, 菌株产生蛋白酶和纤维素酶二者之间存在一致性 ( 表 2) 抗病原真菌试验显示, 菌株 sd037 sd039 同时对 3 株靶标病原真菌具有拮抗作用, 抑菌率为 42% 55%,sd010 对 ACCC37402 sd373 对 ACCC36249 分别具有拮抗性, 其他菌株不具有拮抗病原真菌的能力 菌株拮抗病原真菌的能力和菌株产蛋白酶 纤维素酶的能力二者之间存在明显的一致性 ( 表 2) 2.5 菌株对抗生素 杀菌剂的耐性检测了 18 株新分离菌株对 8 种抗生素和 6 种杀菌剂的耐药性, 结果显示多数菌株对氨苄青霉素 噻孢霉素 青霉素 G 钠盐 盐酸四环素 甲霜灵 咯菌腈 恶霜灵具有不同程度的耐性, 对氯霉素 硫酸卡那霉素 硫酸新霉素 敌克松 福美双则相对比较敏感 从单个菌株的耐药性来看,sd032 sd039 sd086 sd372 sd373 的耐药性相对较强, 这也正是那些产碱 产酶 产孢 高温生长能力较强的菌株 ( 表 3)

115 3758 中国农业科学 49 卷 表 1 新分离水稻内生固氮菌及其最大相似性模式种 Table 1 Isolated endophytic diazotrophs and their maximum similarity type strains 菌株编号 Strain number 分离部位 Isolate position 最大相似性模式种 Maximum similarity type strain (accession) 相似性 Similarity (%) sd010 根 Root Brevibacterium halotolerans DSM 8802 (T) (AM747812) sd020 叶 Leaf Bacillus idriensis SMC (T) (AY904033) sd032 根 Root Bacillus tequilensis KCTC (T) (AYTO ) sd037 根 Root Bacillus methylotrophicus CBMB205 (T) (EU194897) sd039 叶 Leaf Bacillus subtilis KCTC (T) (AMXN ) sd086 茎 Stem Bacillus aryabhattai B8W22 (T) (EF114313) 100 sd091 茎 Stem Bacillus aryabhattai B8W22 (T) (EF114313) 100 sd106 叶 Leaf Bacillus megaterium IAM (T) (D16273) sd194 根 Root Paenibacillus barcinonensis BP-23 (T) (AJ716019) sd232 茎 Stem Bacillus licheniformis ATCC (T) (AE017333) sd237 茎 Stem Paenibacillus lautus NRRL NRS-666 (T) (D78473) sd250 叶 Leaf Bacillus cereus ATCC (T) (AE016877) 100 sd300 叶 Leaf Bacillus indicus Sd/3 (T) (AJ583158) sd308 叶 Leaf Bacillus megaterium IAM (T) (D16273) sd352 根 Root Fictibacillus phosphorivorans Ca7T (T) (JX258924) 100 sd372 茎 Stem Bacillus tequilensis KCTC (T) (AYTO ) sd373 茎 Stem Bacillus tequilensis KCTC (T) (AYTO ) sd385 茎 Stem Bacillus aryabhattai B8W22 (T) (EF114313) 100 sd400 叶 Leaf Fictibacillus nanhaiensis JSM (T) (GU477780) sd032 sd372 sd373 9 Bacillus tequilensis 5 Bacillus licheniformis 8 Bacillus subtilis sd Brevibacterium halotolerans 7 Bacillus methylotrophicus sd037 sd039 sd232 3 Bacillus idriensis sd020 4 Bacillus indicus sd300 2 Bacillus cereus sd250 6 Bacillus megaterium sd106 sd308 sd385 sd091 1 Bacillus aryabhattai sd086 sd Fictibacillus phosphorivorans sd Paenibacillus barcinonensis sd Paenibacillus lautus sd237 图 1 新分离 19 株水稻内生固氮菌系统发育树 ( 与参比模式种比较 ) Fig. 1 Phylogenetic tree of 19 endophytic diazotrophs compared with reference type cultures

116 表 3 新分离菌株对抗生素 杀菌剂的耐性 Table 3 Tolerance of the isolated endophytic diazotrophs to antibiotics and fungicides 菌株编号 Strain number 氨苄青霉素 Ampicillin 噻孢霉素 Cefotaxime 氯霉素 Chloromycetin 硫酸卡那霉素 Kanamycin 硫酸新霉素 Neomycin 青霉素 G 钠盐 Penicillin G 硫酸链霉素 Streptomycin 盐酸四环素 Tetracycline 戊唑醇 Tebuconazole 敌克松 Dexon 甲霜灵 Metalaxyl 咯菌腈 Fludioxonil 恶霜灵 Oxadixyl 福美双 Thiram sulfate sulfate sodium sulfate hydrochloride sd sd sd sd sd sd sd sd sd sd sd sd sd sd n n n n n n sd sd sd sd 表示未形成菌落 No colony formation; + 表示初步形成菌落 Initial formation of colony; ++ 表示形成典型菌落 Typical formation of colony; +++ 表示形成旺盛生长菌落 Formation of actively growing colony; n 表示未测定 No test

117 19 期袁梅等 : 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 菌株对碳源的发酵利用选取了 4 菌株 sd037 sd106 sd194 sd372 为代表, 测定了新分离水稻内生固氮菌对 78 种碳源的发酵利用 整体来看菌株对碳源的利用种类不多 乳酸钠 蔗糖 葡萄糖 甘油 苹果酸 丙氨酸 葡萄糖醛酰胺是菌株利用较多的碳源, 其他碳源则较少被利用 ( 表 4) 2.7 菌株对水稻苗期生长及植株 Cd 含量的影响从根长来看, 菌株 sd385 显著促进根生长, 而菌株 sd039 sd237 sd372 则表现出对根生长的抑制作用 从株高来看, 接种分离菌株后稻苗普遍低于对照, 5 个处理达到统计显著水平 从植株鲜重来看, 接种分离菌株后稻苗生物量普遍高于对照处理,5 个处理 sd086 sd232 sd308 sd385 sd400 均显著高于对照, 说明接种水稻内生固氮菌可以显著提高稻苗生物量 ( 表 5) 菌株 sd385 使稻苗根系显著伸长, 生物量显著增加, 株高增加, 值得进一步研究 有 6 个菌株促进水稻苗期 Cd 吸收, 与对照相比植株 Cd 含量增加 6.41% 38.45% 其他 13 个菌株抑制水稻苗期 Cd 吸收, 与对照相比植株 Cd 含量减少 2.06% 34.46%( 表 5) 3 讨论 学术上较严格的植物内生菌 (endophytic bactcria) 概念是指从经过表面消毒的植物组织器官或植物体内分离提取出来的对植物本身有益无害的细菌 [17] 现在这个概念有了一些扩大, 通常认为植物内生菌泛指生活史或某个生命阶段生活在健康植物体内, 不引起宿主植物外在病症的细菌 真菌或放线菌 [18], 但不包括在植物体内定殖, 引起寄生植物病害的致病菌, 也不包括菌根真菌 [19] 水稻内生固氮菌是指从水稻体内分离 并且检测到固氮基因 (nifh) 或者检测到固氮酶活性的细菌 从文献资料来看, 目前关于水稻内生菌的研究报道较多 [1,20-23], 水稻内生菌固氮菌的研究报道相对少一些 关于内生固氮菌的研究大多集中在高效菌株分离鉴定与促生特性研究 [8,24-26], 分离到的菌株有 Acinetobacter oryzae Herbaspirillum seropedicae Paenibacillus Microbacterium Klebsiella Bacillus Azospirillum amazonense Burkholderia cepacia/vietnamiensis Rhizobium Pseudomonas 等 关于水稻内生固氮菌系统发育的研究报道是分离鉴定了 25 株水稻内生固氮菌, 这些菌株的系统发育地位分别属于芽孢杆菌 (Bacillus altitudinis/amyloliquefaciens/aryabhattai/safensis/ tequilensi) 伯克霍尔德氏菌(Burkholderia /cenocepacia/ cepacia/ubonensis) 肠杆菌(Enterobacter cowanii/ ludwigii) 黄杆菌(Flavobacterium oceanosedimentum) 草螺菌 (Herbaspirillum aquaticum) 克雷伯氏菌 (Klebsiella variicola) 类芽孢杆菌(Paenibacillus hunanensis) 泛菌(Pantoea ananatis) 根瘤菌 (Rhizobium massiliae), 共计 9 属 16 种 [15] 本文分离鉴定了 19 株水稻内生固氮菌, 在系统发育地位上分别属于芽孢杆菌 (Bacillus aryabhattai/cereus/idriensis/ indicus/licheniformis/megaterium/methylotrophicus/subtilis /tequilensis) 短杆菌(Brevibacterium halotolerans) Fictibacillus( F. phosphorivorans) 类芽孢杆菌 (Paenibacillus barcinonensis/lautus), 其中短杆菌 (Brevibacterium halotolerans) 和 Fictibacillus(F. phosphorivorans) 是未曾报道过的水稻内生固氮菌属种, 同时丰富了内生固氮菌的芽孢杆菌新类群 菌株的生物学特性, 特别是与环境适应性和微生物肥料生产应用相关的特性, 是菌株在自然界生存 在农业生产中发挥作用的基础 本文检测了分离菌株的产碱 产孢 高温生长 产蛋白酶 产纤维素酶等特性 菌株的产碱能力与菌株对土壤重金属 Cd 的钝化有关, 原理是菌株产碱引起土壤 ph 升高, 减少了 Cd 在土壤溶液中的溶解性, 从而减少植株对 Cd 的吸收, 本试验结果支持这一观点 对 19 个菌株产碱能力测定的结果显示, 其中 4 个菌株 sd010 sd039 sd232 sd373 的发酵液终 ph 为 , 它们对应的稻苗 Cd 含量增减百分比分别为 -8.59% % % %, 全部是减少稻苗 Cd 含量 菌株 sd106 sd194 sd237 发酵液终 ph 7.0, 没有显示出产碱性能, 对应的稻苗 Cd 含量增减百分比为分别为 % % % 考虑到土壤环境和实验室纯培养环境的巨大差异, 笔者认为这个试验结果还是显示了菌株的产碱能力与减少稻苗 Cd 含量存在相关性, 是一个值得深入研究的现象 芽孢 (spore) 是指某些细菌在一定的环境条件下, 在菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体, 是细菌的休眠方式, 称为内芽孢 (endospore), 简称芽孢 菌株的产孢能力强, 对不良环境的耐受能力也强 菌株的高温生长能力反映了菌株对较高温度的适应性, 这一性状对于微生物肥料的生产应用很重要, 比如菌剂的工厂化生产和堆肥发酵等就涉及到 50 甚至更高的温度 菌株产蛋白酶和纤维素酶的能力反映了菌株对

118 表 4 新分离菌株对碳源的发酵利用 Table 4 Utilization of carbon sources by the isolated endophytic diazotrophs 菌株编号 Strain number 阴性对照 Negative control 阳性对照 Positive control 糊精 Dextrin D- 麦芽糖 D-Maltose D- 海藻糖 D-Trehalos D- 纤维二糖 D-Cellobiose 龙胆二糖 Gentiobiose 蔗糖 Sucrose D- 松二糖 D-Turanose 水苏糖 Stachyose sd ± - - ± sd sd sd 菌株编号 Strain number 棉子糖 D-Raffinose α-d- 乳糖 α-d-lactose 蜜二糖 D-Melibiose β- 甲酰 -D- 葡糖苷 D- 水杨苷 D-Salicin N- 乙酰 -D- 葡糖胺 N-Acetyl-D- N- 乙酰 -β-d- 甘露糖胺 N- 乙酰 -D- 半乳糖胺 N-Acetyl-D- N- 乙酰神经氨酸 N-Acetyl 梭链孢酸 Fusidic acid β-methyl-dglucoside glucosamine N-Acetyl-β- D mannosamine galactosamine Neuraminic acid sd sd sd sd ± 菌株编号 Strain number α-d- 葡萄糖 α-d-glucose D- 甘露糖 D-Mannose D- 果糖 D-Fructose D- 半乳糖 D-Galactose 3- 甲酰葡糖 3-Methyl glucose D- 果糖 D-Fucose L- 果糖 L-Fucose L- 鼠李糖 L-Rhamnose 肌苷 Inosine 1% 乳酸钠 Sodium lactate sd ± sd sd sd 菌株编号 Strain number D- 丝氨酸 D-Serine D- 山梨醇 D-Sorbitol D- 甘露醇 D-Mannitol D- 阿拉伯醇 D-Arabito 肌醇 myo-inositol 甘油 Glycerol D- 葡糖 -6- 磷酸 D-Glucose-6-PO 4 D- 果糖 -6- 磷酸 D-Fructose-6-PO 4 D- 天冬氨酸 D-Aspartic acid D- 丝氨酸 D-Serine sd sd sd sd ± + - ± - -

119 续表 4 Continued Table 4 菌株编号 Strain number 明胶 Gelatin 氨基乙酰 -L- 脯氨酸 Glycyl-L-proline L- 丙氨酸 L-Alanine L- 精氨酸 L-Arginine L- 天冬氨酸 L-Aspartic acid L- 谷氨酸 L-Glutamic acid L- 组胺 L-Histidine L- 焦谷氨酸 L-Pyroglutamic acid L- 丝氨酸 L-Serine 萘啶酮酸 Nalidixic acid sd sd sd sd 菌株编号 果胶 D- 半乳糖醛酸 L- 半乳糖醛酸内酯 D- 葡萄糖酸 D- 葡萄糖醛酸 葡萄糖醛酰胺 黏液酸 奎宁酸 糖质酸 氨曲南 Strain number Pectin D-Galacturonic acid L-Galactonic acid lactone D-Gluconic acid D-Glucuronic acid Glucuronamide Mucic acid Quinic acid D-Saccharic acid Aztreonam sd sd106 ± sd sd ± ± 菌株编号 p- 羟基 - 苯乙酸 丙酮酸甲酯 D- 乳酸甲酯 L- 乳酸 柠檬酸 α- 酮 - 戊二酸 D- 苹果酸 L- 苹果酸 溴 - 丁二酸 Strain number p-hydroxy- Methyl pyruvate D-Lactic acid L-Lactic acid Citric acid α-keto-glutaricacid D-Malic acid L-Malic acid Bromo-succinicAcid phenylacetic acid methyl ester 丁酸钠 Sodium butyrate sd sd ± sd sd ± 菌株编号 吐温 40 γ- 氨基 - 丁酸 α- 羟基 - 丁酸 β- 羟基 -D,L 丁酸 α- 酮 - 丁酸 乙酰乙酸 丙酸 乙酸 甲酸 溴酸钠 Strain number Tween 40 γ-amino-butryric acid α-hydroxy-butyric acid β-hydroxy-d,l α-keto-butyricacid butyric acid Acetoacetic acid Propionic acid Acetic acid Formic acid Sodium bromate sd sd106 - ± sd194 ± sd 表示不利用 No utilization; + 表示利用 Utilization; ± 表示少量利用 Slightly utilization

120 3764 中国农业科学 49 卷 表 5 接种水稻内生固氮菌对水稻苗期生长及植株 Cd 吸收的影响 Table 5 Influences of diazotroph inoculation on rice seedling growth and Cd absorption 处理 Treatment 根长 Root length (cm) 株高 Plant height (cm) 鲜重 Fresh weight (g) 稻苗 Cd 含量 Seedling Cd (mg kg -1 ) Cd 增减 Cd increase (%) sd ± ± ± ± sd ± ±1.6* 0.51± ± sd ± ± ± ± sd ± ± ± ± sd ±0.8* 16.8±1.2* 0.31± ± sd ± ± ±0.08* 8.10± sd ± ±0.8* 0.47± ± sd ± ± ± ± sd ± ± ± ± sd ± ± ±0.11* 6.42± sd ±0.3* 21.4± ± ± sd ± ± ± ± sd ± ± ± ± sd ± ± ±0.10* 8.01± sd ± ± ± ± sd ±0.6* 21.1±0.7* 0.64± ± sd ± ±1.0* 0.49± ± sd ±1.0* 27.8± ±0.20* 8.80± sd ± ± ±0.15* 9.58± 空白对照 Negative control 7.9± ± ± ±0.39 * 表示统计学差异达到 0.05 显著水平 Significant differences at 5% level 蛋白质和纤维素类物质的分解代谢能力, 也是菌株生存竞争能力的重要指标 试验中也发现一个有趣的现象, 菌株 sd032 sd037 sd039 sd372 sd373 产生蛋白酶和纤维素酶的能力较强, 在 48 的生长能力也较强, 在产孢液体培养基上生长好, 在固体产孢培养基上产孢率高, 产碱能力也相对较强, 似乎显示出一种强者恒强的特性 病害是水稻生产中的一大问题, 多年来主要依靠抗病育种和农药防治 生物防治开辟了一条预防水稻病害的新途径 因此, 水稻病害的生物防治一直是水稻内生菌研究的热点之一 [27-30] 仔细分析就会发现, 水稻内生菌研究报道中的细菌有很多就是固氮菌, 只是研究者没有研究菌株的生物固氮特性, 或者说没有从水稻内生固氮菌的角度进行研究和分析讨论, 比如在 MANO 发表的一篇水稻内生细菌综述中所列举的很多细菌属种就是作者分离 鉴定过的固氮菌 [1,13,15,31] 事实上, 生物固氮特性只是固氮菌的基本特性, 很多固氮菌都有 提高植物抗病 抗逆等多种特性 [12,16,31], 这使得内生固氮菌研究更有意义 本文以 3 株病原真菌立枯丝核菌 ACCC36246 禾谷镰孢 ACCC36249 拟枝孢镰孢 ACCC37402 作为靶标, 测试分离到的 19 株水稻内生固氮菌的拮抗性能, 结果 3 株内生固氮菌对立枯丝核菌具有抗性,3 株内生固氮菌对禾谷镰孢菌具有抗性, 3 株内生固氮菌对拟枝孢镰孢菌具有抗性 说明在自然生长的水稻体内有大约 1/6 的内生固氮菌对真菌病害具有天然的抗性 同时, 这个结果也提示研究者, 这些抗病菌株具有很大的潜能, 如果把这些功能菌株做成菌剂接种水稻秧苗, 可能对预防水稻病害起到很好的作用 抗生素和杀菌剂有共同点, 也有不同点 共同点在于它们都是用于杀灭病原微生物, 不同点在于抗生素主要用于人 畜等动物, 杀菌剂主要用于农业种植 养殖如农田 养殖场 研究菌株对抗生素和杀菌剂耐性的意义也是不同的 菌株对抗生素的耐性越强, 菌

121 19 期袁梅等 : 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 3765 株就越是难以被控制, 传播耐药性的机率就越大, 环境风险也就越大 所以, 笔者在筛选功能菌株时希望菌株的耐药性小, 最好是抗生素敏感菌株, 这样在使用时环境风险小, 便于控制菌株传播 而对于杀菌剂的耐性则希望筛选到耐药性较强的菌株 原因是水稻种植过程中病害严重, 特别是在中国北方寒地水稻早春育秧过程中苗床发病率很高, 水稻生产离不开杀菌剂 目前能做的就是将化学杀菌剂与生物防治 ( 抗病功能菌剂 ) 措施配合使用, 逐渐减少化学杀菌剂的用量 要做到与化学杀菌剂配合使用, 就需要功能菌株具有较强的杀菌剂耐性 本文检测了 18 株新分离菌株对 8 种抗生素和 6 种杀菌剂的耐药性, 发现了一些对抗生素敏感, 对杀菌剂耐性强的菌株, 这对于基础数据积累和应用技术开发都有积极意义 细菌对不同碳源的发酵利用能力是菌株的基本特性, 具有种属特点, 因此 BIOLOG 测定常用于菌株鉴定 本文进行分离菌株的 BIOLOG 测定, 不仅是积累基础数据, 更多地希望了解菌株对多种碳源的发酵利用能力 因为这些数据作为基础研究, 有助于了解水稻内生固氮菌的碳源利用特点和菌株鉴定等 ; 作为应用研究, 有助于筛选功能菌株, 以及设计工厂化菌剂生产配方等 本文测定了菌株对多种碳源的发酵利用, 结果显示 4 个代表菌株对 78 种碳源的利用种类较少, 这也许正是水稻内生固氮菌的特异之处, 需要将来扩大菌株数量继续研究 将进入土壤的重金属元素剥离土壤非常困难, 科学工作者发明了物理 化学 生物 工程等多种方法来阻控土壤 Cd 污染 [32] 比较彻底的修复方法是植物修复法 [33], 通过种植 Cd 高积累植物把土壤中的 Cd 剥离出来 [34-35] 另一种研究较多的方法是原位修复法 [36], 通过大量施用生物炭等有机物料 [37], 或者海泡石 黏土等矿物类物料 [38], 改变土壤理化性状, 阻止 Cd 进入稻米 采用植物内生菌修复重金属污染土壤是近年来的一个新的研究热点 [39], 植物 - 微生物联合修复技术展示出良好的应用前景 [40-41] 耐 Cd 微球菌 Micrococcus sp. TISTR2221 显著促进玉米对 Cd 的吸收积累, 使试验土壤中 Cd 含量大大降低 [42] 田间试验表明, 接种罗尔斯顿菌 Ralstonia sp. TISTR 2219 和节杆菌 Arthrobacter sp. TISTR 2220 的丁香 (Ocimum gratissimum) 移栽 2 个月后体内 Cd 积累量与不接种对照相比增加了 20% 40% [43] 国内学者的大量研究工作也验证了微生物在植物 - 微生物联合修复土壤 Cd 污染中的巨大作用 [44-47] 本试验结果也显示出接种水稻内生固氮菌可以显著影响水稻苗期 Cd 吸收,19 株内生固氮菌中有 1/3 菌株促进水稻苗期 Cd 吸收,2/3 菌株抑制水稻苗期 Cd 吸收 4 结论 从湖南郴州桂阳农田水稻上分离到 19 株内生固氮菌, 菌株的系统发育地位属于 Bacillus Brevibacterium Fictibacillus Paenibacillus 4 属 13 种 部分菌株产蛋白酶 纤维素酶能力强,48 生长良好, 产孢率高 (60% 90%), 产碱 (ph ), 对立枯丝核菌 禾谷镰孢 拟枝孢镰孢具有拮抗性, 对抗生素相敏感, 对杀菌剂耐性强, 具有良好应用前景 试验的 19 株内生固氮菌中有 13 个菌株抑制水稻苗期 Cd 吸收, 与对照相比植株 Cd 含量减少 2.06% 34.46%, 提示采用微生物方法阻控稻田 Cd 污染是一个非常值得研究 探讨的途径 References [1] MANO H, MORISAKI H. Endophytic bacteria in the rice plant. Microbes and Environments, 2008, 23(2): [2] 李龚程, 张仕颖, 肖炜, 龙智勇, 张乃明. 水稻中内生菌研究进展. 中国农学通报, 2015, 31(12): LI G C, ZHANG S Y, XIAO W, LONG Z Y, ZHANG N M. Research progress on endophytes in rice. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(12): (in Chinese) [3] WANG M E, CHEN W P, PENG C. Risk assessment of Cd polluted paddy soils in the industrial and township areas in Hunan, Southern China. Chemosphere, 2016, 144: [4] LIU Y B, XIA T F, BAVEYE P C, ZHU J M, NING Z P, LI H J. Potential health risk in areas with high naturally-occurring cadmium background in southwestern China. Ecotoxicology Environmental Safety, 2015, 112: [5] 尹艺, 赵颖, 马莲菊, 卜宁. 碱蓬内生真菌对镉胁迫水稻幼苗生长及生理生化指标的影响. 贵州农业科学, 2014, 42(3): YI Y, ZHAO Y, MA L J, BU N. Effects of endophyte isolated from Suaeda salsa on growth and physiclogical and biological indexes of rice seedlings. Guizhou Agricultural Sciences, 2014, 42(3): (in Chinese) [6] BARRAQUIO W L, REVILLA L, LADHA J K. Isolation of endophytic diazotrophic bacteria from wetland rice. Plant and Soil, 1997, 194: [7] ZHANG G X, PENG G X, WANG E T, YAN H, YUAN Q H,

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125 3766 中国农业科学 49 卷 ZHANG W, LOU X, WU H, TAN Z Y. Diverse endophytic nitrogen-fixing bacteria isolated from wild rice Oryza rufipogon and description of Phytobacter diazotrophicus gen. nov. sp. nov. Archives of Microbiology, 2008, 189: [8] CHAUDHARY H J, PENG G X, HU M, HE Y M, YANG L J, LUO Y, TAN Z Y. Genetic diversity of endophytic diazotrophs of the wild rice, Oryza alta and identification of the new diazotroph, Acinetobacter oryzae sp. nov. Microbial Ecology, 2012, 63: [9] GOVINDARAJAN M, BALANDREAU J, KWON S W, WEON H Y, LAKSHMINARASIMHAN C. Effects of the inoculation of Burkholderia vietnamensis and related endophytic diazotrophic bacteria on grain yield of rice. Microbial Ecology, 2008, 55(1): [10] 李倍金, 罗明, 周俊, 孔德江, 张铁明. 几种禾草内生固氮菌的分离及固氮活性测定. 草业学报, 2008, 17(5): LI B J, LUO M, ZHOU J, KONG D J, ZHANG T M. Isolation of endophytic diazotrophic bacteria from several gramineae grasses and determination of their nitrogenase activity. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(5): (in Chinese) [11] 孙建光, 张燕春, 徐晶, 胡海燕. 高效固氮芽孢杆菌选育及其生物学特性研究. 中国农业科学, 2009, 42(6): SUN J G, ZHANG Y C, XU J, HU H Y. Isolation and biological characteristic investigation on efficient nitrogen-fixing bacilli. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(6): (in Chinese) [12] 秦宝军, 罗琼, 高淼, 胡海燕, 徐晶, 周义清, 孙建光. 小麦内生固氮菌及其 ACC 脱氨酶测定. 中国农业科学, 2012, 45(6): QIN B J, LUO Q, GAO M, HU H Y, XU J, ZHOU Y Q, SUN J G. Isolation of wheat endophytic diazotrophs and determination of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(6): (in Chinese) [13] 孙建光, 徐晶, 胡海燕, 张燕春, 刘君, 王文博, 孙燕华. 中国十三省市土壤中非共生固氮微生物菌种资源研究. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(6): SUN J G, XU J, HU H Y, ZHANG Y C, LIU J, WANG W B, SUN Y H. Collection and investigation on asymbiotic nitrogen-fixing microbial resources from 13 provinces over China. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2009, 15(6): (in Chinese) [14] GAO M, ZHOU J J, WANG E T, CHEN Q, XU J, SUN J G. Multiphasic characterization of a plant growth promoting bacterial strain, Burkholderia sp and its effect on tomato growth in the field. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 14(9): [15] 孙建光, 罗琼, 高淼, 胡海燕, 徐晶, 周义清. 小麦 水稻 玉米 白菜 芹菜内生固氮菌及其系统发育研究. 中国农业科学, 2012, 45(7): SUN J G, LUO Q, GAO M, HU H Y, XU J, ZHOU Y Q. Isolation and phylogeny of nitrogen-fixing endophytic bacteria in wheat, rice, maize, Chinese cabbage and celery. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(7): (in Chinese) [16] 陈倩, 高淼, 胡海燕, 徐晶, 周义清, 孙建光. 一株拮抗病原真菌的固氮菌 Paenibacillus sp. GD812. 中国农业科学, 2011, 44(16): CHEN Q, GAO M, HU H Y, XU J, ZHOU Y Q, SUN J G. A nitrogen-fixing bacterium Paenibacillus sp. GD812 antagonistic against plant pathogenic fungi. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(16): (in Chinese) [17] SAHARAN B S, NEHRA V. Plant growth promoting rhizobacteria: a critical review. Life Science and Medical Research, 2011, 2011: LSMR-21. [18] STONE J K, BACON C W, WHITE J F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes, 2000, 3: [19] KLOEPPE J W, RODRIGUEZ-KABANA R, ZEHNDER G W, MURPHY J F, SIKORA E, FERNÁNDEZ C. Plant rootbacterial interactions in biological control of soilborne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant Pathology, 1999, 28(1): [20] CHAUDHRY V, BAINDARA P, PAL V K, CHAWLA N, PATIL P B, KORPOLE S. Methylobacterium indicum sp. nov., a facultative methylotrophic bacterium isolated from rice seed. Systematic and Applied Microbiology, 2016, 39: [21] LIN L, WEI C, CHEN M, WANG H, LI Y, LI Y, YANG L, AN Q. Complete genome sequence of endophytic nitrogen-fixing Klebsiella variicola strain DX120E. Standards in Genomic Sciences, 2015, 10: 22. [22] CHUNG E J, HOSSAIN1 M T, KHAN1 AQ, KIM K H, JEON C O, CHUNG Y R. Bacillus oryzicola sp. nov., an endophytic bacterium isolated from the roots of rice with antimicrobial, plant growth promoting, and systemic resistance inducing activities in rice. Plant Pathology Journal, 2015, 31(2): [23] ZHANG X X, GAO J S, CAO Y H, SHEIRDIL R A, WANG X C, ZHANG L. Rhizobium oryzicola sp. nov., potential plantgrowthpromoting endophytic bacteria isolated from rice roots. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2015, 65: [24] 王秀呈, 曹艳花, 唐雪, 马晓彤, 高菊生, 张晓霞. 水稻内生固氮菌 Herbaspirillum seropedicae DX35 的筛选及其促生特性. 微生物

126 19 期袁梅等 : 水稻内生固氮菌分离鉴定 生物特性及其对稻苗镉吸收的影响 3767 学报, 2014, 54(3): WANG X C, CAO Y H, TANG X, MA X T, GAO J S, ZAHNG X X. Rice endogenous nitrogen fixing and growth promoting bacterium Herbaspirillum seropedicae DX35. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(3): (in Chinese) [25] JI S H, GURURANI M A, CHUNA S C. Isolation and characterization of plant growth promoting endophyticdiazotrophic bacteria from Korean rice cultivars. Microbiological Research, 2014, 169: [26] JHA B, THAKUR M C, GONTIA I, ALBRECHT V, STOFFELS M, SCHMID M, HARTMANN A. Isolation, partial identification and application of diazotrophic rhizobacteria from traditional Indian rice cultivars. European Journal of Soil Biology, 2009, 45: [27] GIMENEZ C, CABRERA R, REINA M, GONZÁLEZ-COLOMA A. Fungal endophytes and their role in plant protection. Current Organic Chemistry, 2007, 11(8): [28] SU Z Z, MAO L J, LI N, FENG X X, YUAN Z L, WANG L W, LIN F C, ZHANG C L. Evidence for biotrophic lifestyle and biocontrol potential of dark septate endophyte Harpophora oryzae to rice blast disease. PLoS ONE, 2013, 8(4): e [29] 杨海莲, 孙晓璐, 宋未. 植物根际促生细菌和内生细菌的诱导抗病性的研究进展. 植物病理学报, 2000, 30(2): YANG H L, SUN X L, SONG W. Current development on induced resistance by plant growth promoting and endophytic bacteria. Acta Phytopathologica Sinica, 2000, 30(2): (in Chinese) [30] 陈夕军, 胡长松, 童蕴慧, 纪兆林, 徐敬友. 水稻内生枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌和稻恶苗病菌的抑制作用. 中国生物防治, 2008, 24(4): CHEN X J, HU C S, TONG Y H, JI Z L, XU J Y. Inhibition of rice endophytic Bacillus subtilis on Magnaporthe grisea and Gibberella fujikuroi. Chinese Journal of Biological Control, 2008, 24(4): (in Chinese) [31] 孙建光, 胡海燕, 刘君, 陈倩, 高淼, 徐晶, 周义清. 农田环境中固氮菌的促生潜能与分布特点研究. 中国农业科学, 2012, 45(8): SUN J G, HU H Y, LIU J, CHEN Q, GAO M, XU J, ZHOU Y Q. Growth promotion potential and distribution features of nitrogenfixing bacteria in field environments. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(8): (in Chinese) [32] WANG W Z, XU W H, ZHOU K, XIONG Z T. Research progressing of present contamination of Cd in soil and restoration method. Wuhan University Journal of Natural Sciences, 2015, 20(5): [33] 苏慧, 魏树和, 周启星. 镉污染土壤的植物修复研究进展与展望. 世界科技研究与发展, 2013, 35(3): SUN H, WEI S H, ZHOU Q X. Advances in phytoremediation of cadmium contaminated soil. World Sci-Tec Research& Development, 2013, 35(3): (in Chinese) [34] 李廷强, 董增施, 姜宏, 李冰, 杨肖娥. 东南景天对镉 - 苯并 [a] 芘复合污染土壤的修复效果. 浙江大学学报 ( 农业与生命科学版 ), 2011, 37(4): LI T Q, DONG Z S, JIANG H, LI B, YANG X E. Remediation efficiency of Ca-B[a] P combined polluted soil by Sedum alfredii. Journal of Zhejiang University (Agricultural & Life Science), 2011, 37(4): (in Chinese) [35] 唐皓, 李廷轩, 张锡洲, 余海英, 陈光登. 水稻镉高积累材料不同生育期镉积累变化特征研究. 农业环境科学学报, 2015, 34(3): TANG H, LI T X, ZHANG X Z, YU H Y, CHEN G D. Cadmium accumulation in high cadmium-accumulating rice cultivars at different growth stages. Journal of Agro-Environment Science, 2015, 34(3): (in Chinese) [36] 韩君, 梁学峰, 徐应明, 徐愿坚, 雷勇, 蒋荣辉. 黏土矿物原位修复镉污染稻田及其对土壤氮磷和酶活性的影响. 环境科学学报, 2014, 34(11): HAN J, LIANG X F, XU Y M, XU Y J, LEI Y, JIANG R H. In-situ remediation of Cd-polluted paddy soil by clay minerals and their effects on nitrogen, phosphorus and enzymatic activities. Acta Scientiae Circumstantiae, 2014, 34(11): (in Chinese) [37] BIAN R J, CHEN D, LIU X Y, CUI L Q, LI L Q, PAN G X, XIE D, ZHENG J W, ZHANG X H, ZHENG J F, CHANG A. Biochar soil amendment as a solution to prevent Cd-tainted rice from China: Results from a cross-site field experiment. Ecological Engineering, 2013, 58: [38] 孙约兵, 徐应明, 史新, 王林, 梁学峰. 海泡石对镉污染红壤的钝化修复效应研究. 环境科学学报, 2012, 32(6): SUN Y B, XU Y M, SHI X, WANG L, LIANG X F. The effects of sepiolite on immobilization remediation of Cd contaminated red soil. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(6): (in Chinese) [39] RAJKUMAR M, AE N, FREITAS H. Endophytic bacteria and their potential to enhance heavy metal phytoextraction. Chemosphere, 2009, 77: [40] ULLAH A, SUN H, MUNIS M, FAHAD S, YANG X Y. Phytoremediation of heavy metals assisted by plant growth promoting (PGP) bacteria: A review. Environmental and Experimental Botany, 2015, 117: [41] ARYAL M, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES M. Bioremoval of

127 3768 中国农业科学 49 卷 heavy metals by bacterial biomass. Environmental Monitoring and Assessment, 2015, 187: [42] SANGTHONG C, SETKIT K, PRAPAGDEE B. Improvement of cadmium phytoremediation after soil inoculation with a cadmiumresistant Micrococcus sp. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(1): [43] PRAPAGDEE B, KHONSUE N. Bacterial-assisted cadmium phytoremediation by Ocimum gratissimum L. in polluted agricultural soil: A field trial experiment. International Journal of Environmental Sciences and Technology, 2015, 12: [44] 刘莉华, 刘淑杰, 陈福明, 杨小龙, 杨春平, 赵晶晶, 吴秉奇. 两株镉抗性奇异变形杆菌对龙葵修复镉污染土壤的强化作用. 环境工程学报, 2013, 7(10): LIU L H, LIU S J, CHEN F M, YANG X L, YANG C P, ZHAO J J, WU B Q. Efects of two cadmium-resistant strains of Proteus mirabilis on enhanced remediation efficiency of Solanum nigrum L. in serious cadmium polluted soil. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2013, 7(10): (in Chinese) [45] 江春玉, 盛下放, 何琳燕, 马海艳, 孙乐妮, 张艳峰. 一株铅镉抗性菌株 WS34 的生物学特性及其对植物修复铅镉污染土壤的强化 作用. 环境科学学报, 2008, 28(10): JIANG C Y, SHENG X F, HE L Y, MA H Y, SUN L N, ZHANG Y F. Isolation and characteristics of heavy metal-resistant strain WS34 and its effects on the phytoremediation of soils contaminated with lead and cadmium. Acta Scientiae Circumstaniae, 2008, 28(10): (in Chinese) [46] 胡振琪, 杨秀红, 高爱林, 危向峰. 镉污染土壤的菌根修复研究. 中国矿业大学学报, 2007, 36(2): HU Z Q, YANG X H, GAO A L, WEI X F. Remediation of mycorrhezae on Cd contaminated soil. Journal of China University of Mining & Technology, 2007, 36(2): (in Chinese) [47] 马文亭, 滕应, 凌婉婷, 李振高, 吴龙华, 骆永明. 里氏木霉 FS10-C 对伴矿景天吸取修复镉污染土壤的强化作用. 土壤, 2012, 44(6): MA W T, TENG Y, LING W T, LI Z G, WU L H, LUO Y M. Enhancing remediation of Sedum plumbizincicola in cadmium contaminated soils by Trichoderma reesei FS10-C. Soils, 2012, 44(6): (in Chinese) ( 责任编辑岳梅 ) 欢迎订阅 2017 年 中国草食动物科学 中国草食动物科学 是农业部主管 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所主办的国家级科技核心期刊, 由 中国草食动物 于 2012 年 4 月更名而成, 前身为 中国养羊 草与畜杂志 该刊 2011 年被 美国化学文摘 (CA) 收录, 曾荣获第四届全国优秀农业学术期刊二等奖 第四届全国畜牧兽医优秀期刊二等奖, 先后被评为全国中文核心期刊 中国农业核心期刊 中国科技核心期刊和 RCCSE 中国核心学术期刊 中国草食动物科学 为中国科学引文数据库 (CSCD) 中国科技论文与引文数据库 中国学术期刊综合评价数据库 (CAJCED) 和中国生物学文献数据库等的统计源期刊 ; 是 中国核心期刊 ( 遴选 ) 数据库 万方数据 - 数字化期刊群 中国期刊全文数据库 (CJFD) 中国生物学文摘 中国生物学文献数据库 台湾 CEPS 中文电子期刊 中国科技论文在线来源期刊和收录期刊 中国草食动物科学 主要刊登包括牛 羊 马 骆驼 鹿 兔 鸭 鹅 驼鸟 鱼等在内的各种节粮型草食动物的最新科研成果和科技成就 主要栏目包括 : 遗传育种, 繁殖与生理, 营养与饲料, 草地与牧草, 疾病防控, 专论与综述 主要读者和服务对象是从事动物养殖和饲草料科研 教学 生产 经营和管理的各级科研 教学 生产人员及广大养殖专业户等 中国草食动物科学 为双月刊, 大 16 开,80 页码, 彩色封面, 每期定价 8.00 元, 全年 元, 逢双月 1 日出版 国内统一连续出版号 :CN /Q, 国际标准连续出版号 :ISSN , 邮发代号 :54-57, 国外代号 :RM5133 全国邮局和本刊编辑部均可订阅 地址 : 甘肃省兰州市七里区硷沟沿 335 号, 邮政编码 : 电话 :(0931) ; xumuchj@163.com; 联系人 : 肖玉萍

128 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 朱开伟 1 1,2 1 1, 刘贞, 贺良萍, 林金钗 ( 1 重庆理工大学低碳能源中心, 中国重庆 ; 2 劳伦斯伯克利国家实验室, 美国加州 94530) 摘要 : 目的 如何在保护生态环境和考虑秸秆资源开发成本的基础上, 实现秸秆资源的合理开发, 对中国农业生物质能发展规划有着重要的意义 因此, 从保护生态环境和开发成本角度, 对可新型能源化利用秸秆资源的生态经济总量进行评估, 为生物质能产业布局 优先发展区域 优先发展技术以及政策制定提供参考 方法 采用文献调研法对研究秸秆还田量与水土流失 土壤有机质和农作物单产关系的文献进行梳理, 在此基础上提出土壤生态保留量的概念, 并归纳出不同农作物的基础土壤生态保留量 ; 根据基准年农作物单产 种植结构和草谷比系数, 考虑土壤生态保留量和秸秆用途, 对区域秸秆生态总量和资源密度进行计算 ; 对政府政策和相关项目成本进行分析, 设计发展情景和项目成本参数, 并以项目投资回报率为变量, 计算不同回报率下项目的经济收集半径 ; 根据秸秆资源密度和经济收集半径, 计算项目的经济收集量, 并与项目理论需求量进行比较, 整理出不同项目可用秸秆生态经济总量 结果 中国主要农作物可新型能源化利用秸秆生态总量约 万 t, 主要分布在广西 四川 山东和河南, 主要由薯类 甘蔗和油菜秸秆构成 当投资回报率 (ROI) 为 0 时, 现有技术水平和政策下,6 MW 25 MW 直燃发电项目,12 MW 气化发电项目, 年产 t 和 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为 和 t 当 ROI 为 5% 时,6 MW 25 MW 直燃发电项目,12 MW 气化发电项目, 年产 t 和 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为 和 t 当 ROI 为 10% 时,6 MW 25 MW 直燃发电项目,12 MW 气化发电项目, 年产 t 和 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为 和 t 在现有技术水平和政策下, 不同 ROI 下纤维素乙醇项目的可用秸秆生态经济总量均为 0 结论 (1) 现有政策对发电类项目有显著的激励作用, 可适当降低对年产 t 燃料成型项目的补贴力度, 提高发电类项目的补贴力度 ;(2) 在生物质能产业布局方面, 现阶段可优先发展年产 t 秸秆燃料成型项目, 可优先在广西 湖北 广东 安徽 河南等地规划建设 12 MW 秸秆气化发电项目, 其次可考虑在广西 湖北 广东和安徽规划建设 25 MW 秸秆直燃发电项目, 最后可考虑在广西规划建设 6 MW 秸秆直燃发电项目 关键词 : 土壤生态保留量 ; 秸秆生态经济总量 ; 经济收集半径 ; 生物质能 Eco-Economic Potential Analysis of Chinese Main Crops Bio-Energy Utilization Straw Resources ZHU Kai-wei 1, LIU Zhen 1,2, HE Liang-ping 1, LIN Jin-chai 1 ( 1 Low-Carbon Energy Research, Chongqing University of Technology, Chongqing , China; 2 Lawrence Berkeley National Laboratory, California 94530, USA) Abstract: Objective Realizing the reasonable development of straw resource on the basis of protecting environment has 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 重庆市研究生科研创新项目 (CYS16223) 联系方式 : 朱开伟,Tel: ; kaiwei_zhu@foxmail.com 通信作者刘贞,Tel: ; zhenliu@tsinghua.edu.cn

129 3770 中国农业科学 49 卷 important significance to Chinese agricultural bio-energy development planning. And effective development of straw resource is also closely related with cost. Thus, from the perspective of protecting environment and cost, this study analyzed the eco-economic potential of main crops energy utilization straw resource in different regions, which can provide reference for the layout of agricultural bio-energy industry, prior suitable regions for straw energy utilization project, prior developing technology and government policy formulation. Method Based on the research for the studies on the relationship between straw returning amount and soil erosion, soil organic matter, and the crop yield, the concept of soil ecological reserve amount was put forward and the specific returning amount of different crop straws were concluded. Combining the crop yield, planting structure, and grass grain ratio in benchmark year with the soil ecological reserve amount and other straw usages, the total ecological energy utilization straw resource and straw resource density were calculated by regions. Analyzing the policies and costs of different straw energy utilization projects, four developing scenarios and project costs were designed, and the economic collecting radius in different ratio of return on investment (ROI) was calculated by regions. According to the density and economic collecting radius, straw economic collecting amount was calculated, and then comparing the economic collecting amount with the project s theory straw demand, to conclude the eco-economic straw collecting amount and space distribution of different projects. Result The straws can be used for bio-energy are million ton, mainly distributed in Guangxi, Sichuan, Shandong and Henan, and the main straws are those of potato, sugar and rapeseed straws. When ROI is 0, the available straw for 6 MW SDFPG, 25 MW SDFPG, 12 MW SGPG, BMF t a -1 and BMF t a -1, respectively, is 86.85, 86.55, 86.85, 33.15, million ton at the current level technology and incentive policy. When ROI is 5%, the available straw for 6 MW SDFPG, 25 MW SDFPG, 12 MW SGPG, BMF t a -1 and BMF t a -1, respectively, is 79.43, 83.47, 83.47, 2.60, and million ton. When ROI is 10%, the available straw for 6 MW SDFPG, 25 MW SDFPG, 12 MW SGPG, BMF t a -1 and BMF t a -1, respectively, is 18.53, 70.23, 70.68, 0, and million ton. At current level technology and incentive policy, under different scenarios, the available straws for CE projects are always 0 in different ROI. Conclusion The existing policies have obvious incentives for power projects, the incentives for BMF t a -1 should be appropriately reduced, and the incentives for power projects should be increased. In straw energy industry layout, at present, as for the BMF t a -1, first priority should be given, then first priority should be given to Guangxi, Hubei, Guangdong, Anhui, and Hainan to build 12 MW SGPS, and then construction of 25 MW SDFPG should be considered in Guangxi, Hubei, Guangdong and Anhui, and finally, construction of 6 MW SDFPG in Guangxi should be considered. Now the cost of CE project is so high that it does not necessarily produce economic benefits in every region. Key words: soil ecological reserve amount; eco-economic straw resource amount; economic collecting radius; biomass energy 0 引言 研究意义 与林业木质剩余物 禽畜粪便等生物质相比, 农作物秸秆在时空间上分布相对集中, 具有易收集 成本低等特点, 已成为发展生物质能源的重要原料之一 同时, 秸秆还田具有防止水土流失 维护土壤功能的作用 [1], 能减小化肥需求及其带来的环境污染 中国作为农业大国, 秸秆资源丰富 因此, 农作物秸秆具有非常可观的能源效益和环境效益 秸秆新型能源化利用不仅与秸秆资源量有关, 还与区域和开发成本相关 因此, 从保护生态环境和开发成本角度, 对不同区域不同秸秆能源化项目可用秸秆的生态经济总量进行评估, 对保护农业生态环境以及秸秆新型能源化产业布局 优先发展区域 优先发展技术和政策制定都有着重要的意义 前人研究进展 目前, 秸秆资源的评估可分为 3 类 第一类主要研究秸 [2] 秆资源理论总量,LIU 等考虑农作物产量和土地变 更等因素, 对加拿大秸秆资源潜力进行了评估, 认为其潜力约为 [3] t;roberts 等考虑农作物种类 种植面积和单产, 测算出培列敦地区年秸秆资源量约为 [4] t;haase 等考虑农作物播种面积和草谷比系数, 通过 GIS 系统对欧洲农业可利用秸秆资源总量进行了评估 ; 第二类是考虑秸秆还田 收集率和用途, 对可能源化秸秆资源潜力进行评估, 但在计算秸秆还田量时采用还田比进行计算 田宜水 [5] 等考虑不同农作物的燃料 肥料 饲料及工业用途, 得出中国可能源化利用秸秆资源量约 t; [6] CHANDRA 等考虑农作物产量 秸秆收集率以及用途, 采用能流图的方法测算出斐济农业生物质能 [7] 潜力约为 PJ; 朱开伟等考虑秸秆农业 工业 燃烧等用途, 采用情景分析法测算出中国主要农作物可新型能源化秸秆资源为 t 标煤 第三类是研究开发成本 加工技术等因素对秸秆资源经济总量的影响 由于具体技术和评价内

130 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 3771 容不同, 经济总量的评价结果差异较大 如 : [8] STEPHEN 等采用 IBSAL 模型, 考虑交易成本和运输成本, 计算出亚伯达平河地区农作物剩余可采集量介于 [9] t;hoogwijk 等对不同区域生产力水平和劳动力投入成本进行设计, 发现当生产成本低于 2 $/GJ 时, 全球荒地和可复耕耕地每年 [10] 可提供 EJ 生物质能 ;SUN 等考虑单位采购成本 运输成本和收集成本, 采用蒙特卡罗模拟法对农作物剩余收集率进行研究, 发现价格联盟有利于提高农作物剩余使用率 本研究切入点 (1) 提出土壤生态保留量的概念, 并通过对相关研究的梳理确定不同农作物的基础还田量 ;(2) 从项目层面构建成本曲线, 考虑技术进步和激励政策的影响, 计算不同情景下不同区域 不同项目可用秸秆的生态经济总量 拟解决的关键问题 考虑秸秆还田量对水土流失 土壤有机质和农作物长期产量的影响, 对不同农作秸秆的基础还田量进行设计 ; 对现有相关政策和文献进行梳理, 设计合理的发展情景 ; 以项目投资收益率为变量做灵敏度分析, 寻找优先发展项目和优先发展区域 1 材料与方法 1.1 可新型能源化秸秆资源生态经济总量评价模型 可新型能源化秸秆资源密度可新型能源化秸秆资源密度是指可用于发展生物质能源的秸秆资源生态总量与播种面积的比值, 则不同区域可新型能源化秸秆的生态潜力可表示为 : [ π ( α β δ ) ] n Q = s p 1 s r (1) i i, j i, j j j j j i, j i, j j = 1 式中,Q i 为区域 i 可新型能源化秸秆生态总量 ;S i,j p i,j 和 r i,j 分别为第 i 区域第 j 种农作物的播种面积 单产和土壤生态还田量 ;π j α j β j 和 δ j 分别为第 j 种农作物的草谷比系数 工业用比 饲料用比和燃烧用比 ; n 为农作物种类 则区域 i 可新型能源化秸秆资源密度 ρ i 可表示为 : ρ = Q = s n [ s p π,, ( 1 α β δ i j i j j j j j) s r i, j i, j] i j= 1 i n n i, j i, j j= 1 j= 1 s (2) 最大经济收集半径设项目收益主要来自能源化产品销售和政府补贴, 且产品均能售完 ; 项目主 要成本包括建设成本 工人工资 加工成本 秸秆原料成本 秸秆运输成本和维修成本 依据相关政策 [11], 暂不考虑税收, 则项目周期内的总收益和总成本分别如公式 (3) 和 (4) 所示 : ( ) ( ) R = p q + G P/A, d, Lm (3) C m m m m H L + c q + C = c S + + C5, im, + cm Sm ωm im, m m m m m m 4, im, ( P/A, dl, ) m (4) 式中,R m p m q m G m c m H m c m S m L m 和 ω m 分别为第 m 种项目的总收入 产品单价 年产量 年政府补贴 单位建造成本 年工人工资 单位加工成本 项目规模 项目周期和年维修系数 ;C i,m C 4,i,m 和 C 5,i,m 分别为区域 i 第 m 种项目总成本 秸秆原料成本和运输成本 ;(P/A,d,L m ) 为年金现值系数 ; d 为贴现率 秸秆原料成本主要为秸秆田间售价 收集成本和其他成本 收集成本方面, 每吨秸秆收 存 运所需人数按 2 人测算, 每天处理 7 t 秸秆, 工资按各省农村劳动力成本进行计算 ; 其他成本按总成本的 17% 计算, 包括合理利润 场地租赁费和打捆机损耗费 [12] 则区域 i 吨秸秆原料成本和总成本分别为 : 2c n 0 p μ + i, j i, j n j= = = i, m μ + i, j i, j i(5) j= c p c C = c q = p + c q 4, im, (6) 式中, c i *,m n 0 im, m μ i, j i, j i m 83 j= 为第 i 区域第 m 种项目单位秸秆原料成本 ; p * i, j 为第 i 区域第 j 种农作物秸秆田间收购价格 ;μ i,j 为第 i 区域第 j 种农作物秸秆占区域 i 可新型能源化秸秆总量比 ; c 0 i 为区域 i 农民日薪 由于农村实际 公路较曲折, 故引入曲折因子为 : 2 [13], 则运输费用 2 2 C L R c drd r L (7) 2π r m = 5, im, 2 3 m 2ρ θ = πρ i i mc m 式中,r m 为第 m 种项目的秸秆收集半径 ;c * 为单位秸秆运输成本 则在满足一定年收益率 I 的基础上, 区域 i 第 m 种项目的最大经济收集半径 R i,m 可表示为 :

131 3772 中国农业科学 49 卷 R im, = 3 m m m m m ( 1 ) p q + G c S + I * ( ) 3 H L + c q + C + C P/A, dl, m m m m 4, i, m 5, m m + c S ω m m m 2 2 π ρ c i L m (8) 项目理论秸秆需求为保障项目正常运转, 项目安全库存按理论总量的 5% 计算 对于秸秆发电类项目而言, 其秸秆理论需求量可表示为 : T me, = S me, me, ( ) t η η μ h n 2 i, j j = 1 6 j (9) 式中,T m,e S m,e 和 t m,e 分别表示当第 m 种项目为发电类项目时秸秆理论需求量 项目规模 年发电时间 ;η 1 和 η 2 分别为秸秆发热量占比和发电效率 ;h j 为第 j 种农作物秸秆的单位热值 ; 为千瓦时与焦耳的转换系数 非发电类项目秸秆理论需求量如下所示 : S m, α Tm, α = (10) η3 ( ) 式中,T m,a 和 S m,a 分别表示当第 m 种项目为非发电类项目时的秸秆理论需求量和项目规模 ;η 3 表示非发电类项目转化效率 可新型能源化秸秆资源生态经济总量区域 i 第 m 种项目的经济秸秆收集量 A i,m 为 πr 2 i,m, 项目理论秸秆需求量为 T m 若 T m >A i,m, 则表示第 i 区域不适合第 m 种项目, 反之则经济可行 因此, 可新型能源化秸秆生态经济总量可以表示为 : ( ) 31 Q = Q f A i im, i = 1 (11) 式中,Q 表示可新型能源化秸秆经济生态总量 ;31 表示大陆区域省 ( 市 自治区 ) 数量 f(a i,m ) 为 0-1 函数, 具体为 f ( A ) im, = 1 0 A A im, im, T m < T 1.2 情景及参数设计 土壤生态保留量 草谷比及秸秆用途设计秸秆还田对生态环境保护起着积极的作用 [14-16] 但保留过多又会引发病虫害等 ; 反之, 又不能有效防止水土流失, 维护土壤生态功能 因此, 土壤生态保留量是指在一定农业耕种环境下, 能够有效防止水土流失, 增强和维护土壤功能的秸秆基础还田量 在保留量取值设计方面, 首先从防止水土流失 维护土壤有机质和作物长期产量的角度, 对相关文献进行检索, 并总结出研究结论 ; 然后, 按作物种类对上述文献进行分类, 并计算各农作物所对应研究结论的均值, 将其视为土壤生态保留量 本文主要选取稻谷 小麦 玉米 大豆 薯类 棉花 花生 油菜和甘蔗作为研究对象 ; 由于薯类 花生和甘蔗的相关研究较少, 则取其他农作物秸秆保留量的均值 不同研究给出的草谷比不尽相同, 为确保草谷比设计的合理性, 综合文献 [17-18] 对草谷比进行设计 由于难以获取各区域各主要农作物秸秆的用途比, 因此采用全国性数据进行计算, 主要参考文献 [19-21] 进行设计 不同农作物的土壤生态保留量 草谷比和秸秆用途设计具体如表 1 所示 m 表 1 主要农作物秸秆土壤生态保留量 草谷比和用途设计 Table 1 Design of soil ecological reserve amount, grass valley then and straw usage 稻谷 Paddy 小麦 Wheat 玉米 Corn 大豆 Soybean 薯类 Potato 棉花 Cotton 花生 Peanut 油菜 Rape 甘蔗 Sugar 土壤生态保留量 3.97 [22-23] 3.24 [24-25] 4.44 [26-29] 3.45 [30-31] [32] [33-34] 3.57 Soil ecological reserve amount (t hm -2 ) 草谷比 Grass grain ratio 工业用比 Industrial using ratio 饲料用比 Fodder using ratio 燃烧用比 Energy using ratio

132 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 项目参数设计秸秆新型能源化利用项目主要有秸秆直燃发电 气化发电 混燃发电 秸秆燃料成型和纤维素乙醇项目 常见秸秆直燃发电装机容量有 6 WM 和 25 MW, 而秸秆气化发电一般为 12 MW 以下 [35-36] ; 混燃发电项目主要为秸秆与煤或与生活垃圾混燃发电, 考虑到现有火力发电厂的选址, 以及燃料成本难以核算, 故不考虑混燃项目 对于秸秆燃料成型, 国内企业生产能力较低, 平均生产能力约 t a -1[37] 纤维素乙醇方面, 国内尚处于产业化前期研究阶段 在上述基础上, 采用文献调研的方法对不同类型秸秆新型能源化利用项目进行归纳设计, 具体如表 2 所示 发展情景设计从技术进步和政策激励角度共设计了 4 种情景, 分别为情景 I( 现有技术水平, 无政策激励 ) 情景 II( 现有技术水平, 政策激励 ) 情景 III( 技术进步, 无政策激励 ) 和情景 IV( 技术进步, 政策激励 ) 无政策激励是指政府不对企业进行除税收外的激励 ; 政策激励情景中, 主要参照 关于完善农林生物质能发电价格政策的通知 (2010) 可再生能源发电价格和费用分摊管理试行办法 (2006) 和 秸秆能源化利用补助资金管理暂行办法 (2008), 对政策激励情景进行设计 现有技术水平主要是依据当前国内秸秆新型能源化项目的转换效率进行设计, 而技术进步情景则主要是参照国外同类型项目进行设计 此外, 由于秸秆燃料成型转化效率高, 从转化效率角度进行设计不能体现技术进步的影响, 因此从成本角度进行设计 则不同情景下, 秸秆新型能源化项目的补贴强度和技术进步情景如表 3 所示 秸秆原料成本设计各区域生物质发电上网电价见表 4 稻谷 小麦 玉米和棉花秸秆的田间收购价分别约 yuan/t [43], 而其他农作物秸秆的相关资料较少 因此, 以稻谷 小麦 玉米 棉花秸秆单价与其折标系数比值的均值为基准, 分别乘以豆类 薯类 花生 油菜和甘蔗秸秆的折标煤系数进行定价 ; 若稻谷 小麦 玉米 豆类 薯类 棉花 花生 油菜和甘蔗秸秆折标系数分别取 和 0.8, 则豆类 薯类秸秆单价分别为 yuan/t, 花生 油菜和甘蔗秸秆单价均为 200 yuan/t; 农民日工资从中国农村统计年鉴获取, 根据公式 (5), 则各省 ( 市 ) 单位秸秆资源成本如表 5 所示 表 2 秸秆能源化项目设计 Table 2 Design of straw energy utilization project 项目类型 Project type 秸秆直燃发电 SDFPG 规格 Scale 前期投资 Upfront investment 维修系数 Maintenance Coefficient 工人工资 Wage 加工成本 Processing cost 6 MW 9500 yuan/kw yuan/a 4 yuan/t 25 MW yuan/a 4 yuan/t 项目周期 Project cycle 发电时间 Power generation time 参考文献 Reference 15 a 6700 h a -1 [38-39] 秸秆气化发电 SGPG 12 MW 9000 yuan/kw yuan/a 4 yuan/t 15 a 6700 h a -1 [40] 纤维素乙醇 t a yuan/t yuan/a 3600 yuan/t 20 a / [41] CE t a yuan/a / 秸秆固体成型 5000 t a yuan/t yuan/a yuan/a 10 a / [42] BMF t a yuan/a yuan/a / 秸秆直燃发电简写为 SDFPG, 秸秆气化发电简写为 SGPG, 纤维素乙醇简写为 CE, 秸秆固体成型简写为 BMF 下同 SDFPG is short for straw direct firing power generation. SGPG is short for straw gasification power generation; CE is short for cellulosic ethanol; BMF is short for biomass modeling fuel. The same as below 表 3 政策激励强度和技术进步情景设计 Table 3 Design of policy incentive intensity and technology progress 项目类型 Project type 无政策激励 No policy incentive 政策激励 Policy incentive 现有技术水平 Now technology level 技术进步 Technology progress 秸秆直燃发电 SDFPG 见表 yuan/(kw h) 20% 30% 秸秆气化发电 SGPG See table 4 20% 30% t a -1 秸秆燃料成型 BMF t a yuan/t 0 10% t a -1 秸秆燃料成型 BMF t a yuan/t 0 10% 纤维素乙醇 CE yuan/t 15% 20%

133 3774 中国农业科学 49 卷 [12] 表 4 各区域生物质发电上网电价 Table 4 Feed-in tariff of biomass power generation in different provinces (yuan/(kw h)) [12] 地区 Region 电价 Price 地区 Region 电价 Price 地区 Region 电价 Price 北京 Beijing 上海 Shanghai 江西 Jiangxi 天津 Tianjin 江苏 Jiangsu 山东 Shandong 河北 Hebei 浙江 Zhejiang 河南 Henan 山西 Shanxi 陕西 Shaanxi 宁夏 Ningxia 辽宁 Liaoning 湖北 Hubei 新疆 Xinjiang 吉林 Jilin 湖南 Hunan 福建 Fujian 黑龙江 Heilongjiang 广西 Guangxi 青海 Qinghai 海南 Hainan 重庆 Chongqing 安徽 Anhui 四川 Sichuan 贵州 Guizhou 甘肃 Gansu 云南 Yunnan 西藏 Xizang 广东 Guangdong 内蒙古 Inner Mongolia 表 5 各省 ( 市 ) 单位秸秆资源成本 Table 5 The straw price in different provinces (yuan/t) 地区 Region 成本 Price 地区 Region 成本 Price 地区 Region 成本 Price 北京 Beijing 206 上海 Shanghai 240 江西 Jiangxi 228 天津 Tianjin 219 江苏 Jiangsu 234 山东 Shandong 167 河北 Hebei 174 浙江 Zhejiang 225 河南 Henan 203 山西 Shanxi 141 陕西 Shaanxi 192 宁夏 Ningxia 176 辽宁 Liaoning 184 湖北 Hubei 221 新疆 Xinjiang 137 吉林 Jilin 190 湖南 Hunan 211 福建 Fujian 186 黑龙江 Heilongjiang 173 广西 Guangxi 265 青海 Qinghai 157 海南 Hainan 237 重庆 Chongqing 164 安徽 Anhui 235 四川 Sichuan 180 贵州 Guizhou 162 甘肃 Gansu 172 云南 Yunnan 225 西藏 Xizang 203 广东 Guangdong 238 内蒙古 Inner Mongolia 结果 2.1 秸秆资源密度及构成以 2012 年为基准年, 考虑秸秆生态保留下可新型能源化秸秆总量约为 t, 主要集中在广西 四川 山东和河南, 分别约占总量的 13.80% 8.83% 8.10% 和 7.30% 其主要由薯类 甘蔗和油菜秸秆构成, 分别约占总量的 45.70% 20.68% 和 15.06% 全国平均可新型能源化秸秆资源密度约 t km -2, 其中广西最高, 约 t km -2 ; 海南 广东 重庆 福建 甘肃 青海和四川秸秆资源密度介于 t km -2, 其余省份均小于 100 t km -2 不同区域可新型能源化秸秆资源密度及构成如图 1 所示 2.2 项目理论秸秆需求整体来看, 现有技术水平下 6 MW 和 25 MW 直燃发电项目平均秸秆理论需求量分别约 和 t,12 MW 气化发电项目约 t; 年产 t 和 t 的纤维素乙醇项目分别约需 和 t 秸秆 ; 年产 t 和 t 的燃料成型项目分别约需 和 t 秸秆 技术进步情景下,6 MW 和 25 MW 秸秆直燃发电项目平均理论需求量分别约 和 t,12 MW 气化发电项目约 t; 年产 t 和 t 的纤维素乙醇项目分别需约 和 t 现有技术水平和技术进步下, 不同项目的秸秆理论需求量分别如图 2-a 和 2-b 所示

134 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 3775 秸秆资源构成 Straw resource structure 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 稻谷 Paddy 小麦 Wheat 玉米 Corn 豆类 Soybean 薯类 Potato 花生 Peanut 油菜 Rapeseed 棉花 Cotton 甘蔗 Sugar 资源密度 Resource Density 北京 Beijing 天津 Tianjin 河北 Hebei 山西 Shanxi 内蒙古 Inner Mongolia 辽宁 Liaoning 吉林 Jilin 黑龙江 Heilongjiang 上海 Shanghai 江苏 Jiangsu 浙江 Zhejiang 安徽 Anhui 福建 Fujian 江西 Jiangxi 山东 Shandong 河南 Henan 湖北 Hubei 湖南 Hunan 广东 Guangdong 广西 Guangxi 海南 Hainan 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 贵州 Guizhou 云南 Yunnan 西藏 Xizang 陕西 Shaanxi 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 宁夏 Ningxia 新疆 Xinjiang 秸秆资源密度 Straw resource density (t km -2 ) 图 1 各省 ( 市 ) 秸秆资源密度及构成 Fig. 1 The straw resource density and components in different provinces a 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 纤维素乙醇 t CE t 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 BMF 10000t 纤维素乙醇 50000t CE 50000t b 图 2 不同情景下不同秸秆能源化项目秸秆理论需求量 Fig. 2 Theoretical straw demand of different projects in different scenarios

135 3776 中国农业科学 49 卷 2.3 最大经济收集半径 投资回报率为 0 若贴现率取 0.1, 单位运价取 1.5 yuan/(t km), 发电类项目厂内用电率取 0.11 [39], 成型燃料单价取 700 yuan/(t km), 燃料乙醇单价取 yuan/(t km) 4 种情景中纤维素乙醇项目的总运营成本均大于总收益, 故其最大经济收集半径均为 0 情景 I 中, 除北京 天津 辽宁 西藏 甘肃 青海和宁夏最大经济收集半径为 0 外, 绝大部分地区 25 MW 直燃发电项目的收集半径介于 km, 而 6 MW 直燃发电项目仅江苏 浙江 安徽 安徽 江西 山东 河南 湖北 湖南 广东 广西 海南和新疆具有经济性 ;12 MW 气化发电项目的最大经济收集半径主要介于 km; 年产 t 和 t 燃料成型项目平均最大经济收集半径分别约 4.01 和 km 情景 II 中年产 t 秸秆燃料成型项目的收集半径不变, 其余项目收集半径有所增加 其中 6 MW 和 25 MW 秸秆直燃发电项目平均经济收集半径分别约 和 km,12 MW 气化发电和年产 t 燃料成型项目的平均经济收集半径分别约为 和 km 在情景 III 和 IV 中, 年产 t 的秸秆燃料成型项目经济收集半径有着显著的变化, 其余项目的经济收集半径均有所提高 除纤维素乙醇项目外, 其余项目在不同地区不同情景下的最大经济收集半径分别如图 3 所示 投资回报率为 5% 4 种情景中纤维素乙醇项目的最大经济收集半径仍为 0 情景 I 中,6 MW 直燃发电项目仅在广东具有 6.48 km 的经济收集半径, 其余省份均为 0; 而 25 MW 直燃发电项目仅在江苏 浙江 安徽 江西 山东 河南 湖北 湖南 广东 广西 海南和新疆具有经济性, 平均最大经济收集半径约 km;12 MW 秸秆气化发电项目则仅在浙江 安徽 江西 湖北 湖南 广东 广西和海南具有经济性, 平均经济收集半径约 km; 年产 t 燃料成型项目仅在山西 青海和新疆具有经济性, 而年产 t 燃料成型项目的平均经济收集半径约 km 情景 II 中各区域年产 t 燃料成型项目的最大经济收集半径与情景 I 相同 ;25 MW 直燃发电项目 12 MW 气化发电项目和年产 t 燃料成型项目在所有省市都具有经济性, 平均经济收集半径分别为 和 km; 而 6 MW 直燃发电项目仅在北京 天津不具有经济性, 其平均收集半径约 km 情景 III 中,25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目的经济适应区相同,6 MW 直燃发电项目 年产 t 和 t 燃料成型项目的经济收集半径分别为 和 km 情景 IV 中,6 MW 和 25 MW 直燃发电项目的平均经济收集半径分别为 和 km,12 MW 气化发电项目平均约为 km, 年产 t 燃料成型项目平均约为 km 不同情景中, 具有经济性的秸秆能源化项目在不同地区的经济收集半径分别如图 4 所示 投资回报率为 10% 情景 I 中,6 MW 直燃发电项目 12 MW 气化发电项目和年产 t 燃料成型项目的经济收集半径均为 0,25 MW 直燃发电项目仅在广东具有经济性, 收集半径为 9.41 km, 年产 t 燃料成型项目仅在河北 山西 内蒙古 黑龙江 山东 重庆 贵州 甘肃 青海 宁夏和新疆具有经济性, 平均收集半径约 km 情景 II 中, 25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目均在除北京 天津 上海以外的地区具有经济性, 平均经济收集半径分别为 和 km;6 MW 直燃发电项目仅在山西 安徽 湖北 广西 贵州 云南 陕西 甘肃和新疆具有经济性, 而年产 t 燃料成型项目在所有省份均具有经济性 情景 III 中,25 MW 直燃发电项目 12 MW 气化发电项目和年产 t 燃料成型项目的平均经济收集半径分别为 和 km,6 MW 直燃发电项目仅在广东具有经济性, 而年产 t 燃料成型项目仅在河北 山西 内蒙古 黑龙江 山东 重庆 贵州 甘肃 青海 宁夏和新疆具有经济性 情景 IV 中,6 MW 和 25 MW 直燃发电项目的平均经济收集半径分别为 和 km,12 MW 气化发电项目平均约为 km, 年产 t 燃料成型项目平均约为 km 不同情景中, 具有经济性的秸秆能源化项目在不同地区的经济收集半径分别如图 5 所示 2.4 可新型能源化秸秆资源生态经济总量 投资回报率为 0 由上述分析可知纤维素乙醇项目可利用秸秆资源的生态经济总量均为 0 情景 I 中,6 MW 和 25 MW 直燃发电项目可利用秸秆资源的生态经济总量分别为 和 t, 12 MW 气化发电项目为 t, 年产 t 和 t 燃料成型项目分别为 和 t 其中,6 MW 直燃发电项目秸秆资源主要来自广西 湖北 广东和安徽 ;25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目秸秆资源均主要来自广

136 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 情景 I Scenario I 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 燃料成型 BMF 10000t 情景 II Scenario II 200 最大经济收集半径 The max economic collecting radiis (km) 情景 III Scenario III 情景 IV Scenario IV 北京 Beijing 天津 Tianjin 河北 Hebei 山西 Shanxi 内蒙古 Inner Mongolia 辽宁 Liaoning 吉林 Jilin 黑龙江 Heilongjiang 上海 Shanghai 江苏 Jiangsu 浙江 Zhejiang 安徽 Anhui 福建 Fujian 江西 Jiangxi 山东 Shandong 河南 Henan 湖北 Hubei 湖南 Hunan 广东 Guangdong 广西 Guangxi 海南 Hainan 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 贵州 Guizhou 云南 Yunnan 西藏 Xizang 陕西 Shaanxi 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 宁夏 Ningxia 新疆 Xinjiang 图 3 不同情景下不同项目的经济收集半径 (ROI=0) Fig. 3 The economic straw collecting radii in different scenarios (ROI=0)

137 3778 中国农业科学 49 卷 北京 Beijing 天津 Tianjin 河北 Hebei 山西 Shanxi 内蒙古 Inner Mongolia 辽宁 Liaoning 吉林 Jilin 黑龙江 Heilongjiang 上海 Shanghai 江苏 Jiangsu 浙江 Zhejiang 安徽 Anhui 福建 Fujian 江西 Jiangxi 山东 Shandong 河南 Henan 湖北 Hubei 湖南 Hunan 广东 Guangdong 广西 Guangxi 海南 Hainan 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 贵州 Guizhou 云南 Yunnan 西藏 Xizang 陕西 Shaanxi 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 宁夏 Ningxia 新疆 Xinjiang 最大经济收集半径 The max economic collecting radiis (km) 图 4 不同情景下不同项目的经济收集半径 (ROI=5%) Fig. 4 The economic straw collecting radii in different scenarios (ROI=5%)

138 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 情景 I Scenario I 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 燃料成型 BMF 10000t 最大经济收集半径 The max economic collecting radiis (km) 180 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 情景 II Scenario II 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 BMF 10000t 情景 III Scenario III 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 燃料成型 BMF 10000t 情景 IV Scenario IV 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 燃料成型 BMF 10000t 北京 Beijing 天津 Tianjin 河北 Hebei 山西 Shanxi 内蒙古 Inner Mongolia 辽宁 Liaoning 吉林 Jilin 黑龙江 Heilongjiang 上海 Shanghai 江苏 Jiangsu 浙江 Zhejiang 安徽 Anhui 福建 Fujian 江西 Jiangxi 山东 Shandong 河南 Henan 湖北 Hubei 湖南 Hunan 广东 Guangdong 广西 Guangxi 海南 Hainan 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 贵州 Guizhou 云南 Yunnan 西藏 Xizang 陕西 Shaanxi 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 宁夏 Ningxia 新疆 Xinjiang 图 5 不同情景下不同项目的经济收集半径 (ROI=10%) Fig. 5 The economic straw collecting radii in different scenarios (ROI=10%)

139 3780 中国农业科学 49 卷 西 四川 山东和河南 ; 年产 t 燃料成型项目则主要来自四川 山东 重庆和甘肃 ; 年产 t 燃料成型主要来四川 山东 河南和湖北 情景 II 中, 6 MW 25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目可利用秸秆资源生态经济总量分别为 和 t, 而年产 t 燃料成型项目为 t, 年产 t 燃料成型项目仍为 t 情景 III 中,6 MW 25 MW 直燃发电项目可利用秸秆生态经济总量分别为 和 t,12 MW 气化发电项目为 t, 年产 t 和 t 燃料成型项目分别为 和 t 情景 IV 中, 发电类项目和年产 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量均为 t, 而年产 t 燃料成型项目仍为 t 不同情景下不同项目可新型能源化利用秸秆生态经济总量如图 6 所示 投资回报率为 5% 情景 I 中,6 MW 直燃发电项目的最大经济收集半径为 0, 故其可用秸秆生态经济总量为 0, 而 25 MW 直燃发电项目 12 MW 气化发电项目和 t 燃料成型项目分别为 和 t, 其中发电类项目秸秆资源主要来自广西 湖北 广东和安徽, 燃料成型项目主要来自四川 山东 重庆 甘肃和新疆 ; 另外, 年产 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量为 t, 仅来自新疆 情景 II 中,6 MW 25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目可用秸 秆生态经济总量分别为 和 t, 均主要来自广西 四川 山东 河南和湖北 ; 而年产 t 和 t 燃料成型项目分别为 和 t 情景 III 中,6 MW 直燃发电项目秸秆可利用生态经济总量约为 t, 来自广东 ;25 MW 直燃发电项目和气化发电项目可利用秸秆资源生态经济总量均为 t, 均来自于浙江 湖南 广东 广西和海南 ; 年产 t 和 t 燃料成型项目可利用秸秆生态经济总量分别为 和 t 情景 IV 中,6 MW 25 MW 直燃发电项目 12 MW 气化项目和年产 t 燃料成型项目可利用秸秆资源的生态经济总量分别为 和 t, 年产 t 燃料成型项目可利用秸杆资源生态经济总量与情景 III 相同 此外, 由于纤维素乙醇项目在所有情景中均不经济, 其可利用秸秆资源量均为 0 不同情景下不同项目可用秸秆生态经济总量如图 7 所示 投资回报率为 10% 情景 I 中, 年产 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量约 t, 主要来自山东 重庆 甘肃和新疆, 而其余项目可用秸秆生态经济总量均为 0 情景 II 中,25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目可用秸秆生态经济总量分别为 和 t, 均主要来自广西 四川 山东 河南 湖北和广东 ; 6 MW 直燃发电项目为 t, 可用秸秆仅来自广西 安徽和新疆 ; 而年产 t 燃料成型项 生态经济可开发量 Available eco-economic straw amount (10 4 t) Fig. 6 图 6 不同情景下可能源化秸秆资源生态经济总量 (ROI=0) The eco-economic amount of available straw resource in different scenarios (ROI=0)

140 19 期朱开伟等 : 中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析 3781 生态经济可开发量 Available eco-economic straw amount (10 4 t) 情景 I Scenario I 情景 II Scenario II 情景 III Scenario III 情景 IV Scenario IV 0 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 燃料成型 10000t BMF 10000t Fig. 7 图 7 不同情景下可能源化秸秆资源生态经济总量 (ROI=5%) The eco-economic amount of available straw resource in different scenarios (ROI=5%) 目可用秸秆仍为 0 情景 III 中,25 MW 直燃发电项目和 12 MW 气化发电项目可用秸秆生态经济总量均为 t, 均主要来自广西 湖北 广东 安徽和江苏 ;6 MW 直燃发电项目为 t, 仅来自广东 ; 年产 t 和 t 燃料成型项目可用秸秆分别为 和 t, 分别主要来自山东 重庆 甘肃 新疆和四川 山东 河 南 重庆 情景 IV 中,6 MW 25 MW 直燃发电项目 12 MW 气化发电项目 年产 t 和 t 燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为 和 t 此外, 所有情景中纤维素乙醇项目可用秸秆生态经济总量均为 0 不同情景下不同秸秆能源化项目可用秸秆生态经济总量分别如图 8 所示 生态经济可开发量 Available eco-economic straw amount (10 4 t) 情景 I Scenario I 情景 II Scenario II 情景 III Scenario III 情景 IV Scenario IV 0 直燃发电 6MW SDFPG 6MW 直燃发电 25MW SDFPG 25MW 气化发电 12MW SGPG 12MW 燃料成型 5000t BMF 5000t 燃料成型 10000t BMF 10000t Fig. 8 图 8 不同情景下可能源化秸秆资源生态经济总量 (ROI=10%) The eco-economic amount of available straw resource in different scenarios (ROI=10%) 3 讨论 3.1 方法有效性农作物秸秆还田具有防止水土流失 增强和维护 土壤功能, 具有非常可观的环境效益 因此, 如何在保障生态环境的基础上, 实现秸秆的新型能源化利用, 对中国环境保护和秸秆资源的有序开发都有着重要的意义 而秸秆新型能源化利用不仅受秸秆资源的制约,

141 3782 中国农业科学 49 卷 还与技术类型 开发成本和地域相关 为探究不同区域不同秸秆新型能源化项目可利用秸秆资源的生态经济总量, 本研究从防止水土流失和维护土壤有机质的角度, 提出了土壤生态保留量的概念 ; 同时从项目层面, 考虑土壤生态保留 技术进步和政策激励, 对不同区域不同秸秆能源化项目可利用秸秆资源的生态经济总量进行评价研究, 并提出了相关发展建议 考虑秸秆生态还田和秸秆用途后, 可新型能源化利用秸秆资源生态总量约为 t, 比现有相关研究偏小 [7,21], 同时在秸秆资源的空间分布和资源构成上也有所差异 文献 [7,21,45] 认为秸秆资源主要集中在黑龙江 吉林 新疆和河南等地, 而本研究则认为主要集中在广西 四川 山东和河南 ; 在秸秆资源构成上, 部分研究认为可能源化秸秆资源主要由玉米 水稻和小麦秸秆构成 [5,7,21], 而本研究认为可能源化秸秆资源主要是由薯类 甘蔗和油菜秸秆构成 造成该差异的主要原因在于, 采用还田比计算还田量是在可获秸秆资源理论总量上进行的, 等效于采用加权平均法计算整体农作物秸秆还田量, 其还田量总是小于其理论秸秆产量 ; 而土壤生态保留是针对土壤生态要求对不同农作物进行设计, 会出现农作物秸秆理论产量小于生态还田需求量, 同时不同区域农作物种植结构存在差异, 从而造成可能源化秸秆资源构成和空间分布上的差异 在项目经济性评价方面, 大多数区域 6 MW 25 MW 秸秆直燃发电项目和 12 MW 秸秆气化发电项目的直接发电成本介于 [46-48] yuan/(kw h), 与相关研究基本一致, 秸秆纤维素乙醇项目和秸秆燃料成型项目单位生产成本与文献 [42,49] 基本相当 3.2 政策建议现有激励政策在不同 ROI 下对新型秸秆能源化项目都有着显著的激励作用, 除年产 t 燃料成型项目外, 其他项目的经济可行性依赖于政府补贴, 尤其是在较高 ROI 条件下 可适当降低年产 t 燃料成型项目的补贴力度, 提高其他项目的补偿强度 此外, 在不同 ROI 和情景下, 年产 t 燃料成型项目的区域适应性最好, 其次为 12 MW 气化发电项目和 25 MW 直燃发电项目, 而年产 t 燃料成型项目和 6 MW 秸秆直燃发电项目的区域适应性较差, 且现阶段秸秆纤维素乙醇项目不具有经济可开发性 因此, 在秸秆能源化产业布局方面现阶段可优先考虑年产 t 燃料成型项目 12 MW 秸秆气化项目和 25 MW 秸秆直燃发电项目 在技术进步下, 政策激励 对秸秆能源化利用仍是必要的, 且在高 ROI 下政策激励能有效提高能源化利用秸秆资源量 当项目年收益和年运营成本一定时, 随着 ROI 的不断增加, 可用于秸秆运输的费用不断减小, 使得最大经济收集半径也逐渐减小, 导致部分区域秸秆经济收集量小于项目秸秆理论需求量, 使得秸秆新型能源化项目在空间布局上发生变化 在现有技术水平和激励强度下, 当 ROI 从 0 增加到 10% 时, 年产 t 燃料成型项目的适宜开发区域变化不大, 基本覆盖所有省市 ; 发电类项目的适宜开发区域随着 ROI 的提高而迅速减少 ; 不管是低 ROI 还是高 ROI,6 MW 直燃发电项目和年产 t 燃料成型项目的经济性均较差 ; 而纤维素乙醇项目在全国范围内均不经济 4 结论 在现有中国农作物种植结构 单产和播种面积下, 考虑土壤生态保留和秸秆主要用途后, 中国可新型能源化利用秸秆生态总量约为 t, 空间上主要分布在广西 四川 山东和河南, 构成上主要由薯类 甘蔗和油菜秸秆构成 现有政策对发电类项目有着显著的激励作用, 可适当降低对年产 t 燃料成型项目补贴力度, 提高发电类项目的补助力度 ; 同时在技术进步下, 政策激励对秸秆新型能源化利用仍是必要的, 在高投资回报率 (ROI) 下, 政策激励能有效提高秸秆资源的利用 在秸秆能源产业布局方面, 现阶段可优先发展年产 t 秸秆燃料成型项目, 可优先在广西 湖北 广东 安徽 河南等地规划建设 12 MW 秸秆气化发电项目, 其次可考虑在广西 湖北 广东和安徽规划建设 25 MW 秸秆直燃发电项目, 最后可考虑在广西规划建设 6 MW 秸秆直燃发电项目 References [1] WILHELM W W, HESS R J, KARLEN D L, JOHNSON J M F, NUTH D J, BARKER J M, GOLLANY H T, NOVAK J M, STOTT D E, VARVEL G E. Review: balancing limiting factors & economic drivers for sustainable Midwestern US agricultural residue feedstock supplies. Industrial Biotechnology, 2010, 6(5): [2] LIU T T, MCCONKEY B, HUFFMAN T, SMITH S, MACGREGOR B. Potential and impacts of renewable energy production from agricultural biomass in Canada. Applied Energy, 2014, 130(2): [3] ROBERTS J J, CASSULA A M, PRADO P O, DIAS R A,

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145 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 袁月, 张亚光, 高世敏, 陶建敏 ( 南京农业大学园艺学院, 南京 ) 摘要 : 目的 OVATE 是一类调控植物生长发育的转录抑制因子, 对葡萄 OVATE 基因家族 (VvOFPs) 进行生物信息学和组织特异性表达分析, 为该类基因的功能研究奠定基础 方法 根据 OVATE 保守域蛋白序列 (PF04844) 对葡萄 OVATE 基因家族进行鉴定, 利用生物信息学方法对葡萄 OVATE 基因家族染色体定位 基因结构 保守结构域 亚细胞定位等方面进行预测和分析, 并分析葡萄和拟南芥 OVATE 基因家族的进化关系 采用实时荧光定量 PCR 技术检测 VvOFPs 组织表达特性 结果 葡萄 OVATE 基因家族包含 17 个成员, 不均匀地分布在 11 条染色体上, 均没有内含子结构, 编码 个氨基酸, 等电点 , 均为亲水蛋白 ; 所有蛋白均包含完整的 OVATE 保守结构域, 亚细胞定位主要在细胞核中 根据进化树拓扑结构, 将葡萄和拟南芥 OVATE 蛋白家族聚为六类 (I VI), 其中,Ⅱ Ⅲ Ⅴ 类仅包含两个基因,Ⅰ Ⅳ Ⅵ 类中 VvOFPs 和 AtOFPs 相互交错地聚类在一起 ;VvOFPs 和 AtOFPs 共包含 10 个未知基序, 保守元件 1 和 2 位于 OVATE 结构域区域, 此外, 在 OVATE 结构域外每个类别均包含特有基序 VvOFPs 具有组织表达特异性,12 个基因在根 茎 叶 花和果实中均可以检测到表达, 其余 5 个基因仅在特定组织中表达 多数 VvOFPs 在根 嫩茎和花中表达量较高, 在嫩叶和果实中仅检测到少数基因表达 ;VvOFPs 在不同发育期表达量存在差异, 通常在开花前 1 周和开花期表达量较高, 而花后 4 周果实中表达量较低 1 对旁系同源基因表达模式相似,3 对旁系同源基因产生了新的表达模式 结论 葡萄 OVATE 结构域序列比较保守, 其在不同组织中呈现出多种表达模式, 推测其可能参与了葡萄生长发育的调控 关键词 : 葡萄 ;OVATE 基因家族 ; 生物信息学 ; 表达 Bioinformatics and Expression of the OVATE Gene Family in Grape YUAN Yue, ZHANG Ya-guang, GAO Shi-min, TAO Jian-min (College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing ) Abstract: Objective OVATE is a class of transcriptional repressor that regulates plant growth and development. In this study, the authors analyzed the grape OVATE gene family (VvOFPs) from the aspects of bioinformatics and tissue-specific expression in order to lay a foundation for the functional studies in future. Method Based on the conserved OVATE domain (PF04844), OVATE genes were identified from grape genome. Chromosome location, gene structure, conserved domain and subcellular localization were also analyzed by the bioinformatics methods. A phylogenetic analysis was conducted based on the alignment of the OVATE proteins from grape and Arabidopsis genomes. The expression patterns of VvOFPs were tested via quantitative real-time polymerase chain reaction (qrt-pcr). Result Seventeen putative VvOFPs were identified in the grape genome and they unevenly distributed on the eleven chromosomes. No intron was found in the gene structures of VvOFPs. The VvOFPs encoded hydrophilic proteins, containing amino acids, and their isoelectric points ranged from In 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家现代农业葡萄产业技术体系项目 (CARS-30) 国家 948 重点项目 (2016-X19) 淮安科技局葡萄新品种引进及设施栽培技术研究与应用项目 (HAC ) 江苏省科技厅设施条件下葡萄高效栽培新技术研究与应用项目 (SBE ) 联系方式 : 袁月,Tel: ; @njau.edu.cn 通信作者陶建敏,Tel: , tjm266@sina.com

146 19 期袁月等 : 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 3787 addition, all the VvOFPs contained the entire OVATE domain and were predicted to be located in the nucleus. According to the topology of phylogenetic tree, OVATE proteins from grape and Arabidopsis were divided into six groups (I-VI). Group II, III and V contained only two members, whilst members of groups I, IV and VI were clustered in the species-specific pattern. VvOFPs and AtOFPs contained 10 uncharacterized motifs. Motifs 1 and 2 were located in the OVATE domain region. Besides, group-specific motifs were also found outside the OVATE domain. qrt-pcr analysis showed that VvOFPs exhibited different tissue-specific expression patterns. Interestingly, twelve VvOFPs were found to be expressed in the detected organs of roots, stems, leaves, flowers and fruits while the others were expressed in the specific organ tissues. Most of the VvOFPs were more highly expressed in roots, stems and flowers, whereas a little gene was detected with low level in leaves and fruits. Meanwhile, VvOFPs expressed differently at different developmental stage. Transcripts in flowers a week before or at anthesis were at a high level, while low in fruits four weeks after anthesis. In addition, one pair of paralogues exhibited the same expression patterns, whereas the other three pairs of paralogues exhibited divergent expression patterns. Conclusion Results of this study showed that grape OVATE domain is conserved. VvOFPs exhibited different expression patterns and may be involved in regulation of plant growth and development. Key words: grape; OVATE gene family; bioinformatics; expression 0 引言 研究意义 OVATE 是一类植物转录因子 [1-5], 调控植物生长发育的多个方面, 包括胚囊和花粉发育 [1] [5] [6-7] 次生细胞壁合成以及果实形状等 葡萄 (Vitis L.) 具有 多年的栽培历史 [8], 其保留着古老的开花植物的基因组结构, 是非常有用的模式植物 [9] 对葡萄 OVATE 基因家族进行生物信息学分析, 对于葡萄功能基因组学的研究发展有重要意义 前人研究进 [6] 展 LIU 等首次在番茄中克隆出 OVATE, 研究发现其能够控制番茄果实形状, 该基因的一个点突变导致翻译提前终止, 使得野生番茄果实纵径增长, 颈部生长受到限制, 从而由圆形果实发育成梨形果实 OVATE 编码一个亲水蛋白, 该蛋白的 C 末端结构域 DUF623 在拟南芥 水稻和番茄中具有保守性, 被命名为 OVATE 结构域, 凡含有该结构域的蛋白, 均属于 OVATE 蛋白家族 目前关于 OVATE 蛋白家族的研究主要集中在拟南芥 番茄和水稻中, 其中, 拟南芥基因组中共被鉴定出 18 个 OVATE 蛋白, 功能分析表明这些蛋白作为转录抑制因子, 调控植株生长发育的多个过程 [3,5] 在酵母双杂交试验中,9 个 OVATE 蛋白被发现与 TALE 同源异型盒蛋白相互作用, 且 AtOFP1 和 AtOFP5 共同调控一个 TALE 同源异型盒蛋白 BLH1 的亚细胞定位, 当这两个基因在烟草叶片中共表达时,BLH1 蛋白从细胞核运输到细胞质中 [1] TALE 同源异型盒蛋白包含一个三氨基酸残基环连接两个螺旋的结构 [10], 分为 KNOX 和 BELL 两个子类 [11-13],KNOX 和 BELL 蛋白相互作用形成异源二聚体, 调控植物的生长发育 [14-18], 因此, 拟南芥 OVATE 蛋白可以通过与 TALE 蛋白相互作用而间接调控植物生长发育, 不仅如此,OVATE 蛋白还可以直接调控靶基因的表达 AtGA20ox1 是赤霉素合成关键酶基因, 染色质免疫共沉淀表明该基因是 AtOFP1 蛋白的靶基因,AtOFP1 通过抑制该基因的表达, 调控赤霉素的生物合成, 从而导致包括莲座叶 下胚轴 茎叶 花序梗 花器官和角果在内的地上部器官变短, 该家族其他基因的过表达也具有相似的生理效应 [3] 此外, 沉默 AtOFP1 AtOFP4 AtOFP8 AtOFP10 AtOFP15 和 AtOFP16 中任一个基因, 植株的表型并未发生变化, 表明这些家族成员间存在功能冗余 [4] AtOFP1 还与 AtKu70 相互作用, 参与 DNA 非同源末端修复 [19] AtOFP4 能够与 KNAX7 蛋白的相互作用, 进而调控次生细胞壁的形成 [5] AtOFP5 通过抑制 BLH1-KNAT3 复合物活性在胚囊的发育早期发挥作用 [2] 在番茄全基因组中共预测了 31 个 OVATE 家族基因, 其中 SlOFP07 SlOFP08 SlOFP14 SlOFP18 SlOFP20 SlOFP29 和 SlOFP31 在生殖器官中的表达量高于营养器官, 而 SlOFP10 SlOFP13 和 SlOFP22 在苗期的根 幼叶和下胚轴中表达量较高, 表明番茄 OVATE 家族成员在植株发育调控中发挥着不同的作用 [20] 在水稻的基因组中共预测出 31 个 OVATE 家族基因, 这些基因同样具有组织表达特异性, 接近一半的基因在苗期表达量较高 ; 外施油菜素内酯可以显著影响 OsOFP3 和 OsOFP15 的表达 [21] 辣椒 OVATE 蛋白家族成员 CaOVATE 也是通过抑制 CaGA20ox1 表达, 从而改变果实形状 [7] 香蕉 OVATE 蛋白家族成员 MaOFP1 与香蕉 MuMADS1 蛋白存在互作, 两者共同调控香蕉果实的发育,MaOFP1 在

147 3788 中国农业科学 49 卷 香蕉果实发育前期表达量较高, 后期表达则受到乙烯的抑制 [22] [23] 在最近的研究中, 包含拟南芥 水稻 番茄在内的 13 种植物 OVATE 基因家族被鉴定出来, 共有 265 个 OVATE 蛋白序列, 这些物种包含较古老的苔藓和石松门植物, 生物信息学分析表明, OVATE 基因家族存在不同的进化机制, 主要为保守进化和分散扩增两种方式 本研究切入点 目前, 仅有一篇外文文献报道葡萄全基因组中包含 9 个 OVATE 家族成员, 鉴定出的基因数目较少, 且未详细地进行生物信息学和表达分析, 因此, 有必要对葡萄 OVATE 基因家族进行全面鉴定和分析 拟解决的关键问题 在葡萄全基因组中搜索鉴定 OVATE 基因家族成员, 全面分析基因结构 染色体定位 蛋白保守结构域及系统发育等信息, 同时研究葡萄 OVATE 基因家族的组织表达特征, 为进一步探究基因功能提供依据 1 材料与方法 1.1 材料供试品种为二倍体 宝满 葡萄, 种植于南京农业大学园艺学院汤山葡萄基地, 以每个花序一半以上的小花开放作为开花期, 分别于 2015 年 5 月 5 日 ( 花前一周 ) 采集花蕾,5 月 12 日 ( 开花期 ) 采集开放的小花 ( 含花冠和花药 ),6 月 12 日 ( 花后四周 ) 采果实, 采集新稍上完全展开的嫩叶和嫩茎 根取自组培苗, 组培苗由南京农业大学园艺学院果树生物技术实验室培养, 培养条件是光照时间 16 h, 光照强度 lx, 培养温度 25 材料用液氮速冻后, 保存于 -80 冰箱 1.2 方法 葡萄和拟南芥 OVATE 基因家族的鉴定拟南芥全基因组的注释序列在 NCBI( nlm.nih.gov/) 中下载, 葡萄全基因组注释序列分别在 Grape Genome [9] ( 和 NCBI( 中下载, 在 Pfam 数据库 [24] ( 中下载葡萄和拟南芥 OVATE 蛋白保守域序列 (PF04844), 利用 Bioedit 软件在葡萄和拟南芥的蛋白组中搜索这些序列的同源蛋白, 删除重复序列, 将得到的序列在 Pfam 上搜索, 去除没有 OVATE 保守域的序列, 最终获得葡萄和拟南芥 OVATE 家族基因 葡萄 OVATE 基因家族的生物信息学分析利用在线网站 EXPASY( [25] 中 ProtParam 工具对葡萄 OVATE 家族蛋白的氨基酸组成 疏水性 等电点等理化性质进行分析 ; 在 NCBI 上下载葡萄和拟南芥 OVATE 家族基因的 CDS 序列和基因组定位信息, 利用在线软件 GSDS2.0 [26] ( 绘出基因结构图, 并运用 MapInspect 工具进行染色体定位作图 ; 利用序列分析软件 clustalx2.0,jalview2.8 和在线软件 WebLogo3 [27] ( 分析葡萄 OVATE 家族蛋白的 OVATE 保守结构域序列 ; 使用在线软件 CelloV.2.5 [28] ( tw/),wolf PSORT( 以及在线网站 Soft Berry( softberry.com/berry.phtml) 中的 PROTCOMP 程序共同对葡萄 OVATE 家族基因进行亚细胞定位预测, 利用 MEGA5.0 [29] 软件对已鉴定的葡萄和拟南芥 OVATE 家族蛋白进行序列比对, 并用邻位 (Neighbor-Joining) 算法构建系统进化树, 进行 Bootstrap 测试, 重复设置 1 000; 基序预测采用在线软件 MEME [30] ( 参数设置为 : 预测数目 10, 氨基酸数目 4 70, 位点数 葡萄 OVATE 基因家族表达分析根据基因序列设计实时荧光定量 PCR 特异引物 ( 表 1), 以葡萄 Actin(XM_ ) 作为内参基因, 采用成都福际公司的多糖多酚植物组织总 RNA 提取试剂盒提取 RNA, 利用 TaKaRa 公司的反转录试剂盒 PrimeScript 1st Strand cdna Synthesis Kit 反转录合成 cdna 第一条链, 稀释后的 cdna 用于实时荧光定量 PCR PCR 采用 20 μl 反应体系 :cdna 1 μl,2 SYBR Premix EX Taq TM (TaKaRa)10 μl, 上 下游引物各 0.2 μl, 灭菌后 ddh 2 O 8.6 μl; 反应程序 : 95 预变性 4 min;95 变性 20 s,60 退火 20 s,72 延伸 40 s,40 个循环 每个处理 3 次重复, 采用 ABI7300system 软件和 2 -ΔΔCT[31] 方法分析数据 2 结果 2.1 VvOFPs 鉴定及蛋白质理化性质分析通过搜索葡萄全基因组数据库, 共鉴定出 17 个葡萄 OVATE 基因家族成员, 根据其在染色体上的位置, 依次命名为 VvOFP1 17 这些基因的编码区长度在 bp, 编码 个氨基酸, 等电点在 , 氨基酸序列的平均亲水系数在 , 均为负值, 表明这些蛋白均为亲水蛋白, 但亲水程度不同, 详见表 2

148 19 期 袁月等 : 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 3789 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 基因名称 Gene name 上游引物 Forward primer(5-3 ) 下游引物 Reverse primer(5-3 ) VvOFP1 TGTCGTCTCCAGAAAGTG CCAGTATCATCTCCATCATTG VvOFP2 CGTTGATTGGGATTACTTGG CGGAATCTCGCCTTGAATA VvOFP3 GCGGTTCATACTTACTCAC GAGATAGCAGAGGAGCAG VvOFP4 CCAGGCACAGAAGAAGTT CAGTAGGCTTTCGGACAA VvOFP5 GACACAAGTTCAATCTCAGTAG CCCATAATCCTCAATCATTTCC VvOFP6 TTCCACCACCACATTCTC CCTTAACAACAGCGATGC VvOFP7 CTGCTACCTCTCCCTCAA GAATCGCCGTGGAATGTT VvOFP8 GAACAACTCACCCAGAATT TCTCCACAATCATCTCCAT VvOFP9 GTGAGACGAGTTCCATATTG GCTCCGATGATGTAACC VvOFP10 CGATTACGAAGCGAAGAG TAGTATGGCGAGTTGAGC VvOFP11 CATGCAGGAGATGATCGAAG GTGCGAGTCCTTATCGTTGA VvOFP12 GATGAAGAAGAAGATTGAGGAG GTCAGATAACAAGCCAAGAG VvOFP13 TGATGGCTATGGAGAAGAG GGCATTTACAACACAAGAAC VvOFP14 GTCTCTCCTCGGATTCAT ATCACTGGACCTCTTCAC VvOFP15 GGCTTCTTGTTCTGATTCC TCTTCGTCTTCCTCCTTATC VvOFP16 GAATGAGCACAAGCACTG ATGAACTGATGAACCTGAGA VvOFP17 GAATCAACCGCAGAAGATG CGTCATAGTCACCACCTT VvActin TACAATTCCATCATGAAGTGTGATG TTAGAAGCACTTCCTGTGAACAATG 表 2 葡萄 OVATE 家族基因信息和理化性质分析 Table 2 The information and physicochemical analysis of VvOFPs 基因名称 Gene name 基因号 Gene ID 染色体定位 Chromosome location 基因大小 Size (bp) 氨基酸大小 Size (aa) 分子量 MW (Da) 等电点 PI 平均亲水系数 Grand average of hydropathicity (GRAVY) VvOFP1 LOC Chr4: VvOFP2 LOC Chr4: VvOFP3 LOC Chr5: VvOFP4 LOC Chr6: VvOFP5 LOC Chr6: VvOFP6 LOC Chr6: VvOFP7 LOC Chr7: VvOFP8 LOC Chr8: VvOFP9 LOC Chr8: VvOFP10 LOC Chr8: VvOFP11 LOC Chr9: VvOFP12 LOC Chr10: VvOFP13 VIT_210s0116g00380 Chr10: VvOFP14 LOC Chr11: VvOFP15 LOC Chr13: VvOFP16 LOC Chr16: VvOFP17 LOC Chr18:

149 3790 中 国 农 2.2 VvOFPs 的 OVATE 保守域的鉴定和分析 通过 Pfam 在线数据库对候选的葡萄 OVATE 家族 业 科 49 卷 学 域序列比较保守 氨基酸数目在 所有蛋白的 OVATE 结构域序列都比较完整 结合基序分析结果 蛋白进行鉴定 所有候选基因在 C 末端均含有 OVATE 基序 1 全部位点均在 OVATE 结构域区域 其中保守 保守结构域 下载这些蛋白的 OVATE 结构域序列 性强的氨基酸有亮氨酸 L35 天冬酰胺 N43 利用 clustalx2.0 软件进行序列比对 并使用 Jalview2.8 异亮氨酸 I51 及苯丙氨酸 F55 基序 2 大部分 绘制并分析比对序列 WebLogo3 创建保守域 Logo 位点位于结构域区域 其中保守性强的氨基酸有丝氨 最终拼接得到图 1 由图 1 可知 葡萄 OVATE 结构 酸 S1 S11 脯氨酸 P4 蛋氨酸 M VvOFP9 VvOFP5 VvOFP10 VvOFP7 VvOFP6 VvOFP17 VvOFP3 VvOFP15 VvOFP11 VvOFP2 VvOFP1 VvOFP12 VvOFP14 VvOFP16 VvOFP4 VvOFP8 VvOFP13 4 bits N 图1 Fig. 1 C 葡萄 OVATE 蛋白家族的保守结构域序列比对 Multiple sequence alignment of conserved domain in VvOFPs 2.3 VvOFPs 的染色体定位分析 葡萄 OVATE 家族的 17 个基因不均等地分布在 11 基因较少 均只有两个基因 均包含 1 个 VvOFP 和 1 个 AtOFP 说明该分支内基因进化速度相对缓慢 推 条染色体上 号染色 测其基因功能相对保守 Ⅰ类包含 2 个 VvOFPs 和 4 体上均没有分布 其中 在 6 号和 8 号染色体上分布 个 AtOFPs Ⅳ类包含 5 个 VvOFPs 和 4 个 AtOFPs 的基因最多 分别有 3 个基因 4 号 10 号染色体各 Ⅵ类包含 7 个 VvOFPs 和 7 个 AtOFPs 在Ⅰ Ⅳ Ⅵ 分布 2 个基因 其余 7 条染色体均只含有 1 个基因 类中 VvOFP14 和 AtOFP8 VvOFP15 和 AtOFP13 此外 6 号染色体上的 VvOFP5 和 VvOFP6 及 8 号染 VvOFP11 和 AtOFP14 的亲缘关系较近 可能具有相 色体上的 VvOFP9 和 VvOFP10 物理距离较近 分别为 似的功能 其余 VvOFPs 和 AtOFPs 相互交错地聚类 8.7 和 6.4 kb 以串联的方式排列在染色体上 图 2 在 一 起 VvOFPs 形 成 了 4 对 旁 系 同 源 基 因 对 2.4 VvOFPs 的进化树分析 VvOFP1/17 VvOFP6/10 VvOFP3/7 VvOFP4/8 构建葡萄和拟南芥 OVATE 蛋白家族系统进化树 AtOFPs 形成了 4 对旁系同源基因对 AtOFP2/4 图 3-A 根 据 进 化 树 的 拓 扑 结 构 对 两 个 物 种 AtOFP6/17 AtOFP15/18 AtOFP12/16 OVATE 家族蛋白进行聚类 可分为六类 分别是Ⅰ 2.5 VvOFPs 的基序分析 Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ和Ⅵ 其中 Ⅱ Ⅲ Ⅴ类所包含的 利用在线软件 MEME 对葡萄和拟南芥 OVATE 家

150 19 期 袁月等 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 图2 葡萄 OVATE 基因家族的染色体定位 Fig. 2 The chromosome location of VvOFPs 3791 族的蛋白序列进行基序预测 结果表明 葡萄 OVATE 南芥全基因组序列进行 BLAST 并在植物转录因子数 蛋白家族共包含 10 个未知基序 图 3-B 每个蛋白序 据库 PlnTFDB 3.0 中搜索 AtOFP9 共鉴定出 18 列的 C 末端均含有保守元件 1 和 2 位于 OVATE 结构 个 OVATE 家族基因 根据两个物种的基因组和 CDS 域区域 推测这两个基序可能与 OVATE 结构域的功能 序列 绘制两个物种的基因结构图 图 3-C 表明拟南 相关 结合进化树分析 Ⅴ类的基因仅有基序 1 和 2 芥和葡萄 OVATE 家族基因均没有内含子 此外 葡 除Ⅰ和Ⅲ类之外 Ⅱ Ⅳ和Ⅵ类中也分别存在 1 2 个基 萄 OVATE 家 族 有 两 个 基 因 结 构 不 完 整 分 别 是 因仅有这两个基序 除基序 1 和 2 外 有些基序也在不 VvOFP11 缺少 3 非编码区 VvOFP2 既缺少非 5 编码 同的类别中同时存在 如Ⅱ类中的 1 个基因与Ⅵ类中的 区 也没有 3 非编码区 拟南芥 OVATE 家族只有 6 4 个基因共享基序 7 Ⅳ类中的 5 个基因与Ⅰ类中的 2 个 个基因包含完整的结构 AtOFP3 AtOFP4 AtOFP8 基因共享基序 9 而有些基序是各类别所特有的 Ⅰ类中 AtOFP10 AtOFP11 AtOFP12 AtOFP14 和 AtOFP17 全部基因都共享保守元件 3 该基序位于 N 末端 DNA 结 既缺少非 5 编码区 也没有 3 非编码区 AtOFP1 合域中 Ⅲ类的两个基因共享基序 10 Ⅳ类中 3 个基因 AtOFP16 和 AtOFP6 缺少 5 非编码区 AtOFP2 缺少 3 共享未知基序 8 Ⅵ类中 6 个基因同时共享基序 4 5 和 6 非编码区 基序分析结果和进化树分类结果基本一致 2.7 VvOFPs 的亚细胞定位 2.6 VvOFPs 的内含子和外显子分析 利用 Pfam 数据库中 OVATE 保守结构域序列对拟 在 3 个亚细胞定位网站上分析葡萄 OVATE 蛋白 家族 预测的结果存在差异 表 3 其中在 CelloV2.5

151 A B VvOFP8 VvOFP4 AtOFP1 AtOFP3 AtOFP2 AtOFP4 VvOFP12 AtOFP5 VvOFP13 AtOFP9 VvOFP10 VvOFP6 AtOFP6 AtOFP17 VvOFP14 AtOFP8 AtOFP7 VvOFP1 VvOFP17 VvOFP16 AtOFP10 VvOFP15 AtOFP13 VvOFP9 AtOFP15 AtOFP18 VvOFP5 VvOFP11 AtOFP14 VvOFP2 AtOFP12 AtOFP16 AtOFP11 VvOFP3 VvOFP7 Motif 1 Motif 7 Motif 2 Motif 8 Motif 3 Motif 9 Motif 4 Motif 10 Motif 5 Motif 6 C CDS upstream/downstream Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ aa bp 基因登录号分别是 AtOFP1 At5g01840 AtOFP2 At2g30400 AtOFP3 At5g58360 AtOFP4 At1g06920 AtOFP5 At4g18830 AtOFP6 At3g52525 AtOFP At2g18500 AtOFP8 At5g19650 AtOFP9 T24H24.4 AtOFP10 At5g22240 AtOFP11 At4g14860 AtOFP12 At1g05420 AtOFP13 At5g04820 AtOFP14 At1g79960 AtOFP15 At2g36050 AtOFP16 At2g32100 AtOFP17 At2g36026 AtOFP18 At3g52540 系统发育树树枝上面或下面的数字代表自举值 GenBank accession numbers are as follows: AtOFP1, At5g01840; AtOFP2, At2g30400; AtOFP3, At5g58360; AtOFP4, At1g06920; AtOFP5, At4g18830; AtOFP6, At3g52525; AtOFP7, At2g18500; AtOFP8, At5g19650; AtOFP9, T24H24.4; AtOFP10, At5g22240; AtOFP11, At4g14860; AtOFP12, At1g05420; AtOFP13, At5g04820; AtOFP14, At1g79960; AtOFP15, At2g36050; AtOFP16, At2g32100; AtOFP17, At2g36026; AtOFP18, At3g52540; Numbers above or below branches of the tree indicate bootstrap values 图3 Fig. 3 葡萄和拟南芥 OVATE 蛋白家族系统发育树 A 保守基序 B 和基因结构 C 分析 Phylogenetic tree (A), conserved motif (B) and structure (C) analysis of OVATE family protein from grape and Arabidopsis

152 19 期袁月等 : 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 3793 表 3 葡萄 OVATE 蛋白家族的亚细胞定位预测 Table 3 Prediction of the subcellular location of VvOFPs 蛋白 Protein 亚细胞定位软件 Subcellular location predictor CelloV2.5 WOLF PSORT PROTCOMP VvOFP1 nucl (4.0) mito (7) nucl (6) extr. (2.4) VvOFP17 nucl (3.9) chlo (5) nucl (3) extr (3) e.r. (2) extr (2.5) VvOFP14 nucl (4.1) nucl (6) mito (4) chlo (3) nucl (7.4) VvOFP10 nucl (3.7) chlo (9) nucl (3) mito (2) nucl (6.3) VvOFP6 nucl (3.0) nucl (10.5) cyto_nucl (6) chlo (1) mito (1) nucl (5.7) VvOFP8 nucl (2.8) nucl (13) extr (2.5) VvOFP4 nucl (4.3) nucl (14) extr (2.7) VvOFP12 nucl (4.2) chlo (6) nucl (4) mito (4) extr (2.5) VvOFP13 nucl (2.5) nucl (7.5) cyto_nucl (5) chlo (3) mito (2) nucl (7.0) VvOFP16 nucl (2.0) chlo (9) nucl (4) extr (2.5) VvOFP9 chlo (1.3) extr (1.0) chlo (7) nucl (6) nucl (7.4) VvOFP15 cyto (1.6) nucl (1.5) nucl (7) cyto (3) mito (2) plas (1) nucl (7.4) VvOFP5 plas (1.3) extr (1.25) chlo (7) golg (2) nucl (1) mito (1) plas (1) extr (1) extr (2.6) VvOFP7 nucl (2.7) nucl (6.5) mito (5) cyto_nucl (4.5) cyto (1.5) nucl (7.2) VvOFP3 nucl (1.8) mito (7) nucl (4) chlo (3) nucl (7.4) VvOFP11 nucl (4.4) nucl (9) mito (3) chlo (1) nucl (7.3) VvOFP2 nucl (2.3) nucl (5) mito (5) chlo (4) extr (2.6) nucl: 细胞核,plas: 质膜,extr: 细胞外,cyto: 细胞质,mito: 线粒体,E.R.: 内质网,chlo: 叶绿体,golg: 高尔基体 括号内的数值代表预测的综合得分 nucl: nucleus, plas: plasma membrane, extr: extracellular, cyto: cytoplasm, mito: mitochondria, E.R.: endoplasmic reticulum, chlo: chloroplast, golg: golgi. The numbers in parenthesis mean the integral prediction scores of protein location 预测结果中,15 个蛋白被定位在细胞核,VvOFP9 被定位在叶绿体和细胞外,VvOFP5 被定位在细胞膜和细胞外 ; 根据 WOLF PSORT 预测结果,17 个蛋白被定位在细胞核,12 个在线粒体,11 个在叶绿体,9 个在三者中均被定位, 还有少数蛋白被定位在细胞外 细胞膜 内质网和高尔基体上 ; 在 PROTCOMP 预测结果中,8 个蛋白被定位在细胞核, 其余 7 个蛋白被定为在细胞外 综合分析预测结果, 5 个蛋白定位结果一致, 定位在细胞核的分值最高, 分别是 VvOFP6 VvOFP7 VvOFP11 VvOFP13 和 VvOFP14, 另外 12 个蛋白在两种或一种定位方法中被定为在细胞核, 这符合转录因子在细胞核中调控基因表达的作用特点 2.8 VvOFPs 家族基因在不同组织中表达分析对葡萄 OVATE 基因家族在不同组织的表达结果 ( 图 4) 进行分析, 表明这些基因具有组织表达特异性,12 个基因在各个组织中均可以检测到表达, 其余基因 VvOFP2 VvOFP3 VvOFP5 VvOFP11 VvOFP13 仅在几个组织中检测到表达, 且这 5 个基因集中在 Ⅲ 类和 Ⅵ 类 在根中表达量较高的是 VvOFP3 VvOFP8 VvOFP11 VvOFP13 VvOFP14; 在茎中表达量较高的是 VvOFP4 VvOFP9 VvOFP10 VvOFP12 VvOFP15 VvOFP16; 在花前 1 周的花蕾表达量较高的有 VvOFP1 VvOFP2 VvOFP4 VvOFP5 VvOFP6 VvOFP7 VvOFP12 VvOFP17 ; 在开花期的小花中表达量较高的有 VvOFP1 VvOFP2 VvOFP12 VvOFP17 这些基因在叶片和花后 4 周的果实中表达量均较低 对比不同时期花和果实的表达量, 可以发现全部基因在花后 4 周的果实中表达量均显著下降, 大部分基因花前 1 周花蕾中的表达量高于开花期, 这说明葡萄 OVATE 家族基因对果实发育的调控在开花期及其前 1 周 此外,VvOFP1 和 VvOFP17 这对旁系同源基因表达模式相似, 主要在生殖器官中表达 ; 而 VvOFP6 和 VvOFP10,VvOFP3 和 VvOFP7,VvOFP4 和 VvOFP8, 这 3 对旁系同源基因表达模式不同

153 3794 中国农业科学 49 卷 VvOFP VvOFP VvOFP R YS YL 1BA A 4AA 0.0 R YS YL 1BA A 4AA 0.0 R YS YL 1BA A 4AA 8.4 VvOFP4 7.5 VvOFP5 12 VvOFP R YS YL 1BA A 4AA R YS YL 1BA A 4AA R YS YL 1BA A 4AA 3.5 VvOFP7 4.8 VvOFP8 60 VvOFP9 相对表达量 Relative expression R YS YL 1BA A 4AA VvOFP R YS YL 1BA A 4AA VvOFP R YS YL 1BA A 4AA VvOFP R YS YL 1BA A 4AA 0 R YS YL 1BA A 4AA 0.0 R YS YL 1BA A 4AA 3.5 VvOFP VvOFP14 15 VvOFP R YS YL 1BA A 4AA 0.0 R YS YL 1BA A 4AA 0 R YS YL 1BA A 4AA VvOFP16 R YS YL 1BA A 4AA VvOFP17 R YS YL 1BA A 4AA R: 根,YS: 嫩茎,YL: 嫩叶,1BA: 花蕾 ( 花前 1 周 ),A: 小花 ( 开花期 ),4AA: 果实 ( 花后 4 周 ); 垂直线表示的是 3 个生物学重复相对表达量之间的正偏差 R: Root, YS: Young stem, YL: Young leaf; 1BA: Flower one week before anthesis, A: Flower at anthesis, 4AA: Fruit four weeks after anthesis; Vertical bars represent the normalized relative quantification of VvOFPs in three biological replicates (error bars indicate the SD) 图 4 葡萄 OVATE 基因家族在不同组织中的表达分析 Fig. 4 Expression profiles of the VvOFPs in various grape tissues

154 19 期袁月等 : 葡萄 OVATE 基因家族生物信息学及表达 讨论 本文利用 Pfam 数据库中 OVATE 保守结构域序列 对葡萄全基因组序列进行 BLAST, 共获得葡萄 OVATE 基因家族成员 17 个, 经过保守结构域分析鉴定, 这些 [23] 基因均属于 OVATE 基因家族 LIU 等根据已报道 的拟南芥 OVATE 蛋白序列以及番茄 OVATE 蛋白 (AAN17752), 在 Phyzome 和 Genoscope 两个基因 组网站上进行 BLAST, 共获得 9 个葡萄 OVATE 基因 家族成员, 比本文获得的基因数少了 8 个 本文所鉴 定的拟南芥 OVATE 基因家族成员与前人报道不尽相同, [1] HACKBUSCH 等根据番茄 OVATE 蛋白结构域序列在 拟南芥基因组数据库 TAIR ( org/) 中进行 BLAST, 获得 18 个 AtOFPs,WANG [4] 等发现 AtOFP9( 登录号 At4g04030) 编码的蛋白中 缺少 OVATE 结构域, 本文利用 Pfam 数据库中 OVATE 保守结构域序列对拟南芥全基因组序列进行 BLAST, 只获得了 17 个基因, 缺少 AtOFP9 ( 登录号 At4g04030), 在植物转录因子数据库 PlnTFDB(3.0) 中查找到含有 OVATE 结构域的 AtOFP9, 将该蛋白序 列在 NCBI 上 BLAST, 获得相似度 100% 的序列 T24H24.4( 登录号 AF075598), 该序列是通过细菌 人工染色体克隆获得, 氨基酸数目为 411 个, 而 At4g04030 氨基酸数目仅为 128 个, 两个基因均位于 4 号染色体, 存在部分重叠区域, 因此, 本研究认为 T24H24.4 即是 AtOFP9 [21,23] 葡萄和拟南芥均属于双子叶植物, 前人研究发现在单子叶植物的 OVATE 家族基因数目高于双子叶植物, 高等植物 OVATE 家族多数基因缺少内含子结构, 其中带有内含子的基因一般只有 1 个内含子, 这可能是因为 OVATE 基因家族在进化过程中相对保守 本文对葡萄和拟南芥 OVATE 家族基因结构进行分析, 发现两个物种均没有内含子结构 本研究根据葡萄和拟南芥 OVATE 基因家族的蛋白序列进行进化树构建, 并根据进化树的拓扑结构分为 6 类, 基序分析表明在 OVATE 结构域外, 每个类别包含特有基序, 这也同时验证了分类结果 在多项 OVATE 蛋白家族聚类分析研究中也采用了此类方法 [4,20-21,23] [23] LIU 等提出 OVATE 基因家族包括保守进化和发散扩增两种进化机制, 一方面有些分支每个物种仅有 1 2 个基因, 这些基因在功能上相对保守, 可能对植物的发育有着非常重要的作用 ; 另一方面有些分支每个物种包含很多基因, 这些基因在功能上发生了分化, 拥有这 个物种所特有的功能, 本文也有类似的情况, 如 Ⅱ Ⅲ Ⅴ 类中仅包含两个基因, 可能发生了保守进化, 产生相似的功能 葡萄在生长发育过程中要经历营养生长和生殖生长两个时期, 基因在不同发育期不同组织的表达特性反应了基因的功能, 本研究表明葡萄 OVATE 基因家族在不同组织中特异表达, 有些基因在某个组织中特异表达, 例如 VvOFP5 只在花前一周和开花期检测到表达, 说明该基因可能在花中发挥调控作用 ; 有些基因在生殖器官或营养器官中表达量较高, 例如, VvOFP2 在花中表达量较高, 而在根 叶中表达量极少, 推测该基因可能参与了葡萄生殖生长的调控 ; 有些基因在各组织中表达量差异不大, 如 VvOFP12 在叶 茎, 花前 1 周和开花期的花中表达量差异不大, 推测该基因可能调控葡萄生长发育的多个过程 对比拟南芥 OVATE 基因家族组织表达研究结果 [4], 发现一些直系同源的葡萄和拟南芥 OVATE 家族基因也存在类似的表达特性, 推测这些基因可能行使相似的功能, 例如,VvOFP15 和 AtOFP13 被检测到在嫩茎中表达量较高,VvOFP4 和 AtOFP4 在花蕾中表达量较高, VvOFP14 和 AtOFP8 在根中被检测到表达量较高 LIU [23] 等研究发现番茄 OFPs 中旁系同源基因存在两种表达模式, 一种是保持复制前的功能, 两个基因具有相似的表达模式 ; 另一类是两个基因的功能发生了变异, 其中 1 个基因保留着原始的功能, 而另 1 个基因则产生了新的表达模式 本研究中也有类似的发现, 如 VvOFP1 和 VvOFP17 这对旁系基因在生殖器官中的表达量较高 ;VvOFP4 VvOFP8 与 AtOFP1 属于直系同源基因,VvOFP8 和 AtOFP1 在根中的表达量较高, 而 VvOFP4 在根部的表达量很低, 在花前 1 周的花蕾中表达量较高 4 结论 通过分析葡萄 OVATE 基因家族的染色体定位 基因结构 亚细胞定位 保守域分析 系统进化和基序鉴定等多方面的生物学信息, 较为系统地鉴定了葡萄 OVATE 基因家族, 葡萄 OVATE 结构域序列比较保守 ; 其在不同组织中呈现出多种表达模式, 推测其可能参与了葡萄生长发育的调控 References [1] HACKBUSCH J, RICHTER K, MULLER J, SALAMINI F, UHRIG J F. A central role of Arabidopsis thaliana ovate family proteins in

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157 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 余义和, 李秀珍, 郭大龙, 张会灵, 杨英军, 李学强, 张国海 ( 河南科技大学林学院, 河南洛阳 ) 摘要 : 目的 在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶 VvCIPK10, 分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式, 为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能, 探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据 方法 利用电子克隆技术获得 VvCIPK10 序列, 设计特异引物进行 RT-PCR 反应, 对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析 ; 构建原核表达载体, 转化表达菌株后用 IPTG 进行诱导表达, 收集菌体后裂解细胞, 制备蛋白上样液,SDS-PAGE 电泳对表达产物进行分析, 同时对融合蛋白进行可溶性分析 ;IPTG 大量诱导表达融合蛋白, 收集菌体后进行超声破碎细胞, 用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化 MBP-VvCIPK10 融合蛋白,SDS-PAGE 电泳进行分析 ; 纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应, 反应后 SDS-PAGE 电泳, 压磷屏检测体外自磷酸化反应 ; 构建重组瞬时表达载体 pbi221-gfp/vvcipk10; 分离拟南芥原生质体, 通过 PEG 介导的瞬时转化方法将重组表达载体 pbi221-gfp/ VvCIPK10 转化至原生质体 ; 通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体 pbi221-gfp/vvcipk10 转化至洋葱表皮细胞, 培养 16 h 后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测 ; 选择生长相对一致且健壮的葡萄植株, 于干旱 低温和盐胁迫处理后不同时间取样, 同时在田间取葡萄不同组织样品, 实时荧光定量 PCR 检测 VvCIPK10 在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式 结果 PCR 克隆获得葡萄 VvCIPK10 全长为 bp,5 端非编码区为 30 bp,3 端非编码区为 156 bp, 开放阅读框为 bp, 编码 436 个氨基酸, 理论等电点为 8.59, 分子量为 48.7 kda 保守结构域预测分析显示该蛋白 5 端具有一个激酶结构域,3 末端具有一个 PPI 结构域和一个 NAF 结构域 BLSATP 分析表明葡萄 VvCIPK10 与桃树 CIPK(XP_ ) 一致性最高 (74%) 重组表达载体 pmal-c5x/vvcipk10 在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量 (43 kda+48.7 kda) 相一致的融合蛋白 MBP-VvCIPK10 融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,VvCIPK10 的自磷酸化活性依赖于 Mn 2+, 不依赖于 Mg 2+ 和 Ca 2+,EDTA 可以抑制 VvCIPK10 的自磷酸化活性 亚细胞定位结果显示,VvCIPK10 定位在细胞核 细胞膜和细胞质 VvCIPK10 在葡萄各个组织中均有表达, 主要在葡萄根和叶片中大量表达, 葡萄茎 花序 果实和卷须中的表达量较低 在干旱 低温和盐胁迫处理后,VvCIPK10 呈现受诱导表达模式 VvCIPK10 的表达在低温胁迫后 6 h 达到峰值, 干旱和盐胁迫后 2 h 即达到峰值 结论 葡萄 VvCIPK10 能够响应干旱 低温和盐胁迫, 推测 VvCIPK10 在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用 关键词 : 葡萄 ; 类钙调磷酸酶 B 亚基 ; 丝苏氨酸蛋白激酶 ;VvCIPK10; 表达分析 Characteristics and Expression of Calmodulin Like B Subunit Interaction Protein VvCIPK10 in Grapevine YU Yi-he, LI Xiu-zhen, GUO Da-long, ZHANG Hui-ling, YANG Ying-jun, LI Xue-qiang, ZHANG Guo-hai (College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang , Henan) 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 (U , ) 河南省教育厅科学技术研究重点项目 (14A210018) 河南省教育厅科技攻关项目 ( ) 河南省科技创新人才计划 ( ) 河南省高校科技创新人才支持计划 (13HASTIT004) 河南科技大学创新团队项目 (2015TTD003) 联系方式 : 余义和,Tel: ; yuyihe2008@163.com 通信作者张国海,Tel: ; guohaizhang@126.com

158 19 期余义和等 : 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 3799 Abstract: Objective The objective of this study is to clone serine/threonine protein kinase VvCIPK10 in grapevine, and analyze the kinase characteristics and its expression pattern under stresses. This study will provide a theoretical basis for further study on the molecular function of VvCIPK10 involved in abiotic stress, and investigate the molecular mechanism of grapevine stress resistance. Method The sequences of VvCIPK10 were obtained by electronic cloning technology, and the specific primers were designed to perform RT-PCR reaction. Open reading frame and conserved structure domain of VvCIPK10 were analyzed. The prokaryotic expression vector was constructed and transformed into the expression cells, and the recombinant bacteria were induced by IPTG. The expression products were collected and the protein sample was prepared. The protein samples were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis, and the soluble characteristics of the fusion protein were analyzed. The fusion protein was induced by IPTG. The cells were collected and broken by using ultrasonic. The MBP-VvCIPK10 fusion protein was purified by maltose binding protein purification column and analyzed by SDS-PAGE. The purified fusion protein was incubated with in vitro self-phosphorylation buffer solution. After SDS-PAGE electrophoresis, the phosphor screen was performed and the phosphorylation reaction was detected in vitro. The recombinant transient expression vector pbi221-gfp/vvcipk10 was constructed. The recombinant expression vector pbi221-gfp/vvcipk10 was transformed into protoplasts by PEG mediated transient transformation. The recombinant expression vector pbi221-gfp/vvcipk10 was transformed into onion epidermal cells by gene gun mediated transformation, and the fluorescence signal was detected by laser scanning confocal microscope after 16 h of culture. The relatively consistent and robust grape plants were selected, samples were taken at different times after drought, low temperature and salt stress treatments, at the same time, different tissue samples of grapes were taken in the field, with a kit to extract total RNA. After reverse transcription, expression of VvCIPK10 was detected by real-time quantitative PCR. Result The full-length of VvCIPK10 is bp, 5 end of non-coding region is 30 bp, 3 end of non-coding region is 156 bp, the open reading frame is bp. VvCIPK10 open reading frame encoded 436 amino acids, the theoretical isoelectric point is 8.59, molecular weight is 48.7 kda. Conserved domain prediction analysis showed that the protein has a kinase domain in 5 terminal, a PPI domain and a NAF domain in 3 terminal. BLSATP analysis showed VvCIPK10 consistency with peach CIPK (XP_ ) is highest (74%). Recombinant expression vector pmal-c5x/vvcipk10 transformation in Escherichia coli, expressed the molecular weight of fusion protein is consistent with the predicted molecular weight (43 kda+48.7 kda). MBP-VvCIPK10 fusion protein was purified by column. VvCIPK10 autophosphorylation activity was dependent on Mn 2+ but not dependent on Mg 2+ and Ca 2+, and EDTA could inhibit the autophosphorylation activity of the VvCIPK10. Subcellular localization showed VvCIPK10 in the nucleus, cell membrane and cytoplasm. VvCIPK10 expressed in various tissues of grapevine. VvCIPK10 transcripts mainly accumulated in grapevine roots and leaves, but showed low expression levels in grapevine stem, inflorescence, fruit and tendril. After drought, low temperature and salt stress treatments, VvCIPK10 showed the induced expression model. The expression of VvCIPK10 reached peak value at 6 h after low temperature stress, and reached the peak at 2 h after drought and salt stresses. Conclusion It was concluded that grapevine VvCIPK10 as a serine threonine protein kinase is able to respond to drought, low temperature and salt stress, suggesting that VvCIPK10 plays an important role in resistance to abiotic stress. Key words: grapevine; calmodulin like B subunit; serine threonine protein kinase; VvCIPK10; expression analysis 0 引言 研究意义 葡萄作为重要果树在世界范围内广泛栽培 葡萄栽培过程中常遇到各种各样的非生物逆境胁迫, 导致葡萄生长发育受阻和果实品质降低, 严重影响葡萄生产和经济效益 [1] 在葡萄中挖掘逆境胁迫相关基因并分析关键基因功能, 对于培育抗逆能力强的葡萄新种质具有重要的理论意义和应用价值 前人研究进展 类钙调磷酸酶 B 亚基蛋白 (Calcineurin B-like protein, CBL) 是植物钙信号转导途径中的重要钙感受器之一, 在钙信号介导的植物逆境胁迫响应过程中发挥重要作用 [2-5] CBL 互作蛋白激酶 (CBL- interacting protein kinase,cipk) 编码丝 / 苏氨酸蛋白激酶, 与 CBL 相互作用形成蛋白激酶复合物来响应逆境胁迫, 通过感受细胞内 Ca 2+ 浓度变化来调节下游逆境相关基因的表达, 实现对逆境胁迫的转录调控 [6-8] 研究人员利用正向遗传学在拟南芥中筛选到一系列的盐敏感突变体 (salt overly sensitive,sos),sos2 编码丝 / 苏氨酸蛋白激酶即 AtCIPK24,SOS3 编码 CBL 蛋白即 AtCBL4, 二者通过相互作用协同应对高盐逆境胁迫 [9-10] TaCIPK29 是在小麦中克隆的一个丝 / 苏氨酸蛋白激酶,TaCIPK29 在转录水平可以响应干旱 NaCl 和低温处理, 在烟草中过量表达 TaCIPK29 增强了转基因植株的耐盐性 [11] 油菜 BnCIPK6 转录本在

159 3800 中国农业科学 49 卷 NaCl 渗透胁迫以及 ABA 处理后急剧增加,BnCIPK6 启动子活性受 NaCl 甘露醇以及 ABA 的诱导, 转 BnCIPK6 的拟南芥植株增强了对 NaCl 的耐受能力 [12] 苹果 MdCIPK6L 受盐 低温和干旱胁迫诱导表达, 在拟南芥中过量表达 MdCIPK6L 可以增强转基因植株的抗盐 干旱和低温的能力 [13] 鹰嘴豆 CaCIPK6 转录本受盐 低温和干旱等逆境胁迫的诱导表达, 在拟南芥 cipk6 突变体中过量表达 CaCIPK6 可以恢复 NaCl 敏感表型 [14] 这些研究表明 CIPK 不仅参与了植物对盐 低温以及干旱等逆境胁迫反应, 还说明不同物种中的 CIPK 基因功能保守 本研究切入点 VvK1.1 是葡萄中 K + 通道 Shaker 家族的一个成员, 与拟南芥 ATK1 高度同源 [15] VvCIPK23 可以通过调控 VvK1.1 来实现 K + 在干旱条件下进入果实组织中, 进而调节果实酸度 [15] CIPK 能否直接参与葡萄逆境胁迫响应还不清楚 拟解决的关键问题 本研究拟在葡萄中克隆 VvCIPK10 并进行序列分析, 对其是否具有激酶特性进行鉴定, 并探讨该基因在不同逆境胁迫条件下的表达模式, 为进一步鉴定葡萄 VvCIPK10 在逆境胁迫下的生物学功能及其抗逆分子机制提供理论依据 1 材料与方法 试验于 2015 年在河南科技大学进行 1.1 植物材料与试验处理于 2015 年在河南科技大学试验基地取样 植物材料为 4 6 年生篱架栽培 京秀 葡萄, 果实于转色期取样, 根系 ( 第一侧根 ) 茎 ( 第 3 4 片新展开叶之间的茎段 ) 叶 ( 第 3 4 片新展开叶 ) 卷须( 新生第 1 卷须 ) 和花序在盛花前期采样 取样后液氮速冻, 及时提取总 RNA, 反转录为 cdna 后 -80 条件下保存备用 京秀 葡萄组培苗继代培养 20 d, 选择生长健壮一致的瓶苗用于逆境胁迫处理 组培苗正常生长条件 : 温度为 (24±1) 相对湿度为 75% 光周期为光照 14 h/ 黑暗 10 h 从培养基中拔出幼苗置于培养皿( 不盖盖子 ), 暴露于正常生长条件下进行干旱处理 将瓶苗置于 4 条件下进行低温处理 在培养瓶中加入 20 ml 100 mmol L -1 的 NaCl 溶液进行盐胁迫处理 正常培养条件下的组培苗作为干旱和低温胁迫的对照 在培养瓶中加入 20 ml 蒸馏水作为盐胁迫的对照 试验组和对照组分别于处理后 和 24 h 取样 取样后液氮速冻, 提取总 RNA 后反转录 为 cdna,-80 条件下保存备用 1.2 总 RNA 提取与反转录葡萄不同组织总 RNA 提取按照 plus 植物总 RNA 提取试剂盒 ( 天根生化科技有限公司, 北京 ) 说明书进行 反转录按照 PrimeScriptII 1st Strand cdna Synthesis Kit(TaKaRa, 大连 ) 说明书进行 1.3 VvCIPK10 的克隆与序列分析以葡萄 VvCIPK10 的部分 cdna 序列为种子序列 (GenBank 登录号 :NM_ ), 在 NCBI 网站的 EST 数据库中进行 BLAST 检索, 下载同源性在 95% 以上的 EST 序列, 利用 SeqMan 软件进行拼接, 获得葡萄 VvCIPK10 的电子序列 依据此电子序列, 用 Primer Premier 5.0 软件设计特异引物 P1:5 -GGAGAG AGGGGTGTTCGATCTCTG-3 和 P2:5 -GCGCTAAC CAGAACATTTAATCGC-3 用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 进行 PCR 反应, 具体反应体系和反应程序参考使用说明书 PCR 产物经 1.2% 的琼脂糖凝胶电泳, 回收目标片段, 连接至 pmd19-t 载体, 转化 TOP10 感受态细胞, 经抗生素和蓝白斑筛选, 挑取阳性克隆送公司测序验证 利用 NCBI 网站的 ORF Finder 在线软件分析 VvCIPK10 的开放阅读框 用 NCBI 网站的 BLASTn 和 BLASTp 在线软件进行同源性分析 用 ExPASy 网站的 PROSITE 和 NCBI 网站的 CD search 进行保守结构域预测分析 用 ExPASy 网站的 Compute pi/mw 程序分析氨基酸序列的分子量和理论等电点 1.4 原核表达载体和瞬时表达载体构建根据葡萄 VvCIPK10 开放阅读框设计引物, 构建原核表达载体用引物 P3:5 -GGGGTCGACATGCCAG AGATCGAACGCGGCTC-3 ( 下划线为 Sal I 酶切位点 ) 和 P4:5 -GGGGAATTCTTAATCGATCAATTTG AACCCCG-3 ( 下划线为 EcoR I 酶切位点 ), 构建瞬时表达载体用引物 P5:5 -AGCATCTAGAATGCCAG AGATCGAACGCGGCTC-3 ( 下划线为 Xba I 酶切位点 ) 和 P6:5 -ATGCTGGTACCTTAATCGATCAATTT GAACCCCG-3 ( 下划线为 Kpn I 酶切位点 ) 以 pmd19-t/vvcipk10 质粒为模板, 用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 进行 PCR 反应 用 Sal I 和 EcoR I 双酶切 PCR 产物和 pmal-c5x 原核表达载体, 用 Xba I 和 Kpn I 双酶切 PCR 产物和 pbi221-gfp 瞬时表达载体, 分别回收目标片段后进行连接反应, 转化 TOP10 感受态细胞, 经抗性筛选后挑取阳性克隆, 提取质粒用双酶切进行鉴定, 含有目标片段的重组载体

160 19 期余义和等 : 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 3801 经测序验证 1.5 原核表达与蛋白纯化重组载体 pmal-c5x/vvcipk10 转化 BL21 感受态细胞, 经氨苄青霉素 (100 mg L -1 ) 筛选, 挑取单克隆进行 PCR 检测 阳性克隆接种至 LB 液体培养基中 ( 含 100 mg L -1 氨苄青霉素 ),37 振荡培养过夜 次日以 1:50 的比例接种至新鲜 LB 液体培养基中, 37 振荡培养至 OD 600 值为 0.6 左右, 加入终浓度为 0.1 mmol L -1 的 IPTG 诱导培养 4 h, 以不加 IPTG 诱导的 pmal-c5x/vvcipk10 和 pmal-c5x 空载体作为对照 r/min 离心 2 min 收集菌体, 加入等体积的 2 倍上样缓冲液悬浮细胞, 沸水浴 5 min, 样品冷却后 r/min 离心 1 min, 取适量样品进行 SDS-PAGE( 浓缩胶浓度为 5%, 分离胶浓度为 12%) 电泳分析 PBS(pH 7.4) 缓冲液重悬诱导表达的菌体, 在冰浴条件下超声波 (100 V 电压,5 S 间隔 ) 处理至菌液粘稠透亮, 制备上样液后经 SDS-PAGE 电泳, 进行蛋白可溶性分析 融合蛋白纯化按照 pmal TM 融合蛋白纯化系统 (NEB) 说明书进行 菌液经 IPTG 诱导后, 用 50 ml 离心管收集菌体,10 ml Column Buffer 重悬沉淀, 于 -20 冷冻过夜 冰浴中解冻后用超声破碎机处理,4 条件下 r/min 离心 20 min, 上清液中加入 5 倍体积的 Column Buffer 即为粗提液 将直链淀粉树脂倒入柱子中, 用 5 倍柱体积的 Column Buffer 洗柱子, 然后加入粗提液,12 倍柱体积的 Column Buffer 洗柱子, 流速为 10 ml min -1, 最后用 Column Buffer+10 mmol L -1 麦芽糖洗脱融合蛋白, 收集流出液, 检测不同收集管中的蛋白浓度 根据浓度需要混合不同收集管的融合蛋白 1.6 蛋白激酶活性分析取纯化过的融合蛋白 4 μg, 加入 0.4 μl 1 mol L -1 Tris-HCl(pH 8.0), 金属离子 10 mmol,ddh 2 O 补齐至 9.5 μl 加入 0.5 μl 5 μci γ-32p-atp 后充分混匀, 30 温浴 30 min 加入等体积的 2 倍上样缓冲液终止反应, 沸水浴 5 min, 样品冷却后 SDS-PAGE 电泳 电泳后转移至 PVDF 膜, 保鲜膜包好后进行压磷屏 1.7 亚细胞定位大量抽提重组质粒 pbi221-gfp/vvcipk10, 纯化后备用 参照 Yoo 等的方法制备拟南芥原生质体 [16], 采用 PEG 介导的方法将重组质粒转化原生质体 取洋葱 5 6 层鳞茎, 剥取内表皮置于培养皿中, 黑暗培养 24 h 金粉包裹重组质粒, 用基因枪介导的方法转化 洋葱表皮细胞 转化后的材料置于 25 条件下光照培养 16 h, 用激光共聚焦显微镜 (ZEISS LSM-510 META,Germany) 进行观察 转化空载体 pbi121-gfp 作为对照 1.8 实时荧光定量 PCR 根据 VvCIPK10 序列设计引物 P7:5 -CCGTCGGT ATTTCCAGCAG-3 和引物 P8:5 -CTTTCGCCCCAT CGTAGC-3 VvAct(GenBank 登录号 :AY680701) 基因作为内参基因, 设计引物 P9:5 -GATTCTGGT GATGGTGTGAGT-3 和引物 P10:5 -GACAATTTC CCGTTCAGCAGT-3 提取葡萄不同组织和逆境处理后不同时间叶片的总 RNA, 反转录 cdna 后稀释 50 倍, 在 Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 进行实时荧光定量 PCR PCR 反应体系和反应程序按照 SYBR Premix Ex Taq TM II 说明书进行 采用 2 -ΔΔCt 法对结果进行相对定量分析 [17], 每个样品重复 3 次 1.9 数据处理与分析采用 Excel 进行数据处理和作图, 用 DPS 7.05 软件进行显著性检验 2 结果 2.1 葡萄类钙调磷酸酶 B 互作蛋白激酶 VvCIPK10 的克隆与序列分析根据电子克隆获得的基因序列设计引物, 以 京秀 葡萄叶片 cdna 为模板进行 PCR 扩增, 结果得到与预期片段大小一致的产物 测序结果表明 VvCIPK10 5 端非编码区为 30 bp,3 端非编码区为 156 bp, 开放阅读框为 bp, 编码 436 个氨基酸, 理论等电点为 8.59, 分子量为 48.7 kda(genbank 登录号为 KT001237) 保守结构域预测分析显示该蛋白 5 端具有一个激酶结构域,3 末端具有一个 PPI 结构域, 中间具有一个 NAF 结构域 经 BLSATP 分析显示, 所获得的葡萄 VvCIPK10 蛋白与桃树 (XP_ ) 苹果 (XP_ ) 草莓(XP_ ) 和拟南芥 (NP_180595) 在氨基酸水平上一致性分别达到 74% 72% 70% 和 65% 2.2 VvCIPK10 的原核表达以葡萄叶片 cdna 为模板, 用特异引物扩增 VvCIPK10 的开放阅读框, 通过 T/A 克隆连接到 pmd19-t 载体上, 获得重组质粒 pmd19-t/vvcipk10, 测序验证 VvCIPK10 开放阅读框序列 用 EcoR I 和 Hind III 双酶切重组载体 pmd19-t/vvcipk10 和原核

161 3802 中国农业科学 49 卷 表达载体 pmal-c5x, 分别回收 VvCIPK10 开放阅读框目标片段和 pmal-c5x 载体骨架片段, 连接后形成重组载体 pmal-c5x/vvcipk10 用 EcoR I 和 Hind III 双酶切重组载体 pmal-c5x/vvcipk10, 结果获得与 VvCIPK10 开放阅读框序列大小一致的目标片段 ( 图 1), 说明原核表达载体构建完成, 可用于下一步原核表达试验 bp M 1 2 M:DNA 分子量标准 ;1: 重组质粒 pmal-c5x/vvcipk10;2:ecor I 和 Hind III 双酶切重组质粒 pmal-c5x/vvcipk10 M: DNA molecular weight standard; 1: Recombinant plasmid pmal-c5x/vvcipk10; 2: Recombinant plasmid pmal-c5x/vvcipk10 digested with EcoR I and Hind III 图 1 重组质粒 pmal-c5x/vvcipk10 的双酶切鉴定 Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pmal-c5x/ VvCIPK10 by double enzyme digestion 将重组载体 pmal-c5x/vvcipk10 转化至大肠杆菌 BL21, 经菌液 PCR 检测, 挑取阳性克隆摇菌培养, 用 0.1 mmol L -1 的 IPTG 诱导表达后进行 SDS-PAGE 分析 含有 pmal-c5x 空载体的菌株经诱导后, 在 43 kda 的位置产生一条目标带, 说明麦芽糖结合蛋白正确表达 含有重组载体 pmal-c5x/vvcipk10 的菌株经诱导后, 在 90 kda 左右的位置产生一条目标带, 菌体经超声破碎后上清液在相同位置也有目标条带 ( 图 2-A), 说明 VvCIPK10 正确表达并以可溶性蛋白形式表达 将含有可溶性蛋白的上清液用亲和淀粉树脂柱纯化,SDS-PAGE 结果显示在 90 kda 左右的位置产生单一目标带 ( 图 2-B), 说明纯化得到成分单一的 MBP-VvCIPK 融合蛋白 2.3 VvCIPK10 的激酶特性分析 VvCIPK10 具有激酶结构域, 为分析该蛋白是否具有激酶特性, 用纯化获得的 MBP-VvCIPK10 融合蛋白进行体外自磷酸化酶活性分析 结果表明 VvCIPK10 的自磷酸化酶活性依赖于 Mn 2+, 但不依赖于 Mg 2+ 和 Ca 2+, 添加金属离子螯合剂可以抑制 VvCIPK10 的自磷酸化酶活性 ( 图 3) 2.4 VvCIPK10 的亚细胞定位转化空载体 pbi221-gfp 的原生质体和洋葱表皮细胞的细胞核 细胞质和细胞膜上存在荧光信号, 转化重组载体 pbi221-gfp/vvcipk10 的原生质体和洋 A M B M kda kda A: 葡萄 VvCIPK10 在大肠杆菌中的诱导表达 M: 蛋白质分子量标准 ;1: 未经 IPTG 诱导的对照 ;2:IPTG 诱导的对照 ; 3: 未经 IPTG 诱导的重组菌 ;4:IPTG 诱导重组菌的总蛋白 ;5:IPTG 诱导重组菌的可溶性蛋白 B:MBP-VvCIPK10 融合蛋白的纯化泳道 1:IPTG 诱导的对照 ; 泳道 2: IPTG 诱导重组菌的可溶性蛋白 ; 泳道 3: 纯化后的 MBP-VvCIPK10 融合蛋白 A: Induction expression grapevine VvCIPK10 in Escherichia coli.. Lane M: Protein molecular weight standard; Lane 1: Control sample with no IPTG induced; Lane 2: Control sample induced with IPTG; Lane 3: Recombinant E. coli with no IPTG induced; Lane 4: Recombinant E. coli induced with IPTG; Lane 5: Soluble protein induced with IPTG in recombinant E. coli. B: Purification of MBP-VvCIPK10 fusion protein. Lane 1: Control sample induced with IPTG; Lane 2: Soluble protein induced with IPTG in recombinant E. coli ; Lane 3: After purification of MBP-VvCIPK10 fusion protein 图 2 VvCIPK10 在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 Fig. 2 Induced expression and purification of VvCIPK10 in E. coli

162 19 期余义和等 : 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 3803 图 3 VvCIPK10 的自磷酸化酶活性分析 Fig. 3 Analysis of autophosphorylase activity of VvCIPK10 葱表皮细胞的细胞核 细胞质和细胞膜上存在荧光信号 这说明 VvCIPK10 定位在细胞核 细胞质和细胞膜 ( 图 4) 2.5 VvCIPK10 的表达分析 VvCIPK10 在葡萄各个组织中均有表达, 但表达量在不同组织之间存在差异 VvCIPK10 在葡萄茎 花序 果实和卷须中的表达量较低 VvCIPK10 在葡萄根和叶中大量表达, 与茎 花序 果实和卷须中的表达量相比存在显著差异 (P<0.05) 为探讨 VvCIPK10 对不同逆境处理的响应模式, 用低温 干旱和盐胁迫 A: 葡萄 VvCIPK10 在拟南芥原生质体中的亚细胞定位 ;B: 葡萄 VvCIPK10 在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位 A: Subcellular localization of grapevine VvCIPK10 in Arabidopsis thaliana protoplasts; B: Subcellular localization of grapevine VvCIPK10 in onion epidermal cells 图 4 葡萄 VvCIPK10 的亚细胞定位分析 Fig. 4 Subcellular localization analysis of grapevine VvCIPK10 处理葡萄幼苗后, 检测叶片中 VvCIPK10 的表达变化 VvCIPK10 的表达在低温处理后 2 h 开始增加, 6 h 达到最大值, 然后表达量降低, 到 24 h 表达量又恢复到一个较高的水平 VvCIPK10 的表达量在干旱胁迫后 2 h 快速增加, 达到一个峰值, 然后在不同时间点都维持较高的表达水平 盐胁迫后 VvCIPK10 的表达量迅速增加, 在 2 h 就达到峰值, 6 h 下降至较低的表达水平, 在 h 呈现持续增加的模式 ( 图 5) 3 讨论 植物 CBI-CIPK 网络信号系统在逆境胁迫响应过程中具有重要作用 [17-18] CBL 蛋白是植物所特有的小分子 Ca 2+ 感受器 CIPK 是能够与 CBL 相互作用的丝 / 苏氨酸蛋白激酶, 属于第 3 类的 SnRK3(SNF1-related protein kinase 3) [19-20] 在拟南芥中,AtCBL4/SOS3 与 AtCIPK24/SOS2 相互作用, 并与 NHX7/SOS1 共同组成 SOS 信号系统参与拟南芥对盐胁迫的调控 [9-10]

163 3804 中国农业科学 49 卷 A c B b 对照 Mock 干旱 Drought b 60 b b b 相对表达量 Relative expression level 根 Root C a 茎 Stem 对照 Mock 低温 Cold b 叶 Leaf b a 果实 Fruit a 卷须花序 Tendril Inflorescence b a b a D a a a a a b 时间 Time (h) 对照 Mock 盐 Salt b b b a a a a a a a a a a a a 时间 Time (h) 时间 Time (h) A:VvCIPK10 在葡萄不同组织中的表达分析 ;B D: 葡萄 VvCIPK10 对干旱 低温和盐胁迫的响应 不同小写字母表示差异显著 (P<0.05) A: Expression analysis of VvCIPK10 in different tissues of grapevine; B-D: Grapevine VvCIPK10 response to drought, low temperature and salt stress. Different letters within columns represent significantly at 5% level 图 5 葡萄 VvCIPK10 的表达模式分析 Fig. 5 Expression pattern analysis of grapevine VvCIPK10 已有的研究结果表明 CIPK 的表达模式主要分两种 : 一是同一物种内不同的 CIPK 对不同的环境刺激呈现不同的响应模式 [21-22] ; 二是不同物种中的同源 CIPK 对不同刺激的响应模式 [23-25] 拟南芥 AtCIPK6 可以增强转基因植株对干旱和盐胁迫的抗逆性, 但不能明显改善转基因植株的抗低温能力 [26-27] 苹果 MdCIPK6L 与 AtCIPK6 高度同源,MdCIPK6L 可以对干旱 低温和盐胁迫做出快速响应, 同时在苹果中过量表达可以明显提高转基因植株对干旱 低温和盐胁迫的耐受性 [13,28] 油菜 BnCIPK6 是 AtCIPK6 的另一个同源基因, 该基因可以对干旱 盐和 ABA 处理作出快速响应, 同时,BnCIPK6 启动子活性可以受干旱 盐和 ABA 处理的诱导 [12] 在拟南芥中过量表达 BnCIPK6 可以提高转基因植株抗盐能力, 但没有提高转基因植株抗干旱的能力 [12] VvCIPK10 具有丝 / 苏氨酸蛋白激酶结构的典型特征,N 端具有保守的激酶结构域, 是激活底物的 关键功能域,C 端具有一个 NAF 基序 ( 也称为 FISL 基序 ) 和一个蛋白磷酸酶互作 (protein phosphatase interaction,ppi) 基序 CBL 与 CIPK 的 NAF 基序结合可以解除其对 CIPK 活性的抑制, 从而激发 CIPK 的自磷酸化和磷酸化活性, 使 CIPK-CBL 复合体具有活性功能, 进而使复合体处于激活状态 [29-30] PPI 结合位点能够与蛋白磷酸酶 2C(PP2C)ABI 的 N 端相互作用, 如 CIPK24 和 CIPK8 能够与 ABI2 相互作用,CIPK20 与 ABI1 相互作用 [4] 为分析 VvCIPK10 的激酶特性, 笔者在大肠杆菌中表达了 MBP-VvCIPK10 融合蛋白, 纯化后进行了自磷酸化分析, 结果显示 VvCIPK10 的自磷酸化依赖于 Mn 2+, 但不依赖于 Ca 2+ 和 Mg 2+, 同时 EDTA 可以抑制 VvCIPK10 依赖于 Mn 2+ 的自磷酸化活性 亚细胞定位结果显示 VvCIPK10 主要定位在细胞核 细胞膜和细胞质中, 这与 CIPK 在细胞中的定位特性是一致的 体外激酶活性和亚细胞定位试验表明 VvCIPK10 是一

164 19 期余义和等 : 葡萄类钙调磷酸酶 B 亚基互作蛋白激酶 VvCIPK10 的特性与表达 3805 个典型的丝 / 苏氨酸蛋白激酶 在电子克隆 VvCIPK10 的过程中发现, 与 VvCIPK10 高度同源的 6 条 EST 序列均是受非生物胁迫诱导的 用干旱 低温和盐胁迫逆境处理葡萄幼苗后,VvCIPK10 的表达都呈现诱导表达模式 不同逆境处理的表达模式略有不同, 其中干旱胁迫对 VvCIPK10 的表达影响最为明显, 说明 VvCIPK10 有可能主要参与抗旱反应 小麦 TaCIPK29 的表达受盐 低温和干旱胁迫的诱导, 其中受盐胁迫表达变化更明显, 在烟草中过量表达导致转基因植株抗盐胁迫能力提高 [11] 通过转基因试验分析 VvCIPK10 的耐胁迫能力以及 VvCIPK10 如何响应逆境有待进一步研究 4 结论 葡萄 VvCIPK10 的自磷酸化酶活性依赖于 Mn 2+, 但不依赖于于 Mg 2+ 和 Ca 2+ VvCIPK10 定位在细胞核 细胞膜和细胞质 VvCIPK10 在葡萄各个组织中均有表达, 主要在葡萄根和叶片中大量表达 在干旱 低温和盐胁迫处理后, 葡萄 VvCIPK10 呈现受诱导表达模式 研究结果为进一步研究 VvCIPK10 参与逆境胁迫的分子功能, 以及为探讨葡萄抗逆分子机制提供了参考 References [1] 贺普超. 葡萄学. 北京 : 中国农业出版社, 1999: HE P C. Viticulture. Beijing: China Agriculture Press, 1999: (in Chinese) [2] 汤湖斌, 闵康康, 徐玲玲, 胡海涛, 杨玲, 王长春. CBL-CIPKs 信号系统的研究进展. 中国细胞生物学学报, 2015, 37(1): TANG H B, MIN K K, XU L L, HU H T, YANG L, WANG C C. Research progress in CBL-CIPKs signaling system. Chinese Journal of Cell Biology, 2015, 37(1): (in Chinese) [3] 沈金秋, 郑仲仲, 潘伟槐, 潘建伟. 植物 CBL-CIPK 信号系统的功能及其作用机理. 植物生理学报, 2014, 50(4): SHEN J Q, ZHENG Z Z, PAN W H, PAN J W. Functions and action mechanisms of CBL-CIPK signaling system in plants. Plant Physiology Journal, 2014, 50(4): (in Chinese) [4] LUAN S. The CBL-CIPK network in plant calcium signaling. Trends in Plant Science, 2009, 14(1): [5] WEINL S, KUDLA J. The CBL-CIPK Ca 2+ -decoding signaling network: function and perspectives. New Phytologist, 2009, 184(3): [6] LUAN S, LAN W, LEE S C. Potassium nutrition, sodium toxicity, and calcium signaling: connections through the CBL-CIPK network. Current Opinion in Plant Biology, 2009, 12(3): [7] BATISIC O, WAADT R, STEINHORST L, HELD K, KUDLA J. CBL-mediated targeting of CIPKs facilitates the decoding of calcium signals emanating from distinct cellular stores. The Plant Journal, 2010, 61(2): [8] YU Q, AN L, LI W. The CBL-CIPK network mediates different signaling pathways in plants. Plant Cell Reports, 2014, 33(2): [9] LIU J, ISHITANI M, HALFTER U, KIM C S, ZHU J K. The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2000, 97(7): [10] HALFTER U, ISHITANI M, ZHU J K. The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calciumbinding protein SOS3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2000, 97(7), [11] DENG X M, HU W, WEI S Y, ZHOU S Y, ZHANG F, HAN J P, CHEN L H, LI Y, FENG J L, FANG B, LUO Q C, LI S S, LIU Y Y, YANG G X, HE G Y. TaCIPK29, a CBL-Interacting protein kinase gene from wheat, confers salt stress tolerance in transgenic tobacco. PLoS ONE, 2013, 8(7): e [12] HEN L, REN F, ZHOU L, WANG Q Q, ZHONG H, LI X B. The Brassica napus calcineurin B-Like 1/CBL-interacting protein kinase 6 (CBL1/CIPK6) component is involved in the plant response to abiotic stress and ABA signaling. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(17): [13] WANG R K, LI L L, CAO Z H, ZHAO Q, LI M, ZHANG L Y, HAO Y J. Molecular cloning and functional characterization of a novel apple MdCIPK6L gene reveals its involvement in multiple abiotic stress tolerance in transgenic plants. Plant Molecular Biology, 2012, 79(1/2): [14] TRIPATHI V, PARASURAMAN B, LAXMI A, CHATTOPADHYAY D. CIPK6, a CBL-interacting protein kinase is required for development and salt tolerance in plants. The Plant Journal, 2009, 58(5): [15] CUELLAR T, PASCAUD F, VERDEIL J L, TORREGROSA L, ADAM-BLONDON A F, THIBAUD J B, ADAM-BLONDON A, THIBAUD J, SENTENAC H, GAILLARD I. A grapevine Shaker inward K + channel activated by the calcineurin B-like calcium sensor 1-protein kinase CIPK23 network is expressed in grape berries under drought stress conditions. The Plant Journal, 2010, 61(1): [16] YOO S D, CHO Y H, SHEEN J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A

165 3806 中国农业科学 49 卷 versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols, 2007, 2(7): [17] LIVAD K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 -ΔΔCt method. Methods, 2001, 25(4): [18] THODAY-KENNEDY E L, JACOBS A K, ROY J. The role of the CBL-IPK calcium signalling network in regulating ion transport in response to abiotic stress. Plant Growth Regulation, 2015, 76(1): [19] SYANYAL S K, PANDEY A, PANDEY G K. The CBL-IPK signaling module in plants: a mechanistic perspective. Physiologia Plantarum, 2015, 155(2): [20] CROZET P, MARGALHA L, CONFRARIA A, RODRIGUES A, MARTINHO C, ADAMO M, BAENA-GONZALEZ E. Mechanisms of regulation of SNF1/AMPK/SnRK1 protein kinases. Frontiers in Plant Science, 2014, 5: 190. [21] KRZYWINSKA E, BUCHOLC M, KULIK A, CIESIELSKI A, LICHOCKA M, DEBSKI J, DOBROWOLSKA G. Phosphatase ABI1 and okadaic acid-sensitive phosphoprotein phosphatases inhibit salt stress-activated SnRK2. 4 kinase. BMC Pant Biology, 2016, 16(1): 136. [22] ZHANG H, YIN W, XIA X. Calcineurin B-Like family in Populus: comparative genome analysis and expression pattern under cold, drought and salt stress treatment. Plant Growth Regulation, 2008, 56(2): [23] KOLUKISAOGLU U, WEINL S, BLAZEVIC D, BATISTIC O, KUDLA J. Calcium sensors and their interacting protein kinases: genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks. Plant Physiology, 2004, 134(1): [24] KURUSU T, HAMADA J, NOKAJIMA H, KITAGAWA Y, KIYODUKA M, TAKAHASHI A, HANAMATA S, OHNO R, HAYASHI T, OKADA K, KOGA J. Regulation of microbe-associated molecular pattern-induced hypersensitive cell death, phytoalexin production, and defense gene expression by calcineurin B-like protein-interacting protein kinases, OsCIPK14/15, in rice cultured cells. Plant Physiology, 2010, 53(2): [25] D'ANGELO C, WEINL S, BATISTIC O, PANDEY G, CHEONG Y, SSHULTKE S, ALBRECHT V, EHLERT B, SCHULZ B, HARTER K, LUAN S. Alternative complex formation of the Ca 2+ - egulated protein kinase CIPK1 controls abscisic acid-dependent and independent stress responses in Arabidopsis. The Plant Journal, 2006, 8(6): [26] CHEN L, WANG Q Q, ZHOU L, REN F, LI D D, LI X B. Arabidopsis CBL-interacting protein kinase (CIPK6) is involved in plant response to salt/osmotic stress and ABA. Molecular Biology Reports, 2013, 40(8): [27] TRIPATHI V, PARASURAMAN B, LAXMI A, CHATTOPADHYAY D. CIPK6, a CBL interacting protein kinase is required for development and salt tolerance in plants. The Plant Journal, 2009, 58(5): [28] HU D G, MA Q J, SUN C H, SUN M H, YOU C X, HAO Y J. Overexpression of MdSOS2L1, a CIPK protein kinase, increases the antioxidant metabolites to enhance salt tolerance in apple and tomato. Physiologia Plantarum, 2016, 156(2): [29] TANG R J, ZHAO F G, GARCIA V J, KLEIST T J, YANG L, ZHANG H X, LUAN S. Tonoplast CBL-IPK calcium signaling network regulates magnesium homeostasis in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2015, 112(10): [30] HASHIMOTO K, ECKERT C, ANSCHUTZ U, SCHOLZ M, HELD K, WAADT R, REYER A, HIPPLER M, BECKER D, KUDLA J. Phosphorylation of calcineurin B-like (CBL) calcium sensor proteins by their CBL-interacting protein kinases (CIPKs) is required for full activity of CBL-CIPK complexes toward their target proteins. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(11): ( 责任编辑赵伶俐 )

166 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 薄晓培 1, 王梦馨 1, 崔林 1, 王金和 2, 韩宝瑜 1 ( 1 中国计量大学浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室, 杭州 ; 2 江苏吟春碧芽股份有限公司, 江苏丹阳 ) 摘要 : 目的 探讨 2 个茶树品种可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸等 3 类渗透调节物质含量变化及其与冬春期间气温的相关性, 评价其对低温的响应程度及其品种间的差别 方法 选早芽品种 平阳特早 和 中茶 102, 连续 2 年于 10 月 21 日至翌年 4 月 5 日逐日记载茶梢间气温, 每天 8:00 14:00 20:00 记录干湿球温度计的温度, 每日 3 次测得的每块茶园 3 支干球温度计的平均值即为当日茶梢生境气温 ; 测温期间每月 5 日 15 日 25 日采摘成叶, 以蒽酮比色法测定茶鲜叶可溶性糖含量, 将剩余擦拭干净的鲜叶蒸青 烘干制成蒸青茶样, 用 SDE-HPLC 方法测定茶干叶脯氨酸和游离氨基酸含量 结果 根据茶树的发育起点温度和休眠温度, 将试验阶段分为越冬期 (2013/10/ /3/5,2014/10/ /3/5) 和早春期 (2014/3/6 2014/4/5,2015/3/6 2015/4/5)2 个阶段 1 连续 2 年试验的越冬期间 (2013/10/ /3/5,2014/10/ /3/5), 气温先逐渐下降, 再持续低温 ;2 个品种成叶的可溶性糖含量相应地升高 再升高, 与旬平均气温显著负相关 ; 脯氨酸含量升高 保持, 与旬平均气温显著负相关 ; 游离氨基酸含量则为下降 保持, 与旬平均气温显著正相关 ; 当温度出现最低值时, 可溶性糖含量和脯氨酸含量相应出现最高值, 游离氨基酸含量也跟随着出现最低值, 而当温度出现最高值时, 可溶性糖含量和脯氨酸含量随后也就相应地出现最低值, 游离氨基酸含量随之也相应地出现最高值 22 年试验的早春期间 (2014/3/6 2014/4/5,2015/3/6 2015/4/5) 气温渐升, 可溶性糖含量趋于减少, 脯氨酸 游离氨基酸含量趋于增加 ;3 茶树抗冻性与温度密切相关, 茶鲜叶可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸含量与茶树的抗冻性密切相关,2 年越冬期间, 与 中茶 102 相比, 在遭受冬季低温胁迫时, 平阳特早 3 类渗透调节物质对低温的响应性 响应幅度分别更灵敏 更大, 平阳特早 3 类渗透调节物质含量稍多 结论 深秋至清明期间茶树易受冻害和倒春寒, 其中越冬期间可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸皆能敏感地响应低温变化, 三者含量分别与旬平均气温显著相关, 是茶树的重要抗冻指标 ; 平阳特早 品种对于低温响应程度大于 中茶 102 关键词 : 低温 ; 茶树 ; 冻害 ; 可溶性糖 ; 脯氨酸 ; 游离氨基酸 Evaluation on Correlations of Three Kinds of Osmoregulation Substances in Tea Fresh Leaves with Low Temperature During Winter and Spring Respectively and Their Difference Among Cultivars BO Xiao-pei 1, WANG Meng-xin 1, CUI Lin 1, WANG Jin-he 2, HAN Bao-yu 1 ( 1 Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, China Jiliang University, Hangzhou ; 2 Jiangsu Yinchunbiya Tea Co. Ltd, Danyang , Jiangsu) Abstract: Objective The content dynamics of three types of osmoregulation substances in fresh leaves of two cultivars of 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 863 计划 (2012AA10A508) 联系方式 : 薄晓培, @qq.com 通信作者韩宝瑜,Tel: ; han-insect@263.net

167 3808 中国农业科学 49 卷 tea plants and their correlations with air temperatures during winter and early spring were investigated, to evaluate the differences in their responsiveness to the low temperature between the two tea cultivars. Method Two early bud tea cultivars, Pingyangtezao and Zhongcha 102, were chosen, and air temperatures around their tea shoots were recorded every day from Oct. 21 to April 5 for two consecutive years. The temperature of the dry and wet bulb thermometer at 8:00, 14:00 and 20:00 was daily recorded, and the average of the three dry bulb thermometers set in the experimental tea plantations three times per day standard for the temperature of tea shoot habitat. During these two testing periods adult tea leaves of each cultivar were sampled on the fifth, fifteenth and twenty-fifth days of each month. The soluble sugar contents in the tea fresh leaves were measured by anthrone colorimetric method, the remaining clean fresh leaves were processed into the steamed green tea samples, whereas the contents of proline and free amino acids were determined by SDE-HPLC method. Result The test phase was divided into two stages, the overwintering period (2013/10/ /3/52014/10/ /3/5) and early spring period (2014/3/6-2014/4/52015/3/6-2015/4/5) according to the developmental threshold temperature and the dormancy temperature of the tea plant. Accompanied with initial gradual drops and then maintaining at low air temperatures during the two winters (2013/10/ /3/5, 2014/10/ /3/5), the soluble sugar contents in fresh tea leaves of the two cultivars increased continuingly, negatively correlated with the 10-day average air temperatures. The proline contents increased first and then kept at a high level, also negatively correlated with the 10-day average air temperatures. The free amino acid contents dropped first and then stayed at a low level, which was positively correlated with the 10-day average air temperatures. When the temperature appeared the lowest value, the content of soluble sugars and the content of proline also correspondingly appeared the highest values subsequently, then the content of free amino acids also correspondingly appeared the lowest value. When the temperature was the highest value, the content of soluble sugar and the content of proline also correspondingly appeared the lowest value later, the content of the free amino acids also correspondingly appeared the highest value soon afterwards. During the two spring seasons (2014/3/6-2014/4/5, 2015/3/6-2015/4/5), as air temperatures increased gradually, the soluble sugar contents decreased, while the proline and the free amino acid contents appeared to increase. The frost-resistance of tea plant closely related with air temperature, and soluble sugar, the contents of proline and free amino acids in tea leaves closely related with the frost-resistance of tea plants. During the two winter seasons, compared with Zhongcha 102, when suffered from the low temperature stress in winter, the content of each of three kinds of osmoregulation substances of Pingyangtezao more sensitively responsed to low temperature than Zhongcha 102, and the contents of the three kinds of substances in cultivar Pingyangtezao were slightly high. Conclusion Tea plants are vulnerable to frost, freeze and the late spring coldness from late autumn to Qingming Festival. As important cold-resisting indices of tea plants, the contents of soluble sugars, proline and the free amino acids varied sensitively in responses to the low temperatures, and showed significant correlations with the 10-day average air temperatures during the winter and early spring seasons. The responsiveness of cultivar Pingyangtezao to the low temperatures was greater than that of cultivar Zhongcha 102. Key words: low temperature; Camellia sinensis L.; cold damage; soluble sugar; proline; free amino acids 0 引言 研究意义 近年来, 中国江北和江南茶区茶园面积持续扩展, 而深秋至早春的极度严寒和 倒春寒 不期而至, 常常导致大片茶园受冻 [1-2] 早春日平均气温高于 10 时, 茶芽开始萌动, 代谢活动增强, 假以时日即可采制高档茶叶 然而萌动了的茶芽抗寒性减弱, 若气温骤降, 则会受冻而死, 延迟大批茶芽的萌发并降低萌发率, 进而导致春茶减产和品质降低 [3-4] 前人研究进展 茶树具备抗冻生理生化机制, 茶鲜叶脯氨酸 可溶性蛋白和可溶性糖含量随气温的降低皆呈先升后降的变化趋势, 但不同茶树品种响应低温胁迫的温度范围有所不同 [5] 有研究者认为可溶性糖含量高低可作为判断茶树品种或新梢抗寒性 强弱的一个指标 [6] 也有研究者指出冷驯化中茶树体内脯氨酸含量变化是对外界条件变化的一种综合反应, 很难说明单一的脯氨酸含量与抗寒力之间的因果关系 [7] 还有研究者认为可溶性糖和脯氨酸都是植物体内重要的抗寒物质 [8-10] 本研究切入点 关于脯氨酸含量与茶树抗寒性的关系, 目前的研究还存在异议 ; 而且关于游离氨基酸含量与茶树抗寒性的研究较少 ; 茶树抗寒特早生品种的选育一直成为炙手可热的 [11] 话题 为探讨茶树抗冻的物质基础, 田野等从 2013 年深秋至 2014 年早春研究了 乌牛早 和 茂绿 品种抗冻性, 检测了成叶中可溶性糖 脯氨酸 游离氨基酸含量与冬春气温相关性, 发现这 3 类物质与低温密切相关, 可作为茶树 抗冻指标, 且可溶性糖含量与温度相关性更密切, 乌牛早 抗性强于 茂绿

168 19 期薄晓培等 : 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 3809 拟解决的关键问题 本研究于 2013 年 10 月 21 日至 2014 年 4 月 5 日 2014 年 10 月 21 日至 2015 年 4 月 5 日连年检测早芽种 [12-13] 平阳特早 和 中茶 102 可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸含量, 分析这 3 类物质分别对于低温响应程度和含量变化, 以及其在这 2 个早芽种成叶中的含量差异, 比较 2 个品种对于低温的敏感性 1 材料与方法 1.1 试验茶园与茶梢生境气温调查方法 2013 年 10 月 21 日至 2014 年 4 月 5 日 2014 年 10 月 21 日至 2015 年 4 月 5 日在中国计量大学试验茶园 ( 北纬 , 东经 , 海拔 11 m) 选 平阳特早 和 中茶 个茶树品种, 树龄 6 年, 树高 95 cm 树幅宽 100 cm 每个品种园约为 80 m 2 正方形, 在每块试验茶园单对角线的茶丛内各放 3 支干湿球温度计, 贴近茶梢, 温度计顶端与茶芽平齐 每天 8:00 14:00 20:00 记录干湿球温度计的温度和湿度, 每日 3 次测得的每块茶园 3 支干球温度计的平均值即为当日茶梢生境气温 1.2 茶鲜叶 3 类渗透调节物质的检测 样品可溶性糖检测试验期间的每月 5 日 15 日 25 日采集茶芽下第 2 至 6 片叶, 用干净湿润的纱布轻轻擦去叶面灰尘 称取 g 鲜叶, 剪碎放入具塞试管中, 加 10 ml 蒸馏水, 浸入沸水中提取 1 h, 冷却后 r/min 离心 10 min, 上清液即为待测液 采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量 每个样品重复 6 次, 平均值即为当日检测值 样品氨基酸检测将剩余擦拭干净的鲜叶蒸青 烘干制成蒸青茶样 将蒸青样研磨均匀, 称取 g 茶粉放入 100 ml 具塞锥形瓶中, 加入 75 ml 蒸馏水, 摇匀, 于沸水中提取 1 h 冷却后,2 000 r/min 离心 5 min, 取上清液用 0.45 µm 微孔滤膜过滤, 吸 600 µl 滤液至 2 ml 离心管, 加入 0.2 mol L -1 PITC- 乙腈溶液 1 mol L -1 三乙胺 - 乙腈溶液各 200 µl, 混匀, 室温放置 1 h 加正己烷 400 µl, 涡旋振荡 30 s, 静置 10 min, 取下层溶液至棕色小瓶, 即为待测液 每个样品重复 3 次 采用高效液相色谱法测定脯氨酸 [11] 和 17 种游离氨基酸含量 色谱条件参照田野等的方法并改进 氨基酸定量分析 : 用 50% 的乙腈将氨基酸标准品原液进行不同浓度梯度的稀释, 分别稀释 10 倍 20 倍 50 倍 100 倍, 用高效液相色谱法测定峰面积, 将不同浓度梯度的标准品按其峰面积和浓度制做成标准曲线, 根据测得样品的峰面积, 通过标准曲线计算出样品中氨基酸的含量 1.3 数据处理茶树发育起点温度是 10, 严冬来临时日平均温度低于 10 则开始休眠, 早春时节高于 10 茶树便开始发芽 [14], 因此, 将试验阶段分为越冬期 (2013/10/ /3/5,2014/10/ /3/5) 和早春期 (2014/3/6 2014/4/5,2015/3/6 2015/4/5)2 个阶段 以 ORIGIN 软件作出渗透调节物质含量 (g g -1 )- 气温关系图, 观察各类渗透调节物质含量随着气温的变化趋势, 比较 2 个供试品种之间渗透调节物质含量的差异 为便于数值分析, 文中各类物质含量皆用百分含量 ; 以旬平均气温为自变量 x, 以各类渗透调节物质含量分别为因变量 y, 用 DPS 软件求出相关系数并检验显著性, 建立回归方程 2 结果 2.1 越冬期和早春期 2 个品种茶鲜叶可溶性糖含量动态及其与气温关系依据茶树发育起点为 10 的标准, 将越冬期分为第 1 阶段 (2013/10/ /12/5 和 2014/10/ /12/5) 和第 2 阶段 (2013/12/6 2014/3/5 和 2014/12/6 2015/3/5), 其中第 1 阶段为深秋至初冬时期, 气温持续下降, 日均温 10 ; 第 2 阶段为寒冷的严冬期间, 日均温 年严冬期间, 气温变幅剧烈, 还有 3 d 日平均气温低于 0, 即 (2013/12/27) (2013/12/28) 和 (2014/2/10), 平均气温 6.42 ; 年严冬期间气温变化相对平缓且日均温均在 0 以上, 最低温度为 1.97 (2015/1/1), 平均温度 6.98 早春期(2014/3/6 2014/4/5 和 2015/3/6 2015/4/5) 温度呈上升趋势, 日均温 10, 茶芽逐渐萌发 ( 图 1) 年越冬期间, 中茶 102 可溶性糖平均百分含量 (4.19%) 低于 平阳特早 (4.68%) 第 1 阶段 (2013/10/ /12/5), 中茶 102 和 平阳特早 可溶性糖含量逐渐上升, 该阶段 中茶 102 从 g g -1 (2013/10/25) 增加为 g g -1 (2013/12/5), 上升了 24.87%, 平阳特早 从 g g -1 (2013/10/25) 增加为 g g -1 (2013/12/5), 上升了 68.90% 第 2 阶段 (2013/12/6 2014/3/5), 中茶 102 平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平

169 3810 中国农业科学 49 卷 均含量 g g -1 上升了 20.54%, 平阳特早 平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 上升了 38.77% 当最低气温在 2013/12/ /12/28 和 2014/2/10 出现, 分别为 和 时, 相应地 中茶 102 可溶性糖百分含量在 2014/1/5 出现 1 个峰值 (4.93%) 在 2014/2/15 再出现 1 个峰值 (4.95%); 而 平阳特早 在 2014/2/15 也出现 1 个峰值 (7.95%) 在 2014 年 1 月底气温突然升高时, 中茶 102 可溶性糖百分含量在 2014/2/5 出现低谷 (3.42%), 平阳特早 在 2014/2/5 也出现低谷 (3.23%) 早春期间 (2014/3/6 2014/4/5), 中茶 102 可溶性糖平均含量 (4.53%) 高于 平阳特早 (4.19%) ( 图 1) 年越冬期间, 中茶 102 可溶性糖平均百分含量 (5.30%) 高于 平阳特早 可溶性糖平均百分含量 (4.91%) 第 1 阶段 (2014/10/ /12/5), 中茶 102 可溶性糖含量从 g g A 温度 Temperature 中茶 102 Zhongcha102 平阳特早 Pingyangtezao 温度 Temperature ( ) B 可溶性糖含量 Content of soluble sugar (g g -1 ) 日期 Date 图 1 越冬期和早春期 2 个品种茶鲜叶可溶性糖含量波动及其与温度关系 Fig. 1 Fluctuation in the contents of soluble sugars in tea fresh leaves of two cultivars and their correlation with temperature during overwintering and early spring stage

170 19 期薄晓培等 : 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 3811 (2014/10/25) 升至 g g -1 (2014/12/5), 升高了 1.2 倍 ; 平阳特早 的可溶性糖含量从 g g -1 (2014/10/25) 上升至 g g -1 (2014/12/5), 升高了 1.5 倍 ; 第 2 阶段 (2014/12/6 2015/3/5), 中茶 102 平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 上升了 89.13%; 平阳特早 平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 上升了 99.13% 在 2015 年 2 月 15 日温度骤然升高,2 种茶树的可溶性糖含量在 2 月 25 日分别下 降了 21.47%( 中茶 102 ) 和 29.13%( 平阳特早 ) 在早春阶段 (2015/3/6 2015/4/5), 中茶 102 可溶性糖的平均百分含量 (4.26%) 高于 平阳特早 (2.73%) 2.2 越冬期和早春期 2 个品种茶鲜叶脯氨酸含量动态及其与气温关系 年越冬期间 ( 图 2), 中茶 102 的脯氨酸平均百分含量 0.13% 高于 平阳特早 平均 A 温度 Temperature 中茶 102 Zhongcha102 平阳特早 Pingyangtezao 温度 Temperature ( ) B 脯氨酸含量 Content of proline (g g -1 ) 日期 Date 图 2 越冬期和早春期 2 个品种茶叶脯氨酸含量波动及其与温度关系 Fig. 2 Fluctuation in the contents of prolines in tea leaves of two cultivars and their correlation with temperature during overwintering and early spring stages

171 3812 中国农业科学 49 卷 百分含量 0.07% 在越冬期第 1 阶段 (2013/10/ /12/5), 中茶 102 的脯氨酸含量由 g g -1 (2013/10/25) 逐渐降至 g g -1 (2013/12/5), 降低了 55.88%, 平阳特早 脯氨酸含量由 g g -1 (2013/10/25) 下降至 g g -1 (2103/12/5), 降低了 33.33% 越冬期第 2 阶段 (2013/12/6 2014/3/5), 中茶 102 脯氨酸平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 下降了 52.63%; 平阳特早 脯氨酸平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 升高了 16.67% 当最低气温在 2013/12/ /12/28 和 2014/2/10 出现, 分别为 和 时, 中茶 102 脯氨酸含量在 2014/1/5 出现 1 个峰值 g g -1 ; 平阳特早 脯氨酸含量在 2014/2/15 出现 1 个峰值 g g -1 在 2014 年 1 月底温度突然升高时,2 个品种茶树的脯氨酸含量在 2014/1/25 同时出现低谷, 皆为 g g -1 早春期间 (2014/3/6 2014/4/5), 中茶 102 的脯氨酸平均百分含量为 0.11%, 是 平阳特早 百分含量 0.05% 的 2 倍 年越冬期间 中茶 102 的脯氨酸平均百分含量为 0.03%, 高于 平阳特早 平均百分含量 0.01% 在越冬期第 1 阶段 (2014/10/ /12/5), 中茶 102 脯氨酸百分含量由 0.06% (2014/10/25) 逐渐降低至 0.03%(2014/12/5), 下降了 50.00%; 平阳特早脯氨酸百分含量由 % (2014/10/25) 升至 %(2014/12/5), 升高了 1.70 倍 在越冬期第 2 阶段 (2014/12/6 2015/3/5), 中茶 102 脯氨酸平均百分含量 %, 比第 1 阶段脯氨酸平均百分含量 % 下降了 31.59%; 平阳特早 脯氨酸平均百分含量 %, 比第 1 阶段平均百分含量 % 升高了 1.10 倍 2015 年 2 月 15 日温度骤然升高,2 种茶树的脯氨酸含量在 2014/2/25 分别下降了 41.07%( 中茶 102 ) 和 31.26% ( 平阳特早 ) 早春阶段(2014/3/6 2014/4/5), 脯氨酸含量有所下降, 中茶 102 的脯氨酸平均百分含量为 %, 比 平阳特早 (0.0047%) 高了 3 倍 2.3 越冬期和早春期 2 个品种茶鲜叶游离氨基酸含量动态及其与气温关系 年越冬期间, 中茶 102 游离氨基酸平均百分含量为 g g -1, 低于 平阳特早 的游离氨基酸平均百分含量 g g -1 在越冬期第 1 阶段 (2013/10/ /12/5), 中茶 102 游离氨基酸含量由 g g -1 (2013/10/25) 降至 g g -1 (2013/12/5), 下降了 34.48%, 平阳特早 由 g g -1 (2013/10/25) 降至 g g -1 (2013/12/5), 下降了 43.75% 在越冬期第 2 阶段 (2013/12/6 2014/3/5), 中茶 102 游离氨基酸的平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 降低了 36.36%; 平阳特早 游离氨基酸的平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 下降了 35.29% 早春时期 (2014/3/6 2014/4/5),2 个茶树品种游离氨基酸含量逐渐上升, 中茶 102 的平均含量 ( g g -1 ) 低于 平阳特早 平均含量 ( g g -1 ) 年越冬期间, 中茶 102 的游离氨基酸平均含量为 g g -1, 低于 平阳特早 平均含量 g g -1 越冬期第 1 阶段 (2014/10/ /12/5), 中茶 102 的游离氨基酸含量由 g g -1 (2014/10/25) 降至 g g -1 (2014/12/5), 下降了 16.28%; 平阳特早 游离氨基酸平均含量由 g g -1 (2014/10/25) 降至 g g -1 (2014/12/5), 下降了 21.74% 在越冬期第 2 阶段 (2014/12/6 2015/3/5),2 个茶树品种的游离氨基酸含量较低, 中茶 102 的游离氨基酸平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段的平均含量 g g -1 下降了 23.53%; 平阳特早 游离氨基酸的平均含量为 g g -1, 比第 1 阶段平均含量 g g -1 下降了 34.09% 在早春阶段 (2015/3/6 2015/4/5), 游离氨基酸含量开始上升, 中茶 102 游离氨基酸的平均含量 ( g g -1 ) 低于 平阳特早 平均含量 ( g g -1 ) 2.4 越冬期和早春期 2 个品种茶鲜叶 3 种渗透调节物质含量与气温的数值相关性以旬平均气温 x 为自变量, 以渗透调节物质含量 y 为因变量, 检验抗冻物质含量与旬平均气温的相关性, 并建立线性回归方程 ( 表 1) 在 2 年试验越冬期间第 1 阶段和第 2 阶段 : 中茶 102 和 平阳特早 的可溶性糖含量分别与旬平均气温显著负相关 ; 中茶 102 和 平阳特早 的脯氨酸含量与旬平均气温显著负相关 ; 中茶 102 和 平阳特早 的游离氨基酸含量与旬平均气温显著正相关 ( 表 1) 2014/3/6 2014/4/5 和 2015/3/6 2015/4/5 分别为 2 年试验的早春期间, 气温逐渐回升, 可溶性糖含量趋向于减少 ( 图 1), 脯氨酸 游离氨基酸含量则分别趋向于增加 ( 图 2 和图 3)

172 19 期薄晓培等 : 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 A 温度 Temperature 中茶 102 Zhongcha102 平阳特早 Pingyangtezao B 温度 Temperature ( ) 游离氨基酸含量 Content of free amino acids (g g -1 ) 日期 Date 图 3 越冬期和早春期 2 个品种茶叶游离氨基酸含量波动及其与温度关系 Fig. 3 Fluctuation in the contents of free amino acids in tea leaves of two cultivars and their correlation with temperature during overwintering and early spring stages 3 讨论 3.1 渗透调节 可溶性糖糖在植物生长中具有重要的调节作用, 当植物受到环境胁迫时, 可溶性糖含量增加并通过渗透调节增强植物的抵抗力 [15-17] 植物受低温胁迫一段时间之后, 膜系统发生一系列生理生化变化, 通透性增大, 膜内可溶性物质外渗, 细胞失水, 植物组织便会受到损伤以致于死亡 [18] 可溶性糖可调节细胞渗透压, 增大保水能力, 能够供给碳源和底物, 诱导其他抗寒 生理生化反应以提高植物的抗寒性 ; 还可以保护蛋白质, 避免蛋白质遭受低温而发生凝固, 以增强植物抗寒性 [19-20] 本研究发现: 在越冬期第 1 阶段, 可溶性糖含量伴随着温度的下降而上升 ; 在越冬期第 2 阶段, 可溶性糖含量继续升高, 最低温出现之后, 可溶性糖含量峰值随后也就出现 ; 当温度突然升高时, 可溶性糖含量快速下降 说明可溶性糖灵敏地响应温度变化 ; 回归分析表明越冬期可溶性糖含量与气温显著负相关 这些与前人研究结果一致 [21-23], 也与田野对于 乌牛早 和 茂绿 品种的研究结果一致 [11] 在早春时

173 3814 中国农业科学 49 卷 表 1 越冬期间 2 个品种茶鲜叶 3 种渗透调节物质与气温的相关性 Table 1 Correlation between air temperature with contents of three types of osmoregulation substances in fresh leaves of two tea cultivars overwintering stage 抗冻物质 Cold-resisting substance 可溶性糖 Soluble sugar 试验时间 Experimental duration 品种 Cultivar 回归方程 Regression equation P 值 P-value 相关系数 Correlation coefficent 中茶 102 Zhongcha102 y= x ** 平阳特早 Pingyangtezao y= x ** 中茶 102 Zhongcha102 y= x ** 平阳特早 Pingyangtezao y= x ** 脯氨酸 Proline 中茶 102 Zhongcha102 y= x * 平阳特早 Pingyangtezao y= x * 中茶 102 Zhongcha102 y= x ** 平阳特早 Pingyangtezao y= x ** 游离氨基酸 Free amino acids 中茶 102 Zhongcha102 y= x ** 平阳特早 Pingyangtezao y= x ** 中茶 102 Zhongcha102 y= x ** 平阳特早 Pingyangtezao y= x ** * 表示在 P<0.05 水平上差异显著,** 表示在 P<0.01 水平上差异显著 * significantly different at P<0.05, ** extremely significant different at P<0.01 期, 温度持续上升, 中茶 102 和 平阳特早 的可溶性糖含量相比越冬期间略有下降, 且与此时期的温度无显著相关性, 中茶 102 可溶性糖平均含量高于 平阳特早 3.2 渗透调节 脯氨酸在越冬期和植物萌芽期, 脯氨酸的累积与植物生长密切相关 [24-25] 脯氨酸作为植物体内一种渗透调节物质, 当植物受到低温胁迫时, 游离脯氨酸能够促进蛋白质的水合作用, 保护酶结构的稳定, 从而保护细胞免受伤害 [19] 植物叶片的脯氨酸含量与植物抗寒力有显著相关性, 抗寒力强的植物在受到一定范围的低 [8, 10, 温胁迫之后, 游离脯氨酸显著增多 26-27] 但也有报道认为植物体内脯氨酸含量与植物抗寒力无显著相关性 [28] 也有研究表明脯氨酸的累积与植物对环境胁迫的响应无显著相关性 [29-30] 本研究表明, 越冬期间, 2 个供试茶树品种鲜叶游离脯氨酸含量变化虽没有可溶性糖明显, 但 年 年越冬期间 2 个品种茶树脯氨酸含量皆分别与旬平均气温显著负相关 ; 并且在越冬期第 2 阶段出现最低温度时,2 个品种茶树脯氨酸含量随着都有明显升高, 在 2014 年 1 月底气温突然升高时 2 个品种茶树脯氨酸含量也随着出现低谷, 比较灵敏地响应温度的变化 认为脯氨酸也是一种重要的渗透调节物质, 促进茶树抗冻, [8, 10, 与前人研究结果一致 26-27] 在早春期间, 中茶 102 的脯氨酸含量高于 平阳特早, 两者的脯氨酸 含量与气温无显著相关性 3.3 渗透调节 游离氨基酸植物抗寒性与可溶性蛋白含量正相关 [31], 植物遭受低温胁迫后, 体内可溶性蛋白遭到破坏而降解, 造成氨基酸的累积 在低温处理过程中, 稻叶内游离氨基酸大量积累, 与可溶性蛋白含量的下降极显著相关 [32] 另有研究表明植物在冷训化过程中游离氨基酸含量增加 [33] 游离氨基酸含量增加, 加大植物 C N 源的供给, 增强蛋白对于水分子束缚, 调节渗透性, 也就增强了抗冻性, 其抗冻机理尚待深入研究 但本研究结果表明, 越冬期茶树鲜叶的游离氨基酸含量变化趋势与气温一致 ; 随着温度最低值的出现, 游离氨基酸含量也相应的达到低谷, 温度升高时, 游离氨基酸含量也逐渐升高, 说明游离氨基酸含量比较敏感地响应温度变化 ; 茶鲜叶游离氨基酸含量与气 [11] 温极显著正相关 田野等也发现 2013 年 10 月 20 日到翌年 4 月 5 日 乌牛早 和 茂绿 品种茶鲜叶游离氨基酸含量与气温正相关, 但未达到显著水平, 可能是品种之间有差异, 试验时间也较短 也有研究证实霜冻胁迫会显著影响茶叶游离氨基酸含量, 在遭受霜冻胁迫时, 游离氨基酸含量下降 [34] 早春期气温升高时, 游离氨基酸含量也相应地升高, 明显高于越冬期含量, 中茶 102 游离氨基酸含量低于 平阳特早

174 19 期薄晓培等 : 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 三类渗透调节物质抗冻性能的初步评判以及 平阳特早 和 中茶 102 抗冻性比较优良的渗透调节物质, 不仅具有增强茶树免于冻害的生物效应, 而且从深秋至严冬乃至早春倒春寒侵袭时能够灵敏地响应低温变化, 具有生物统计学意义的相关性 有研究认为, 茶树抗冻性与温度密切相关, 茶鲜叶可溶性糖 脯氨酸和可溶性蛋白含量与茶树的抗冻性密切相关 [35] 本研究发现, 可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸在茶树体内具有一定含量, 年越冬期间这 3 类物质与气温显著相关, 对于温度的响应程度较大 在越冬期第 1 阶段和第 2 阶段, 平阳特早 可溶性糖含量的升高幅度皆大于 中茶 102 的 ; 在越冬期第 2 阶段 平阳特早 的脯氨酸含量相比第 1 阶段显著升高, 而 中茶 102 的脯氨酸含量相比第 1 阶段略有降低 ; 平阳特早 游离氨基酸含量在越冬期第 1 阶段下降幅度高于 中茶 102, 而在第 2 阶段的平均含量高于中茶 102 与 中茶 102 相比, 在遭受冬季低温胁迫时, 平阳特早 3 类渗透调节物质对低温的响应性 响应程度分别更灵敏 更大, 平阳特早 3 类渗透调节物质含量稍多 即便如此, 茶树品种抗冻性评价是一个复杂问题, [6, 8, 还要结合电导率 酶活等可信的生理生化指标 10] [36] 遗传特性和田间冻害指数等进行综合评价, 可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸含量只是其中的几个参考指标 4 结论 越冬期间可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸皆能敏感地响应空气温度的变化, 三者含量分别与旬平均气温显著负相关 显著负相关和显著正相关, 被认为是茶树的重要渗透调节物质, 可作为抗冻指标 越冬期间, 平阳特早 可溶性糖含量 游离氨基酸含量明显大于 中茶 102, 平阳特早 可溶性糖 脯氨酸和游离氨基酸对于低温的变幅大于 中茶 102 的, 因此, 平阳特早 对低温响应程度大于 中茶 102 References [1] HWANG J G, KIM Y D. A survey low temperature damage of tea tree at South Korea in Korean Journal of Agricultural and Forest Meteorology, 2012, 14(4): [2] 杨俊虎, 张行才, 王超, 陆小强. 气象因子与春茶及中高档春茶产 量的灰色关联分析. 山西农业科学, 2012, 40(1): YANG J H, ZHANG H C, WANG C, LU X Q. Grey connection analysis of spring tea and high-middle grade spring tea yield with meteorological factors. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2012, 40(1): (in Chinese) [3] 朱秀红, 袁洪刚, 郑海涛. 近 45 年山东茶树冻害气候原因分析. 中国茶叶, 2012(3): ZHU X H, YUAN H G, ZHENG H T. Analysis on frozen injury weather of Shandong tea plants. China Tea, 2012(3): (in Chinese) [4] 吴华玲, 陈栋, 李家贤. 广东茶区 倒春寒 冻害情况的调查与反思. 广东农业科学, 2010(7): WU H L, CHEN D, LI J X. Investigation and reflection of late spring coldness frozen injury from Guangdong tea-producing area. Guangdong Agricultural Sciences, 2010(7): (in Chinese) [5] 黄海涛, 余继忠, 王贤波, 张伟, 周铁锋, 敖存. 不同抗寒性茶树品种秋季新梢的生理特性研究. 浙江农业学报, 2014, 26(4): HUANG H T, YU J Z, WANG X B, ZHANG W, ZHOU T F, AO C. Study on physiological characters of new shoot in different cold-resistant tea varieties in autumn. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2014, 26(4): (in Chinese) [6] 李叶云, 庞磊, 陈启文, 周月琴, 江昌俊. 低温胁迫对茶树叶片生理特性的影响. 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 ), 2012, 40(4): LI Y Y, PANG L, CHEN Q W, ZHOU Y Q, JIANG C J. Effects of low temperature stress on physiological characteristics of tea leaves (Camellia sinensis L.). Journal of Northwest A & F University (Natural Sciences Edition), 2012, 40(4): (in Chinese) [7] 孙海伟, 曹德航, 尚涛, 张虹, 刘静, 谢忠琴, 王相涛. 茶树抗寒育种及转基因研究进展. 山东农业科学, 2013, 45(6): , 129. SUN H W, CAO D H, SHANG T, ZHANG H, LIU J, XIE Z Q, WANG X T. Advances in research of cold-resistant breeding and transgene of tea plant. Shandong Agricultural Sciences, 2013, 45(6): , 129. (in Chinese) [8] 张婷, 车凤斌, 潘俨, 胡柏文, 许娟, 李萍. 低温胁迫对核桃枝条几个抗寒生理指标的影响. 新疆农业科学, 2011, 48(8): ZHANG T, CHE F B, PAN Y, HU B W, XU J, LI P. Influence of low temperature stress on several cold resistance indexes of the primary branches of walnuts. Xinjiang Agricultural Sciences, 2011, 48(8): (in Chinese) [9] 李叶云, 舒锡婷, 周月琴, 江昌俊. 自然越冬过程中 3 个茶树品种的生理特性变化及抗寒性评价. 植物资源与环境学报, 2014, 23(3):

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176 19 期薄晓培等 : 茶树 3 类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价 3817 wheat. Xinjiang Agricultural Sciences, 2007, 44(5): (in Chinese) [28] 杨亚军, 郑雷英, 王新超. 冷驯化和 ABA 对茶树抗寒力及其体内脯氨酸含量的影响. 茶叶科学, 2004, 24(3): YANG Y J, ZHENG L Y, WANG X C. Effect of cold acclimation and ABA on cold hardiness, contents of proline in tea plants. Journal of Tea Science, 2004, 24(3): (in Chinese) [29] BORGO L, MARUR C J, Vieira L G E. Effects of high proline accumulation on chloroplast and mitochondrial ultrastructure and on osmotic adjustment in tobacco plants. Acta Scientiarum Agronomy, 2015, 37(2): [30] LÜ B S, MA H Y, LI X W, Wei, LI X, LÜ H Y, YANG H Y, JIANG C J, LIANG Z W. Proline accumulation is not correlated with saline-alkaline stress tolerance in rice seedlings. Agronomy Journal, 2015, 107(1): [31] 梁锁兴, 孟庆仙, 石美娟, 罗钢铁, 王贵珠. 平欧榛枝条可溶性蛋白及可溶性糖含量与抗寒性关系的研究. 中国农学通报, 2015, 31(13): LIANG S X, MENG Q X, SHI M J, LUO G T, WANG G Z. Reasearch on relationship between cold-resistance and soluble protein and sugar of Corylus heterophylla Corylus avellana branches. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(13): (in Chinese) [32] 龚明, 刘友良, 朱培仁. 低温下稻苗叶片中蛋白质及游离氨基酸的变化. 植物生理学通讯, 1989(4): GONG M, LIU Y L, ZHU P R. Changes of proteins and free amino acids in leaves of rice seedlings during chilling stress. Plant Physiology Communications, 1989(4): (in Chinese) [33] KOVACS Z, Simon-Sarkadi L, Sovany C, Kirsch K, Galiba G, Kocsy G. Differential effects of cold acclimation and abscisic acid on free amino acid composition in wheat. Plant Science, 2011, 180(1): [34] 郭湘, 唐茜, 许燕, 陈玖琳, 王自琴. 早春霜冻对不同茶树品种芽叶的生化成分及制茶品质的影响. 云南大学学报 ( 自然科学版 ), 2015(6): GUO X, TANG Q, XU Y, CHEN J L, WANG Z Q. Effect of frost in early spring on biochemical composition and sensory quality of new shoots in different tea cultivars. Journal of Yunnan University(Natural Science Edition), 2015(6): (in Chinese) [35] 林郑和, 钟秋生, 陈常颂. 茶树抗性育种研究进展. 福建茶叶, 2015(4): 2-4. LIN Z H, ZHONG Q S, CHEN C S. Research progress on resistance breeding of tea plant. Fujian Tea, 2015(4): 2-4. (in Chinese) [36] 韩宝瑜, 章正和, 房国宾, 黄安智. 茶树益微增强茶树抗寒和复壮效能的试验研究. 茶叶, 1996, 12(1): HAN B Y, ZHANG Z H, FANG G B, HUANG A Z. Study on enhancing cold-resistant of tea plant by tea beneficial microbes. Journal of Tea, 1996, 12(1): (in Chinese) ( 责任编辑李莉 ) 欢迎订阅 2017 年 杂交水稻 杂交水稻 是由国家杂交水稻工程技术研究中心和湖南杂交水稻研究中心主办的 对国内外公开发行的专业技术刊物, 刊号 :ISSN ,CN /S 主要宣传报道我国及国外杂交水稻研究 应用中的最新成果 进展 动态 技术经验和信息等 辟有专题与综述 选育选配 栽培技术 繁殖制种 新组合 基础理论 国外动态和简讯等栏目 获第二届国家期刊奖提名奖, 为历届全国中文核心期刊 中国科学引文数据库 (CSCD) 核心库来源期刊 中国核心期刊 ( 遴选 ) 数据库 收录期刊 中国科技论文统计源期刊 中国期刊方阵双效期刊 湖南省十佳科技期刊 双月刊, 大 16 开本,96 页, 逢单月出版, 每册定价 10 元, 年价 60 元 订阅办法 :(1) 可到当地邮局订阅, 邮发代号 : (2) 直接向本刊杂志社订阅, 另加收挂号费每个订户全年 18 元整 请将款邮汇至长沙市芙蓉区马坡岭远大二路 736 号 杂交水稻 杂志社, 邮编 :410125; 或信汇中国农业银行长沙马坡岭支行, 账户为湖南杂交水稻研究中心, 账号 ( 务请注明为杂交水稻 2017 年杂志款 ) 电话 : , ; zjsdzzs@163.com,zjsd@chinajournal.net.cn; 欢迎订阅, 并欢迎投稿 刊登广告

177 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 童鑫 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 1, , 张瑞芬, 邓媛元, 肖娟, 刘磊, 张雁, 魏振承, 张名位 ( 1 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 / 农业部功能食品重点实验室 / 广东省农产品加工重点实验室, 广州 ; 2 华南农业大学食品学院, 广州 ) 摘要 : 目的 建立米糠中酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺, 比较米糠提取物纯化前后总酚 总黄酮含量及抗氧化能力, 为米糠的深加工利用提供参考 方法 比较 9 种不同类型大孔吸附树脂 (HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 D101 HPD-722 AB-8 ADS17 和 HPD-826) 对米糠提取物中总酚的静态吸附和解吸性能, 筛选出对脱脂米糠酚类物质纯化效果最佳的大孔吸附树脂类型 ; 通过考察其静态吸附动力学曲线, 比较不同上样液浓度 上样流速和上样体积下的动态吸附曲线以及采用不同浓度乙醇洗脱的解吸效果, 建立米糠多酚的大孔吸附树脂吸附和解吸工艺条件 ; 比较 HPD-300 型大孔吸附树脂纯化前后总酚 总黄酮含量, 采用高效液相色谱法结合应用酚类标准品分析米糠提取物经大孔吸附树脂纯化前后其各单体酚类物质种类与含量, 并通过氧自由基吸收能力 (oxygen radical absorption capacity,orac) 和细胞抗氧化分析法 (cellular antioxidant activity,caa) 比较其纯化前后的抗氧化活性 结果 9 种类型大孔吸附树脂对脱脂米糠提取物酚类物质均有一定的吸附能力, 其中 HPD-300 型大孔吸附树脂对脱脂米糠总酚静态吸附和解吸效果明显优于其他类型树脂, 其饱和吸附量为 9.04 mg GAE g -1, 解吸率为 82.62%, 同时米糠总酚静态吸附在 6 h 时达到饱和值 HPD-300 型大孔吸附树脂最佳吸附和解吸工艺条件为 : 米糠酚类提取液上样浓度为 1.0 mg GAE ml -1, 上样流速为 3.0 BV h -1, 上样体积为 3.5 BV, 洗脱剂为 70% 乙醇溶液, 洗脱流速为 3.0 BV h -1 经 HPD-300 型大孔吸附树脂纯化后, 米糠酚类提取物的总酚和总黄酮含量分别从纯化前的 µg GAE mg -1 和 µg CE mg -1 提高到 µg GAE mg -1 和 µg CE mg -1, 分别提高了 2.6 和 3.4 倍 经高效液相色谱分析, 米糠酚类提取物经 HPD-300 型大孔吸附树脂纯化后, 其中的没食子酸 原儿茶酸 香草酸 对羟基苯甲酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香草醛 对香豆酸和阿魏酸等 10 种酚类单体组成未见明显变化和损失, 且上述酚类单体在提取物中的含量较纯化前分别提高 倍 纯化后提取物的 ORAC 和 CAA 值分别为 µmol TE g -1 和 µmol QE g -1, 较纯化前的 µmol TE g -1 和 µmol QE g -1, 分别提高了 1.4 和 2.2 倍 结论 HPD-300 型大孔吸附树脂适合米糠酚类物质的分离纯化, 经其纯化后的米糠提取物中总酚 总黄酮含量及抗氧化活性提高 1 3 倍, 且不会造成单体酚的明显损失 关键词 : 米糠 ; 酚类物质 ; 大孔树脂 ; 纯化 ; 细胞抗氧化 ; 氧自由基吸收能力 Separation and Purification of Polyphenols in Rice Bran by Macroporous Resins TONG Xin 1,2, ZHANG Rui-fen 1, DENG Yuan-yuan 1, XIAO Juan 1, LIU Lei 1, ZHANG Yan 1, WEI Zhen-cheng 1, ZHANG Ming-wei 1 ( 1 Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou ; 2 College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou ) 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 广东省自然科学基金团队项目 (2016A ) 广东省科技计划项目 (2015A , 2016B ) 联系方式 : 童鑫, tongxin322@126.com 通信作者张名位, mwzhh@vip.tom.com

178 19 期童鑫等 : 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 3819 Abstract: Objective The objective of this study is to screen a resin with a good adsorption and desorption performance to rice bran polyphenols (RBP) and optimize the purification technique, to compare the total phenols, total flavonoids content and antioxidant activity before and after purification, thus providing a theoretical basis for the deep processing and utilization of rice bran. Method The behavior of static adsorption and desorption, dynamic adsorption and desorption of 9 macroporous resins (HPD-100, HPD-200A, HPD-300, HPD-700, D101, HPD-722, AB-8, ADS17, and HPD-826) with different polarities to RBP was determined. Kinetic characteristics of static adsorption of the preferred resin were analyzed. The purification technique of macroporous resin to RBP was developed through the dynamic adsorption and desorption curves under different loading and elution conditions, including phenolic concentrations in loading samples, sampling rates, sampling volumes and ethanol concentrations in eluent. The phenolic profiles in RBP before and after resin purification were analyzed by HPLC analysis. Their total phenolic and flavonoid contents, oxygen radical absorption capacity (ORAC) and cellular antioxidant activity (CAA) were also estimated. Result HPD-300 exhibited the best capability of adsorption and desorption to RBP among the 9 selected macroporous resins. The saturated absorption quantity of HPD-300 resin to RBP was 9.04 mg GAE g -1, and the desorption rate was 82.62%. It took 6 h for HPD-300 resin to reach absorption equilibrium. The optimized purification parameters were as follows: the phenolic concentration of loading sample is 1 mg GAE ml -1, sampling rate is 3.0 BV h -1, sampling volume is 3.5 BV, eluent is 70% ethanol, flow velocity is 3.0 B V h -1. After HPD-300 resin purification, the total phenolic content increased by 2.6 times from µg GAE mg -1 to µg GAE mg -1, and the total flavonoids content increased by 3.4 times from µg CE mg -1 to µg CE mg -1. Ten phenolic compounds were identified from rice bran phenolic extract, which were gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, p-hydroxy benzoic acid, caffeic acid, clove acid, epicatechin, catechins, vanillic aldehyde, p-coumaric acid and ferulic acid by HPLC analysis. The phenolic profiles of the extract were not changed after HPD-300 resin purification, but the concentrations of 10 phenolic compounds increased by times. The ORAC and CAA antioxidant activity of the extract changed from µmol TE g -1 and µmol QE g -1 before purification to µmol TE g -1 and µmol QE g -1 after purification, and increased by 1.4 and 2.2 times, respectively. Conclusion The total phenolic and flavonoid contents and antioxidant activity increased by 1-3 times after HPD-300 resin purification. The individual phenolic compounds in the extract were not lost significantly during purification. Therefore, HPD-300 macroporous resin was suitable to purify rice bran phenolic extract. Key words: rice bran; phenolics; macroporous resin; purification; CAA; ORAC 0 引言 研究意义 随着营养知识的普及和人们健康意识的增强, 全谷物膳食越来越受到人们的重视 流行病学调查结果显示 : 增加膳食中全谷物的比例有利于高脂血症等许多慢性疾病的防治 [1] 全谷物是指除去外壳等不可食用部分后的完整 碾碎 破碎或压片的颖果, 包括淀粉质胚乳 胚芽与麸皮 ( 糠层 ) 与精谷物相比, 全谷物因为保留了其糠层而含有更多的维生素 膳食纤维等营养成分, 同时其酚类物质等非营养素植物活性物质含量也远高于精谷物 大量研究表明植物多酚具有抗氧化 抗病毒 抗癌 免疫 护肝和保护心血管等生物活性 [2-3] 项目组研究发现, 占全谷物糙米重量约 10% 的米糠层含有整粒糙米中超过 50% 的酚类物质 [4] 另有研究表明全谷物不同部位的酚类物质组成及其抗氧化活性不同, 米糠层的抗氧化活性大于胚乳部分 [5] 因此, 探明米糠中酚类物质组成 含量及其生物活性对于揭示全谷物膳食的健康效应, 指导米糠的综合加工利用和引导稻米加工产业的 可持续发展具有重要意义 前人研究进展 目前已 [6] 有关于米糠酚类物质的相关研究,JUNG 等测得脱脂米糠中总酚含量为 mg GAE 100g -1 DW, 通过高效液相色谱法从米糠提取物中检测到阿魏酸 芥子酸 苯甲酸 香豆酸等酚类物质, 其中阿魏酸含量最 [7] 高 SUKHONTHA 等在脱脂米糠水提物中检测到原儿茶酸 香草酸 香豆酸 阿魏酸和芥子酸等酚类物质 体内外试验证实米糠中酚类物质具有抗氧化 [8] 抗炎 [9] [10] 抗癌等活性 尽管已经有学者对米糠中酚类物质组成 含量及其生物活性开展了研究, 但目前关于米糠酚类物质生物活性研究采用的试验材料多为米糠经水或乙醇等溶剂浸提后得到的粗提物, 含有较多的粗蛋白 可溶性糖类等杂质, 对其酚类物质含量及其活性的测定结果都会造成干扰 为探明米糠中酚类物质组成, 也有学者利用硅胶柱 聚酰胺柱等柱层析方法对橄榄酚类提取物进行分离纯化 [11], 但这些方法是以分离制备到单个化合物为目标, 不适用于以去除杂质同时保留提取物中各酚类成分为目标的分离纯化 目前常用的酚类物质纯化方法有大孔树脂吸附纯

179 3820 中国农业科学 49 卷 化 硅胶柱层析法 聚酰胺层析法 膜分离法 高效液相色谱半制备色谱分离法 高速逆流色谱法等方法, 其中大孔树脂吸附纯化具有吸附容量大, 物理化学稳定性高, 富集效果好, 解吸条件温和, 再生处理方便和成本低等的优点 不同极性大孔树脂对酚类物质的分离效果比较已有研究 [12-13] 本研究切入点 不同来源的酚类物质因其所含多酚的种类及结构不同, 适于分离纯化的大孔树脂类型及其纯化工艺条件会存在明显差别 研究表明米糠中的酚类物质组成以酚酸为主, 与苹果等的多酚以黄酮类为主有明显的不同 [14-15] 目前关于苹果 茶叶等来源的多酚的大孔树脂分离纯化工艺已有大量的研究报道, 但关于米糠酚类物质分离纯化的研究未见报道 拟解决的关键问题 以脱脂米糠丙酮 / 水提取物为材料, 通过比较 9 种不同极性大孔吸附树脂对米糠酚类物质的吸附和解吸特性, 筛选出对米糠酚类物质具有良好纯化效果的树脂类型, 并优化其纯化工艺参数, 旨在为建立米糠酚类物质分离纯化工艺提供技术支撑, 指导稻米加工副产物的综合开发利用 1 材料与方法 试验于 2015 年 3 8 月在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 / 农业部功能食品重点实验室 / 广东省农产品加工重点实验室进行 1.1 试验材料与主要仪器 原料供试米糠品种为天优 998 水稻米糠层部位, 由广州荔泉食品有限公司提供, 将新鲜制备的米糠采用 CO 2 超临界萃取萃取技术进行脱脂处理, 得到脱脂米糠后 ( 脱脂后米糠油脂含量为 0.1%), 参照文献报道方法制备其酚类物质提取物 [16] 大孔树脂 HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 D101 HPD-722 AB-8 ADS17 HPD-826 购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司 ; 黑壁透明底 96 孔板购自美国 Corning 公司 试剂没食子酸 原儿茶酸 香草酸 对羟基苯甲酸 咖啡酸 丁香酸 表儿茶素 香草醛 对香豆酸 阿魏酸 福林酚试剂 Trolox ABAP DCFH-DA 荧光素二钠盐和二水合槲皮素购于 Sigma Aldrich 公司 ;HepG2 细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心 ;DMEM 培养基购于 Thermo Fisher Scientific 公司 ; 胎牛血清 (FBS) 购自美国 Gibco 公司 ; 其他试剂均为国产分析纯 仪器 IKA T25 高速均质机, 德国 IKA 公司 ; EYELA N-1100 旋转蒸发仪, 京东理化器械株式会社 ; FDU-2100 冷冻干燥机, 东京理化器械株式会社 ;TD6 冷冻离心机, 长沙湘智离心机仪器有限公司 ;HZQ-QX 智能型全温振荡器, 哈尔滨东联电子开发有限公司 ; Vortex Genie 2 多用途涡旋混合器, 美国 Scientific Industries 公司 ;UV-2450 紫外可见分光光度计, 日本岛津公司 ;Infinite M200pro 酶标仪,TECAN 公司 ; Agilent1260 高效液相色谱仪 -Agilent 1260 series DAD 检测器, 美国 Agilent 公司 ;HERAcell 240i CO 2 培养箱,Thermo Scientific 公司 ;ULT V 超低温冰箱,Thermo Scientific 公司 1.2 试验方法 米糠酚类提取物的制备精确称取脱脂米糠 g, 加入 50 ml 4 预冷的 80% 丙酮溶液, 冰浴条件下 r/min 均质 10 min, 均质液在 4 下 r/min 离心 10 min 后, 收集上清液 向沉淀中再加 50 ml 预冷的 80% 丙酮溶液重复上述过程一次, 合并两次上清液 ; 于 45 下真空旋转浓缩得米糠酚类提取液, 冷冻干燥得粉末状提取物, 用水溶解米糠酚类提取物至所需浓度, 备用 树脂预处理 9 种大孔树脂分别用无水乙醇浸泡 24 h, 待树脂充分溶胀后, 用无水乙醇淋洗, 直至洗出液加适量水无白色浑浊现象为止, 再用蒸馏水洗至无乙醇味, 备用 不同极性大孔树脂静态吸附量及解吸率试验称取经预处理的湿树脂 HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 HPD-722 HPD-826 AB-8 ADS17 和 D101 各 1.00 g, 分别加入 100 ml 具塞三角瓶中, 量取 50 ml 总酚含量调整至 0.2 mg GAE ml -1 的米糠酚类提取液于各三角瓶, 室温下振荡 24 h, 取上清液测定总酚含量, 将树脂滤出并用去离子水清洗 3 次, 用滤纸吸干表面水分, 转入 100 ml 具塞三角瓶中, 加入 50 ml 80% 乙醇, 室温下振荡解吸 12 h, 取上清液测定总酚含量, 按照下式分别计算吸附量和解吸率 (C = - C1) V W 0 1 Q C2 V2 100% D = (C - C ) V 式中 :Q 为吸附量 (mg g -1 );C 0 为起始浓度 (mg ml -1 ); C 1 为平衡浓度 (mg ml -1 );V 1 为吸附溶液体积 (ml); W 为树脂重量 (g);d 为解吸率 (%);C 2 为解吸后溶液中总酚含量 (mg ml -1 );V 2 为解吸溶液体积 (ml) 大孔树脂静态吸附动力学曲线称取 1.00 g 0 1 1

180 19 期童鑫等 : 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 3821 经预处理的湿树脂, 置于 100 ml 具塞三角瓶中, 加入上述米糠酚类提取液 50 ml, 放入摇床室温下静置, 每隔 30 min 震荡 2 min 分别在 和 12.0 h 时吸取上清液 0.5 ml 测定总酚含量, 绘制大孔树脂静态吸附动力学曲线 大孔树脂的动态吸附和解吸 上样流速的确定将预处理过的大孔树脂湿法装柱 ( 柱高 200 mm, 内径 6 mm), 上样浓度和上样体积分别固定在 1.5 mg GAE ml -1 和 6.5 BV 室温条件下, 依次用 3 种不同的流速上样 ( 和 4.5 BV h -1 ) 处理大孔树脂, 每流出 0.5 BV 流出液, 收集并测定总酚浓度 其中流出液总酚浓度达到进样浓度的 1/10 即为泄漏点, 此时为吸附终点, 根据泄漏点出现快慢及吸附量确定最佳上样流速 上样浓度的确定将预处理过的大孔树脂湿法装柱, 取 6.5 BV 不同浓度样液 ( 和 2.0 mg GAE ml -1 ), 室温条件下, 分别在 3.0 BV h -1 的上样流速下通过树脂柱, 每流出 0.5 BV 流出液, 收集并测定总酚浓度 根据泄漏点出现快慢及吸附量确定最佳上样浓度 上样体积的确定将预处理过的大孔树脂湿法装柱, 上样浓度和上样流速分别固定在 1.5 mg GAE ml -1 和 3.0 BV h -1, 室温条件下, 取不同体积的样液通过树脂柱, 每流出 0.5 BV 流出液, 收集并测定总酚浓度 根据泄漏点出现快慢确定最佳上样体积 洗脱液浓度的确定将预处理过的大孔树脂湿法装柱, 上样浓度 上样流速和上样体积分别固定在 1.5 mg GAE ml BV h -1 和 3.5 BV, 室温条件下, 将样液通过大孔树脂, 待吸附平衡后 (6 h), 用去离子水洗脱, 去除水溶性蛋白 还原糖和多糖等杂质, 再用不同浓度 (50% 60% 70% 80% 90%) 的乙醇溶液作为洗脱剂在相同流速下进行洗脱, 洗脱液体积均为 5 BV, 收集全部洗脱液, 测定洗脱液中总酚浓度, 计算解吸率 脱脂米糠纯化前后总酚及总黄酮含量及其抗氧化能力测定样品预处理 : 按照优化后的 HPD-300 大孔树脂纯化工艺参数纯化后得到的米糠酚类洗脱液, 经 45 真空旋蒸浓缩至无乙醇, 冷冻干燥得粉末状提取物, 取适量溶于甲醇中待进一步检测 总酚含量测定 : 总酚含量的测定参照 [17] SINGLETON 等的方法略有改动 : 向试管中分别加入 125 μl 标准品或待测样品溶液, 再加入 0.5 ml 超 纯水和 125 μl 福林酚试剂 室温下避光静置 6 min 后加入 1.25 ml m : v 为 7% 的 Na 2 CO 3 溶液和 1 ml 超纯水, 振荡混匀, 室温下避光反应 90 min, 于 760 nm 下测定其吸光度 以没食子酸为标准品, 总酚含量以每克米糠酚类提取物粉末中所含没食子酸当量 (mg gallic acid equivalents g -1 ) 表示, 单位为 mg GAE g -1 总黄酮含量测定 : 总黄酮含量的测定参照 JIA [18] 等的方法略有改动 : 向试管中分别加入 300 µl 标准品或待测样品溶液, 再加入 1.5 ml 超纯水和 90 μl m : v 为 5% 的 NaNO 2 溶液, 振荡混匀, 避光静置 6 min 后加入 180 μl m : v 为 10% 的 AlCl 3 6H 2 O 溶液, 避光反应 5 min, 再加入 0.6 ml 1 mol L -1 的 NaOH 溶液, 然后加入 330 μl 超纯水, 于 510 nm 下测定其吸光度 以儿茶素为标准品, 总黄酮含量以每克脱脂米糠提取物粉末中所含儿茶素当量 (mg catechin equivalents g -1 ) 表示, 单位为 mg CE g 米糠酚类提取物纯化前后单体酚组成及含量分析将大孔树脂纯化前 后的米糠酚类提取物采用高效液相色谱法分析其单体酚组成及含量 具体液相色谱条件参考 ZHANG 等的方法略有改动 [19] 色谱柱: Zorbox SB-C18 柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm); 柱温 : 30 ; 进样量 :10 μl; 流速 :1.0 ml min -1 流动相: 100% 乙腈 (A) 和 0.4% 冰乙酸 (B) 按照以下梯度洗脱 :0 40 min,5% 25% A;40 45 min,25% 35% A, 总运行时间 45 min 采用 DAD 检测器, 检测波长 280 nm 样品色谱峰保留时间与标准品保留时间比较, 判定单体酚种类, 根据峰面积计算单体酚含量, 结果以 µg mg -1 米糠提取物计 (µg mg -1 ) 米糠酚类提取物纯化前后总酚及总黄酮含量及其抗氧化活性测定氧自由基清除能力 (oxygen radical absorbance capacity,orac) 测定 [20] : 将米糠酚类提取物用 ph 7.4 浓度为 75 mmol L -1 的磷酸缓冲液稀释至不同浓度 向 96 孔板每孔中分别加入 20 μl 提取物溶液或 Trolox 标准品溶液或空白对照, 再向每孔加入 200 μl 预先在 37 孵育过的 0.96 μmol L -1 荧光素, 此 96 孔板在 37 条件下孵育 20 min 孵育完后, 除 F 孔外, 每孔分别加入 20 µl 用 25 磷酸缓冲液配制的 119 mmol L -1 ABAP 溶液 ( 现配现用 ),F 孔中加入 20 μl 磷酸缓冲液 激发波长 485 nm, 发射波长 520 nm 条件下测定各孔荧光值, 共 35 个循环, 每个循环 4.5 min 米糠酚类提取物的 ORAC 值用 Trolox 当量 (μmol Trolox equivalents g -1 ) 表示, 单位为 μmol TE g -1

181 3822 中国农业科学 49 卷 细胞抗氧化活性 (cellular antioxidant activity, CAA) 测定 [21] : 将 HepG2 细胞 ( 生长对数期 ) 转入含有 10% 的胎牛血清 DMEM 培养基中, 将细胞密度调整至 ml -1 向 96 孔细胞培养板中加入 100 μl 细胞悬液, 培养 24 h 后吸出培养液 再向各孔加入 100 μl DMEM 培养基 ( 含有 25 μmol L -1 DCFH-DA 和不同浓度槲皮素标准品或米糠酚类提取物 ),37 下孵育 1 h 孵育完后, 除空白对照孔以外, 再向各孔加入含有 600 μmol L -1 ABAP 的 PBS 100 μl, 空白对照孔加入 100 μl 2ABAP 的 PBS 在 37 下读取该 96 孔板各孔的荧光值, 激发波长 485 nm, 发射波长 520 nm 下测定各孔荧光值, 共 12 个循环, 每个循环 5 min 米糠酚类提取物的 CAA 值用槲皮素当量 (μmol Quercetin equivalents g -1 ) 表示, 单位为 μmol QE g 结果统计分析实验重复 3 次, 结果用均值 ± 标准差表示, 不同极性大孔树脂静态吸附量及解吸率实验结果采用 SPSS 13.0 进行单因素方差分析以及 SNK 检验 纯化前后酚类物质含量和抗氧化活性比较采用独立样本 t 检验,P<0.05 时差异有统计学意义 2 结果 2.1 不同大孔树脂的静态吸附与解吸能力不同极性的 9 种大孔树脂在相同条件下, 经 24 h 静态吸附后对米糠多酚提取物总酚的吸附量和解吸率如图 1 和 2 所示 结果表明,HPD-300 大孔树脂的吸附量最高 (9.59 mg GAE g -1 ), 其次是 HPD-100(8.84 mg GAE g -1 ), 两者间差异显著 (P<0.05) HPD-200A HPD-700 HPD-722 D101 和 AB-8 五种树脂对米糠多酚的吸附效果相当, 以 ADS-17 的吸附效果最差 HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 和 HPD-722 的解吸率相当, 均在 80% 以上 (P>0.05), 高于受试的其他几种大孔树脂 综合考虑大孔树脂对米糠提取物中总酚的吸附量和解吸率结果, 选取吸附和解吸性能均最好的大孔树脂 HPD-300 进行吸附动力学研究 2.2 HPD-300 型大孔树脂的吸附动力学 HPD-300 大孔树脂吸附米糠酚类物质动力学结果见图 3 静态吸附起始阶段 HPD-300 大孔树脂对米糠总酚的吸附量快速上升, 属于快速平衡型 随着时间的延长, 吸附曲线逐渐变得平缓, 树脂对米糠多酚的吸附量变化缓慢,HPD-300 大孔树脂吸附脱脂米糠总酚的量在 6 h 后达到吸附平衡 2.3 上样流速米糠酚类提取物上样流速对 HPD-300 大孔树脂吸附性能的影响见图 4 上样流速为 和 4.5 BV h -1 时, 泄漏点分别在上样体积为 和 2.0 BV 附近出现 在上样流速为 和 4.5 BV h -1 时, 10 a 米糠多酚提取物总酚吸附量 Adsorption amount of total phenolic of RBP extract (mg g -1 ) b de cd cd e c f c 4 HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 HPD-722 HPD-826 D101 ADS-17 AB-8 不同小写字母表示差异显著 (P<0.05) 下同 Different small letters indicate significant difference (P<0.05). The same as below 图 1 不同极性大孔树脂对米糠酚类提取物的静态吸附量比较 Fig. 1 Comparison of static adsorption capacity of different polar macroporous resins to total phenolics in RBP extracts

182 19 期童鑫等 : 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 米糠多酚提取物总酚解吸率 Desorption rate of total phenolic of rice bran extract (%) ab a a ab ab cd bc d e HPD-100 HPD-200A HPD-300 HPD-700 HPD-722 HPD-826 D101 ADS-17 AB-8 图 2 不同极性大孔树脂对米糠酚类提取物的静态解吸率比较 Fig. 2 Comparison of static desorption capacity of different polar macroporous resins to total phenolics in RBP extracts 米糠多酚吸附量 Adsorption amount of polyphenolic of rice bran (mg g -1 ) 图 3 HPD-300 树脂吸附米糠酚类物质的动力学曲线 Fig. 3 The adsorption kinetics of HPD-300 macroporous resin to RBP HPD-300 大孔吸附树脂对米糠酚类提取物总酚的吸附量分别是 和 81 mg GAE 当上样流速为 1.5 BV h -1 时, 泄漏点尽管最晚出现, 但上样时间较长, 工作效率低 上样流速为 4.5 BV h -1 时, 虽然较快达到泄露点, 但大孔树脂对总酚的吸附量较低, 可能是因为上样流速过快, 导致样液与树脂表面接触时间过短, 酚类物质来不及扩散到树脂的内表面充分吸附, 从而降低吸附率 当上样速度为 3.0 BV h -1 时, 泄漏点出现相对较早, 同时树脂吸附量较高 综合考虑纯化效率和成本, 选择 3.0 BV h -1 为最适宜上样流速 2.4 上样浓度米糠酚类提取物上样浓度对 HPD-300 大孔树脂吸附性能的影响见图 5 米糠多酚提取物样品浓度为 2 mg GAE ml -1 时, 上样体积在 2 BV 时即开始泄漏, 泄露点出现太早, 样品处理量少, 且在此浓度下样液

183 3824 中国农业科学 49 卷 BV h BV h BV h 米糠多酚提取物上样体积 Sample volume of rice bran extract (BV) 图 4 上样流速对 HPD-300 树脂吸附性能的影响 Fig. 4 Impact of sampling rate on the adsorption properties of HPD-300 resin 流出液总酚浓度 Effluent concentration of total phenolic (µg ml -1 ) 图 5 上样浓度对 HPD-300 树脂吸附性能的影响 Fig. 5 Impact of sample concentration on the adsorption properties of HPD-300 resin 黏度较大, 且含有沉淀物, 容易对树脂造成堵塞, 降低其吸附性能 ; 样品浓度为 0.5 mg GAE ml -1 时, 在上样体积达 5.5 BV 时才达到泄漏点, 此时上样时间过长, 不适于实际应用 ; 当样品浓度为 1.5 mg GAE ml -1 和 1.0 mg GAE ml -1 时, 泄漏点均在 3.5 BV 附近出现 样品浓度为 和 2.0 mg GAE ml -1 时, 树脂吸 附量分别为 和 85 mg GAE 样品浓度为 1.0 mg GAE ml -1 时,HPD-300 大孔树脂对米糠酚类物质的吸附量最大, 因此, 将米糠酚类物质的上样浓度确定为 1.0 mg GAE ml 上样体积米糠酚类提取物上样体积对 HPD-300 树脂吸附

184 19 期童鑫等 : 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 3825 性能的影响见图 6 随着上样体积的增加, 流出液中总酚浓度随之增加, 在 3.5 BV 时, 流出液中总酚浓度 为 150 µg GAE ml -1, 达到泄漏点, 上样量继续增加, 流出液中总酚含量继续升高, 因此选择上样量为 3.5 BV 脱脂米糠多酚提取物上样体积 Sample volume of rice bran extracts (BV) 图 6 上样体积对 HPD-300 树脂吸附性能的影响 Fig. 6 Impact of sampling volume on the adsorption properties of HPD-300 resin 2.6 洗脱液的浓度洗脱液乙醇体积分数对 HPD-300 大孔树脂吸附的米糠酚类物质的解析性能见图 7 HPD-300 大孔树脂的解吸性能随着洗脱液乙醇浓度的增加呈先上升后降低的趋势, 当洗脱液乙醇体积分数为 50% 时, 解吸率最低, 为 70.8%; 随着洗脱液乙醇体积分数的提高, 在 70% 时, 解吸率达到最大, 为 86.41%; 当乙醇体积分数提高到 80% 和 90% 时, 解吸率有所下降, 分别为 80.24% 和 77.35% 因此, 选择 70% 乙醇为洗脱溶剂 2.7 纯化前后米糠提取物中单体酚类的组成与含量大孔树脂 HPD-300 纯化前后的米糠酚类提取物 HPLC 谱见图 8 由图可见, 米糠酚类提取物纯化前在 2 5 min 有较多杂峰, 纯化后杂峰有所减少, 且后面主要的酚类物质均被很好地保留, 说明 HPD-300 大孔树脂适用于米糠多酚的分离纯化 从脱脂米糠中共检测到 10 种单体酚类物质, 经树脂纯化前后的含量见表 1 米糠酚类提取物中含量最高的酚类物质是阿魏酸 没食子酸 对香豆酸 经 HPD-300 大孔树脂处理后, 酚类物质有所损失, 是由于在上样后洗脱除杂过程中, 少部分酚类物质被洗脱下来而损失掉, 同时在解析过程中洗脱液对吸附到树脂上的米糠酚类物质的解析能力无法达到 100%, 会有少量酚类物质吸附在树脂上造成纯化过程中的损失 经过 HPD-300 大孔树 脂吸附脱脂米糠中单体酚构成谱并未发生明显改变, 由表 1 可以看出, 各单体酚组分含量均有明显增加 综上所述,HPD-300 树脂能较好地分离纯化脱脂米糠提取物中酚类物质 解吸率 Desorption rate (%) 图 7 不同乙醇浓度洗脱液对 HPD-300 树脂吸附的米糠酚类物质解吸率的影响 Fig. 7 Effects of ethanol concentrations on the desorption rate of HPD-300 resin to RBP

185 3826 中国农业科学 49 卷 mau mau A: 纯化前 ;B: 纯化后 A: Before purification; B: After purification 1: 没食子酸 Gallic acid;2: 原儿茶酸 Protocatechuic acid;3: 香草酸 Vanillic acid;4: 对羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid;5: 咖啡酸 Caffeic acid;6: 丁香酸 Syringic acid;7: 表儿茶素 Epicatechin;8: 香草醛 Vanillin;9: 对香豆酸 p-coumaric acid;10: 阿魏酸 Ferulic acid 图 8 HPD-300 大孔树脂纯化前后米糠酚类提取物的 HPLC 谱 Fig. 8 HPLC spectrum of RBP extracts before and after HPD-300 resin purification 表 1 HPD-300 大孔树脂纯化前后米糠酚类提取物中单体酚种类及含量比较 Table 1 Composition and content of individual phenolic compounds in RBP extracts before and after HPD-300 resin purification (µg mg -1 ) 酚类物质单体 纯化前 纯化后 纯化后含量增加幅度 ( 倍 ) Phenolic compounds Before purification After purification Increased times of phenolic contents after purification 没食子酸 Galic acid 1.63± ± 原儿茶酸 Protocatechuic acid 0.69± ± 香草酸 Vanillic acid 1.27± ± 对羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid 1.07± ± 咖啡酸 Caffeic acid 0.96± ± 丁香酸 Syringic acid 0.81± ± 表儿茶素 Epicatechin 0.43± ± 香草醛 Vanillin 0.98± ± 对香豆酸 p-coumaric acid 2.09± ± 阿魏酸 Ferulic acid 2.97± ±

186 19 期童鑫等 : 米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺 纯化前后米糠提取物总酚 总黄酮含量及抗氧化能力米糠酚类提取物经大孔树脂纯化前后的总酚 总黄酮含量及抗氧化能力见表 2 纯化后米糠酚类提取物中总酚和总黄酮含量分别为 µg GAE mg -1 和 µg CE mg -1, 较纯化前的 µg GAE mg -1 和 µg CE mg -1 分别提高了 2.6 和 3.4 倍 纯化前的脱脂米糠酚类提取物 CAA 和 ORAC 值分别为 µmol QE g -1 和 μmol TE g -1, 而纯化后的 CAA 和 ORAC 值分别为 µmol QE g -1 和 μmol TE g -1, 较纯化前分别提高了 2.2 和 1.4 倍 表 2 HPD-300 大孔树脂纯化前后米糠酚类提取物总酚总黄酮含量和抗氧化能力比较 Table 2 Contents of total phenolics, total flavonoids and vitro antioxidant activity in RBP extracts before and after HPD-300 resin purification 纯化前 Before purification 纯化后 After purification P 值 P values 总酚 Total phenolics (µg GAE mg -1 ) 88.07± ±24.12 P<0.01 总黄酮 Total flavonoids (µg CE mg -1 ) 30.04± ±11.04 P<0.01 CAA 值 CAA Values (µmol QE g -1 ) 29.19± ±2.19 P<0.01 ORAC 值 ORAC Values (μmol TE g -1 ) ± ± P< 讨论 3.1 大孔树脂极性对米糠酚类物质吸附性能的影响大孔树脂是一种包含网状孔穴结构 不含交换基团的高分子吸附材料, 由于其较多的网状孔穴结构 较大的颗粒比表面积以及一定的极性基团, 因而具有较大的吸附能力 有机化合物根据其分子体积的大小及吸附力的强弱, 可吸附在一定规格的大孔吸附树脂上, 采取适当的溶剂洗脱可达到分离的目的 [22] 不同极性和含不同官能团的树脂对各类化合物的吸附能力不同, 因此, 对于分离纯化植物中的有效成分, 选择适合的树脂型号非常重要 已有大量文献报道不同植物来源的酚类物质的分离纯化适用不同大孔树脂类 [23] 型 凌庆枝等比较了 7 种不同极性的大孔吸附树脂 (AB-8 D-101 HPD-450 HPD-500 HPD-600 HPD-750 NKA-9) 对芦根总酚酸的分离纯化作用, 结果显示 HPD-500 型大孔树脂对芦根总酚酸成分具有较好的吸附和解吸性能, 精制纯化后, 芦根提取物中总酚酸含量较纯化前提高了 10 倍, 说明 HPD-500 型大孔树脂对酚酸类化合物的富集具有高选择性 李 [24] 文兰等比较了 4 种大孔吸附树脂 (AB-8 D-101 X-5 和 NKA-9) 对川穹中阿魏酸及总酚酸的分离纯化效果, 发现 D-101 型大孔树脂对川穹中阿魏酸及总酚 [25] 酸具有较好的吸附效果 冯进等通过比较 8 种大孔树脂 (AB-8 D-101 DM-130 HPD-100 HPD-400 HPD-400A HPD-750 和 HPD-826) 对蓝莓叶多酚的静态吸附与解吸效果, 发现 HPD-400 大孔树脂对富含 咖啡酰奎宁酸与槲皮素甙的蓝莓叶多酚的吸附解吸效果最好 非极性和弱极性的大孔吸附树脂对于极性溶剂 ( 水 ) 提取物中的芳香族化合物具有较好的吸附性能 [26] 由高效液相色谱分析结果可以看出, 米糠提取物中所含酚类物质是一类水溶性的具有苯环结构的芳香族化合物, 因而非极性 (HPD-100 HPD-300 HPD-700 和 D101) 及弱极性 (HPD-722 和 AB-8) 的大孔吸附树脂对米糠多酚的吸附量均较好, 其中 HPD-300 树脂的比表面积最大 ( m 2 g -1 ), 孔径最小 (50 55A ), 更有利于小分子物质的吸附, 因而表现出较好的吸附性能 3.2 大孔树脂吸附和解吸性能对米糠酚类物质吸附性能的影响大孔树脂的分离效果不仅与树脂极性相关, 上样及洗脱条件也会影响树脂的吸附性能 目前已有大量关于上样流速 上样浓度等因素影响大孔树脂吸附性 [27] 能的研究报道 杨芙莲等比较了不同上样浓度 ( 和 0.48 mg ml -1 ) 及上样流速 ( 和 3.0 ml min -1 ) 对 AB-8 大孔树脂吸附甜荞麦壳黄酮性能的影响, 结果发现树脂的吸附率随上样浓度的增大而减小, 随上样流速增大则泄漏率呈增大趋势, 综合考虑吸附率, 确定最佳吸附工艺条件为吸附液浓度 0.24 mg ml -1 吸附流速 2.0 mg ml -1 [28] 王雅等采用动态吸附分离法, 研究沙枣多酚提取物不同上样浓度 ( 和 2.0 mg ml -1 ) 和上样流速 ( 和 2.5 ml min -1 ) 下 NKA-9 大孔树脂的泄漏曲线, 发现上样浓度为 1.0

187 3828 中国农业科学 49 卷 mg ml -1, 上样流速为 1.0 ml min -1 时树脂对沙枣多酚的吸附性能较好 以上研究结果均说明, 在高浓度样品和较高上样速度时, 尽管上样时间缩短, 但泄漏点出现较早, 树脂对总酚的吸附量较低 其原因可能是上样浓度过高导致过多的多酚分子停留在树脂表面, 阻碍其他酚类物质进入树脂内部, 使得酚类物质无法在树脂内扩散吸附, 从而降低树脂的吸附率 ; 当较高上样流速时, 酚类物质和树脂接触时间很短, 酚类物质尚未被吸附到树脂的内表面就被流出, 使得树脂吸附率下降 而在过低的样品浓度和较慢的上样流速时, 泄漏点虽然出现较晚但作业周期延长, 不利于实际生产应用 中等样品浓度和上样流速增加了酚类物质与树脂的接触, 有利于提高树脂对酚类物质的吸附量, 延迟泄漏点出现时间 本研究与以上文献报道一致, 中等样品浓度和上样流速更有利于米糠提取物酚类物质的分离纯化 上样体积也是影响树脂吸附性能的重要因素 当上样体积过大时树脂容易发生吸附过饱和, 酚类物质无法再扩散到树脂内部进行吸附, 且上样体积过大, 树脂柱上部容易发生多层吸附, 或是树脂孔隙深处吸附的样液溶质分子过多, 二者结合作用力增强, 树脂对溶质分子的吸附量超过了其饱和吸附量, 发生树脂局部中毒现象, 造成大孔树脂再生困难, 影响树脂的重复利用 本研究显示, 上样体积为 3.5 BV 时, 流出液中总酚浓度达到泄漏点, 树脂吸附饱和 乙醇水溶液是大孔树脂分离纯化过程中常使用的洗脱溶液, 不同的乙醇浓度对树脂解吸活性成分的解 [29] 吸效果明显不同 吴彩娥等研究青钱柳叶总黄酮大孔树脂纯化工艺, 比较 3 种不同浓度乙醇洗脱液 (50% 70% 90%) 对 AB-8 树脂解吸性能的影响, 发现树脂的解吸率随洗脱液浓度的增加呈先上升后下 [30] 降的趋势,70% 的乙醇洗脱率最佳 冀德富等比较了 5 种不同浓度乙醇洗脱液 (5% 30% 50% 70% 90%) 对 HPD-100 大孔树脂吸附的叶下珠总多酚的解吸效果, 发现 50% 乙醇洗脱所得固形物中总酚含量最高 可见, 因树脂类型和纯化酚类物质的不同, 适宜的洗脱液浓度会有差别 本研究结果显示,70% 乙醇对米糠多酚有较好的洗脱效果, 一方面可能是由于米糠中的多酚多为水溶性物质, 其解吸需要一定的含水量, 当乙醇浓度过高时, 洗脱剂中含水量较少, 米糠酚类物质难以溶出, 导致解吸率较低 ; 另一方面, 当乙醇体积分数过低时, 因解吸溶剂极性过大而不利于多酚物质的洗脱 3.3 大孔树脂吸附对米糠酚类物质的组成及抗氧化活性的影响米糠中含有的酚类物质组成较为复杂, 本研究从大孔树脂纯化前的米糠酚类提取物中检测到没食子酸 阿魏酸 儿茶素 表儿茶素 绿原酸等 10 种单体酚类成分 为探明经大孔树脂纯化后上述不同种类的酚类物质含量变化, 对纯化后的酚类提取物进行 HPLC 分析, 发现经过大孔树脂吸附后脱脂米糠多酚不会造成峰丢失, 即单体酚组成未发生改变, 各单体酚含量均有明显增加 因此,HPD-300 型大孔树脂适于分离纯化脱脂米糠多酚 纯化后的米糠酚类提取物总酚和总黄酮含量明显提高, 因此其抗氧化活性也较纯化前明显增强 通过 ORAC 方法和更接近生理环境的细胞抗氧化分析方法进行测定, 发现纯化后的米糠酚类提取物细胞抗氧化活性较纯化前提高了 3.2 倍, ORAC 抗氧化活性提高了 2.4 倍, 表明经大孔树脂纯化也明显提高了米糠酚类提取物的生物活性 4 结论 通过静态吸附和解吸试验筛选出适用于脱脂米糠多酚分离纯化的大孔吸附树脂为 HPD-300, 其分离纯化米糠酚类提取物的最佳工艺条件为 : 米糠酚类提取物上样浓度为 1.0 mg GAE ml -1, 上样流速为 3.0 BV h -1, 上样体积为 3.5 BV,70% 乙醇溶液作为洗脱剂, 洗脱流速为 3.0 BV h -1 纯化后的脱脂米糠多酚提取物总酚和总黄酮含量较纯化前分别提高了 2.6 和 3.4 倍, 氧自由基吸收能力和细胞抗氧化活性分别提高了 1.4 和 2.2 倍, 且不会造成其 10 种主要单体酚组成变化, 其含量较纯化前提高 倍 References [1] LIU R H. Whole grain phytochemicals and health. Journal of Cereal Science, 2007, 46: [2] PANDEY K B, RIZVI S I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2009, 2(5): [3] GHARRAS H E. Polyphenols: food sources, properties and applications A review. International Journal of Food Science and Technology, 2009, 44: [4] TI H H, LI Q, ZHANG R F, ZHANG M W, DENG Y Y, WEI Z C, CHI J W, ZHANG Y. Free and bound phenolic profiles and antioxidant activity of milled fractions of different indica rice varieties cultivated in southern China. Food Chemistry, 2014, 159(13):

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189 3830 中国农业科学 49 卷 Drugs, 2007, 16(9): (in Chinese) [25] 冯进, 李敏, 曾晓雄, 李春阳. 大孔树脂纯化蓝莓叶多酚及其组成分析. 食品科学, 2013, 34(10): FENG J, LI M, ZENG X F, LI C Y. Macroporous resin purification and composition analysis of polyphenols from blueberry leaves. Food Science, 2013,34(10): (in Chinese) [26] 苏东晓, 张瑞芬, 张名位, 黄菲, 魏振承, 张雁, 遆慧慧, 邓媛元, 唐小俊. 荔枝果肉酚类物质大孔树脂分离纯化工艺优化. 中国农业科学, 2014, 47(14): SU D X, ZHANG R F, ZHANG M W, HUANG F, WEI Z C, ZHANG Y, TI H H, DENG Y Y, TANG X J. Separation and purification of polyphenol in litchi pulp by macroporous resins. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(14): (in Chinese) [27] 杨芙莲, 夏银, 任蓓蕾. 大孔树脂对甜荞麦壳类黄酮的纯化研究. 食品科技, 2009(1): YANG F L, XIA Y, RENG B L. Study on purification of general flavonoids from buckwheat hulls with macroporous resin. Food Science and Technology, 2009(1): (in Chinese) [28] 王雅, 樊明涛, 赵萍, 曾贤菲, 李占娟. 大孔树脂对沙枣多酚的动态吸附解析性能研究. 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 ), 2010, 38(12): WANG Y, FAN M T, ZHAO P, ZENG X F, LI Z J. Dynamic absorption and desorption of polyphenols from Elaeagnus angustifolia L. by macroporous absorbent resins. Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition), 2010, 38(12): (in Chinese) [29] 吴彩娥, 方升佐, 冯宗帅, 杨万霞, 李婷婷, 贾韶千. 青钱柳叶总黄酮大孔树脂纯化工艺. 农业机械学报, 2009, 40(6): WU C E, FANG S Z, FENG Z S, YANG W X, LI T T, JIA S Q. Purification process of total flavonoids in cyclocarya paliurus leaves with macroporous resins. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2009, 40(6): (in Chinese) [30] 冀德富, 郭东艳. HPD100 大孔树脂纯化叶下珠总多酚的工艺研究. 中华中医药杂志, 2013, 28(1): JI D F, GUO D Y. Study on purification of total polyphenols in Phyllanthus urinaria L. by HPD100 macroporous resin. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2013, 28(1): (in Chinese) ( 责任编辑赵伶俐 ) 欢迎订阅 2017 年 中国果树 中国果树 是农业部主管 中国农业科学院果树研究所主办的技术类期刊, 是中国科技核心期刊 全国中文核心期刊 曾荣获第二届国家期刊奖提名奖 农业部优秀科技期刊奖 全国优秀农业期刊一等奖等多项奖励 主要报道我国果树科研新成果 新技术 新优品种, 交流果树生产先进经验, 普及果树科学技术知识, 提供国外果树科技信息等 双月刊, 单月 10 日出版, 每期定价 6.00 元, 全年 6 期共 元, 全国各地邮局均可订阅, 邮发代号 :8-106 也可直接汇款至编辑部订阅, 免收邮费, 如需挂号, 每期另加 3 元 ; 订 10 套以上挂号邮寄, 免收挂号费 地址 : 辽宁省兴城市兴海南街 98 号中国农业科学院果树研究所 中国果树 编辑部 ( 邮编 :125100) 电话 :(0429) ; 传真 :(0429) 电子信箱 :zggsbjb@vip.163.com( 编辑部 ) zggsggb@126.com( 广告部 ); 网址 :

190 中国农业科学 2016,49(19): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 贾丰, 郭玉蓉, 刘冬, 杨曦, 邓红, 孟永宏 ( 陕西师范大学食品工程与营养科学学院, 西安 ) 摘要 : 目的 中国苹果年均产量占世界总产量的 50% 以上, 其中约有 20% 用于工业化深加工 因此, 每年将产生数以万吨的苹果渣, 这些苹果渣一般作为廉价饲料出售或作为废料丢弃, 造成资源极大浪费 比较苹果渣发酵前后多糖的物理特性 流变特性 黏均分子量及基本结构等加工特性, 为苹果渣多糖的开发利用提供新的思路和依据 方法 以苹果原渣多糖 (apple pomace polysaccharides,ap) 苹果酒渣多糖(wine fermented apple pomace polysaccharides,wfp) 苹果醋渣多糖(vinegar fermented apple pomace polysaccharides, VFP) 为原料, 通过对苹果渣多糖提取率 溶解性 乳化性及其稳定性 起泡性及其稳定性 吸湿性与保湿性等物理指标进行全面测定 利用流变仪测定多糖溶液流变学特性 利用台式扫描电镜 (DSEM) 对多糖微观结构进行观察, 同时利用乌氏粘度计对多糖进行黏均分子量测定, 从而对加工特性进行全方位的对比研究 结果 AP 提取率为 5.68%, 发酵苹果渣多糖提取率为 6% 7%, 与 AP 差异显著 (P<0.05) VFP WFP 在水中溶解度分别为 g ml g ml -1, 均与 AP( g ml -1 ) 存在显著差异 (P<0.05) 与 AP 相比, 发酵苹果渣多糖起泡稳定性有所增加, 吸湿性 保湿性明显升高 (P<0.05), 但吸油性 乳化性及乳化稳定性均显著降低 (P<0.05) 此外, 在流变学方面,AP VFP WFP 均为典型的非牛顿流体, 其表观黏度存在明显的浓度依赖特征 ;WFP VFP 具有良好的温度抗逆性 黏均分子量和微观结构分析表明,AP WFP VFP 黏均分子量在 kda, 黏均分子量的大小顺序依次为 :AP>WFP>VFP 台式扫描电镜微观结构图像显示,AP 主要由条带 棒状 片状组成, 结构间相互交联, 形成网状结构 ;WFP 主要由齿状 棒状和片状组成, 有一定交联性, 但交联程度相对较低 ;VFP 主要由较大的片状组成, 弯曲折叠在一起, 交联程度相对最低 结论 发酵苹果渣多糖在物理特性 流变学特性 基本结构 黏均分子量等方面均有所提升, 苹果酒渣多糖 醋渣多糖加工特性优于原渣多糖 关键词 : 苹果渣多糖 ; 发酵 ; 物性 ; 流变性 ; 结构 ; 加工特性 Effect of Fermentation on the Polysaccharides Processing Characteristics in Apple Pomace JIA Feng, GUO Yu-rong, LIU Dong, YANG Xi, DENG Hong, MENG Yong-hong (College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi an ) Abstract: Objective The output of apple in China accounts for over 50% of the world annually. Among those apples, there are about 20% of apple fruits are used as raw materials to produce deep-processed products. As a result, apple pomace of thousands of tons are produced each year, which has caused the tremendous waste of apple recourse because these pomace are generally sold as a cheap fertilizer or are discarded directly as junks. The difference of physical and rheological property, viscosity-average molecular weight, and basic structure of polysaccharides between raw pomace and fermented apple pomace was studied in order to provide innovative thoughts and a theoretical basis for the exploitation of apple polysaccharides. Method Apple pomace (AP), wine fermented apple pomace polysaccharides (WFP), vinegar fermented apple pomace polysaccharides (VFP) were used as experimental materials, the paper 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 农业部现代苹果产业技术体系建设专项 (CARS-28) 联系方式 : 贾丰, feng_juslin@163.com 通信作者郭玉蓉, yurongguo730@163.com

191 3832 中国农业科学 49 卷 investigated overall the processing properties of polysaccharides in fermented apple pomace through comparing with the extract ratio, solubility, hygroscopicity, moisture retention, and emulsifiability, foaming capacity and stability among AP, WFP and VFP. Besides, the rheological properties, microstructure, viscosity-average molecular weight were determined by using rheometer, desktop scanning electron microscope (DSEM), ubbelohde viscometer, respectively. Result The extraction ratio of AP was 5.68%, while that of polysaccharide in fermented apple pomace was 6%-7%, both of which had a significant difference (P<0.05). The solubilities of VFP and WFP were, respectively, g ml -1 and g ml -1, and significantly higher (P<0.05) than AP ( g ml -1 ). Compared to AP, the stability of foaming, hygroscopicity, moistureretention of polysaccharides, fermented apple pomace were significantly increased (P<0.05), while oil absorption, emulsifiability and its stability obviously decreased (P<0.05). According to analysis on rheological property, AP, WFP, VFP could be attributed to typical non-newtonian fluid, and the apparent viscosity showed obvious dependent-characteristic of concentration. Besides, VFP and WFP had great resistance against temperature change. The findings of analysis of viscosity-average molecular weight and DESM indicated that the viscosity-average molecular weight of AP, WFP, VFP all distributed in the range of kda, and AP>WFP>VFP. Additionally, the microstructure analysis showed that AP consisted of band, bar and flake, twining with each other and forming firm network. WFP contained dentation, bar and flake, so its cross-linking was comparatively lower. But VFP mainly consisted of flake, overlapping with one another, and cross-linking was the lowest. Conclusion WFP, VFP were greatly improved in physicaland rheological properties, microstructure and viscosity-average molecular weight, indicating the processing property of polysaccharides in fermented apple pomace was superior to AP. Key words: apple pomace polysaccharide; fermentation; properties; rheology; structure; processing characteristics 0 引言 研究意义 陕西是中国目前苹果种植面积最大 的省份, 有着巨大的苹果生产力, 截至 2015 年底, 陕 西果业面积和产量连续增长, 苹果产量占全国 25%, 世界 14%, 苹果汁产量占世界 30% 陕西果业已成为 陕西省大农业中效益最好 风险最小 竞争力最强的产 业 [1] 在大产业条件下, 每年将产生大量苹果渣, 目前 这些苹果渣的利用多集中在饲料或饲料加工, 甚至丢 弃, 不但造成浪费, 还对环境造成影响, 因此, 寻求新 方法或途径来实现苹果渣的利用, 不但可有效利用苹果 渣营养成分, 同时可延长苹果加工企业产业链, 创造经 济价值, 为苹果渣加工提供理论支持和保证 前人研 究进展 刘杰超 [2] 李锦运 [3] 李倩 [4] 张丽萍 [5] 苏钰 琦 [6] 马惠玲 [7] 马文杰 [8] 耿乙文 [9] [10] 尤毅娜等主 要集中在苹果渣中多糖的提取 分离 纯化 改性及其 生物活性等方面研究 ; 李洁 [11] [12] 毛英丽等虽然进行 了物性或者流变学研究 LOHANI [13] MADRERA [14] EVCAN [15] MACAGNAN [16] 等主要进行了多酚 纤维 素以及发酵香气与生产饲料研究 此外, 根据现有研究, 植物多糖具有极好的生物活性, 如抗肿瘤 抗癌 防衰 [17-18] 老 抗高血脂 抗炎 抗病毒, 同时提高免疫力等 作用 本研究切入点 但在发酵苹果渣多糖物性 流 变性与结构等方面研究鲜有报道, 且多数是对新鲜苹果 渣或干苹果渣进行研究 在良好生物活性前提下, 对其 加工特性进行研究, 可以更有效利用苹果加工产业副产 物 苹果渣, 达到为企业创收和保护环境的双重目 的 [19-21] 拟解决的关键问题 通过探究发酵苹果渣多糖与苹果渣多糖在物性 流变性 结构等方面的加工特性, 为发酵苹果渣多糖的加工与利用提供理论支撑, 同时为苹果加工企业苹果渣的综合利用提供新思路 1 材料与方法 1.1 材料与试剂苹果 ( 秦冠 ) 原渣 :2015 年 4 月, 陕西蓝海果业有限公司苹果酒加工副产物原渣, 烘箱 50 烘干, 破碎, 过 40 目筛, 待用 苹果酒渣 : 陕西蓝海果业有限公司苹果酒加工副产物原渣在陕西师范大学食品工程与营养科学学院中试工厂接种安琪酵母 DV10, 常温 ( 约 25 ) 固态发酵 20 d, 取渣, 烘箱 50 烘干, 破碎, 过 40 目筛, 待用 苹果醋渣 : 陕西蓝海果业有限公司苹果酒加工副产物原渣经陕西咸阳三原甘露池醋厂酿醋工艺 ( 添加 5% 左右蔗糖,3 5 d 安琪酵母固态发酵,6 15 d 醋酸菌固态发酵, 室温发酵 ) 获得醋渣, 烘箱 50 烘干, 破碎, 过 40 目筛, 待用 95% 粮食酒精, 西安市晶博生物有限公司 ; 其余药品均为分析纯 1.2 仪器与设备 EQUINX55 傅里叶变换红外光谱仪, 德国 Brucher 公司 ; 乌氏粘度计, 上海 EHSY 西域仪器公司 ;AR-G2 流变仪, 美国 TA 公司 ;Multiskan Go 全波长酶标仪, 美国热电公司 ;TM3030 台式扫描电子显微镜, 日立公司等 1.3 试验方法 发酵苹果渣多糖的制备

192 19 期贾丰等 : 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 3833 苹果渣 Apple pomace 脱脂 Skimmed 过滤得滤渣 Filtration gave residue 超声辅助水提 Ultrasound-assisted water extraction 浓缩滤液 The filtrate was concentrated 醇沉 Alcohol precipitation 粗多糖 Polysaccharides 冷冻干燥 Freeze-drying 旋蒸浓缩 Concentrated 透析 Dialysis 旋蒸浓缩 Concentrated 滤渣水溶解 Residue dissolved in water [11] 发酵苹果渣多糖的鉴定参照李洁方法, 利用溴化钾压片法在 cm -1 区间进行红外光谱扫描, 观察谱峰情况 [22-25] 发酵苹果渣多糖物性研究 [12] 溶解性参照毛英丽等方法, 称量少量样品多糖溶于蒸馏水 ( 先称取 0.05 g 加入溶解, 快到达饱和溶液时每次称取 g 加入溶解 ), 记下溶解质量, 即为溶解性 以相同方法将样品溶解于乙醇 丙酮 乙酸乙酯 四氯化碳等常见溶剂中, 进行研究 吸油性及蔗糖 NaCl 对其影响准确称取 0.10 g 多糖样品, 再加入 5.0 ml 植物油,6 000 r/min 离心 10 min, 测定游离油的体积 (V); 分别添加 0.01 g 0.03 g 0.05 g NaCl 蔗糖观察吸油性变化 [12,17] : 吸油性 (ml g -1 )=(5-V) 起泡性及其稳定性研究 (1) 起泡性称取 0.50 g 多糖样品加入 50 ml 蒸馏水中, 测定溶液的初始体积 V 0, 高速搅拌 1 min 后, 测定总体积 V; 分别添加 和 0.05 g NaCl 与蔗糖研究起泡特性 调节 ph 在 4 10 范围, 研究多糖起泡特 V V0 性, 以起泡率表示 : 起泡率 (%)= 100 V0 (2) 泡沫稳定性按照 (1) 操作后, 分别记录搅打停止 和 120 min 后的泡沫初始体积 V 0 和溶液的总体积 V i, 用稳定系数衡量泡沫 V i 的稳定性, 稳定系数 K 表示 :K= V 乳化性及其稳定性 1% 多糖 5 ml 和同体积大豆油混合, 记录液体高度 H 0, r/min 高速乳化 2 min,3 000 r/min 离心 5 min, 记录乳化层高度 H, 重复 3 次, 取平均值计算乳化活性 : H EA(%)= 100 H 0 将乳化样品 80 水浴 30 min, 冷却 15 min,3 000 r/min 离心 5 min, 如上, 计算乳化稳定性 ES: H ES(%)= 100 H 吸湿性与保湿性称取 0.50 g 干燥多糖置于称量杯中, 放入两个干燥器中 ( 形成相对湿度分别为 RH=81% 和 RH=43% 的环境 ), 然后将干燥器置于 25 的恒温箱中, 每隔 12 h 称量多糖的质量, 研究其吸湿性 ; 相对湿度换为 RH=43% 和放置硅胶干燥剂的干燥器中, 用水分残存率来表示保湿性 : Δ m w= 100% m 0 式中,w: 吸湿率 (%);Δm: 多糖水分的增加量 ; m 0 : 多糖的质量 M R= 100% M 0 式中,M 0 为放置前多糖中水分含量 ;M 为放置后多糖水分含量 发酵苹果渣多糖流变学研究 剪切速率和浓度对多糖流体特性影响参 [11] 照李洁等方法, 配制质量浓度为 0.1% 0.3% 0.5% 多糖溶液进行研究 温度对多糖流体特性影响配制质量浓度 [11] 为 0.5% 的溶液, 参照李洁等操作进行 放置时间对发酵苹果渣多糖流体特性的影响配制 0.5% 质量浓度的多糖溶液, 分别放置 1 h [11] 24 h 和 2 周后, 参照李洁等方法进行 [11] 黏均分子量的测定参照李洁等方法进行 台式扫描电子显微镜观察结构采用 TM3030 台式扫描电子显微镜对发酵苹果渣多糖样品进行显微形态观察, 在电压为 15 kv 的条件下观察 3 种多糖样品的结构特征 [12] 1.4 数据分析试验结果采用 DPS v7.05 统计软件进行统计分析,Excel 2010 Origin8.0 软件绘图制表

193 3834 中国农业科学 49 卷 2 结果 2.1 发酵对苹果渣多糖提取率的影响多糖制备所得样品纯度 70% 左右,3 种粗多糖纯度没有显著性差异 提取率如表 1, 随着发酵的进一步进行, 苹果渣多糖的提取率明显增强 (P<0.05), AP WFP VFP 的提取率分别为 5.68% 6.00% 7.09% 2.2 发酵苹果渣多糖的鉴定不同的化学键或官能团吸收频率不同, 在红外光谱上将处于不同位置, 从而可获得分子中化学键或官能团的信息来鉴定不同物质 [22-23] 如图 1-A B C,AP WFP VFP 在 cm -1 区间均有多糖的特征吸收峰, 且吸收峰基本一致,3 450 cm -1 处的吸收峰代表 表 1 发酵对苹果渣多糖提取率的影响 Table 1 Effect of fermentation on apple pomace polysaccharide extraction yield 多糖种类 Polysaccharides 苹果原渣多糖 AP 苹果酒渣多糖 WFP 苹果醋渣多糖 VFP 提取率 Extraction rate (%) 5.68±0.014c 6.00±0.007b 7.09±0.078a 同行中不同字母表示数值间存在显著差异 (P<0.05) 下同 Counterparts in different letters indicate significant differences exist between the matter (P<0.05). The same as below A AP B WFP 波数 Wave numbers (cm -1 ) 0.9 C VFP 波数 Wave numbers (cm -1 ) AP: 苹果原渣多糖 Apple pomace polysaccharides;wfp: 苹果酒渣多糖 Wine fermented apple pomace polysaccharides;vfp: 苹果醋渣多糖 Vinegar fermented apple pomace polysaccharides 下同 The same as below 图 1 多糖鉴定结果 Fig. 1 Results of identified polysaccharides 多糖的 O H 伸缩振动, cm cm -1 处吸收峰代表多糖的 C H 伸缩振动, cm -1 处吸收峰表示多糖的 C=O 的非对称伸缩振动, cm -1 处吸收峰表示多糖的 C=O 的对称伸缩振动和弯 曲振动 [23] 每种特定的多糖在 cm -1 区域具有特殊的吸收峰, 在此波长区间内, 可以判断出多糖的主要化学基团, 而每种多糖化学键的位置和强度都是特定的, 因此, cm -1 波长区间也称为多糖

194 19 期贾丰等 : 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 3835 的指纹区 [24], cm cm -1 为 C OH 的伸缩振动峰和 C O C 糖苷键的振动峰 [25], 表明 AP WFP VFP 三种多糖中均有吡喃糖单元的存在, 可见所提取成分为多糖 2.3 发酵对苹果渣多糖物性的影响 溶解性如表 2,VFP WFP AP 在水中溶解性分别达到 和 g ml -1, 经发酵, 苹果渣多糖溶解性明显改善 (P<0.05), 且 3 种 多糖均不溶于乙醇 丙酮 乙酸乙酯 丙三醇 石油醚 氯仿等 吸油性如图 2-A,AP WFP VFP 吸油性分别为 和 2.9 ml g -1, 经发酵处理,WFP VFP 的吸油性明显减弱 (P<0.05) 如图 2-B C, 添加蔗糖 NaCl 对 AP WFP VFP 吸油性增强作用明显 (P<0.05), 对吸油性影响大小为 :WFP> VFP>AP 表 2 发酵对苹果多糖溶解性的影响 Table 2 The influence of fermentation on apple pomace polysaccharide solubility 苹果原渣多糖 AP 苹果酒渣多糖 WFP 苹果醋渣多糖 VFP 水 Water ±0.0006c ±0.0006b ±0.0002a 乙醇 Ethanol 丙酮 Acetone 乙酸乙酯 Ethyl acetate 丙三醇 Glycerol 石油醚 Petroleum ether 氯仿 Chloroform 表示不溶解 indicates not dissolve counterparts 多糖种类 Polysaccharide species VFP WFP AP A c 吸油性 Oil absorption (ml g -1 ) b a 吸油性 Oil absorption (ml mg -1 ) B AP WFP VFP b c a d b b a a d c c d 蔗糖添加量 Sucrose amount (g ml -1 ) 吸油性 Oil absorption (ml g -1 ) C d d AP WFP VFP c c d c b b b a a a NaCl 添加量 NaCl amount (g ml -1 ) 同组不同小写字母表示差异显著 (P<0.05) 下同 Different small letters indicate significant difference (P<0.05). The same as below Fig. 2 图 2 添加 NaCl 和蔗糖对发酵苹果多糖吸油性的影响 The influence of adding NaCl, sucrose on oil absorption of the polysaccharides

195 3836 中国农业科学 49 卷 起泡性及其起泡稳定性 (1) 起泡性如图 3-A,3 种多糖都具有一定的起泡性, 且 WFP VFP 起泡性稍高于 AP, 但 WFP AP 之间无显著性差异,VFP AP 之间差异显著 (P< 0.05) 添加 NaCl 对多糖起泡性影响如图 3-B,AP 加入 NaCl 其起泡性与浓度成正比 蔗糖对多糖起泡性影响如图 3-C, 添加蔗糖对 3 种多糖起泡性影响与添加 NaCl 基本一致, 都有改善作用, 特别是 VFP ph 对多糖起泡性影响如图 3-D, 酸性条件下成正相关, 碱性条件下成负相关,WFP VFP 在酸性条件下起泡性优于碱性条件, 起泡性都在 ph 6 8 达最大, 结果 [12] 与毛英丽等结果一致 (2) 泡沫稳定性如图 4, 起泡稳定性基本趋势是 VFP>WFP>AP,60 min 后泡沫大部分消失,75 min 后 WFP>VFP>AP, 发酵苹果渣多糖泡沫稳定性大于 AP 多糖种类 Polysaccharide species VFP WFP AP A b ab a 起泡性 Foaming (%) 60 B AP WFP VFP 起泡性 Foaming (%) C 起泡性 Foaming (%) AP WFP VFP 起泡性 Foaming (%) D NaCl 浓度 NaCl concentration (g ml -1 ) AP WFP VFP 蔗糖浓度 Concentration of sucrose (mg ml -1 ) ph 图 3 (A) 发酵对苹果多糖起泡性以及添加 NaCl(B) 蔗糖(C) 与调节 ph(d) 对多糖起泡性的影响 Fig. 3 (A) The influence of fermentation on faomability of the apple pomace polysaccharides and the effect of adding NaCl (B), sucrose (C) and adjusting ph (D) on the foamability of polysaccharides 稳定系数 Stability factor 图 4 发酵对苹果渣多糖起泡稳定性的影响 Fig. 4 The influence of fermentation on apple pomace polysaccharides bubble stability 乳化性及其乳化稳定性乳化性如图 5-A, AP WFP VFP 都具有一定的乳化性, 且 VFP<WFP <AP, 其中 AP 乳化活性达 53%,WFP VFP 分别是 14% 和 12%, 这说明苹果渣经发酵改性后获得的多糖乳化活性明显降低 (P<0.05); 如图 5-B,AP WFP VFP 乳化稳定性分别是 94.7% 65.4% 60.5%, 乳化稳定性还是 AP 最好,WFP VFP 乳化稳定性相对较差, 发酵后乳化稳定性明显降低 (P<0.05) 吸湿性与保湿性吸湿性如图 6-a b, 分别表示 RH=81% 和 RH=43% 环境中,AP WFP VFP 吸湿性大小为 :WFP>VFP>AP, 且在前 12 h 吸湿性快速增大,12 h 后吸湿性变化不明显,24 h 后基本达到稳定状态, WFP VFP 吸湿性更好 保湿性如图 6-c d, 分别表

196 19 期贾丰等 : 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 3837 A B 多糖种类 Polysaccharide species VFP WFP AP b b a 多糖种类 Polysaccharide species VFP WFP AP b b a 乳化性 Emulsifying (%) 乳化稳定性 Emulsion stability (%) 图 5 发酵对苹果多糖乳化性 乳化稳定性的影响 Fig. 5 The influence of fermentation on polysaccharides emulsification and emulsion stability 10 8 a 10 8 b AP WFP VFP c 时间 Time (h) d 时间 Time (h) a:rh=81%;b:rh=43%;c:rh=81%;d: 干燥硅胶 Dry silica gel 图 6 发酵对苹果多糖吸湿性和保湿性的影响 Fig. 6 The influence of fermentation on polysaccharides moisture absorption and retention 示 RH=81% 和干燥硅胶环境中,AP WFP VFP 保湿性能较好,72 h 保湿性还在 20% 以上, 且始终是 AP <WFP<VFP 在干燥硅胶环境中,72 h 过程中 WFP VFP 始终较 AP 具有更好的保湿性, 前 24 h 中保湿性始终是 WFP<VFP,24 h 以后两者基本一致 2.4 发酵对苹果渣多糖流变学影响 剪切速率对发酵苹果渣多糖流体特性的影响如图 7 所示, 随着剪切速率的增大,3 种多糖溶液的表观黏度均降低 (AP>WFP>VFP), 此外, 在低剪切速率范围 (0 150 s -1 ) 内,3 种多糖溶液, 随着剪切速率升高, 多糖溶液的流体特性趋于稳定,0.5% (w/w) 的 AP WFP VFP 黏度分别为 和 0.01 Pa s 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) 图 7 剪切速率对多糖黏度影响 Fig. 7 The influence of shear rate on the viscosity of polysaccharides

197 3838 中国农业科学 49 卷 浓度对发酵苹果渣多糖流体特性的影响如图 8-a b c, 在剪切速率 s -1,AP WFP VFP 表观黏度随着浓度的增加而增大 [26], 且 AP>WFP >VFP,0.5% 的 AP WFP VFP 溶液的表观黏度分别为 和 Pa s 0.3% 的 AP WFP VFP 溶液的表观黏度分别为 和 Pa s 0.1% 的 AP WFP VFP 溶液的表观黏度分别为 和 Pa s 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) a AP 0.5% (w/w) b WFP 0.5% (w/w) AP 0.3% (w/w) 0.21 WFP 0.3% (w/w) AP 0.1% (w/w) WFP 0.1% (w/w) 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) 剪切速率 Shear rate (1/s) 剪切速率 Shear rate (1/s) 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) c VFP 0.5% (w/w) VFP 0.3% (w/w) VFP 0.1% (w/w) 剪切速率 Shear rate (1/s) 图 8 浓度对多糖黏度影响 Fig. 8 The influence of different concentrations on the viscosity of polysaccharides 温度对发酵苹果渣多糖流体特性的影响如图 9,AP WFP VFP 表观黏度随温度的升高而迅速降低,AP 表观黏度受温度影响最大,WFP VFP 表观黏度降低趋势稍缓, 温度升高对 AP 的流体特性影响较大, 对 WFP VFP 流体特性影响不大 [27-28] 放置时间对发酵苹果渣多糖流体特性的影响如图 10-a b c, 放置 1 d 2 周后,AP WFP VFP 表观黏度均下降, 放置 1 d 后, 多糖溶液的初始黏度有明显的降低 2.5 发酵对苹果渣多糖黏均分子量的影响由表 3 可知,AP WFP VFP 黏均分子量在 kda,ap 的分子量最大, 其次是 WFP,VFP 最小, 发酵苹果渣多糖分子量明显减小 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) 温度 Tempreture ( ) AP 0.5% (w/w) WFP 0.5% (w/w) VFP 0.5% (w/w) 图 9 温度对多糖黏度影响 Fig. 9 The influence of different temperatures on the viscosity of polysaccharides

198 19 期贾丰等 : 发酵对苹果渣多糖加工特性的影响 3839 [29-30] 2.6 发酵对苹果渣多糖微观结构的影响 如图 11,AP WFP VFP 扫描图像分别如图 A i W i V i (i=1,2,3), 分别是在 倍条件下获得 由 A 1 A 2 A 3 可以看出 AP 多由条带 棒状 (A 1 A 2 ) 片状(A 3 ) 组成,AP 结构之间相互交联, 组成网状结构 W 1 W 2 W 3 可以看出 WFP 主要有齿状 (W 1 ) 棒状(W 2 ) 和片状 (W 3 ), 与 AP 相比, 结构相对简单, 有一定交联性, 但交联性低 (W 2 W 3 ) V 1 V 2 V 3 可以看出 VFP 主要有片状结构 (V 1 V 2 V 3 ), 结构简单, 主要由较大的片状组成, 弯曲重叠在一起 (V 2 V 3 ) 表观黏度 Apparent viscosity (Pa s) a AP 2 w AP 3 d AP 1 d 剪切速率 Shear rate (1/s) 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) b WFP 2 w WFP 3 d WFP 1 d 剪切速率 Shear rate (1/s) 表观黏度 Apparent viscosity (Pa.s) c 剪切速率 Shear rate (1/s) VFP 2 w VFP 3 d VFP 1 d 图 10 放置时间对多糖黏度影响 Fig. 10 The influence of time on the viscosity of polysaccharides 表 3 3 种多糖的黏均分子量 Table 3 The viscosity-average molar mass of polysaccharides M H M K M AV 苹果原渣多糖 AP 苹果酒渣多糖 WFP 苹果醋渣多糖 VFP M H 为哈金斯黏均分子量 ;M K 为克莱默黏均分子量 ;M AV 为平均黏均分子量 M H is Huggins viscosity average molecular weight; M K is Kramer viscosity-average molecular weight; M AV is average viscosity average molecular weight 3 讨论 WFP VFP 提取率明显高于 AP(P<0.05), 主要是因为苹果原渣含有较多的醇溶性物质, 以及 小分子糖, 经醇沉 透析等步骤后除去单糖与醇溶性物质, 导致多糖含量偏低, 而苹果渣在发酵过程中部分果胶在发酵过程中有所降解, 导致最终多糖含量提高

199 3840 中 国 农 业 科 49 卷 学 A1 A2 A3 W1 W2 W3 V1 V2 V3 图 11 Fig. 11 台式扫面电镜图 Desktop scanning electron micrographs of polysaccharides 物性方面主要有以下几个方面的提升 1 发酵 浓度减弱起泡性 而较高浓度则具有增强作用 但改 苹果渣多糖在水中的溶解性明显改善 P 0.05 但 善作用有限 其结果与毛英丽等[12]结果基本一致 蔗 不溶于乙醇 丙酮 乙酸乙酯 丙三醇 石油醚 氯 糖对 AP WFP VFP 起泡性影响趋势基本一致 添 仿等 原因是采用水提醇沉法来获得多糖 等质量溶 加蔗糖对于 3 种多糖的起泡性有改善作用 特别是 解时 AP 黏度明显高于 WFP VFP 这对溶解性有一 VFP 而对于 AP WFP 而言 一定浓度增强其起泡 [9] 定的阻滞作用 导致 AP 溶解性较差 此外 WFP 性 浓度稍大时作用就不再明显[30-33] 起泡性在食品 VFP 水溶性高于 AP 的原因还可能是发酵中多糖支链 加工等方面有着重要的作用 一般起泡性较好的物质 打开 多糖分子减小 脂肪链缩短 部分亲水基团裸 都是良好的表面活性剂 有助于气体在液体中形成稳 露 导致溶解性较好 2 发酵苹果渣多糖起泡性有 定的形态[11,34] 稳定系数 K 直接关系到泡沫稳定性 所改善 P 0.05 主要与黏度 溶解性有关 黏度 而泡沫持久性与起泡性在食品加工中所发挥的作用息 越大 表面张力越大 导致起泡性减弱 起泡稳定性 息相关 因此物质具有良好的泡沫稳定性 才能更好 基本趋势是 VFP WFP AP 但在 75 min 后 WFP 的发挥起泡性的作用[35-37] 3 WFP VFP 吸湿性 VFP 主要原因可能是 VFP 溶解性大于 WFP 导致 保湿性能优于 AP 主要原因可能与溶解性 黏度和分 在等质量分数的溶液中 VFP 的黏度偏大 直接影响其 子量大小有关 溶解性在一定程度上就反映了物质吸 泡沫稳定性 这与黏度 溶解性的结论相统一 ph 对 湿性和保湿性 而分子量较大时分子中的脂肪链较长 物质起泡性有一定的影响 不同物质存在较大差异 亲水性基团包裹在脂肪链中 经发酵改性 导致脂肪 AP 在 ph 3 10 范围内 起泡性在酸性条件下成正相 链断开来 亲水性基团裸露 导致其吸湿性和保湿性 关 碱性条件下成负相关 WFP VFP 在酸性条件下 明显改善 吸湿性和保湿性是加工食品或者保证食品 的起泡性优于碱性条件 但 3 种多糖的起泡性基本都 口感 货架期 营养等方面的重要条件 4 发酵苹 在 ph 6 8 达最大 对于 AP 而言 加入 NaCl 对其起 果渣多糖吸油性 乳化性及其乳化稳定性有所减弱 泡性的影响基本与浓度成正比 WFP VFP 则在较低 但可通过添加蔗糖 NaCl 调节 ph 得以改善 原因