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1 上海伯豪生物技术有限公司 DNA 甲基化研究策略解析 李明辉

2 背景介绍 : 表观遗传学 (epigenetics) 表观遗传学 (epigenetics): 研究基因组 DNA 序列未改变的情况下, 基因功能的可逆的 可遗传的改变的学科 表观遗传调控机制是生命过程中普遍存在的一种调控方式, 在干细胞维持和自我更新与分化, 个体的衰老和发育异常及疾病 ( 如肿瘤 糖尿病 精神病及神经系统疾病等复杂疾病 ) 的发生发展中起着决定性的作用 表观遗传学研究已越来越得到业界的广泛认同, 成为当今生命科学的一个重要的前沿和热点领域 DNA 的甲基化修饰, 非编码 RNA 调控, 组蛋白修饰, 染色质重塑, 基因组印迹,

3 DNA 的甲基化修饰 第五种碱基 5 mc

4 DNA 的甲基化修饰

5 DNA 甲基化的研究方法 1 亚硫酸盐修饰 2 甲基化特异性内切酶 ATCGCGTGCATCCGCG ATCGC GTGCATCCGCG 3 蛋白或抗体富集

6 DNA 甲基化的研究技术 应用方法基本原理 全基因组整体甲基化的分析 Globle methylation analysis 全基因组甲基化分析 Whole genome methylation Genome scale methylation 单基因 / 位点甲基化分析 HPLC HPCE SssⅠ acceptance assay Immunochemical analysis Bisulfite genomic sequencing ChIP seq (MeDIP / MIRE / MBD) Target BS seq (SeqCap Epi) Illumina infinium 450K ChIP chip (MeDIP / MIRE / MBD) RRBS Bisulfite sequencing, BSP COBRA Methylation-specific PCR, MSP MethyLight HRM pyrosequencing MSRE-PCR Ms-SnuPE MS-SSCA MSO 酶解后高效液相层析酶解后高效毛细管电泳甲基化转移酶放射标记免疫化学结合荧光分析 BS 结合全基因组测序蛋白 ( 抗体 ) 富集并结合高能量测序分析目的区段捕获结合 BS 测序 BS 结合 Illumina beads array 蛋白 ( 抗体 ) 富集并结合芯片分析酶切片段回收后 BS-seq Bs 结合测序 Bs 结合酶切 Bs 结合 PCR Bs 定量 PCR Bs 结合高分辨率熔解曲线 Bs 结合焦磷酸测序酶切结合 PCR Bs 结合单核苷酸延伸 Bs 单链构象分析 Bs 结合芯片分析

7 高通量全基因组 DNA 甲基化研究技术 ChIP on chip ChIP - seq

8 Bisulfite + array Illumina beads array GoldenGate: 1,536 specific CpG sites in 371 genes Infinium methylation27: 27,578 CpG in 14,473 genes Infinium methylation450: 485,553 CpG covering 96% CGI

9 Infinium methylation450 参数

10 全基因组甲基化测序 ----Arabidopsis Fragmentation methylated adapter 5 μg DNA sonication 50 to 500 bp MethylC-seq BS-seq WGBS Maintenance (met1-3) Gel size selection EpiTect Bisulfite kit Illumina GA Eland algorithm mapping ng DNA 120 to 170 bp FFPE procedure X2 5ng of BS-treated DNA 18cycles PCR bp insertion 49-56bp read aligned reads: 55,805,931 Unique: 39,113,599 average depth: 8.0 coverage of 78.5% identified 2,267,447 mc demethylation establishment (ros1-3 dml2-1 dml3 (drm1-2 drm2-2 cmt3-11)

11 全基因组甲基化测序 ----Human Fragmentation By sonication Illumina methylated adapter 5 μg DNA 50 to 500 bp +25 ng UM cl857 Sam7 Lambda DNA H1 IMR90 No.reads(G) Data (Gb) Depth mc detected (M) 62(5.83%) 45(4.25%) coverage of 1 read 86% coverage of cytocine 94% Gel size selection 140 to 210 bp MethylEasy Xceed kit Human Genetic Signatures NSW, Australia Illumina GAII Bowtie mapping 1/3 of BS-treated DNA 4 cycles PCR bp insertion 87bp read

12 甲基化修饰在基因组分布及与基因表达的关系 H = A, C or T 高表达基因的非 CG 甲基化位点比不表达的基因低三倍

13 Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS bp ng ug bp

14 定向二代测序从基因组 DNA 中富集甲基化片段后测序 基因组 DNA 测序文库制备 亚硫酸氢盐处理 SeqCap Epi 目标区域捕获 ( 定制探针 : CG, CHG, CHH) 扩增富集的 DNA 测序 14

15 NimbleGen SeqCap Epi 甲基化捕获系列产品各取所需 目录产品 - 人类全基因组 SeqCap Epi CpGiant Enrichment Kit 全基因组水平的甲基化位点富集 包括了 Illumina s Infinium Human Methylation 450 BeadChip 的所有位点及其附近的区域 定制产品 - 人类或非人类 SeqCap Epi Choice Enrichment Kits 人类基因组特定区域定制设计 最大 90Mb 区域可设计 SeqCap Epi Developer Enrichment Kits 非人类基因组特定区域定制以及超大区域的人类基因组 最大 210Mb 区域可设计 覆盖人类基因组上 >5.5 million 个 可 CpG 位点 仅需 1/4 2x100 bp HiSeq Lane ( 捕获目标 :CG, CHG, CHH) 包装数 :4,48, 384 Rxn 包装数 :12,48, 384 Rxn 15

16 定制目的基因或 CG 位点的研究 SureSelect Methyl-Seq 84Mb; Methyl-Seq Version 1 Site Classification Covered regions (bp) CpGs covered by baits CpG Islands 19,605,556 1,679,870 Cancer-, Tissue- Specific DMRs 9,773, ,619 Gencode promoters 36,974,007 1,272,026 CpG Island shores/shelves (±4 kb) Enhancer Ensemble regulatory features Dnase I hypersensitive sites 48,021,626 2,057,280

17 ChIP chip/ ChIP seq 实验方法原理 -- MeDIP/MIRA/MBD A: 将基因组 DNA 超声打断成 300bp-1000bpDNA 片段 ; B: 将破碎的 DNA 样品分成两份,( 采用 MeDIP 方法需要将样本加热变性为单链与抗体结合 ); C: 其中一份 DNA 样品加入 MBD-GST 蛋白或 5'-mC 抗体与甲基化 DNA 结合 D: 利用 Sepharose 4b 琼脂糖珠或包被有 protein A 的免疫磁珠法分离 C 步样品中甲基化 DNA 片段的抗体或蛋白复合物 ; E: 纯化富集得到的 DNA 片段并扩增 ; F: 对富集 DNA 与 Input DNA 样品分别进行标记或测序文库构建 ; G: 芯片杂交或二代测序 ; H: 结果分析

18 MeDIP-seq 结果展示

19 MeDIP-seq 应用案例 慢性粒单核细胞白血病 (CMML) 是一种慢性髓系白 血病 发病率约为每年 1~2/ , 多数在 60 岁以后发 病, 具体病因不明 目前尚无特效的治疗方法

20 DNMT3A R882 突变体功能研究 已发现 DNMT3A 在急性髓系白血病中存在高频突变 (R882H) 利用一种逆转录病毒转导和骨髓移植 (BMT) 揭示了 DNMT3A- Arg882His (R882H) 突变体的转化能力, 证实这一突变可以诱导造血干 / 祖细胞异常增殖 BMT 12 个月后, 所有小鼠形成了 CMML

21 DNMT3A R882 突变体作用机制 DNMT3A 突变体影响重要基因的甲基化水平, 也一些造血作用相关基因异常表达 DNMT3A R882 突变通过提高造血细胞 CDK1 蛋白水平, 破坏转录表达 /DNA 甲基化程序和细胞周期调控驱动了 CMML

22 焦磷酸测序 重亚硫酸盐处理 PCR 扩增与纯化 焦磷酸测序 类似高通量测序 : 边合成边测序

23 Pyrosequencing

24 甲基化芯片应用案例 J Clin Endocrin Metab. First published ahead of print April 3, 2012 DNA 甲基化芯片比较正常组织 良性肿瘤 原发性恶性肿瘤 转移性恶性肿瘤的甲基化谱 ; 恶性肿瘤的甲基化程度低 ; 与表达谱芯片数据联合分析

25 1 样品与芯片 1 甲基化芯片 芯片型号 : Illumina Infinium Human Methylation450 BeadChip 样品情况 : 样品类型 正常组 良性肿瘤 原发性恶性肿瘤 转移性恶性肿瘤 数目 样品类型 : 肾上腺皮质组织 肿瘤组织取自外科手术 正常组织取自器官移植手术 2 表达谱芯片 芯片型号 : Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0 GeneChip 样品情况 : 样品类型 良性肿瘤 原发性恶性肿瘤 数目 74 5

26 2 甲基化芯片结果 恶性肿瘤 正常组织 良性肿瘤 恶性肿瘤与正常组织之间甲基化差异位点的分布 聚类分析 : 恶性肿瘤存在低甲基化现象 Primary malignant(acc):8 Metastatic :12 Benign:47 Normal:19

27 3 甲基化芯片与表达谱芯片的联合分析 发现 52 个基因, 在肿瘤中低表达, 并且超甲基化 对这 52 个基因进行功能分析, 发现主要集中于药物代谢 内分泌系统发育 脂类代谢相关的信号通路

28 案例 : 乳腺癌甲基化分子标记研究 雌激素受体相关预后相关

29 对雌激素受体 (ER+:ER-) 甲基化分子标记研究 对差异最大的 5% 探针的非监督聚类 (1378probe) ER+ ER- ER- loci, ratio: ,112 loci ER+ loci, ratio: ,264 loci was higher 乳腺癌相关基因 雌激素受体阳性个体 : 更高甲基化 雌激素受体亚型的区分 AUC=0.961 雌激素受体阴性个体在转录起点更多高甲基化位点 40 probes set 50 个体

30 DNA 甲基化在双生子间的比较 多发性硬化症 多层面多平台综合分析 RRBS

31 复杂疾病研究策略 多层面综合研究 案例 : 结肠癌 97 个病例进行低覆盖度全基因组测序, 检测变异程度 224 组病例 ( 癌 / 癌旁 ) 外显子捕获测序, 寻找突变 SNP 6.0 芯片检测拷贝数变异 RNA-seq 检测转录组变异 ( 可变剪接 基因融合等 ) 表达谱芯片, 甲基化芯片,miRNA-seq 等 多层面综合分析,pathway 分析, 发现一些新的肿瘤标志物

32 总结 基因组 转录组 表观遗 传 芯片 测序

33 需要了解更多? 请访问 ebioservice 技术服务热线 : /

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