投影片 1

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1 各位參予本次課程的學員大家好 : 很謝謝您的認真參與讓本次課程順利落幕! 課程中最後介紹的線上工具 :primerx 的應用方向描述有誤, 在此向大家致歉, 並且更正如下 : PrimerX 是設計 mutagenic PCR primers 的線上工具 主要功能是讓使用者可以輸入一段原始序列, 並且指定變異點 PrimerX 便會自動設計出一對 primer 利用這對 primer 去進行 PCR 實驗, 便可以產生一段包含變異點的新序列 最後非常感謝所有在課後提供寶貴建言的學員, 期許這次的課程讓大家都能互相有所進益 敬祝研安

2 Online Tools for Primer Design and Analysis 林依蓉 Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica. Phone: ext

3 Primer Design Primer Length: mer Tm v.s. Ta: Ta (annealing temperature) Tm (melting temperature): Tm should be within 55~65,Tm=2(A+T)+4(G+C) keep the Ta of the primers as close as possible(<5 ) Primer GC content within 45~60% 3' End Stability : It is the maximum ΔG value of the five bases from the 3' end. An unstable 3' end (less negative ΔG) will result in less false priming. Avoid Cross homology : Blast In-Silico PCR

4 loop or dimer Cross Dimer

5 Online Tools for Primer Design and Analysis Primer3Plus: GENEPIPE/ PRIMERZ: NCBI/ Primer-BLAST: ExonPrimer

6 PRIMER3

7 Primer3

8

9 APOE :exon3

10 APOE: exon3 with 200bp franking region

11 Primer3 plus: input page

12 Primer3 plus: General Setting

13 Primer3 plus: result page

14 Exercise APOE : Exon4 TOMM40 NM_ Exon10

15 Primer Z A Primer Design Tool for Gene and SNP Bioinformatics Team Biomedical IT Core

16 Primer Z: Introduction PrimerZ is a high throughput web-based system for designing primers of the genes or SNPs. The users can get all primer data of a gene in one page. 16

17 Originally it took much time and a lot of steps to design the primers of a gene. 17

18 The workflow of PrimerZ Z 5 upstream 1440bps EXON intron 240bps EXON intron 240bps >360bps? EXON Assignment There will be 1440 base pairs Design primers The 240 bp of flanking retrieved in 5' upstream 5 upstream intron intron which will for Z the gene If there is an exon EXON longer sequence than 360 in EXON bps, each this exon will be be used for designing the primers of program selected 240bps will divide 240bpsthis exon into many part the promoters. so that every part of this exon won't be longer ACE than Maximum Exon Length. 240bps 240bps 5 upstream EXON bps bps bps 240bps Exon Flanking sequences Length primer intron EXON Z intron EXON EXON primer Excluded Regions EXON Z EXON 18

19 Primer Z: EXON Z EXON 19

20 Primer Z home page Design Parameters (I) Users can select an option to design primer for a gene, a SNP, or SNPs by uploading file. Select one sepcies for primer design Enter gene name or Ensembl ID PrimerZ will divide the exon into many part so that every part of this exon won't be longer than Maximum Exon Length. The flanking intron sequence length of target exon. A list of product size ranges, for example Primer oligos may not overlap any region called Excluded Region. 20

21 Primer Z: Advance Options

22 Primer Z: Gene result page (I) Primer s Parameters Graphical index of exons, users can click on it and the page is directly go to selected exon primer section. All primer data of a gene designed by Primer Z will be shown in one page. 22

23 Gene result page (II) 23

24 Designing primers for SNPs rs2772 Enter SNP rs ID or Affy_probID Specify the length of sequence that surrounding by the target SNP. 24

25 Designing primers for SNPs 25

26 Designing primers for SNPs 26

27 Error Messages (I) Source Web Server response is too slow or the connection of server and website is lost. 27

28 Error Messages (II) 28

29 Error Messages (III) The input Gene name has been found many records in Ensemble database. 29

30 Exercise Gene: Brca1 PVRL2 SNPs rs rs rs rs rs rs rs rs rs429358

31 NCBI Primer-BLAST

32 NCBI Primer-BLAST

33 NCBI Primer-BLAST

34 NCBI Primer-BLAST

35 NCBI Primer-BLAST: result page

36 NCBI Primer-BLAST : primer reports

37 Exercise NCBI Primer-BLAST NCBI Reference Sequence: NM_ NCBI Reference Sequence: NM_ NCBI Reference Sequence: NM_ NCBI Reference Sequence: NM_

38 ExonPrimer

39 ExonPrimer

40 ExonPrimer

41 注意 : 更正謬誤 PrimerX PrimerX 是設計 mutagenic PCR primers 的線上工具 主要功能是讓使用者可以輸入一段原始序列, 並且指定變異點 PrimerX 便會自動設計出一對 primer 利用這對 primer 去進行 PCR 實驗, 便可以產生一段包含變異點的新序列

42 PrimerX 注意 : 更正謬誤 輸入一段原始序列 指定變異點

43 PrimerX 注意 : 更正謬誤 驗證序列資料

44 PrimerX 利用這對 primer 去進行 PCR 實驗, 便可以產生一段包含變異點的新序列 注意 : 更正謬誤

45 AutoPrime

46 Thanks for your attention! Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica. Phone: ext

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