64 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 4 期石斛中总多酚提取条件, 并对金钗石斛中的多酚化合物进行体外自由基清除实验, 初步分析其抗氧化活性, 以期寻找金钗石斛抗氧化活性的物质基础. 材料与方法. 材料与试剂.. 试验材料金钗石斛购自云南普洱, 于 60 下烘干备用... 药品与仪器 AB

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澜占怀
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1 DOI: 0.374/SP.J 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 05, ( 4 ) : 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 * 费雯淳泽何沁嶷王淼雨罗傲雪 ** 范益军 ** 四川农业大学风景园林学院成都 630 中国科学院成都生物研究所成都 6004 摘要金钗石斛 (Dendrobium nobile) 具有多种保健作用, 药用价值突出. 通过 Box-Behnken 响应面分析法, 研究金钗石斛总多酚的最佳提取工艺, 并评估其体外抗氧化活性. 采用溶剂法提取总多酚, 在单因素实验基础上, 利用 Box- Behnke 响应面分析法对 ph 值乙醇浓度和料液比等参数进行优化, 寻找最佳工艺. 抗氧化活性以 Vc 为阳性对照, 通过体外自由基清除实验评价金钗石斛总多酚的抗氧化活性. 结果显示, 当乙醇浓度为 7%(V/V), 料液比为 :5(g/mL), ph 值为 3 时金钗石斛总多酚提取效率最高, 为 86.%. 体外抗氧化实验显示, 金钗石斛总多酚对 ABTS DPPH 自由基和羟基自由基活性均有不同程度的清除作用, 其清除能力与总多酚质量浓度呈正相关, 在浓度为 5 mg/ml 时对 ABTS (Agreement on Basic Telecommunication Services) DPPH(,-diphenyl--picrylhydrazyl) 羟自由基 3 种自由基的清除率分别为 00% 78.54% 和 49.%. 本研究通过响应面法得到了提取得率及多酚含量较高的金钗石斛总多酚最优提取工艺条件, 且得到的金钗石斛总多酚有良好的抗氧化能力. 图 3 表 4 参 5 关键词金钗石斛 ; 多酚 ; 响应面法 ; 抗氧化 CLC Q Extraction conditions and in vitro antioxidant activities of polyphenols from Dendrobium nobile* FEI Wen, CHUN Ze, HE Qinyi, WANG Miaoyu, LUO Aoxue ** & FAN Yijun ** Department of Landscape Plants, Sichuan Agriculture University, Chengdu 630, China Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 6004, China Abstract Dendrobium nobile has various health care functions and therefore of prominent medicinal value. This study aimed to find out optimal extraction conditions of polyphenols from Dendrobium nobile and to understand their antioxidant activity in vitro. With a single-factor experiment, the main parameters affecting the yield of phenolics were defined, including the ph of solvent, ethanol concentration and ratio of water to raw material. The antioxidant activities of the total polyphenols extract were evaluated by ABTS radicals, DPPH radicals and hydroxyl radicals using Vc as control. The optimal extraction parameters for total polyphenols yield were ethanol concentration 7% (V/V), ratio of water to raw material as :50 (g/ml), ph of 3, to obtain an extraction yield of total phenolic of With the concentration of total phenolic from Dendrobium nobile as 5 mg/ml, the radical scavenging activity in clearing ABTS, DPPH and OH free radicals was 00%, 78.54% and 49.%, respectively. The results suggested that response surface methodology is applicable for optimizing extraction conditions of total polyphenols from Dendrobium nobile, and that the total polyphenols from Dendrobium nobile have good scavenging activity in a closedependent manner. Keywords Dendrobium nobile; polyphenols; response surface methodology; antioxidant 金钗石斛 (Dendrobium nobile) 是兰科 (Orchidaceae) 石 [] 斛属 (Dendrobium) 植物, 是中国药典收录的名贵石斛属药用植物之一, 可用于预防和治疗白内障糖尿病肿瘤等 [-4]. 现代药理研究发现, 金钗石斛中包含许多具有药理和临床疗效的次生代谢产物如生物碱酚性化合物挥发油和多糖等 [5], 其中生物碱和多糖近年来研究较多, 而对其多酚化合物的制备工艺及相关生物活性的研究目前较少. 对于植物多酚的提取工艺优化, 收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 四川省教育厅重点项目 (ZA74) 资助 Supported by the Education Department Foundation of Sichuan Province (ZA74) ** 通讯作者 Corresponding author ( aoxueluo@sina.com; yijfan@6.com) 传统方法是采用正交设计或均匀设计, 这种方法不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式, 从而无法找到整个区域上的因素的最佳组合和响应的最优值 [6]. 而 BBD(Box-Benkhen) 设计是采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系, 通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数, 解决多变量问题的一种统计方法, 该方法能用更少的实验次数描述过程变量的交互影响 [7]. [8-9] 研究认为多酚化合物大多具有抗氧化抗菌抗癌等多重药用价值, 对于人类的健康具有积极作用, 其中最受人关注的是它的抗氧化和清除自由基的活性 [0]. 目前有文献报道石斛中含多酚类化合物, 但没有对其多酚抗氧化活性进行验证的报道. 因此, 本研究采用 Box-Benkhen 设计优化金钗

2 64 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 4 期石斛中总多酚提取条件, 并对金钗石斛中的多酚化合物进行体外自由基清除实验, 初步分析其抗氧化活性, 以期寻找金钗石斛抗氧化活性的物质基础. 材料与方法. 材料与试剂.. 试验材料金钗石斛购自云南普洱, 于 60 下烘干备用... 药品与仪器 ABTS 自由基 (Merck 公司 ); 福林酚试剂 (Folin-Ciocalteu s phenol Reagent)( 上海研域生物科技有限公司 ); 羟自由基试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 );DPPH 自由基 (Sigma-Aldrich 公司 ); 没食子酸乙醇甲醇丙酮碳酸钠及其他试剂 ( 四川瑞进特有限公司 ). 紫外可见分光光度计 ( 上海美谱达仪器有限公司 ); 电子分析天平 ( 奥斯豪仪器有限公司 ); 旋转蒸发仪 ( 上海亚荣生化仪器 ); 高速粉碎机 ( 永康市久品工贸有限公司 ); HY-3 型调速振荡机 ( 常州国华电器有限公司 );DHG-945 型电热恒温鼓风干燥机 ( 上海一恒科技有限公司 ).. 实验方法.. 样品制备将新鲜金钗石斛茎清洗烘干粉碎成粉末备用. 取制金钗石斛粉末置于容量瓶中, 按实验设定的参数室温震荡提取... 样品中多酚含量的测定准确称取没食子酸标准品 0.50 g, 加水定容, 即得质量浓度为 mg/ml 没食子酸标准储备液. 精密量取没食子酸标准储备液 ml 于 00 ml 容量瓶中, 蒸馏水定容, 配成标准系列. 分别吸取标准系列溶液.00 ml 于比色管中, 加入 0.3 ml FC(Folin-Ciocalteu s phenol Reagent) 试剂, 混匀, 再加入.5 ml 0% 碳酸钠溶液, 加水定容至 0 ml, 充分振摇, 室温下静置 0 min []. 以试剂空白作参比, 用 cm 比色皿测定波长 760 nm 处的吸光度. 以测得的吸光度为纵坐标 (y) 没食子酸溶液的质量浓度为横坐标 (x,μg/ml) 绘制标准曲线 [-3], 得到线性回归方程 y =.383x ,R = 取金钗石斛多酚提取液.00 ml 于比色管中, 加入 0.3 ml FC 试剂, 混匀, 再加入.5 ml 的 0% 碳酸钠溶液, 加水定容至 0 ml, 充分振摇, 室温下静置 0 min. 以试剂空白作参比, 用 cm 比色皿测定波长 760 nm 处的吸光度, 根据标准曲线回归方程计算多酚得率...3 因素和水平的确定经查阅文献 [4-7] 和预实验后, 确定对溶剂类型料液比提取时间溶剂 ph 值溶剂乙醇浓度等 5 个因素进行单因素实验, 以筛选出对总多酚的提取有显著影响的因素, 并确定 Box-Behnken 实验设计的水平...4 响应面实验设计采用 Design-Expert 8 软件对实验进行三因素三变量的 Box-Behnken 实验设计, 如表所示, 将本研究选择的 3 个独立变量指定为 X X X 3 和将 3 个水平编码规定为 + 0 -, 分别对应高值中间值和低值. [8-9]..5 ABTS 自由基清除活性根据 Re 等的方法配制 ABTS 反应液 [7 mmol/l ABTS,.45 mmol/l (NHa) S O 8 ], 于室温黑暗中静置 6 h 后, 用磷酸缓冲液 (5 mmol/l,ph 7.4) 稀释至 734 nm 的吸光值为 0.70 ± 0.0. 分别取不同浓度的 ( mg/ml)vc 和各样品液 0. ml, 加入 ml 的 ABTS 溶液, 充分混合, 室温放置 0 min, 紫外分光光度计 734 nm 处测定吸光度, 空白对照用蒸馏水代替样品液, 重复 3 次, 按下式计算清除率 : 清除率 =(A 空白对照 -A 样品 )/ A 空白对照 00%(A 为吸光度 ) [0]..6 DPPH 自由基清除实验根据 Shimadae 等的方法称取 DPPH 标准品 mg, 用体积分数 70% 的乙醇溶解并定容至 00 ml, 配成 0.8 mmo/l DPPH 储备液, 置于冰箱中备用. 分别取不同浓度 ( mg/ml) 的 Vc 和各样品液 0.3 ml, 加入 0.9 ml 的 DPPH 溶液, 室温暗反应 30 min, 紫外分光光度计 57 nm 处测定吸光度, 空白对照用蒸馏水代替样品液, 重复 3 次. 按下式计算清除率 : 清除率 =(A 空白对照 -A 样品 )/A 空白对照 00%(A 为吸光度 )..7 羟自由基清除实验试验采用 Fenton 反应检测多酚的羟自由基清除能力 [], 将各样品及 Vc 标准品配制成浓度为 5. mg/ml.56 mg/ml.8 mg/ml 0.64 mg/ml 0.3 mg/ ml 0.6 mg/ml 的样品液. 采用羟自由基试剂盒检测, 紫外分光光度计 550 nm 处测定吸光度, 空白对照用超纯水代替样品液, 重复 3 次, 计算清除率 : 清除率 =(A 空白对照 -A 样品 )/ A 空白对照 00%(A 为吸光度 ) 结果. 单因素实验结果对溶剂类型提取时间乙醇浓度料液比溶剂 ph 值进行的单因素实验结果见表. 由表可知, 溶剂类型为乙醇提取率最高. 随着提取时间的增加, 提取率的变化不明显, 但总多酚的提取时间对提取率的影响在 4 h 时达到最大. 随着乙醇浓度增大, 金钗石斛多酚的提取得率呈现先增加后降低的趋势, 当乙醇浓度达到 70% 时, 提取得率达到最大, 此后随乙醇浓度的增大而减小. 随着溶剂比例增加, 提取率增加, 当料液比为 :50(g/mL) 时提取率最高. 总多酚的产量随 ph 值的增加而增加, 直到 ph 值达到 3.0 之后, 产量随 ph 的增加而减少. 同时单因素分析显示, 乙醇浓度料液比 ph 值对金钗石斛总多酚的提取影响较大.. 总多酚提取工艺的优化根据单因素试验结果确定三因素三变量的 Box-Behnken 实验设计, 见表. 为对总多酚的提取工艺进行优化, 共进行了 7 组三因素实验, 见表 3. 通过采用 Design-Expert 8 软件进行多元线性回归和二项式拟合, 模型通过复相关系数和方差分析进行判断, 结果见表 4. 得到如下多元线性回归方程 :Y = X X -0.08X 3 + (7.907E-003)X X + (4.759E- 003)X X X X X X X3 (X X X 3 分别代表乙醇浓度料液比 ph 值 ). 由表 4 可知,X X X 3 三个因素及三因素的的二次项 P 值均小于 0.000, 意味着对总多酚提取工艺影响极显著. 而 X X X X 3 的 P 值小于 0.005, 意味着对模型也非常重要. 因此, 为了得到一个精致的响应面模型,X X 3 被删除以重新获得一个新的实验模型方程 : Y = X X -0.08X 3 + (7.907E-003)X X X X X X X3 失拟向检验 (Lack of fit)p 值显示不显著, 表明模型充分拟合, 受其他因素影响小. 经显著性检验, 该模型的相关系数 γ = , 说明该模型与实际试验拟合较好, 自变量与响应值线性关系显著. 图可以清楚显示, 实际实验值和预测值分布相对接近应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

3 卷费雯等 65 表单因素实验结果 Table Results of single factor test 溶剂类型 Solvent type 提取时间 (t/h) Extraction time 乙醇浓度 (φ//%) Ethanol concentration 料液比 (ρ/g ml - ) Solid-liquid ratio ph 值 ph value 反应条件 Reaction condition 甲醇 Methanol 丙酮 Acetone 乙醇 Ehanol :0 :30 :40 :50 : 提取率 (ρ/mg ml - ) Extraction yield 表 3 响应面分析设计及实验结果 Table 3 Box Behnken design for independent variables and their extraction yield 试验号 No. X ( 乙醇浓度 Ethanol concentration) X ( 料液比 Solid-liquid ratio) X 3 (ph) Y ( 提取率 Extraction yield) 表 Box Behnken 实验自变量因素表 Table Independent variables and their levels for Box Behnken design 自变量因素编码水平 Levels Variable - 0 ph 值 ph value (X ) 3 4 乙醇浓度 Ethanol concentration (X, V/V, φ/%) 料液比 Solid-liquid ratio (X 3, ρ/mg ml - ) :40 :50 :60 图实际值与预测值. Fig. Predicted response versus actual value. 表 4 响应面实验回归方程的方差分析 Table 4 ANOVA for response surface quadratic model 方差来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F 值 F-value 显著性 P-value (Prob > F) Model E < X.706E E < X.060E E < X 3.459E E < X X.50E E X X E E X X E E X 4.539E E < X < X E E < Residual.786E E-005 Lack of fit 3.535E E Pure Error.43E E-005 不显著 Not significant Cor total R Adj. R Pred. R Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

66 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 4 期于一条直线, 证明有完美的相关性. 根据回归分析结果, 作出相应三维响应面图和二维等高线图, 如图所示. 响应面可直观反映 3 个因素之间及两者之间的交互作用对响应值的影响. 等高线的形状可反映出交互效应的强弱, 不同形状的轮廓图表明变量之间的交互作用是否显著. 根据图所示, 所有的 3 个响应面表明均较为突出, 意味着交互作用显著.

4 66 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 4 期于一条直线, 证明有完美的相关性. 根据回归分析结果, 作出相应三维响应面图和二维等高线图, 如图所示. 响应面可直观反映 3 个因素之间及两者之间的交互作用对响应值的影响. 等高线的形状可反映出交互效应的强弱, 不同形状的轮廓图表明变量之间的交互作用是否显著. 根据图所示, 所有的 3 个响应面表明均较为突出, 意味着交互作用显著. 由图 a 所示, 等高线为椭圆形, 意味着乙醇浓度 ( X ) 和料液比 (X ) 对提取率有显著影响. 提取率随两个参数的增加而增加, 当乙醇浓度 (X ) 和料液比 (X 3 ) 为 7.6% 和 :5.3 (mg/ml) 时, 提取率达到最大. 超过这个参数, 产量则略有下降. 乙醇浓度和 ph 值对提取率的影响由图 b 所示, 随着乙醇浓度 (X ) 和 ph 值 (X 3 ) 的增加, 提取率起初增加, 然后迅速下降, 当乙醇浓度 (X ) 和 ph 值 (X 3 ) 分别为 7.6% 和.83, 得到最大提取率. 而椭圆并不明显, 这说明两个变量之间的交互作用不显著. 由图 c 所示, 提取率随着料液比 (X ) 和图料液比和乙醇浓度 (a) 乙醇浓度和 ph 值 (b) ph 值和料液比 (c) 对多酚提取率影响的等高线和响应面. Fig. Contour graph and response surface for the effect on yield of total polyphenol content of solid-liquid ratio and ethanol (a), ethanol concentration and ph (b), ph and solid-liquid ratio (c). 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

5 卷费雯等 67 ph(x 3 ) 值得增加而加缓慢增加, 直到料液比为 5.3 (mg/ ml) ph 值为.83 后, 之后提取率缓慢下降, 椭圆较为明显, 说明个变量之间的交互作用较为显著, 而等高线并不明显, 这说明两个变量之间的交互效应较弱..3 模型提取参数的优化和验证通过上述研究, 最优提取条件独立变量和预测的最优响应值呈现如下 : 乙醇浓度 7.6% 料液比 :5.3(g/mL) ph 值.83. 根据上述条件, 最优工艺下金钗石斛多酚提取率为 0.86 mg/g. 为方便规模化生产, 将最优工艺修正为乙醇浓度 7% 料液比 :5 ph 值 3, 经验证实验, 多酚得率为 mg/g, 与理论预测值相比, 无显著性差异 (P > 0.05), 证明实验可靠有效..4 样品对自由基的清除能力.4. 样品对 ABTS 自由基的清除能力样品和 Vc 对 ABTS 自由基的清除能力如图 3a 所示. 结果表明, 样品对 ABTS 自由基的清除能力呈现一定的浓度依赖性, 当浓度达到.8 mg/ ml 的时候, 总多酚对 ABTS 自由基的清除能力接近于 Vc(P > 0.05), 在高浓度时 (-5 mg/ml), 其清除能力达 00%, 表明多酚对 ABTS 自由基有良好的清除能力..4. 样品对 DPPH 自由基的清除能力样品和 Vc 对 DPPH 自由基的清除能力如图 3b 所示, 结果表明, 样品对 DPPH 自由基的清除能力呈现一定的浓度依赖性, 阳性对照 Vc 表现出非常强的 DPPH 清除能力, 而总酚在低浓度时清除能力较弱, 当浓度达 5 mg/ml 时, 总酚表现出较强的清除活性, 可达 77.54%, 但仍低于 Vc..4.3 样品对羟自由基的清除能力样品和 Vc 对羟自由基的清除能力如图 3c 所示, 结果表明,Vc 对羟自由基有很强的清除活性, 且随着浓度的增加, 其活性越高. 而多酚对羟自由基的清除能力也呈现一定的浓度依赖性, 但清除羟自由基的能力小于阳性对照 Vc, 在高浓度 (5 mg/ml) 时, 其活性达到 49.%, 表明多酚具有一定的清除能力. 3 讨论与结论目前关于多酚提取的研究表明, 最常用的技术手段是微波辅助 [] 高压 [3] 脉冲电场和超声波 [4]. 但在实际生产中这些方法往往需要更高的能源消耗更高的温度和复杂的操作. 因此, 近年来随着溶剂提取法的逐渐改善其提取效率已不断上升 [5], 在生产上的应用价值逐渐凸显. 本文采用 Box-Benkhen 设计优化金钗石斛总多酚的溶剂提取法工艺, 实验结果表明, 乙醇浓度料液比 ph 值等因素对金钗石斛茎总多酚的提取率均具有较大的影响且交互作用明显. 通过采用 Design-Expert8 软件对实验进行三因素三变量的 Box-Behnken 实验设计完成了该工艺稳健性参数的预测和验证实验, 确定最优工艺参数为 : 乙醇浓度 7% 比水原料 :5 ph 值 3. 经验证实验, 多酚得率为 86.5 mg/g, 与理论预测值相比, 无显著性差异 (> 0.05), 证明实验可靠有效. 浸提最优工艺参数的获得对规范金钗石斛茎多酚的提取工艺, 指导高效生产有较大意义. 为考查金钗石斛多酚的生物活性, 为其研究及开发利用提供参考, 本研究还对金钗石斛总多酚进行了初步体外抗氧化性探讨, 实验表明在一定浓度范围内, 金钗石斛提取液质图 3 总多酚对 ABTS 自由基 (a) DPPH 自由基 (b) 和羟自由基 (c) 的清除能力. Fig. 3 Scavenging effect of total phenolic content on ABTS radical (a), DPPH radical (b) and OH radical (c). 量浓度与抗氧化活性呈现出较好的线性关系, 但对 ABTS 自由基 DPPH 自由基羟自由基有不同的清除能力, 这可能是因为测定 3 种自由基清除的结构及能力方法的反应机制不同引起的. 金钗石斛总多酚对 ABTS 自由基有非常强的清除能力, 其原因可能是因为金钗石斛粗提物总多酚具有提供氢原子的能力, 因苯环的高电子密度稳定酚氧离子共振形式以稳定结构, 而达到还原化物质的能力. 在金钗石斛提取液高浓度时对 DPPH 自由基也具有较强的清除活性. 而金钗石斛总多酚对羟自由基也具有一定的清除活性, 但相较 Vc 对照品来说较弱. 这可能是因为金钗石斛乙醇粗提物中存在的甾醇甾体皂甙三萜类化合物等多种物质在本体系中对羟自由基产生负效应, 影响其清除效果. 在以后的工作中, 将通过纯化实验纯化金钗石斛总多酚, 并测量其体外抗氧化活性及体内抗氧化活性, 以更好地评定其抗氧化效果. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

6 68 金钗石斛总多酚提取工艺及体外抗氧化活性 4 期参考文献 [References] 中华人民共和国药典 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 005: 6-63 [Chinese Pharmacopoeia [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 005: 6-63 罗傲霜, 淳泽, 葛绍荣, 罗傲雪, 范益军, 刘鹏, 彭文景. 迭鞘石斛多糖降血糖作用研究 [J]. 应用与环境生物学报, 006, (3): [Luo AS, Chun Z, Ge SR, Luo AX, Fan YJ, Liu P, Peng WJ. Effect of Dendrobium denneanum polysaccharide reducing blood glucose in vivo [J]. Chin J Appl Environ Biol, 006, (3): ] 3 Lee YH, Park JD, Baek NI, Kim SI, Ahn BZ. In vitro and in vivo antitumoral phenanthrenes from the aerialparts of Dendrobium nobile [J]. Planta Med, 995, 6 (): 罗傲雪, 宋关斌, 淳泽. 迭鞘石斛抗肿瘤作用研究 [J]. 应用与环境生物学报, 007, 3 (): [ Luo AX, Song GB, Chun Z. Inhibiting effect of tumor by Dendrobium denneanum [J]. Chin J Appl Environ Biol, 007, 3 (): 84-87] 5 Cheng XF, Chen W, Zhou H. Functional characterization of a novel tropinone reductase-like gene in Dendrobium nobile Lindl [J]. J Plant Physiol, 03, 0: 柳俊, 张建军. Box-Benkhen 效应面法优化白芍配方颗粒提取工艺 [J]. 中国实验方剂学杂志, 0, 7 (): 9-3 [ Liu J, Zhang JJ. Optimization of processing parameters for extraction of total glucoside of paeony in paeony dispensing granule using Box-behnken Experimental Design [J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 0, 7 (): 9-3] 7 Srimanta R, Jerald A. Lalmanb. Response Surface Methodology: process and product optimization using designed experiment [J]. Chem Eng J, 0, 69: Duh PD, Yen GC. Changes in antioxidant activity and components of methanolic extracts of peanut hulls irradiated with ultraviolet light [J]. Food Chem, 995, 54: 宋立江, 狄莹, 石碧. 植物多酚研究与利用的意义及发展趋辨 [J]. 化学进展, 000, (): 6-69 [ Song LJ, Di Y, Shi B. The significance and development trend in researchof plant polyphenols [J]. Prog Chem, 000, (): 6-69] 0 陈海光, 刘朝霞, 于立梅. 山竹果皮中多酚类物质的抗氧化性研究 [J]. 食品工业科技, 0, 3 (8): -7 [ Chen HG, Liu CX, Yu LM. Study on antioxidational effects of polyphenols in mangosteen pericarp [J]. Sci Tech Food Ind, 0, 3 (8): -7] Singleton VL, Rossi JL. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents [J]. Am J Enol Viticult, 965, 6: Terpinc P, Ceh B, Ulrih NP, Abramovic H. Studies of the correlation between antioxidant properties and the total phenolic content of different oil cake extracts [J]. Ind Crop Prod, 0, 39: Gutfinger T. Polyphenols in olive oils [J]. J Am Oil Chem Soc, 98, 58: Liu H. Du X. Yuan Q. Optimisation of enzyme assisted extraction of silybin from the seeds of Silybum marianum by Box Behnken experimental design [J]. Phytochem Anal, 009, 0: Silva EM, Rogez H, Larondelle Y. Optimization of extraction of phenolics from Inga edulis leaves using response surface methodology [J]. Sep Purif Technol, 007, 55: 李金凤, 段玉清, 马海乐. 板栗壳中多酚的提取及体外抗氧化性研究 [J]. 林产化学与工业, 00, : [ Li JF, Duan YQ, Ma HL. Study on extraction and antioxidation property of polyphenol from chestnut shells [J]. Chem Ind For Prod, 00, : 53-58] 7 Zhao CF, Li S, Li SJ. Extraction optimization approach to improve accessibility of functional fraction based on combination of total polyphenol, chromatographic profiling and antioxidant activity evaluation: Pyracantha fortuneana fruit as an example [J]. J Funct Foods, 03, 5: Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay [J]. Free Radical Bio Med, 999, 6(9-0): Luo AX, Fan YJ. Antioxidant activities of berberine hydrochloride [J]. J Med Plants Res, 0, 5: Shimada K, Fujikawa K., Yahara K., Nakamura T. Antioxidative properties of xanthin on autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion [J]. J Agr Food Chem, 99, 40: Zou C, Du YM, Li Y, Yang JH, Feng T, Zhang L, Kennedy JF. Preparation of lacquer polysaccharide sulfates and their antioxidant activity in vitro [J]. Carbohydr Polym, 008, 73: 3-33 Li YP, Skouroumounis GK, Elsey GM, Taylor DK. Microwaveassistance provides very rapid and efficient extraction of grape seed polyphenols [J]. Food Chem, 0, : Corrales M, Toepfl S, Butz P, Knorr D, Tauscher B. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: a comparison [J]. Food Sci, 008, 9: Grimi N, Mamouni F, Lebovka N, Vorobiev E, Vaxelaire J. Impact of apple processing modes on extracted juice quality: pressing assisted by pulsed electric fields [J]. Food Eng, 0, 03: Guo XF, Han DM., Xi HP, Rao L, Liao XJ, Hu XS, Wu JH. Extraction of pectin from navel orange peel assisted by ultra-high pressure, microwave or traditional heating: a comparison [J]. Carbohyd Polym, 0, 8 (): 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g

H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g 16 6 2018 11 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 16 No. 6 Nov. 2018 doi 10. 3969 /j. issn. 1672-3678. 2018. 06. 004 1 2 1 1 1. 330200 2. 330006 4 Box-Behnken 1 25 g /ml 121 92 min 2 6. 284%