总顾问 名誉总编辑 社长 / 总编辑 副总编辑 常务编委 编委消化内科学 编辑委员会 / 消化外科学

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1 ISSN CN /R Shijie Huaren Xiaohua Zazhi ( ) 名誉总编辑 总编辑 世界华人消化杂志 对所有来稿均进行同行评议, 是一份被 中国科技论文统计源期刊 和 中文核心期刊要目总览 收录的学术类期刊. 世界华人消化杂志 的英文摘要被美国 化学文摘, 荷兰 医学文摘库 / 医学文摘, 俄罗斯 文摘杂志 收录.

2 总顾问 名誉总编辑 社长 / 总编辑 副总编辑 常务编委 编委消化内科学 编辑委员会 / wcjd@wjgnet.com 消化外科学

3 编辑委员会 玝 消化感染病学 消化中医药学 消化肿瘤学 消化影像学 消化内镜学 消化介入治疗学 消化中西医结合学 消化基础研究 赪 消化病理学

4 世界华人消化杂志 Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 目次 2008 年 2 月 8 日第 16 卷第 4 期 ( 总第 228 期 ) 述评 343 基础研究 350 ARIP2 356 TNF-α 361 TLR2 366 CT 372 PAF ITF 临床研究 379 文献综述 IL-23 IL-23R 研究快报 Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3bHMT 临床经验 431 C(VEGF-C) VEGFR Oddi 450 PCR IL-8 mrna

5 会议纪要 454 致 谢 456 编读往来 378 消 息 421 WCJD WJG 355 WJG (2007) WCJDWJG WCJDWJG 封面故事 2008; 16(4): 本期责任人 ; 编辑 wcjd@wjgnet.com Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 出版 创刊 改刊 wcjd@wjgnet.com 出版 原刊名 印刷 发行 名誉总编辑 总编辑 特别声明常务副总编辑 订购 邮购 编辑部主任 期刊名称 主管单位 wcjd@wjgnet.com 主办单位 年版权归世界华人消化杂志所有 ISSN CN /R M

6 World Chinese Journal of Digestology February 2008 Contents in Brief Volume 16 Number 4 EDITORIAL 343 Advances in pathogenesis of hyperlipidemic acute pancreatitis and its diagnosis and treatment Sun CY, Pan YZ BASIC RESEARCH 350 Activin receptor-interacting protein 2 expression and its biological function in mouse hepatocytes Zhang HJ, Liu ZH, Chen FF, Ma D, Zhou J, Tai GX 356 Effect of tea polyphenols on TNF-α and hepatocytes in rats with alcoholic liver disease Li F, Guan XQ, Liu L 361 Expression of Toll-like receptor 2 in distal ileum of rats with acute necrotizing pancreatitis and its significance Ma JM, Cui J, Yang ZJ 366 Optimization of contrast agents for small intestine computed tomography enteroclysis Song FZ, Cheng YS, Zhu YQ, Zhao PR, Zhao JG, Zhao BH 372 Effect of platelet-activating factor on tight junction in intestinal epithelial cells and protective effect of intestinal trefoil factor Xu LF, Dong YL, Sun M, Ma L, Mao ZQ CLINICAL RESEARCH 379 Clinical pathology of perineural invasion in hilar cholangiocarcinoma Li CG, Huang ZQ, Wei LX, Dong JH, Liu JG, Wang YS REVIEW 385 Pathogenesis and treatment of acute pancreatitis with liver injury Yu HH, Feng ZJ 392 IL-23 and IL-23 receptor in Crohn s disease Li M, Gao X, Hu PJ 399 Advances in studies on relation between inflammatory bowel disease and immunity Shi HX, Ren JL, Dong WG 406 Heparanase: a novel target of tumor metastasis therapy Tian SG, Gao HW, Chang HY, Li SB, Wang XL, Zhang YP, Gong F RAPID COMMUNICATION 413 Analysis of primary structure and modeling of spatial structure of heavy chain variable region of antibody against human gastric cancer Yang LJ, Hou YC, Yao LB, Su CZ 417 Effect of panax notoginseng saponins on gene expression of cultured human hepatic stellate cells Li LG, Wei HS, Qiu S, Zeng H 422 Expression of heme oxygenase-2 in mouse model of colon slow transit motility constipation induced by morphine and its significance Jiang LQ, Lin L, Zhang HJ, Hu YD, Lin Z, Wang MF 426 Expression of Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b and HMT in different colonic cancer cell lines and its significance Zhai RL, Cai KL, Wang GB, Xu F, Tian Y, Zhang JH CLINICAL PRACTICE 431 Expression of vascular endothelial growth factor-c (VEGF-C) and its receptor VEGFR-3 in esophageal squamous carcinoma tissues and its clinical significance Liu PF, Liu BT, Shen WD, Shi RH, Zhu H

7 436 Chinese Reports on the effect and safety of systemic chemotherapy for advanced gastric cancer Cao ND, Zhao AG, Zhu YJ, Yang JK 443 Levofloxacin and rebeprazole-based triple regimen therapy for 94 cases of Helicobacter pylori infection Zhang XM, Zhang ZY 446 Relationship between duodenobiliary reflux and pressure of Oddi sphincter Sun SL, Cui DX, Dai XW, Wu SD, Xu YQ 450 Expression of interleukin-8 mrna in patients with colorectal carcinoma detected by real-time quantitative PCR Zhou WP, Fan QX, Fan KS, Wang RL, Wu JM MEETING MINUTES ACKNOWLEDG- MENT 454 Editors and readers in Xi an Zhang ZF, Zhang S 456 Acknowledgments to reviewers of World Chinese Journal of Digestology COVER Li CG, Huang ZQ, Wei LX, Dong JH, Liu JG, Wang YS. Clinical pathology of perineural invasion in hilar cholangiocarcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): RESPONSIBLE EDITORS FOR THIS ISSUE Assistant Editor: Yan Jiang Review Editor: Jian-Xia Cheng Electronic Page Editor: Ji-Cai He Editor-in-Charge: Jian-Xia Cheng English Language Editor: Xian-Lin Wang Proof Editor: Hai-Ning Zhang Layout Editor: Lian-Sheng Ma Indexed/Abstracted by Chemical Abstracts, EMBASE/ Excerpta Medica and Abstract Journals Shijie Huaren Xiaohua Zazhi Founded on January 15, 1993 Renamed on January 25, 1998 Publication date February 8, 2008 NAME OF JOURNAL World Chinese Journal of Digestology RESPONSIBLE INSTITUTION Department of Science and Technology of Shanxi Province SPONSOR Taiyuan Research and Treatment Center for Digestive Diseases, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China EDITING Editorial Board of World Chinese Journal of Digestology, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China Telephone: wcjd@wcjdnet.com PRINTING Beijing Kexin Printing House PUBLISHING Editorial Department of World Chinese Journal of Digestology, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China Telephone: wcjd@wcjdnet.com OVERSEAS DISTRIBUTOR Beijing Bureau for Distribution of Newspapers and Journals (Code No ) China International Book Trading Corporation PO Box 399, Beijing, China (Code No. M4481) HONORARY EDITOR-IN-CHIEF Bo-Rong Pan EDITOR-IN-CHIEF Lian-Sheng Ma SCIENCE EDITORS Director: Hai-Ning Zhang SUBSCRIPTION RMB 24 Yuan for each issue RMB 864 Yuan for one year CSSN ISSN CN /R COPYRIGHT 2008 Published by WCJD. All rights reserved; no part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise without the prior permission of WCJD. Authors are required to grant WCJD an exclusive licence to publish. SPECIAL STATEMENT All articles published in this journal represent the viewpoints of the authors except where indicated otherwise. INSTRUCTIONS TO AUTHORS Full instructions are available online at / /tgxz.asp. If you do not have web access please contact the editorial office. Copyright 2008 by Editorial Department of World Chinese Journal of Digestology

8 EDITORIAL ; 16(4): ISSN CN /R 高脂血症性急性胰腺炎的发病机制及诊疗进展 hyperlipidemic acute pancreatitis and its diagnosis and treatment. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): Advances in pathogenesis of hyperlipidemic acute pancreatitis and its diagnosis and treatment Cheng-Yi Sun, Yao-Zhen Pan Cheng-Yi Sun, Yao-Zhen Pan, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang , Guizhou Province, China Correspondence to: Cheng-Yi Sun, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, 28 Guiyi Street, Guiyang , Guizhou Province, China. Received: Revised: Abstract Hyperlipidemia is one of the causes for acute pancreatitis. Hyperlipidemic acute pancreatitis often occurs in patients with type Ⅰ, Ⅴ or Ⅳ hyperlipidemia. It results from chemical irritation to the pancreas and disturbance of pancreatic microcirculation due to the toxicity of free fatty acids released from massive triglycerides. When the serum triglyceride level is elevated, the incidence of complications may increase accordingly. However, serum amylase levels may be normal in serum of some patients or lightly e1evated. The diagnosis of hyperlipidemic acute pancreatitis is mainly based on the clinical manifestations of acute pancreatitis and the serum triglyceride level. Therefore, hyperlipidemic acute pancreatitis patients are treated mainly by reducing their serum triglyceride level. Key Words: Acute pancreatitis; Hyperlipidemia; Triglyceride; Diagnosis; Treatment Sun CY, Pan YZ. Advances in pathogenesis of (HL) (AP). HL. (TG) (FFA), TG, HL AP. HLAP., HLAPAP TG, TG. 关键词 0 引言自从 Klaskin(1952 年 ) 报告 1 例原发性高脂血症 (hyperlipidaemia, HL) 导致胰腺炎反复发作以后, 高脂血症与胰腺炎的相关性引起了人们的重视. 此后的临床资料也证明高脂血症是急性胰腺炎 (acute pancreatitis, AP) 的危险因素之一, 他是继胆源性, 酒精性之后 AP 的常见病因, 急性胰腺炎与高脂血症的并存率约为 12%-38%, 且常常在病程中导致或者加重 [1-2]. 过去在我国 AP 的发病原因中, 以胆道疾病为主, 占 50% 以上. 但是近年来随着生活水平的提高和饮食结构的改变, 高脂血症与 AP 的关系越来越引起人们的关注. 国外大样本资料表明, 高脂血症性 AP 占 AP 病例 1.3%-3.8% [3]. 我国台湾地区的多中心临床流行病学研究认为, 急性胰腺炎发病率升高, 且其中 HL 占急性胰腺炎全部病因的 12.3% [4]. 虽然国内外学者从基础到临床开展大量研究, 并且取得 (AP),,,..,.,,

9 344 ISSN CN /R 了令人瞩目的成绩. 但是, 目前高脂血症诱发和, 加重急性胰腺炎的确切发病机制尚不清楚. 因 此, 对于高脂血症性急性胰腺炎的及时诊断和., HL 合理治疗, 医务工作者仍面临着巨大的挑战. 如 AP 何在现有条件下提高高脂血症性急性胰腺炎的., 早期诊断率, 加强合理的综合治疗, 改善预后, 需要我们高度重视并进一步努力.,. 1 高脂血症 高脂血症通常是指血浆总胆固醇 (TC) 和 / 或甘油 三酯 (TG) 含量的增高. 血中 TG 主要以乳糜微粒. (CM) 和极低密度脂蛋白 (VLDL) 形式存在. 血浆 TG 有内 外源性两条生成途径, 正常情况下外, 源性途径是 TG 的主要来源. 即食物中的 TG 在胃 TG 肠道水解 吸收, 形成富含 TG 的乳糜微粒 (CM), TG, 经过淋巴管进入静脉系统. 内源性 TG 来自肝脏. 合成分泌的 VLDL. 乳糜微粒 VLDL 与载脂蛋 白 C-Ⅱ 结合后在脂蛋白脂酶 (LPL) 的参与下进 行脂质代谢. 乳糜微粒通常在餐后 1-3 h 出现, 8 h 后被清除, 当血浆 TG 水平达到 1000 mg/dl 时 则可持续存在. HL 分为 5 型. Ⅰ 型和 Ⅴ 型的特点 是显著的高 TG 血症, Ⅱ 型 Ⅲ 型 Ⅳ 型表现为 单纯的高 TC 血症或同时合并轻 中度高 TG 血 症. 临床报道 Ⅰ 型 Ⅳ 和 Ⅴ 型 HL 发生 AP 最为多 见 [5] [6]. 原发性 HL 常见于家族性 LPL 缺乏和家族 性 apo-cii 缺乏 [7]. 继发性 HL 主要原因为酗酒 糖 尿病 肥胖 血吞噬综合征 高脂饮食 服用 [8-11] 三苯氧胺 利尿剂等药物及妊娠 [12]. 2 高脂血症与急性胰腺炎 大量动物实验 临床研究表明高脂血症是急性 胰腺炎的病因之一 [13], 但同时高脂血症也是急 性胰腺炎代谢异常的表现. 急性胰腺炎可引起 一过性 TG 升高, Chikamune et al [14] 在实验性诱 导犬胰腺炎后检测到血 TG 水平升高. 分析其原 因 : (1) 胰腺炎时, 全身应激, 血清儿茶酚胺 胰 高血糖素 生长激素等脂解激素水平升高, 这 些激素作用于脂肪细胞的激素敏感性脂酶, 使 脂肪组织的 TG 分解. (2) 应激时胰岛素分泌相对 减少或出现胰岛素抵抗, 脂蛋白脂酶 LPL 活性依 赖于胰岛素, 因而 LPL 的活性下降, 引起高 TG, 同时卵磷脂酰基转移酶活性也下降, 对 HDL 表 面的胆固醇不能酯化进入 HDL 核心, 使 HDL 水 平下降. Hofbauce et al 研究发现静脉注入去污剂 Tritum WR1339 导致内源性高 TG 血症, 能使蛙皮 素诱导的鼠胰腺炎病理损害加重. 近十几年来, 在我国由于饮食结构的改变 和对高脂血症认识的加强, 高脂血症性 ( 主要是高甘油三酯 ) 胰腺炎已经成为 AP 的常见原因之一 [15]. 据统计资料显示, 临床上以甘油三酯升高为主的 Ⅰ, Ⅳ, Ⅴ 型高脂血症引起的急性胰腺炎最为常见. 国外报道胰腺炎发生率在 Ⅰ 型高脂血症为 30%, Ⅳ 型为 15%, Ⅴ 型为 27%-41%, 血清 TG 水平 >26 mmol/l 是 AP 发生的明确的危险因素, 此类胰腺炎称之为 高脂血症性胰腺炎 或 高三酰甘油血症性胰腺炎 [16-18]. 而且, 随着血浆甘油三酯水平的升高, 发生 AP 的危险性也迅速上升. 动物实验显示, 研究者从犬离体胰腺的肠系膜上动脉和门静脉注入甘油三酯 游离脂肪酸 (FFA), 发现其胰腺的水肿 出血加重, 血淀粉酶也明显升高, 支持高脂血症引起 AP 和 FFA 对胰腺的损伤作用. Kimura et al [19] 分别采用蛙皮素 牛磺胆酸钠以及结扎胰管的方法建立大鼠的 AP 模型, 然后将病变的胰腺制成灌注模型, 用 TG 离体灌注, 发现血淀粉酶 脂肪酶明显增高, 说明甘油三酯可以加重不同病因诱发的 AP. Mossner et al [20] 在同样的大鼠胰腺腺泡细胞培养液中加入脂肪酸, 胰腺腺泡细胞的损伤程度与脂肪酸作用的时间和浓度呈正比. 临床报道中 Ⅰ 型和 Ⅴ 型 HL 发生 AP 最为多见, 也有少数 Ⅳ 型患者发生 AP. 因此, AP 的发生与高 TG 的关系更为密切. Cameron et al [21] 研究发现, 当血 TG 值 > mmol/l, 且空腹血清呈乳状, 可能诱发 AP. Hofbauer et al [22] 指出, 血 TG 值 >10-20 mmol/l 是 AP 发生的危险因素. Berger et al [23] 则认为, 血 TG 值 >11.3 mmol/l 就可以引起 AP. 3 高脂血症性急性胰腺炎的可能机制目前普遍认为, 高脂血症能导致 AP 发生, 其机制目前还不是很清楚. 经过国内外许多学者的研究, 目前比较公认的高甘油三酯血症导致胰腺炎的机制如下. 3.1 TG 在正常情况下, FFA 与白蛋白结合, 这种结合物对细胞没有毒性. 如 FFA 产生过多, 超出白蛋白的结合能力, 胰腺内高浓度聚集的 FFA 就会产生组织毒性, 损伤胰腺腺泡细胞和小血管, 导致 AP 发生. FFA 对胰腺腺泡细胞损伤的机制可能存在 3 种情况 [24] : FFA 增多诱发酸中毒, 激活胰蛋白酶原, 导致腺泡细胞自身消化 ; 高浓度 FFA 可引起胰腺毛细血管内皮损伤, 导致胰腺微循环障碍 ; FFA 通

10 345 过细胞膜脂质过氧化反应对细胞膜有毒性作用, 损伤胰腺腺泡细胞. 3.2 生理状况下, 胰蛋白酶原及溶酶体水解酶均由腺泡细胞粗面内质网合成, 被输送至高尔基复合体, 溶酶体水解酶再被输送至溶酶体, 而胰蛋白酶原则被输送至浓缩泡进行浓缩, 最后浓缩的酶原与腔浆膜融合, 借助胞吐作用, 将酶原释放至胰导管内, 胰腺炎一旦发生, 由于某种尚不清楚的机制, 酶原向导管管腔释放受阻, 酶原与溶酶体水解酶形成大空泡, 酶原被水解酶激活, 引起腺细胞自身消化, 促使胰腺病理进一步进展 [25-26]. 高 TG 血症时, 胰腺组织 TG 分解产物 FFA 增多, 腺泡细胞内 ph 下降, 在酸性环境, 溶酶体水解酶组织蛋白酶 B 活性增强, 胰蛋白酶原激活加速, 腺泡细胞自身消化及胰腺炎的病理损害加重. 3.3 近年来, 胰腺微循环障碍在 AP 的发病及病程进展中的作用已成共识. (1) 从解剖学角度分析 : 胰腺小叶内中央动脉是唯一一支供应胰腺腺叶的动脉, 缺乏交通支, 一旦供血动脉因各种因素导致循环障碍, 就可诱发相应部位的 AP 发生. 当血清 TG>2.15 mmol/l 时, 患者的血液黏滞度就增高, 高 TG 时, Ⅶ 因子活性 血液和血浆黏滞度均上升, 并使纤溶酶原激活抑制物 (PAI21) 活性增高干扰纤溶, 易于形成血栓. (2) 国外有报道将动物模型进行胰腺缺血再灌注后观察其血清淀粉酶与胰腺组织学改变, 发现试验组毛细血管与小血管内黏附的血小板数量显著增加, 毛细血管的血小板流动速率显著下降 [27] : 再灌注后胰腺组织显著水肿, 发生炎症反应 : 毛细血管通透性的增加和内皮损伤是急性胰腺炎早期重要的病理现象, 血清 TC TG 增高能诱发动脉粥样硬化, 使内皮细胞损伤, 从而使内皮合成与分泌前列环素 (PGI2) 减少. 高脂血症时可激活血小板, 同时产生一种强烈的缩血管物质 - 血栓素 A2(TXA2), 继而导致胰腺血液循环障碍. (3) 长期 HTG 血症及高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 可致动脉粥样硬化以及 TG 血症中大分子的乳糜微栓作用于毛细血管, 使原已狭窄的血管发生栓塞, 从而使胰腺缺血 坏死. 近年来有研究指出, 高脂饮食可以导致细胞膜和细胞器膜脂肪酸含量及其构成的比例发生变化, 因此影响信号传导过程, 引起细胞内钙的异常增加. 而钙离子是细胞内重要的第二信使, 参与细胞内众多的生理功能和代谢过程, 包括 酶原激活 细胞凋亡. 又有实验发现, 分离高脂肪饮食的大鼠胰腺腺泡细胞, 再予 CCK 刺激后, 其细胞内 Ca 2+ 的上升高于正常细胞. 细胞释放的淀粉酶 LDH 也明显上升 [28] ; 当给予不同浓度的棕榈酸刺激胰腺腺泡细胞, 细胞内 Ca 2+ 持续上升 ( 主要来自于内质网 ), 而细胞内钙的上升己经被认为是细胞酶原激活的重要途径之一 [29]. 4 高脂血症性急性胰腺炎的临床特点 4.1 高 TG 性急性胰腺炎临床症状与其他病因所致 AP 相似, 轻重程度不等, 反复发作, 并发症较多 [30-31] ; 少数表现为暴发性 ; 部分高脂血症伴反复腹痛发作者, 可无胰腺炎的临床特征与实验室检查异常, 但按胰腺炎治疗, 可使腹痛缓解. 个体肥胖, 或有家族肥胖史, 日常饮食不规律, 有暴饮暴食史. 病后腹痛症状和腹膜炎体征不明显, 早期仅表现为腹胀痛 恶心 发热, 而中毒性休克在进展期出现. 有学者认为胰腺有适应性分泌功能, 高血脂症状胰腺炎胰脂肪酶活性增高, 血清脂肪酶及 FFA 水平升高. FFA 与血清钙结合可致低血钙, 手足抽搐. 与非高 TG 血症性胰腺炎相比较 : 肥胖 暴饮暴食 乳糜血 血尿淀粉酶正常, 早期低钙血症 低钠血症 低蛋白血症及横结肠中断征等临床征象出现频次高且明显. 空腹高 TG 血症伴腹痛应想到原发性高 TG 血症性胰腺炎 ; 慢性饮酒 暴饮暴食后腹痛, 应想到伴发性高 TG 血症胰腺炎. 多数 AP 患者发病与血 TG 水平升高有关. 当 TG 浓度达到 mmol/l 以上才会产生临床症状明显的 AP. 有学者研究发现, TG 水平与 AP 病变程度存在着显著的相关性, TG 水平升高, Ranson 评分呈上升趋势, 表明高 TG 血症可导致或加重 AP 的病变. TG 浓度达到 mmol/l 时可有轻微腹痛, 66 mmol/l 以上有明显腹痛, 但也有个体反应差异. 若 TG 极度增高, 则会出现剧烈腹痛, 发生暴发性 AP, 甚至死亡. 但亦有相反报道, 认为 TG 对 AP 可能只起触发作用, 而对 AP 的轻重不起决定性作用. 起病初期 TG 值很高, 峰值均在起病后 3 d 内查出, 4-5 d 内迅速降至安全水平 (5.65 mmol/l) 以下, 但仍高于正常上限, 且维持此水平 15 d 以上. 有报道在此期间 TG 可能波动, 再次升至危险水平, 应提高警惕. 乳状血清可在起病后 3 d 内查出, 4-5 d 内消失. 由于乳糜微粒在体内清除极快, 一般在禁食 h 后即可完全清除 ( 亦有人认为禁食 12-14, et al,., et al.

11 346 ISSN CN /R h 即可清除 ), 故 AP 患者入院时应立即检查血脂, 或将血标本低温保存 (4 冰箱过夜后可在表面 形成乳白奶油状层 ) 备次日检测. 4.2 高 TG 性胰腺炎血尿淀粉酶可无 明显升高 (50% 可正常 ), 这就给临床诊断造成一, 定困难. 其原因可能是由于血浆中存在一种抑. 制血淀粉酶活性的因子, 这种非脂类抑制因子 还能通过肾脏进入尿液, 抑制尿淀粉酶的活性. 4.3 超声检查简便易行, 为 AP 首选 影像学检查, 通过对肝 胆的观察可排除胆源 性胰腺炎. 但 AP 患者多有明显肠胀气, 影响检查 致使诊断价值降低. 如 B 超阴性疑为 AP 者均应行 CT 检查, CT 可清楚显示胰腺形态, 有无出血 坏死及囊肿形成, 测定胰外炎症范围与手术对 照有较高的符合率, 尤其对重症胰腺炎的临床 病理分类预测准确性高. 因此, CT 检查既可提高 不典型病例的诊断率, 又有助于对患者实施有 效的治疗方案, 以提高治愈率. 5 高脂血症性急性胰腺炎的临床诊断 高脂血症性 AP 的诊断主要依靠 AP 临床症状结 合高脂血症而定. (1)SAP 诊断标准参照中国急 性胰腺炎诊治指南 : 具备 AP 的临床表现和生化 改变, 且 Ranson 评分 3; CT 分级 D 或 E; APACHE Ⅱ 评分 8. (2)TG>11.3 mmol/l, 或 TG 值在 mmol/l 之间, 但血清呈乳状, 并且排除 AP 的其他致病因素如胆道结石 微结石 Oddi 括约肌功能障碍 药物性 AP 细菌病毒感染 等. 如同时存在高 TG 血症的继发性因素或其他 家族性脂蛋白异常, 有助于诊断. 6 高脂血症性急性胰腺炎的治疗 高脂血症性急性胰腺炎 (HAP) 既表现出 AP 的共 性, 又有其自身的特殊性. 虽然 HAP 目前尚无统 一 有效的治疗方案, 但在规范化治疗 AP 的基 础上, HAP 治疗的关键是迅速降低血 TG 值 [23]. 当 血 TG 值降至 5.65 mmol/l 以下时, 便可阻止 HAP 病情的进一步发展 [5], 其具体的治疗措施可归纳 为 : (1) 常规 AP 治疗, 包括禁饮食 胃肠减压 胰 酶抑制剂 营养支持和抗感染治疗等. 因为 AP 与 HL 互为因果, 所以缓解 HAP 的临床症状便可 阻断此恶性循环, 抑制 HAP 的病程演进. HAP 患 者血液黏度增高, 常导致胰腺微循环障碍, 而胰 腺微循环障碍是 AP 发病的始动因子与病情不断 恶化的促进因子 [32]. 因此, 可常规静脉滴注丹参 以改善胰腺微循环障碍从而减轻 HAP 临床症状. (2) 全胃肠外营养 (TPN). HAP 患者实施 TPN 治疗 时, 脂肪乳剂的摄入应慎重 : HAP 发病 72 h 内绝 对禁止静脉输入各种脂肪乳剂, 防止血 TG 值进 一步升高, 加重胰腺病理损伤 ; 当患者腹痛减轻, 血 TG 值 5.65 mmol/l 而单纯静脉输注高糖补 充能量难以控制血糖者, 可输入短 中链脂肪 乳剂, 使之直接经门静脉代谢而不产生全血乳 糜状微粒 [33] ; HAP 后期, 患者一般状态差而无法 实施肠内营养时, 若血 TG 值在 mmol/l, 在严格监测血脂条件下, 可输入短 中链脂肪 乳剂 24 h 量 750 ml, 长链脂肪乳剂 24 h 量 250 ml. 脂肪乳剂输入 12 h 后, 若血 TG 值 >5.65 mmol/l, 应立即停用. 脂肪乳剂使用过程中, 应 定期复查脂肪廓清试验, 实验阳性者应及时停 用. 目前, 对于高脂血症性 SAP 脂肪乳的应用尚 存争议, Asakura et al [34] 给原发性 HTG 患者 100% 中链甘油三酯饮食并不增加其血浆油三酯的浓 度, 但是患者血胆固醇水平显著升高. 有个案报 道 1 例反复发作 AP 的家族性高脂血症的女性患 者在妊娠期间通过控制饮食和 MCT 支持治疗顺 利渡过妊娠期 [35]. 所以, HAP 患者早期应用肠内 营养不仅可以促进胃肠蠕动 保护肠黏膜屏障 功能 防止肠道菌群易位, 还可缓解因限制脂 肪乳剂输入而导致机体能量不足的矛盾. (3) 脂 蛋白脂肪酶 (LPL) 是内 外源性脂肪代谢的关 键酶, 可水解极低密度脂蛋白中的 TG 和乳糜微 粒, 对血 TG 的清除起重要作用. 大量临床研究证 明, 持续静脉滴注肝素和胰岛素能够激活 LPL 加速乳糜微粒降解, 显著降低血 TG 值, 是治疗 HAP 的有效手段. Monga et al [36] 对 1 名 HAP 患者 进行肝素 胰岛素联合治疗发现, 血 TG 值降低 且 HAP 症状明显缓解. Berger et al [23] 对 5 名 HAP 患者持续静脉滴注肝素和胰岛素, 3 d 后, 5 名患 者血 TG 值 <2.8 mmol/l, 无并发症且全部存活. 皮下注射低分子质量肝素亦可防止中性粒细胞 激活, 促进乳糜微粒降解, 改善胰腺微循环障碍, 降低血 TG 值. (4) 血浆置换 (PE): 血浆置换多用于 重症高 TG 血症性胰腺炎. 通过将患者血液在体 外分离成血浆和血细胞成分, 弃去血浆后再把 细胞成分与血浆等量的置换液 ( 冰冻血浆及白蛋 白 ) 一起回输体内, 可去除血浆中的病理性物质, 起到降低淀粉酶 降低血脂 去除炎症介质及 免疫调控作用, 有很好的治疗效果. PE 的时机是 此疗法的关键. PE 越早, 患者的预后也将更显著 地得以改善 [37-38]. Furuya et al [38] 对 1 例 HAP 患者 在发病后 20 d 实施 PE, 结果患者死于多器官衰竭

12 347 和感染 ; 另 1 例 HAP 患者入院后迅速采取 PE, 血 TG 值很快降到正常水平, 62 d 后痊愈. Yeh et al [39] 对 17 例 HAP 患者实施单程和双程连续 PE, 全组血 TG 胆固醇 淀粉酶和脂肪酶值显著下降; 其中 13 例完全康复, 仅 2 例死于感染性休克和多器官衰竭. Yeh et al [39] 也比较了血浆置换和双重血液滤过 2 种方法对清除血脂的疗效, 经治疗后, TG 和总胆固醇 (TC) 的平均血清浓度分别从 mmol/l 和 mmol/l 降至 mmol/l 和 5.77 mmol/l, 血浆置换对胆固醇的清除率更高 (P = 0.008), 并且治疗期间溶血的发生率低 (P = 0.403). Mao et al 报道 [41], 通过 4 L 的血浆置换, TG 可下降 73%-82%, 血黏度下降 50%, 胰腺炎可较快获得缓解. (5) 血液滤过 : 血液滤过是治疗 HAP 的有效手段 [42], 他可清除和调整循环内的炎症介质, 同时血滤器又能吸附 TG, 故用于 SAP 早期 ( 起病 72 h 内 ), 作为阻断炎症反应的主要有效治疗措施, 尤其是高脂血症性 SAP 的主要有效治疗措施之一. 由于 TG 会阻塞聚砜中空纤维而无法清除中分子质量物质, 所以对高脂血症胰腺炎必须多次更换血滤器 ( 每 1-2 h 更换滤器, 约更换 4-5 次 ), 首先吸附血脂, 然后才可行血液滤过, 以提高细胞因子清除率. (6) 中医中药 : HL 性 AP 患者多体态肥胖, 腹内压升高和膈肌抬高, 严重影响呼吸 循环功能, 易诱发急性呼吸窘迫综合征. 可采用皮硝全腹外敷等中医疗法协助腹腔内水肿吸收及患者排气 排便, 从而有效降低腹内压, 改善症状. 有作者提出, 除 AP 的常规治疗措施外, 加用 五联疗法 [42] [ 血液净化 ( 血脂吸附与血液滤过 ) 降血脂药物 低分子质量肝素 胰岛素 全腹皮硝外敷 ] 是治疗 HL 性 AP 的有效措施. 他们对 32 例重症急性胰腺炎患者除常规治疗措施外, 均加用 五联疗法. 结果, 血液净化结束或发病后 7 d 内, 31 例患者血清甘油三酯和 TNF-α 及 APACHEⅡ 评分较血液净化前显著降低 ; 而 IL-10 浓度在血液净化结束时显著升高, 发病后 7 d 则显著降低. 大部分 HLP 发作 h 后, 因禁食而吸收乳糜微粒到血中的途径被切断, HLP 患者血 TG 水平迅速降低 [43]. 是否所有的 HLP 患者均需血液净化, 其费用以及疗效是否对患者更为有利, 都有待进一步研究. 另外, 血液净化治疗自身的问题同样困扰他治疗 HLP. 首先是血滤对炎性介质是否有足够的清除作用? 如 TNF-α 的生物活性形式是三聚体 ( 分子质量 ), 似乎不可能通过一般的滤过膜. 许 多临床研究结果也是相矛盾的. 其次血滤的清除作用是否总是对机体有益? 众所周知, 血滤的清除作用是非选择性的, 也就是说他既能清除促炎因子, 又能清除抗炎因子, 而促炎因子也并不总是对机体有害. 适当量的 TNF-α 是机体抗感染所必需的, 只是在 SIRS 时, 过量的 TNF-α 才对机体有害. 因此, 血滤的时机非常重要. 然而在疾病的不同阶段, 血液净化对促炎和抗炎因子的平衡作用还是难以预料. 其三是血液净化的不良反应, 包括由于血 - 膜长时间相互作用所诱导的炎症反应 ; 糖 氨基酸 维生素及微量元素的丧失 ; 基于抗凝的出血并发症等. 常用置换液中并无蛋白质成分, 血浆蛋白丢失过多, 必须及时补充白蛋白使治疗成本大幅度上涨. 无论血液净化技术如何发展, 他也只能是 HLP 综合治疗的一个方面, 并不能取代必要的手术 引流等治疗措施. 另外, 血液净化会影响药物的代谢, 缩短其半衰期, 在实施的过程中应注意到这一点. 对基础研究方面, 高脂血症如何诱发 AP 以及血液净化对机体代谢的影响, 有待于以基因或蛋白质代谢组学等分子生物学手段来进一步明确. 在临床中, 由于单个医疗机构 HLP 血液净化治疗的病例是不多的, 更需要多中心联合对血液净化的疗效 费用与疗效等进行循证医学研究, 以提出 HLP 血液净化的适应证 血液净化模式与血液净化次数等治疗指南. (7) 对于妊娠期妇女, 虽然妊娠期 HAP 患病率低, 但母婴病死率高 [44-45]. 因此, 妊娠期妇女应于整个妊娠期间随访血 TG 和脂蛋白浓度的变化, 以便早期发现并控制血脂升高. 妊娠期妇女不宜服用降脂药物, 一旦发现血脂升高, 应及时调整饮食结构以控制血脂浓度. (8)HAP 患者常因脂质代谢障碍导致心 脑 肾等器官的微血管病变. 治疗时, 应密切监测患者全身器官功能和血流动力学的改变. HAP 治愈后仍应长期控制血 TG 值, 从根本上解决 HL 状况, 预防其复发 ; 措施包括禁酒 避免暴饮暴食 低脂饮食 口服降脂药及治疗引起血 TG 升高的相关性疾病 ( 如糖尿病等 ). (9) 对于暴发性 HAP, 他是 HAP 的一个亚型. 若 HAP 经非手术治疗病情仍逐渐加重, 或当 HL 诱发暴发性 HAP 时, 应立即采取手术措施 ( 如坏死组织清除 腹腔灌洗引流等 ), 及时阻止 HAP 病情的持续恶化. 目前, 尚无法清楚地阐明高甘油三酯血症加重急性胰腺炎的确切发病机制. 甘油三酯的分解代谢产物究竟是通过哪些途径加重胰腺的损,.

13 348 ISSN CN /R 伤? 在这些途径中又有哪些信号传导通路参与到其中? 是否能够锁定一些关键的靶分子从而阻断高脂血症对胰腺的损伤? 这将是现在以及未来我们大家所面临的课题和研究方向. 所以, HL 性 AP 是一个较新的课题. 其发病机制非常复杂, 这将需要大量的临床研究和实验探索, 以了解其确切发病机制. 诊断上除了注意检测血脂水平外, 期望能有更敏感的检测指标和更新的检查方法以早期确诊. 其治疗应采取将降脂与其他多种有效手段相结合, 另外采取基因治疗以降低家族性高 TG 血症的血 TG 值有望成为研究的方向. 高脂血症性 AP 复发率高, 因此在 AP 缓解后控制血脂水平在安全范围内对预防 HLP 的复发很重要. 在缓解期, 为避免 AP 再次发作, 应避免接触各种继发性因素, 并控制饮食, 限制脂防摄入, 包括饱和脂防酸与不饱和脂肪酸, 也可使用中链 TG 来替代长链 TG, 因为中链 TG 能被直接吸收入门静脉而不会产生乳糜微粒或 TG 的升高, 但长期使用可致肝纤维化. 国外有报道, 低脂饮食与药物治疗对反复发作 AP 的 HTG 患者控制血脂水平 预防 AP 复发很有效. 对于遗传性 LPL 缺乏引起的原发性 HTG 患者, 国外学者已提出使用基因疗法, 他们在 LPL 缺乏的鼠科和猫科动物模型 im AAVI-LPLS447X 后使成肌细胞产生和分泌具有酶活性的 LPL, 从而使血清 TG 水平下降 97% 并维持 1 年以上时间 [47]. 从他们目前的研究结论来看, 基因疗法有很好的应用前景. 随着人们生活条件的改善, HAP 的发病率会逐年上升. 我们临床医师应对此予以高度重视, 血脂测定也应列为 AP 的入院常规检查之一, 以便能够早期诊断 及时治疗. 肥胖是 AP 的独立危险因素, 也是判断 AP 预后的重要指标, 与 HL 有着较强的相关性. 肥胖患者的胰周和腹膜后间隙中过多的脂肪沉积可使胰周脂肪坏死及胰腺出血 皂化, 从而诱发 HAP. 故肥胖患者应增加运动量 控制体质量, 采取低热 低糖饮食, 降低 HAP 的发病率. 虽然降脂治疗是 HAP 治疗的核心环节, 但 HAP 是多因素参与的复杂的病理生理过程 ; 各因素间既相互独立, 又相互渗透, 共同促进 HAP 的发生 发展. 因此, 只有将降脂治疗与 HAP 综合治疗中的其他手段相结合, 同时控制引发 HAP 的多种因素, 才能提高治疗的依从性, 显著改善 HAP 的预后, 防止其复发. 7 参考文献 1 T o s k e s P P. H y p e r l i p i d e m i c p a n c r e a t i t i s. Gastroenterol Clin North Am 1990; 19: S e a r l e s G E, O o i T C. U n d e r r e c o g n i t i o n o f chylomicronemia as a cause of acute pancreatitis. CMAJ 1992; 147: Fortson MR, Freedman SN, Webster PD 3rd. Clinical assessment of hyperlipidemic pancreatitis. Am J Gastroenterol 1995; 90: Chang MC, Su CH, Sun MS, Huang SC, Chiu CT, Chen MC, Lee KT, Lin CC, Lin JT. Etiology of acute pancreatitis--a multi-center study in Taiwan. Hepatogastroenterology 2003; 50: Yadav D, Pitchumoni CS. Issues in hyperlipidemic pancreatitis. J Clin Gastroenterol 2003; 36: Jap TS, Jenq SF, Wu YC, Chiu CY, Cheng HM. Mutations in the lipoprotein lipase gene as a cause of hypertriglyceridemia and pancreatitis in Taiwan. Pancreas 2003; 27: Sattler AM, Bock K, Schmidt S, Maisch B, Schaefer JR. LDL-Apheresis for the treatment of hyperchylomicronemia-induced pancreatitis. Z Kardiol 2003; 92: III64-III67 8 Athyros VG, Giouleme OI, Nikolaidis NL, Vasiliadis TV, Bouloukos VI, Kontopoulos AG, Eugenidis NP. Long-term follow-up of patients with acute hypertriglyceridemia-induced pancreatitis. J Clin Gastroenterol 2002; 34: Buse GJ, Riley KD, Dress CM, Neumaster T D. P a t i e n t w i t h g e m f i b r o z i l - c o n t r o l l e d hypertriglyceridemia that developed acute pancreatitis after starting ketogenic diet. Curr Surg 2004; 61: Coman T, Dalloz MA, Coolen N, Heshmati F, Pene F, Cariou A, Claessens YE. Plasmapheresis for the treatment of acute pancreatitis induced b y h e m o p h a g o c y t i c s y n d r o m e r e l a t e d t o hypertriglyceridemia. J Clin Apher 2003; 18: Huang DB, Raskin P. Diabetic hypertriglyceridemiainduced acute pancreatitis masquerading as biliary pancreatitis. J Diabetes Complications 2002; 16: ; 14: ; 23: Chikamune T, Katamoto H, Nomura K, Ohashi F. Lipoprotein profile in canine pancreatitis induced with oleic acid. J Vet Med Sci 1998; 60: ; 24: Castro MR, Nguyen TT, O'Brien T. Clomipheneinduced severe hypertriglyceridemia and pancreatitis. Mayo Clin Proc 1999; 74: P a r d o J M. M a s s i v e h y p e r t r i g l y c e r i d e m i a complicating estrogen therapy. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: H o z u m i Y, K a w a n o M, M i y a t a M. S e v e r e hypertriglyceridemia caused by tamoxifentreatment after breast cancer surgery. Endocr J 1997; 44: Kimura W, Mossner J. Role of hypertriglyceridemia in the pathogenesis of experimental acute pancreatitis in rats. Int J Pancreatol 1996; 20: Mossner J, Bodeker H, Kimura W, Meyer F, Bohm S, Fischbach W. Isolated rat pancreatic acini as a model to study the potential role of lipase in

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15 ; 16(4): ISSN CN /R BASIC RESEARCH ARIP2 蛋白在小鼠肝细胞中的表达及其生物学作用 RESULTS: ARIP2 was expressed in mouse liver tissue and Hepal-6 cells. The expression / of ARIP2 in activin A-stimulated Hepal-6 cells, was increased in a time-dependent manner, and, peaked at 24 h. There was a significant difference in the expression level of ARIP2 on Hepal-6, cells at 12 and 24 h in contrast with the control, group (1.01 ± 0.16, 1.62 ± 0.26 vs 0.82 ± 0.11, P. < 0.05, P < 0.01). pcdna3-arip2-transfected Hepal-6 cells obviously suppressed the gene transcription induced by activin A. MTT assay displayed that activin A (5 μg/l and 10 μg/l) remarkably inhibited the proliferation of Hepal-6 cells, the A 570 nm value was 1.59 ± 0.03 and Activin receptor-interacting protein 2 expression and its 1.49 ± 0.04 vs 1.79±0.07), respectively (P < 0.05, P biological function in mouse < 0.01). ARIP2 over-expression in Hepal-6 cells significantly blocked the inhibitory effects of hepatocytes activin A (5 μg/l and 10 μg/l) on the proliferation of Hepal-6 cells.,, Hong-Jun Zhang, Zhong-Hui Liu, Fang-Fang Chen, Di Ma, Jing Zhou, Gui-Xiang Tai Hong-Jun Zhang, Department of Pathogenobiology, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang , Heilongjiang Province, China Zhong-Hui Liu, Fang-Fang Chen, Di Ma, Jing Zhou, Gui-Xiang Tai, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun , Jilin Province, China Supported by: National Natural Science Foundation of China (No and ) and Science Projects of Jilin Province of China (No ) Correspondence to: Gui-Xiang Tai, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, 126 Xinmin Street, Changchun , Jilin Province, China. taiguixiang@163.com Received: Revised: Abstract AIM: To investigate the activin receptorinteracting protein 2 (ARIP2) expression and its biological function in hepatocytes. METHODS: Expression of ARIP2 in mouse liver tissue and hepatoma cell line Hepal-6 cells was detected by Western blot, immunohistochemistry and cytochemical staining. Effect of ARIP2 on activin-induced gene transcription was analyzed using CAGA-lux plasmid. Effect of overexpression of ARIP2 on the proliferation of Hepal-6 cells was assayed with MTT method. CONCLUSION: ARIP2 can be expected to become a regulation target of genes in treatment of liver injury induced by activin. Key Words: Activin; Activin receptor-interacting protein 2; Signal transduction; Hepal-6 cells; Proliferation Zhang HJ, Liu ZH, Chen FF, Ma D, Zhou J, Tai GX. Activin receptor-interacting protein 2 expression and its biological function in mouse hepatocytes. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : 2(ARIP2). 方法 : Western blot ARIP2 Hepa1-6 ; CAGA-lux ARIP2 ; MTTARIP2 Hepa1-6. 结果 : ARIP2 Hepa1-6

16 351. A Hepa1-6 ARIP2, 24 h ; 12 h 24 h (1.01±0.16, 1.62±0.26 vs 0.82±0.11, P <0.05). pcdna3-arip2 Hepa1-6, ; MTTA(5 μg/l 10 μg/l) Hepa1-6, 570 nm (1.59± ±0.04 vs 1.79±0.07, P <0.05, P <0.01). Hepa1-6 ARIP2 AHepa1-6. 结论 : ARIP2. 清楚. 本研究采用 Hepa1-6 细胞 [14], 进一步探讨了 ARIP2 蛋白的表达规律及其参与激活素信号传导和细胞增殖的作用, 为进一步寻找治疗肝脏疾病的基因作用靶点奠定研究基础. 1 材料和方法 1.1 Activin A MTT 购自 Sigma 公司, Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem) 高糖培养基是 G I B C O 产品, L i p o f e c t a m i n e 2000 由 I n v i t r o g e n 公司提供, G l u t a t h i o n e- Sepharose 4B 以及 Protein A-Sepharose 4B 为 Amersham Biosciences 产品. 免疫组织化学染色用 Ultrasensitive SP 试剂盒购置福建迈新公司. Hepa1-6 细胞株来源于小鼠肝癌细胞系, 由中科 关键词 院上海细胞库提供, 采用 100 ml/l 牛血清 (FCS)- DMEM 培养 : 根据编码 ARIP2 全氨基酸 cdna 序列 (1-153 氨基酸残基 ), 分别设计并引入 Eco R Ⅰ 酶切位点的上游引物 : 5'-ggaattcatgattttctcagg gctggg-3' 和引入 Xho Ⅰ 酶切位点及终止密码子的下游引物 5'-gctcgagctattcacaagaacagtgtaaa-3'. 0 引言经一步法 RT-PCR 扩增目的基因片段, TA 克隆激活素 (Activin) 属于转化生长因子 -β(transforming growth factor, TGF-β) 超家族的多功能入 p M D18-T 质粒, 再亚克隆入真核表达载体生长 分化因子 [1-4] pcdna3, 构建 pcdna3-arip2. 同时构建原核表. 近年研究发现激活素与肝达质粒 pgex-4t-1-arip2( 编码 ARIP2 COOH 端脏疾病关系密切, Activin A 不仅以自分泌 / 旁的 氨基酸残基 ). 分泌形式作用于肝实质细胞, 抑制肝细胞的增 ARIP2 : 构建的 pgex-4t- 殖 影响肝组织再生, 还可以通过活化肝星形细胞 (HSC), 促进肝细胞外基质 (extracellular 1-A R I P2 表达质粒转染大肠杆菌 B L21, 采用 matrix, ECM) 异常分泌, 参与肝纤维化的形成和 Glutathione-Sepharose 4B 亲和层析柱纯化表达发展 [5-7]. 的 GST-ARIP2 融合蛋白 ( 按产品说明书操作 ). 取激活素受体属于丝 / 苏氨酸激酶型受体 [8-9], GST-ARIP2 融合蛋白 500 µg 与完全弗氏佐剂混激活素首先与靶细胞表面的 Ⅱ 型受体 (ActRⅡ) 匀, 多点接种免疫家兔, 加强免疫两次后, 静脉结合, ActRⅡ 再活化 Ⅰ 型受体 (ActRⅠ), 进而采血 分离血清. 经 Protein A 亲和层析纯化抗激活细胞内下游信号传导蛋白 Smads, 发挥生 GST-ARIP2 融合蛋白抗体, 再经 GST-Sepharose 物学作用. 激活素受体相互作用蛋白 (ARIP) 是 4B 亲和层析除去抗 GST 抗体 [13]. 获得纯化的抗最近发现的一组信号传导调控蛋白 [10-13], 作为 ARIP2 特异性 IgG 型抗体, 用于免疫组织及细胞 Smad 上游信号调控蛋白可特异结合激活素 Ⅱ 化学染色. 型受体, 影响激活素诱导的细胞内信号传导. 研 ARIP2 究发现 A R I P2 具有抑制激活素信号传导的作 : 取 C57BL/6 小鼠肝脏经 40 g/l 多聚甲用, Northern blot 检测显示 ARIP2 mrna 在肝醛固定, 常规石蜡切片, 再经二甲苯脱蜡 梯度组织内高表达 [10], 我们的研究还显示肝癌细胞酒精水化 ; 同时将处于对数生长期的 Hepa1-6 细系 Hepa1-6 高表达 ARIP2 mrna [10]. 因此推测, 胞接种在放有盖玻片的 12 孔培养板内, 继续培 ARIP2 表达与激活素调控肝细胞活性有关, 但是养过夜, 贴有 Hepa1-6 细胞的盖玻片经 40 g/l 多 ARIP2 在肝细胞中介导激活素信号传导及其对聚甲醛固定. 上述标本经 3 ml/l H 2 O 2 孵育 1 h 除激活素诱导的肝细胞增殖抑制的影响作用仍不去内源性过氧化物酶后, 用 20 ml/l BSA-PBS 2(ARIP2),.

17 352 ISSN CN /R 室温封闭 1 h, 滴加兔抗 ARIP2 抗体 (1 200 稀 ARIP2 释 ), 4 过夜. PBS 洗 3 次, 采用 Ultrasensitive SP 试剂盒, 按照说明书操作进行显色 ; 苏木精复, 染, 水冲洗返蓝, 常规梯度酒精脱水干燥, 二甲 苯透明, 树胶封片, 光学显微镜观察. 实验同时 以未免疫健康兔 IgG 做阴性对照, 操作过程同抗. 体组 Western blot ARIP2: 将对数生长期的 Hepa1-6 细胞接种于 12 孔细胞培 养板, 细胞数 / 孔, 37 培养过夜后, 更换 培养液为 20 ml/l FCS-DMEM 培养基, 各孔加入 刺激物 Activin A(5 mg/l), 同时设培养液单纯培 养细胞做对照孔, 继续培养 8 h 12 h 24 h, 收 集细胞, 每孔细胞加入 50 µl 组织裂解缓冲液 (1 ml/l Triton X-100; ph mmol/l Tris-HCl; 150 mmol/l NaCl; 2 mmol/l EDTA; 2 mmol/l PMSF; 1 mmol/l NaF; 4 ng/l leupeptin; 1 ng/l aprotitin), 4, 制备细胞匀浆, 以 2000 r/min, 4 离心 10 min, 取上清液再以 r/min, 4 离心 30 min, 回收上清液, 加入 2 SDS-PAGE 上样缓 冲液 25 μl, 100 变性样本 5 min, SDS-PAGE 凝 胶电泳分离样本, 电转印至 PVDF 膜, 用抗 ARIP2 抗体做探针进行 Western 杂交, 采用 ECL 化学发 光检测试剂盒检测杂交结果, 以 β-actin 为参照, 将条带进行灰度扫描 : 为了研究 ARIP2 介导的激活素信号传导作用, 实验选择对激活素特异应答的 CAGA-lux 质粒 提供荧光素酶报告基因. 采用 Lipofectamine 2000 将 CAGA-lux CMV-gal( 用于荧光素酶活 性标准化计算 ) 及 pcdna3-arip2 质粒共转染 体外培养的 Hepa1-6 细胞, 采用 5 μg/l Activin A 刺激, 检测细胞内报告基因转录荧光素酶的 活性 [10,13] MTTHepa1-6 : 取对数期生 长期的 Hepa1-6 细胞接种于 96 孔细胞培养板, / 孔. 根据 ARIP2 抑制激活素信号传导情况选 择 0.03 μg pcdna3-arip2 及 0.03 μg pcdna3 空 质粒, 采用 Lipofectamine 2000 分别将 pcdna3- ARIP2 及 pcdna3 转染培养的 Hepa1-6 细胞, 设 单纯培养液对照及 5 μg/l Activin A 和 10 μg/l H e p a 1-6 Activin A 刺激组, 每组设 3 复孔, 培养 24 h 后, 常 ARIP2 规 MTT 法检测细胞增殖, 全自动酶标仪读取波 A, 长 570 nm 的光吸收值 (A 570nm ), 以 A 570nm 值表示细 胞生长情况 [15]. A Hepa1-6. 实验数据以 mean±sd 表示, 采 用统计学处理软件 SPSS9.0 进行统计学分析, 组间比较采用 t 检验, 各实验组与对照组差异的显著性以 P <0.05 或 P <0.01 表示. 2 结果 2.1 ARIP2 Hepa1-6 在肝实质细胞及 Hepa1-6 细胞均有明显的抗 ARIP2 抗体染色 ( 图 1), 提示 ARIP2 蛋白在小鼠肝脏及肝癌细胞系 Hepa1-6 细胞内均存在. 因此实验选择 Hepa1-6 细胞进一步研究 ARIP2 在肝细胞内的生物学活性. 2.2 Activin A Hepa1-6 ARIP2 Activin A 作用 8 h 后, ARIP2 蛋白表达开始出现时间依赖性增加, 12, 24 h 蛋白的表达与对照组比较差异显著明显 (1.01±0.16, 1.62± 0.26 vs 0.82±0.11, P <0.05, P <0.01, 图 2), 尤以 24 h 蛋白表达增加最为明显. 2.3 Hepa1-6ARIP2 ARIP2 呈剂量依赖性的抑制激活素诱导的特异基因转录活性 ( 图 3). 上述结果提示在激活素 A 刺激 Hepa1-6 细胞后, 升高的 ARIP2 可能参与激活素信号传导的负反馈调节, 对终止激活素的病理损伤作用具有重要意义. 2.4 ARIP2 Hepa1-6 Activin A 能明显抑制 Hepa1-6 细胞的增殖, 并具有一定的剂量依赖关系, 5 μg/l 和 10 μg/l Activin A 组 570 nm 吸光度值与 0 μg/l Activin A 组相比有显著差异 (1.59±0.03, 1.49±0.04 vs 1.79 ±0.07, P <0.05, P <0.01). 而 ARIP2 过表达后可以明显阻断 Activin A 对 Hepa1-6 细胞的生长抑制作用 ( 图 4), 5 μg/l 和 10 μg/l Activin A 组 570 nm 吸光度值与 0 μg/l Activin A 组相比无差异 (1.69± 0.09, 1.7±0.08 vs 1.65±0.06, P >0.05). 上述资料提示 ARIP2 在 Hepa1-6 细胞内表达可能是通过阻断激活素特异信号传导途径, 进而翻转激活素 A 对 Hepa1-6 细胞的增殖抑制作用. 3 讨论肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征, 是慢性肝损伤引起肝脏代谢和细胞间相互作用紊乱的结果 [17-18]. 大量研究表明 Activin A 在调节肝细胞生长 [19-20], 促进肝纤维化发生发展过程中发挥重要作用 [21-28]. TGF-β 是重要的致肝纤维化因子, Wada et al [3] 的新近研究发现 TGF-β 在作用于肝星形细胞 (HSC) 诱导胶原产生的过程中, 主要依赖于其对内源性 Activin A 自分泌的诱导. 该研究

18 353 A B 图 1 ARIP2 免疫组织 ( 细胞 ) 化学染色. ARIP2, Hepa1-6,, ARIP2. C D b a b a b Activin A 0 mg/l Activin A 5 mg/l Activin A 10 mg/l 0 ARIP2 β-actin 证实在肝纤维化发病机制中, TGF-β 与 Activin A 二者不仅仅是功能相似, 而且存在协同和依赖图 2 Activin A 刺激 Hepa1-6 细胞 ARIP2 蛋白的动态表达. 的关系, TGF-β 诱导肝纤维化的功能部分依赖于 Activin A ARIP2(μg) a a Activin A 的自分泌, 因此如果能够阻断肝细胞自 分泌激活素, 或抑制其受体后特异信号传导, 都 可能减轻或抑制激活素介导的肝损伤进程, 发 挥治疗肝脏疾病的作用. 激活素受体相互作用蛋白 (ARIP) 具有明显 的组织学特异性, 在不同的组织中不仅表达 分布不同, 其生物学活性也存在很大差异, 是决 定激活素组织学作用特异性的关键分子. 研究 发现 ARIPs 均能特异结合激活素 II 型受体, 调控 激活素诱导的细胞内信号传导 [11-13]. 其中 ARIP1 与 Smad3 蛋白结合, 抑制 ActRI 向细胞内传递信 号 [11] ; ARIP2/2a 通过 Ral/RalBP1 依赖的途径, 促图 3 ARIP2 在 Hepa1-6 细胞抑制激活素诱导的基因转录活性. 进 ActRII 内吞, 降低细胞膜上的 ActRⅡ 受体表 0.0 图 4 ARIP2 过表达对 Hepa1-6 细胞增殖的影响. μ

19 354 ISSN CN /R 达, 具有抑制激活素诱导的信号传导作用 [8,29] ; ARIP2: ARIP2b 2c 可以上调 ActRⅡ 受体表达, 具有促 2, 进激活素诱导的信号传导作用 [13]. 我们的研究发, 现 ARIP2 mrna 在肝脏细胞及 Hepa1-6 细胞中表 达 [16], 提示 ARIP2 与激活素作用肝细胞的信号传. 导调控有关. 为了探讨 ARIP2 蛋白在肝细胞中的表达形 式及其生物学作用, 本研究采用免疫组织化学 以及细胞化学染色, 确定在小鼠肝脏组织细胞 以及 Hepa1-6 细胞均有成熟的 ARIP2 蛋白表达. 研究通过 Western blot 进一步分析了 ARIP2 蛋白 的动态表达情况, 结果显示在 Activin A 刺激的 晚期 h ARIP2 的表达显著增加, 这一结果 与我们前期研究发现的 ARIP2 mrna 动态转录 水平一致 [16], 进一步提示 ARIP2 可能参与激活素 作用后期信号传导调节过程. 为明确 ARIP2 对激 活素的信号传导调控作用, 实验分析了 ARIP2 对 激活素诱导的特异基因转录的影响, 结果显示 ARIP2 在肝细胞中能够明显抑制激活素诱导的 信号传导. 由此可见 ARIP2 可能作为激活素信号 传导负调控蛋白, 参与激活素作用晚期的信号 传导的负反馈调节过程. 为了进一步阐述 A R I P2 作为激活素信号 传导的负调控分子在肝细胞中的生物学作用, 本研究采用来源于肝实质细胞的肝癌细胞系 Hepa1-6 细胞作为研究对象, 研究发现 Activin A 对 H e p a1-6 细胞增殖具有明显的抑制作用, Activin A 10 μg/l 刺激 24 h 生长抑制率达 27%, 具有剂量依赖关系. Activin A 对 Hepa1-6 细胞增 殖抑制与有关报道的 Activin A 抑制小鼠肝实 质细胞增殖的结果一致 [4-5,17-18]. 实验进一步将 pcdna3-arip2 转染至小鼠肝癌细胞系 Hepa1-6 细胞, 观察 ARIP2 表达对激活素诱导的肝细胞增 殖抑制的影响, 结果显示 ARIP2 过表达可以明显 减弱或消除 Activin A 对 Hepa1-6 细胞的增殖抑 制作用, 表明 ARIP2 可能通过抑制激活素信号 传导, 对激活素的生物学作用具有明显的阻断 作用. 上述资料显示 ARIP2 是一种可在肝细胞内 表达, 具有抑制激活素信号传导作用的负调控 蛋白, 在肝细胞内上调 ARIP2 的表达, 可以反转 激活素在肝脏介导的生物学作用. 因此在肝细 胞内上调 ARIP2 的表达对预防和减轻激活素在 肝脏的致病作用, 具有重要意义, ARIP2 有望成 为治疗肝病的有效靶点. 4 参考文献 1 Werner S, Alzheimer C. Roles of activin in tissue repair, fibrosis, and inflammatory disease. Cytokine Growth Factor Rev 2006; 17: Zhang XJ, Li Y, Tai GX, Xu GY, Zhang PY, Yang Y, Lao FX, Liu ZH. Effects of activin A on the activities of the mouse peritoneal macrophages. Cell Mol Immunol 2005; 2: Wada W, Kuwano H, Hasegawa Y, Kojima I. The dependence of transforming growth factor-betainduced collagen production on autocrine factor activin A in hepatic stellate cells. Endocrinology 2004; 145: Takamura K, Tsuchida K, Miyake H, Tashiro S, Sugino H. Activin and activin receptor expression changes in liver regeneration in rat. J Surg Res 2005; 126: Sugiyama M, Ichida T, Sato T, Ishikawa T, Matsuda Y, Asakura H. Expression of activin A is increased in cirrhotic and fibrotic rat livers. Gastroenterology 1998; 114: Smith C, Yndestad A, Halvorsen B, Ueland T, Waehre T, Otterdal K, Scholz H, Endresen K, Gullestad L, Froland SS, Damas JK, Aukrust P. Potential anti-inflammatory role of activin A in acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol 2004; 44: De Bleser PJ, Niki T, Xu G, Rogiers V, Geerts A. Localization and cellular sources of activins in normal and fibrotic rat liver. Hepatology 1997; 26: Mathews LS, Vale WW. Expression cloning of an activin receptor, a predicted transmembrane serine kinase. Cell 1991; 65: Attisano L, Wrana JL, Montalvo E, Massague J. Activation of signalling by the activin receptor complex. Mol Cell Biol 1996; 16: Matsuzaki T, Hanai S, Kishi H, Liu Z, Bao Y, Kikuchi A, Tsuchida K, Sugino H. Regulation of endocytosis of activin type II receptors by a novel PDZ protein through Ral/Ral-binding protein 1-dependent pathway. J Biol Chem 2002; 277: Shoji H, Tsuchida K, Kishi H, Yamakawa N, Matsuzaki T, Liu Z, Nakamura T, Sugino H. Identification and characterization of a PDZ protein that interacts with activin type II receptors. J Biol Chem 2000; 275: Tsuchida K, Nakatani M, Matsuzaki T, Yamakawa N, Liu Z, Bao Y, Arai KY, Murakami T, Takehara Y, Kurisaki A, Sugino H. Novel factors in regulation of activin signaling. Mol Cell Endocrinol 2004; 225: Liu ZH, Tsuchida K, Matsuzaki T, Bao YL, Kurisaki A, Sugino H. Characterization of isoforms of activin receptor-interacting protein 2 that augment activin signaling. J Endocrinol 2006; 189: Darlington GJ. Liver cell lines. Methods Enzymol 1987; 151: M i l j k o v i c D, C v e t k o v i c I, M o m c i l o v i c M, Maksimovic-Ivanic D, Stosic-Grujicic S, Trajkovic V. Interleukin-17 stimulates inducible nitric oxide synthase-dependent toxicity in mouse beta cells. Cell Mol Life Sci 2005; 62: Zhang HJ, Tai GX, Zhou J, Ma D, Liu ZH. Regulation of activin receptor-interacting protein 2 expression in mouse hepatoma Hepa1-6 cells and its relationship with collagen type IV. World J

20 355 Gastroenterol 2007; 13: Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000; 275: Hoek JB, Pastorino JG. Ethanol, oxidative stress, and cytokine-induced liver cell injury. Alcohol 2002; 27: Endo D, Maku-Uchi M, Kojima I. Activin or follistatin: which is more beneficial to support liver regeneration after massive hepatectomy? Endocr J 2006; 53: Date M, Matsuzaki K, Matsushita M, Tahashi Y, Sakitani K, Inoue K. Differential regulation of activin A for hepatocyte growth and fibronectin synthesis in rat liver injury. J Hepatol 2000; 32: Patella S, Phillips DJ, de Kretser DM, Evans LW, Groome NP, Sievert W. Characterization of serum activin-a and follistatin and their relation to virological and histological determinants in chronic viral hepatitis. J Hepatol 2001; 34: Pirisi M, Fabris C, Luisi S, Santuz M, Toniutto P, Vitulli D, Federico E, Del Forno M, Mattiuzzo M, Branca B, Petraglia F. Evaluation of circulating activin-a as a serum marker of hepatocellular carcinoma. Cancer Detect Prev 2000; 24: Huang X, Li DG, Wang ZR, Wei HS, Cheng JL, Zhan YT, Zhou X, Xu QF, Li X, Lu HM. Expression changes of activin A in the development of hepatic fibrosis. World J Gastroenterol 2001; 7: Sugiyama M, Ichida T, Sato T, Ishikawa T, Matsuda Y, Asakura H. Expression of activin A is increased in cirrhotic and fibrotic rat livers. Gastroenterology 1998; 114: Gold EJ, Francis RJ, Zimmermann A, Mellor SL, Cranfield M, Risbridger GP, Groome NP, Wheatley AM, Fleming JS. Changes in activin and activin receptor subunit expression in rat liver during the development of CCl4-induced cirrhosis. Mol Cell Endocrinol 2003; 201: Gold EJ, Zhang X, Wheatley AM, Mellor SL, Cranfield M, Risbridger GP, Groome NP, Fleming JS. betaa- and betac-activin, follistatin, activin receptor mrna and betac-activin peptide expression during rat liver regeneration. J Mol Endocrinol 2005; 34: Yuen MF, Norris S, Evans LW, Langley PG, Hughes RD. Transforming growth factor-beta 1, activin and follistatin in patients with hepatocellular carcinoma and patients with alcoholic cirrhosis. Scand J Gastroenterol 2002; 37: Hughes RD, Evans LW. Activin A and follistatin in acute liver failure. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003; 15: Cui XL, Tai GX, Zhang HJ, Fang L, Liu ZH. Cloning of the full-length gene of activin receptorinteracting protein2a and characterization of its interaction with ActR ⅡA. Progress in Natural Science 2007; 17: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 World Journal of Gastroenterology (WJG ) 2007 年 1-48 期共发表文章 1120 篇, 其中国际文章 791 篇, 占 71%; 国内文章 329 篇, 占 29%. 社论 63 篇, 综述 30 篇, 专题亮点 139 篇, 文章 663 篇 ( 基础研究和临床研究 ), 病例报告 193 篇, 读者来信等 32 篇, 评论性文章占发文总量的 21% 年 1-12 月份共收稿 2628 篇, 其中国内稿件 980 篇, 占 37%; 国外稿件 1648 篇, 占 63%; 退稿 1052 篇, 退稿率为 40%. ( 常务副主任 : 刘晔 )

21 ; 16(4): ISSN CN /R BASIC RESEARCH 茶多酚对酒精性肝病大鼠 TNF-α 及肝细胞的影响 ± 0.83 vs ± 1.87, P < 0.05) were lower in the tea polyphenols-intervened group than in the, model group.., CONCLUSION: Tea polyphenols can protect he- from damage, decrease lipid peroxida- patocytes, tion and TNF-α release.. Key Words: Alcoholic liver disease; Tea polyphenols; Tumor necrosis factor-alpha; Enzyme linked immunosorbent assay; RT-PCR Effect of tea polyphenols on TNF-α and hepatocytes in rats with alcoholic liver disease Fen Li, Xiao-Qin Guan, Li Liu Li F, Guan XQ, Liu L. Effect of tea polyphenols on TNF-α and hepatocytes in rats with alcoholic liver disease. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): ,, Fen Li, Xiao-Qin Guan, Li Liu, Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing , China Correspondence to: Xiao-Qin Guan, Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing , China. guanxiaoqin2003@yahoo.com.cn Received: Revised: Abstract AIM: To investigate the effect of tea polyphenols on Tumor necrisis factor-alpha (TNF-α) expression and liver pathological change in rats with alcoholic liver disease. METHODS: Twenty-nine Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, and tea polyphenols-intervened group. A model of alcoholic liver disease was induced by gastric perfusion with alcohol and intervened with tea polyphenols. Liver tissue sections were stained with H&E. Serum levels of AST, ALT and MDA were determined. Serum TNF-α was detected by ELISA. RT-PCR was performed to determine TNF-α expression in liver tissue. RESULTS: The scores of pathology (3.00 ± 1.59 vs 4.50 ± 1.31, P < 0.05), serum levels of AST and MDA (87.33 ± vs ± 81.34, 2.75 ± 0.72 vs 7.34 ± 3.06, P < 0.05) as well as TNF-α (0.55 ± 0.05 vs 0.73 ± 0.07, P < 0.05) and TNF-α mrna expression (0.55 ± 0.05 vs 0.73 ± 0.07, P < 0.05; 4.45 目的 : TNF-α. 方法 : 29:. ig,., AST ALT MDA, ELISATNF-α RT-PCRTNF-α mrna. 结果 :, (3.00±1.59 vs 4.50±1.31, P <0.05), A S T M D A(87.33±61.00 v s ±81.34, 2.75±0.72 vs 7.34±3.06, P <0.05), TNF-α mrnatnf-α (0.55±0.05 vs 0.73±0.07, 4.45 ±0.83 vs 14.33±1.87; P <0.05). 结论 :,, TNF-α. 关键词 α α 0 引言 酒精性肝病 (ALD) 是由于长期大量饮酒所致的

22 α 357 肝脏疾病. 临床上分轻症酒精性肝病 酒精性脂肪肝 酒精性肝炎 酒精性肝纤维化 酒精性肝硬化. 由于其机制复杂, 涉及乙醇的直接毒性 乙醛的化学性损伤 氧应激和脂质过氧化 线粒体损伤 遗传等多个方面. 近年来 ALD 的治疗进展缓慢, 对 ALD 早期疾病的预防显得尤为重要. 茶多酚 (TP) 是茶叶的主要活性成分, 其主要成分儿茶素占茶多酚总量的 60%-80%, T P 经消化道吸收后进入全身各组织, 体内广泛分布 [1], 抗氧化是其的主要作用. 本研究在建立大鼠 ALD 模型的基础上, 利用茶多酚能直接溶于乙醇的物理特性, 建模的同时给与茶多酚干预, 观察茶多酚对肝细胞病变及其对血清 肝组织中 TNF-α 的影响, 探讨茶多酚用于酒精性肝病早期预防和治疗的可能性. 1 材料和方法 1.1 清洁级成年 Wistar 大鼠 29 只, 体质量 200±50 g, 购自重庆医科大学实验动物中心. 实验期间饲养于重庆医科大学动物中心 IVC 饲养间. 实验仪器 : Thermo Hybaid PCR 仪为英国产品, Bio-Rad 凝胶成像系统为美国产品, Bio-Tec 酶标仪为美国产品, 透射电镜 (Hitachi-7500) 为日本产品. 试剂有 55 度红星二锅头白酒 : 北京红星二锅头酒厂生产, 苏丹 Ⅳ 特染试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司, 丙二醛 (MDA) 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所, TNF-α 兔抗鼠多克隆抗体及免疫组化 SABC 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, ELISA 定量检测细胞因子 TNF-α 试剂购自深圳晶美生物工程有限公司, RT-PCR 引物 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 试剂盒 DNA marker 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, 茶多酚 TP98 购自无锡世纪生物药业公司 ( 茶多酚 98%, 其中儿茶素 85%) : Wistar 大鼠 29 只, 随机分为三组, 对照组 5 只, ALD 模型组 11 只, 茶多酚干预组 13 只. 灌胃溶液 : (1)ALD 模型组 : 55 度白酒 + 玉米油. (2) 茶多酚干预组 : 55 度白酒 + 玉米油 + 茶多酚. (3) 对照组 : 玉米油. 每日上午九点 ig 1 次. 其中 : 55% 白酒以 8-15 ml/(kg d) 剂量, 每周递增. TP: 0.25 g/(kg d), 玉米油 : 2 ml/(kg d). 实验结束得到大鼠 : 对照组 5 只, 模型组 9 只 干预组 9 只. 7 wk 末处死大鼠, 下腔静脉穿刺抽血 5-6 ml, 分 离血清. 取相同部位肝组织 40 g/l 甲醛固定, 石 蜡包埋切片及冰冻切片做脂肪特殊染色, 光镜 观察. 取 1 mm 3 肝组织, 固定于 4 预冷的 20 g/l 戊二醛中, 备电镜检测. 另取 mg 大小的肝 组织若干, 分别用 1 ml/l DEPC 水处理过的锡箔 纸包裹后存放于液氮中, 备 RT-PCR 检测. 其余肝 脏组织保存在 -80 冰箱 : 各组动物肝组织病理切片经 HE 染色, 冰冻切片苏丹 Ⅳ 染色确认细胞内脂滴储 积情况. 依照 2006 年修订的酒精性肝病诊疗指 [2] 南标准进行组织评分, 评分主要内容包括 : 肝 细胞脂变及坏死 肝小叶炎症细胞浸润 纤维 化程度 : 按常规透射电 镜样品制备方法固定 脱水 浸透 包埋, 光 镜半薄切片定位后行超薄切片. 枸橼酸铅电子染 色后, 在透射电镜 (Hitachi-7500) 下观察超微结构 : 用全自动生化仪 测定大鼠血清 ALT AST 水平, 血清 MDA 检测 严格按照说明书进行, ELISA 法检测血清 TNF-α, 严格按照说明书进行. 肝组织 TNF-α mrna 表 达检测采用半定量 RT-PCR 法. 内参 : β-actin. 应 用 TRIzol 试剂提取总 RNA, 参照 RT-PCR 试剂盒 说明逆转录成 cdna, 10 μl 体系. PCR 扩增 : 50 ul 体系 : 5 PCR Buffer 10 μl, 灭菌蒸馏水 μl, TaKaRa Taq HS 0.25 μl, TNF-α 上下游引物 各 0.5 μl, 逆转录产物 10 μl. 反应条件 : (94 3 min)1 cycle; (94 30 s, s, s)40 cycles; (72 5 min) 1 cycle, TNF-α 上游引物 : 5'- TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC, 下游引 物 : 3'-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC, 扩 增产物 295 bp, β-actin: 反应体系同 TNF-α, 反应 条件 : (94 3 min)1 cycle; (94 30 s, s, s)30 cycles; (72 5 min)1 cycle, β-actin 上游引物 : 5'-AGAGCTATGAGCTGCCTGAC-3', 下游引物 : 5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3', 扩增产物 374 bp, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后 用 Bio-Rad Gel Doc2000 型凝胶电泳成像系统照 相后并用 Quantity One 软件计算基因相对表达 值. 被检测的目的基因相对表达值 = 目的基因 条带灰度值 /β-actin 基因条带灰度值 : SABC 法检测肝组织中的 TNF-α 蛋白表达. 石蜡切片脱蜡至水. 30 ml/l H 2 O 2 灭活内源性过氧化物酶. 封闭非特异性抗 原. 加 稀释的 TNF-α 一抗. 4 过夜. 二 抗 三抗工作液 37 孵育各 20 min. DAB 显色,,,,, TNF-α.

23 358 ISSN CN /R,,. 表 1 TNF-α 的检测结果 (mean±sd) 分组肝组织 mrna 血清含量免疫组化 表 2 各组血清 ALT AST MDA 含量比较 (mean±sd) 分组 n AST(U/L) ALT(U/L) MDA(mmol/mL) 表 3 酒精组与茶多酚组血清 AST/ALT 的四格表 处理比值 >2 比值 <2 合计 0 图 1 各组 HE 染色组织切片评分 苏木素复染, 封片, 以磷酸盐缓冲液代替一抗作 阴性对照. 结果判断 : 北航 CM-2000B 型生物医 学图像分析系统, 每张切片随机选取 10 个高倍 视野, 取面密度, 以平均值结果统计分析. 结果以 mean±sd 表示. 各组均 数先进行方差齐性检验, 计量资料单因素方差 分析. 等级资料采用 c 2 检验. 多组样本均数之间 两两比较采用 SNK 检验. P <0.05 有统计学差异. 2 结果 2.1 对照组被毛光滑, 活泼, 体质量增加, 大便正常. 灌白酒的大鼠精神萎 靡 行动迟缓, 皮毛黄 无光泽, 有激惹征象, 部分大鼠大便稀软. 2.2 石蜡切片评分 : 对 照组 : 2.60±1.40. 模型组 : 4.50±1.31. TP 干预组 : 3.00±1.59( 图 1), 模型组与 TP 干预组有显著性差 异. 对照组大鼠肝组织肉眼及光镜下改变不明 显, 其他二组肝脏体积稍增大, 边缘变钝, 色泽 晦暗, 切面油腻感. 模型组大鼠肝细胞胞质疏松 化, 部分细胞气球样变, 胞质内见大小不等的空 泡, 苏丹 Ⅳ 染色证实空泡变性的肝细胞内含大 小不等 被染成猩红色的脂质. 偶见 Mallory 小 体, 小叶内少量点状坏死, 汇管区及小叶内少量 淋巴细胞 嗜中性粒细胞浸润, 但纤维增生不 明显. 茶多酚组上述改变明显轻于模型组, 未见 纤维增生 ( 图 2). 2.3 模型组大鼠肝细胞内易见 脂滴, 线粒体肿胀, 并能见到环状线粒体 内质 网扩张, 而茶多酚干预组肝细胞超微结构基本 正常 ( 图 3). 2.4 TNF-α 肝组织 TNF-α mrna RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳图见图 4; 肝组织 TNF-α 蛋白表达, 免疫组化结果见表 1. 免疫组化结果显示 : 模型组肝组织 TNF-α 阳性细胞数明显多于茶多酚组, 表达强度 ( 面密度 ) 明显高于茶多酚组 (P <0.05). 阳性细胞在肝小叶内弥漫分布, 小叶中央静脉周围细胞数相对较多. 枯否细胞有表达 ( 图 5). 各组血清 ALT AST MDA 含量比较见表 2, 表 3. 3 讨论乙醇进入细胞内, 除了经线粒体氧化代谢, 还可以活化细胞色素 P4502E1, 产生大量 ROS. 当 ROS 的量超出机体抗氧化系统的清除能力时, 发生氧应激, 氧应激达到一定强度, ROS 氧化细胞膜上不饱和脂肪酸, 导致脂质过氧化, 损伤膜结构. 线粒体是细胞内重要的膜性细胞器, 线粒体膜结构的异常与细胞功能损伤相关联. 肝细胞中 AST 大约有 80% 存在于线粒体中. 而 ALT 主要位于肝细胞的细胞质中, 临床上对酒精性肝病患者血清检测结果呈现 AST/ALT>2 的特点, 也提示 ALD 中肝细胞的超微损伤主要在线粒体. 我们的实验结果显示 : 茶多酚组血清 AST 明显低于模型组, 同时组内动物血清 AST/ALT>2 的比例小于模型组. 超微结构显示虽然实验动物给与高浓度的白酒 7 wk, 但线粒体的结构未见明显异常, 说明同时给予的茶多酚对线粒体有保护作用. 病理切片及特染结果提示该组大鼠肝细胞脂变程度 肝小叶内炎症情况也轻于模型组, 同时血清中脂质过氧化产物丙二醛的含量也低于模型组. 提示茶多酚可减轻 ALD 病程中的脂质过氧化损伤.

24 α 359 A B 图 2 各组 HE 染色 组织切片及苏丹 Ⅳ, 染色.,,. C D A B 图 3 模型组与茶多酚组肝细胞超微结构比较 (TEM ). 1 mm 2 mm 374 bp 295 bp 茶多酚抗氧化作用与结构有关, 他的几种 主要成分物质中都含多个羟基, 其 B 环上的邻二 羟基 (3', 4'_OH), A 环上 5 和 7 位上的二个羟基, 以 及 C 环上的 3 位上的羟基, 提供氢与活性氧的孤 电子结合. 儿茶素结构上的 3', 4 邻二羟基可将游 离金属离子螯合, 减少金属离子活化而产生的 M 1200 bp 900 bp 750 bp 600 bp 450 bp 300 bp 150 bp 活性氧离子 [3]. 另外, 茶多酚还可以保护抗氧化 酶, 提高抗氧化酶的活性 [4], 减少酒精代谢造成 的抗氧化剂的过度消耗, 提高细胞抗脂质过氧 化能力. 我们的实验还发现 : 茶多酚对肝细胞的 保护作用不仅直观地体现在形态学上, 还影响 ALD 病程中的炎症介质. TNF-α 是 ALD 病程中多 效能的前炎症因子, 处于肝细胞损伤的细胞因 子网络的核心, 当机体处于应激损伤 急慢性 感染情况下, 机体的多种细胞可以合成分泌. 他 图 4 RT-PCR 肝组织 TNF-a mrna 表达 (n = 3). 介导肝细胞的炎症反应, 免疫反应及肝细胞的 β 凋亡和扩增, 肝纤维化等多种病理生理活动 [5]. α 应用 TNF-α 抑制剂降低 TNF-α 水平可减轻酒精 性肝损伤 [6-7]. 由于血清中 TNF-α 的量并不能完 全说明 TNF-α 对肝细胞的作用, 近年来人们越来 越关心其在不同组织中的表达和变化. 本研究应用 RT-PCR 免疫组化 ELISA 法 分别检测了肝组织及血清中 TNF-α 的含量, 从 mrna 与蛋白水平证明了茶多酚可以减少 ALD

25 360 ISSN CN /R A B 图 5 肝组织 TNF-α 免疫组化结果 (SABC 100). 病程中 TNF-α 的合成和释放. 这与张宇 周晓蓉 et al 的研究结果相近 [8-9]. 同时发现这三种方法检测出的 TNF-α 的变化方向一致. 相对于肝组织中的 TNF-α 的量的变化, 血清中 TNF-α 变化更加敏感. 分析的茶多酚使 TNF-α 减少的原因 : (1) 茶多酚的抗氧化作用直接减少活性氧, 减少 ROS 引起的转录因子 NF-kB 活化, 减少受 NF-kB 转录调节 TNF-α 的基因表达. (2)ALD 肠源性内毒素血症也是 TNF-α 增多的原因 [10-11]. 过量酒精摄入, 不仅会改变肠黏膜的通透性, 而且会增加肠道内细菌的移位, 影响枯否细胞, 导致来源于枯否细胞 NADPH 氧化酶的超氧阴离子以及其他种类的活性氧增多, 而茶多酚本身还有抑菌杀菌调节免疫的功能, 抑制肠道细菌的过度生长, 降低 ALD 大鼠血清中内毒素含量. 减轻 LPS 对枯否细胞的刺激, 减少他所产生的氧自由基. 茶多酚可以通过阻断内毒素诱导的枯否细胞 NF-kB 的活化而减少 TNF-α 的量 [12-13]. 茶多酚作为一种安全高效的抗氧化剂, 大量存在于茶叶特别是绿茶中, 而现在抗 TNF-α 治疗在酒精性肝病的治疗越来越引起人们的重视, 我们的研究结果提示 : 茶多酚对 ALD 病程中 TNF-α 和肝细胞病变有影响, 这为茶多酚预防性的应用 ALD 发病的早期阶段或者将他用作抗炎治疗的辅助剂, 减轻肝脏的病损程度提供一定的理论依据. 4 参考文献 1 Suganuma M, Okabe S, Oniyama M, Tada Y, Ito H, Fujiki H. Wide distribution of [3H](-)- epigallocatechin gallate, a cancer preventive tea polyphenol, in mouse tissue. Carcinogenesis 1998; 19: ; 11: ; 29: Kaviarasan S, Ramamurthy N, Gunasekaran P, Varalakshmi E, Anuradha CV. Epigallocatechin-3- gallate(-)protects Chang liver cells against ethanolinduced cytotoxicity and apoptosis. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2007; 100: α 2005; 6: Ponnappa BC, Israel Y, Aini M, Zhou F, Russ R, Cao QN, Hu Y, Rubin R. Inhibition of tumor necrosis factor alpha secretion and prevention of liver injury in ethanol-fed rats by antisense oligonucleotides. Biochem Pharmacol 2005; 69: Day CP. Treatment of alcoholic liver disease. Liver Transpl 2007; 13: S69-S ; 13: ; 14: Bode C, Bode JC. Effect of alcohol consumption on the gut. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2003; 17: : IETM ; 2: Yang F, de Villiers WJ, McClain CJ, Varilek GW. Green tea polyphenols block endotoxin-induced tumor necrosis factor-production and lethality in a murine model. J Nutr 1998; 128: McVicker BL, Tuma DJ, Kharbanda KK, Kubik JL, Casey CA. Effect of chronic ethanol administration on the in vitro production of proinflammatory cytokines by rat Kupffer cells in the presence of apoptotic cells. Alcohol Clin Exp Res 2007; 31:

26 ; 16(4): ISSN CN /R BASIC RESEARCH TLR2 在大鼠急性坏死性胰腺炎中末端回肠的表达及意义 histoleucocytes, histoleucocytes and eosinocytes of lamina propria, arteries and veins of submucosa, longitudinal and circular muscular layers of the ANP group. CONCLUSION: Expression of TLR2 is increased in the distal ileum of rats with ANP. Its overexpression may correlate with intestinal mucosa injury and development of enterogenic infection. Expression of Toll-like receptor 2 in distal ileum of rats with acute necrotizing pancreatitis and its significance Ji-Min Ma, Jie Cui, Zhi-Jun Yang Ji-Min Ma, Jie Cui, Zhi-Jun Yang, Departmant of Emergency Surgery, Maanshan Central Hospital, Wannan Medical College, Maanshan , Anhui Province, China Correspondence to: Ji-Min Ma, Departmant of Emergency Surgery, Maanshan Central Hospital, Wannan Medical College, Hudong Northern Road, Maanshan , Anhui Province, China. shixined@hotmail.com Received: Revised: Key Words: Acute necrotizing pancreatitis; Toll-like receptor 2; Intestinal mucosa permeability; Enterogenic infection; Western blotting; Immunohistochemistry Ma JM, Cui J, Yang ZJ. Expression of Toll-like receptor 2 in distal ileum of rats with acute necrotizing pancreatitis and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : (ANP) Toll2(TLR2). (ANP), ANP. To l l (TLRs) (PAMP),,. TLRs, ANP, ANP. Abstract AIM: To investigate the expression of Toll-like receptor 2 (TLR2) in distal ileum of rats with acute necrotizing pancreatitis(anp) and its significance. METHODS: Sixty SD rats were randomly divided into ANP group (n = 40) and sham-operation group (n = 20). TLR2 mrna expression in distal ileum of rats was detected by real-time PCR, and its protein expression was determined by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS: The expression levels of TLR2 mrna and its protein were significantly higher in the ANP group than in the sham-operation group. Western blot showed that the TLR2 mrna expression level was correlated with the pathological scores (r = 0.42, P < 0.01) and permeability (r = 0.41, P < 0.011) of intestinal mucosa. Immunohistochemistry displayed that the TLR2 protein expression was rather high on ileum mucosa surface, in T and B lymphocytes, 方法 : 602: 20, ANP40. 5% ANP, 8 h16 h. PCR TLR2 mrna, Western blottlr2. 结果 :, ANP TLR2 mrna, TLR2 (r = 0.42, P <0.01)(r = 0.41, P <0.01)., ANP T B TLR2. 结论 : ANP TLR2 mrna, ANP.,, 关键词

27 362 ISSN CN /R 表 1 PCR 引物核苷酸序列 ANP. ANP 产物长 基因引物序列度 (bp) TLRs 0 引言 β 急性坏死性胰腺炎 (ANP) 是一类起病急 病死 率高 涉及多个脏器的危重症疾病, 胰腺坏死 组织继发感染是 ANP 患者死亡的主要原因 [1]. 在. 急性胰腺炎早期, 肠道是全身炎症反应的一个 靶器官, 而肠道屏障损害所致的肠道细菌或毒素移位是 ANP 时细菌入侵的主要途径 [2-4]. Toll 样受体 (toll-like receptors, TLRs) 是病原相关分子模式 (pathogen associated molecular pattern, PAMP) 的受体, 是内毒素信号转导链中致病的关键环节 [5]. TLR2 作为脂多糖 (LPS) 受体, 可能作为急性炎症反应损伤的扳机点, 启动机体的这种病理过程. 本实验制作大鼠 ANP 模型, 观察 ANP 时末端回肠组织 TLR2 的表达情况, 探讨 TLR2 在 ANP 肠源性感染中的作用. triamine pentacetic acid, 99m Tc-DTPA) 检测肠黏膜通透性 [6] : 术中于近端空肠内缓慢注入 1.5 mci Tc-DTPA. 术后放入代谢笼, 留取 8 h 和 16 h 尿液, 用放射免疫 γ 计数器测定上述时点尿中 99m Tc- DTPA 脉冲数. 末端回肠用 40 g/l 的甲醛固定后, 石蜡包埋 切片, 常规 HE 染色, 光镜下观察. 按参考文献进行肠黏膜病理学评分 [2] RNA : 用 TRIzol 法抽提总 RNA, 紫外分光光度计测定总 RNA 的纯度, 变性琼脂糖凝胶电泳初步评价总 RNA. 符合标准的总 RNA A 260 /A 280 在 之间, 琼脂糖凝胶电泳, 18 S 和 1 材料和方法 1.1 健康成年 S D 大鼠 60 只, 体质量 200 ±20 g, 由东南大学医学院实验动物中心提供. 牛磺胆酸钠 (Sigma 公司 ), TRIzol 试剂盒 (Invitrogen 公司 ), Taq 聚合酶 MMLV 反转录酶 (Promega 公司 ), Sybergreen(Molecular Probes 公司 ), Rotor-Gene 3000 Real time PCR 仪 (Corbett Research 公司 ), 一抗为羊抗大鼠 TLR2 多克隆抗体 (Santa cruz 公司 ), 鼠抗羊二抗购自 Jacksonimmuno 公司 : 60 只大鼠随机分为 2 组, 假手术组 20 只, ANP 组 40 只. 试验前大鼠禁食 h, 自由饮水. ANP 组采用逆行胰胆管注射 50 g/l 牛磺胆酸钠 (1 ml/kg 体质量 ), 假手术组仅轻轻翻动胰腺 3 次后关腹. 关腹后背部 sc 生理盐水 4-6 ml 作为补液, 术后将大鼠放回代谢笼. 假手术组在术后 8 h 处死大鼠, ANP 组分别于术后 8 h 和 16 h 两个时相点 (P8 P16) 处死大鼠, 提取部分末端回肠组织. 新鲜回肠组织于 40 g/l 甲醛溶液中固定 12 h 后, 常规石蜡包埋 切片. 其余组织 -70 冻存备用 : 采用 99m 锝 - 亚锡喷替酸法 ( 99m technetium diethlene 28 S 电泳条带清晰, 28 S 和 18 S 亮度之比 2.1. 抽提的总 RNA 于 -70 保存备用 PCR: 应用 Primer premier 5.0 软件, 参照 TLR2 基因序列设计引物, β-actin 作为内参基因 ( 表 1). 引物由上海康成生物公司合成. 每份标本取 5 μg 总 RNA, 在 MMLV 反转录酶作用下合成 cdna, 针对每一需要测量的基因和管家基因, 进行 PCR 反应以制备用于绘制标准曲线的梯度稀释 DNA 模板, 反应体系 : cdna 1 μl, 上下游引物各 0.5 μl, Sybergreen 0.5 μl, 总反应体积为 25 μl, 反应条件 : s, s, s, 45 个循环 ; 72 延伸 5 min. 将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释 : 设定 PCR 产物浓度为 1, 分别稀释为 , , , , , 和 这几个梯度浓度的 DNA. 几个梯度稀释的 DNA 模板以及所有 cdna 样品分别配置 Real time PCR 反应体系 : cdna 1 μl, 上下游引物各 0.5 μl, Sybergreen 0.5 μl, 总反应体积为 25 μl. 反应条件 : β-actin: 94 5 min; 35 个 PCR 循环 (94 20 s, s, s, s, TLR2: 94 5 min; 40 个 PCR 循环 (94 20 s, s, s, s, TLR4: 94 5 min; 35 个 PCR 循环 (94 20 s, s, s, s). 为建立 PCR 产物的熔解曲线, 每次扩增反

28 363 表 2 肠黏膜组织病理学评分及肠黏膜通透性 (%) 的比较 (mean±sd) 应结束后均继续从 72 缓慢加热到 99 ( 每 5 s 升 高 1 ). 最后, 用标准曲线法定量 : 称取 200 mg 组织研磨粉碎后, 抽 提总蛋白, 按蛋白质定量试剂盒操作说明测定 蛋白浓度, 配制含 50 μg 总蛋白的样品液. 将准备 好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准 分别上样, 行 SDS-PAGE 电泳. 电转移到膜上, 用 50 g/l BSA 封闭. 封闭过的膜加入一抗 (1 300) 室温孵育 1.5 h, PBS 洗膜 3 次, 加入 HRP 标记的二 抗 (1 5000) 以结合一级抗体及 HRP 标记的抗生 物素抗体, 室温孵育 1 h, PBS 洗膜 3 次. 对反应好 的膜进行化学发光, 以 X 光胶片曝光 显影 定 影, 图片扫描保存为电脑文件, 并用 Image J 分析 软件将图片上每个特异条带灰度值数字化 : 石蜡切片常规脱蜡至水, 30 g/l H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶 10 min, 将切片浸入 0.01 mol/l 枸橼酸盐缓冲液 (ph6.0) 煮沸, 10 min 后重复 1 次, 加入一抗 (1 100) 孵育 1 h. 加辣根过 氧化物酶标记的二抗 (1 100) 孵育 20 min; PBS 洗 3 次, 加 SABC 工作液, DAB 显色, 最后苏木素 复染, 脱水 透明 封片, 光镜下观察. 实验数据用 mean±sd 表示. 用 Prism 软件包 ( 美国圣地亚哥 GraphPad 软件公司 ) 进行统计学分析. 组间差异用 Mann-Whitney U 检验或精确 c 2 检验. 相关性分析用 Spearmann 相 关性分析法. P <0.05 为差异具有统计学意义. ANP 组 2 结果分组假手术组 8 h 16 h 2.1 ANP 组血 清淀粉酶值在相应时间点均显著高于对照组, 且随时间推移, 其测定值逐渐增加. 开腹后肉眼 观察所见 : ANP 组大鼠腹腔内可见较多血性腹 水, 肠系膜 大网膜出现皂化斑, 胰腺可见充血 水肿 出血坏死灶及皂化斑, 病变以胰头 体 部为重, 结肠及小肠管壁充血水肿, 小肠色泽暗 红, 肠蠕动明显减少, 弹力减弱, 对照组大鼠腹 腔内无腹水, 胰腺和肠管未见明显异常改变. 肠 黏膜组织病理学评分见表 与假手术对照组相比, ANP 发生 8 h 后 99m Tc-DTPA 排泄率明显增加, 到 16 h 时, 其排泄率仍在增加, 提示肠黏膜通透性 增加 ( 表 2). 2.3 T L R2 m R N A P8 P16 TLR2 mrna 在假手术组表达水平较低, 而 ANP 图 1 对照组和 ANP 肠组织中 TLR2 mrna 的表达. 组 8 h 则开始明显增高 (P <0.05), 8 h 后仍继续升 高, 到 16 h 仍维持较高水平 ( 图 1). 2.4 ANPTLR2 将 所检测的 TLR2 的 mrna 表达量分别与肠黏膜的 病理学评分及通透性指数进行相关性分析, 结 果发现, TLR2 的表达水平分别与肠黏膜的病理 学评分 (r = 0.42, P <0.01) 和肠黏膜通透性指数 (r = 0.41, P <0.01) 明显相关 ( 图 2). 2.5 TLR2 Western blot 结果显示, 假手术组末端回肠组织 中, TLR2 蛋白的表达处于较低水平, 呈一条较淡 的灰色蛋白条带. 在 ANP 组中, TLR2 表达则明显 增加, 与前者相比, 灰度值间差别具有统计学意 义 (P <0.05), ANP 8 h 和 16 h 组间, TLR2 蛋白的表 达则无显著差别 (P >0.05, 图 3). 2.6 TLR2 应用免疫组化技术进行 假手术组和 ANP 大鼠末端回肠组织中 TLR2 的组 织学定位. 正常对照组仅在肠黏膜的表面有比 较弱的 TLR2 的表达. 与之相比, ANP 组的回肠黏 膜表面 黏膜固有层的 T B 淋巴细胞 单核细 胞 中性粒细胞 嗜酸性细胞 黏膜下层的动 静脉 纵形和环形肌层等处都有比较强的 TLR2 的表达. 至术后 16 h 上述细胞仍保持高表达 ( 图 4). 3 讨论 胰腺及胰周感染是 ANP 的严重并发症, 临床上 TLRs AP (ALI), TLRs ALI;, TRL2/4 ; TLRs A L I, A L I.

29 364 ISSN CN /R A ANP, ANP TLR2, TLR2 ANP B TLR2 mrna TLR2 mrna 图 2 TLR2 的 mrna 表达量. A B 图 3 Western blot 检测 TLR2 和 β-actin 在假手术组和 ANP 肠组织中的表达. β A B C 图 4 假手术组和 ANP 组织 TLR2 的表达 ( 免疫组织化学染色 200). ANP 患者的死亡主要是由于胰腺坏死组织继发感染所致 [7]. 胰腺感染主要是由移位的肠道细菌或毒素所致的肠源性感染. 在急性胰腺炎早期, 肠道是全身炎症反应的一个靶器官, 而发生的肠道屏障损害则成为肠道细菌移位的一个重要原因. 发生移位的细菌和内毒素进一步使循环中的细胞因子和炎症介质升高, 对全身各脏器造成再次损害, 形成所谓的 二次打击 [8-10], 即使程度并不严重, 也可引发不同程度全身炎症反应综合征 (SIRS), SIRS 过程中将会引起链式反应, 产生大量的炎症介质, 如肿瘤坏死因子 (TNF) IL-6 IL-8 IL-2 和白三烯等, 加重肠黏膜屏障损伤, 导致肠黏膜通透性继续增高, 如此形成恶性循环 [11-12]. 因此, 如何保护急性胰腺炎时的肠道屏障功能 降低肠黏膜通透性, 进而减少肠道细菌移位, 成为防治胰腺感染的重要 途径. TLRs 属于 Ⅰ 类跨膜受体, 广泛分布于单核巨噬细胞系统 内皮细胞 树突细胞 部分消化道上皮等 [13-14], 其配体包括肽聚糖 (PGN) 脂磷壁酸 (LTA) 和脂蛋白等, 是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁. 目前已发现人类的 TLR 有 11 位成员 (TLR1-11), 其中对 TLR4 和 TLR2 的研究最为广泛. TLR2 主要识别革兰氏阳性菌细胞壁成分. TLRs 的激活将引起一系列下游分子的活化, 最后激活通用转录因子 NF-κB, 最终引起以 TNF-a 等为中心的前炎症因子激活, 导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应 [15]. 因此, TLRs 的激活及引发的下游一系列信号分子活化可能是过度炎症反应造成肠黏膜屏障功能受损的关键点. 本试验结果显示 : 假手术组大鼠末端回肠

30 365 组织中仅有少量 TLR2 的表达, 而 ANP 时 TLR2 表达均明显上调, 且 TLR2 的表达与肠黏膜病理改变和通透性相关. 此结果提示 ANP 可引起末端回肠组织 TLR2 的表达的上调, TLR2 的过度表达 of microbial DNA in the blood. Pancreas 2003; 26: Arancibia SA, Beltrán CJ, Aguirre IM, Silva P, Peralta AL, Malinarich F, Hermoso MA. Toll-like receptors are key participants in innate immune responses. Biol Res 2007; 40: 可能参与了 ANP 的病理生理过程. ANP 时末端回肠组织 TLR2 表达上调的机制尚不清楚, 内毒素和 LPS 可能是重要的刺激因素之一. 急性胰腺炎 6 Park PO, Haglund U, Bulkley GB, Falt K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery 1990; 107: 时, 肠道屏障的损坏, 可使肠道内大量内毒素和 LPS 吸收入血, 从而诱导 TLR2 的表达. 有文献报道, 大量 LPS 存在时 TLR2 起着加速炎症反应的 7 Carnovale A, Rabitti PG, Manes G, Esposito P, Pacelli L, Uomo G. Mortality in acute pancreatitis: is it an early or a late event? JOP 2005; 6: Foitzik T. Pancreatitis and nutrition. Significance of the gastrointestinal tract and nutrition for septic 作用, 进一步诱导 TNF-α 产生, 而这些致炎因子 complications. Zentralbl Chir 2001; 126: Mole DJ, Taylor MA, McFerran NV, Diamond T. 也能增强 TLR2 mrna 表达 [12], 如此而形成恶性 The isolated perfused liver response to a 'second 循环, 加重器官损害. 因此, ANP 时, 对 TLR2 基因 hit' of portal endotoxin during severe acute pancreatitis. Pancreatology 2005; 5: 表达进行适当的调节, 可能为减轻肠屏障的损 10 Furuya T, Soeno T, Komatsu M. Strategy for bacterial translocation in acute pancreatitis. Nippon 害 防治肠源性感染提供新的思路. Shokakibyo Gakkai Zasshi 2004; 101: Theuer J, Dechend R, Muller DN, Park JK, Fiebeler 4 参考文献 A, Barta P, Ganten D, Haller H, Dietz R, Luft FC. 1 Angiotensin II induced inflammation in the kidney and in the heart of double transgenic rats. BMC NK-1R Cardiovasc Disord 2002; 2: ; 19: Wang Z, Castresana MR, Detmer K, Newman WH. 2 Takahashi Y, Fukushima J, Fukusato T, Shiga An IkappaB-alpha mutant inhibits cytokine gene J, Tanaka F, Imamura T, Fukayama M, Inoue expression and proliferation in human vascular T, Shimizu S, Mori S. Prevalence of ischemic smooth muscle cells. J Surg Res 2002; 102: enterocolitis in patients with acute pancreatitis. J 13 Frantz S, Kelly RA, Bourcier T. Role of TLR-2 in the Gastroenterol 2005; 40: activation of nuclear factor kappab by oxidative 3 Penalva JC, Martínez J, Laveda R, Esteban A, stress in cardiac myocytes. J Biol Chem 2001; 276: Muñoz C, Sáez J, Such J, Navarro S, Feu F, Sánchez Payá J, Pérez-Mateo M. A study of intestinal 14 Cario E, Rosenberg IM, Brandwein SL, Beck PL, permeability in relation to the inflammatory Reinecker HC, Podolsky DK. Lipopolysaccharide response and plasma endocab IgM levels in patients with acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol 2004; 38: activates distinct signaling pathways in intestinal epithelial cell lines expressing Toll-like receptors. J Immunol 2000; 164: Ammori BJ, Fitzgerald P, Hawkey P, McMahon MJ. The early increase in intestinal permeability and systemic endotoxin exposure in patients with severe acute pancreatitis is not associated with systemic bacterial translocation: molecular investigation 15 Yang RB, Mark MR, Gray A, Huang A, Xie MH, Zhang M, Goddard A, Wood WI, Gurney AL, Godowski PJ. Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling. Nature 1998; 395: (PAMP):. Toll ( P R R ). (LPS)., (LTA), RNA CpG.,.

31 ; 16(4): ISSN CN /R BASIC RESEARCH 小肠 CT 造影对比剂的优选 scanning. RESULTS: All the Beagles finished smallintestine CT enteroclysis. The enteric cavity widths were compared between pure milk, pure water and angiografin groups (F = , P < 0.01). There was no statistical significance in enteric cavity width between the pure water,,,.,,,.,. Optimization of contrast agents for small intestine computed tomography enteroclysis and angiografin groups, as well as in the thickness of intestinal wall between the three groups. The difference in CT value was ± 6.28 HU when the contrast coefficient for the enteric cavity and intestinal wall was the best in pure milk and pure water group.,, Fu-Zhen Song, Ying-Sheng Cheng, Yue-Qi Zhu, Pei-Rong Zhao, Jun-Gong Zhao, Bing-Hui Zhao Fu-Zhen Song, Ying-Sheng Cheng, Yue-Qi Zhu, Pei- Rong Zhao, Jun-Gong Zhao, Bing-Hui Zhao, Department of Radiology, Shanghai Sixth People s Hospital, Shanghai , China Correspondence to: Ying-Sheng Cheng, Department of Radiology, Shanghai Sixth People s Hospital, Shanghai , China. chengys@sh163.net Received: Revised: Abstract AIM: To evaluate which contrast agents can fully distend the intestinal canal and demonstrate the enteric cavity and intestinal wall in computed tomography (CT) enteroclysis. METHODS: After 8 healthy grown-up Beagles were anesthetized, a catheter was inserted to the Treitz ligament of duodenum, was injected through the veins, and different contrast agents including pure water and milk and 10 ml/l angiografin were infused through the catheter. After MSCT plain scanning, enhancement scanning was performed. Width of the enteric cavity and thickness of the intestinal wall measured through the transverse section and multi-planar reconstruction were statistically analyzed. Plain scanning of intestinal wall was performed. CT values, contrast coefficient of enteric cavity and intestinal wall density, and difference in enteric cavity and intestinal wall density were measured 20 s, 30 s, 40 s, and 50 s after enhancement CONCLUSION: Pure milk is an ideal contrast agent for small-intestine CT enteroclysis, which can fully distend the intestinal canal and demonstrate the enteric cavity and intestinal wall. Key Words: Contrast agent; Small-intestine computed tomography enteroclysis; Beagle Song FZ, Cheng YS, Zhu YQ, Zhao PR, Zhao JG, Zhao BH. Optimization of contrast agents for small intestine computed tomography enteroclysis. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : CT,. 方法 : 8,, 654-2, : 10 ml/l MSCT,.,,. 20 s 30 s 40 s 50 s CT,, CT. 结果 :, (F = , P <0.01),

32 367 ;,., 69.25±6.28 HU. DSA 机器及同级工作站, 导管 (6F Cordis) 及配套导丝 : 毕格犬适应性喂养 1 wk 后, 于实验前禁食 禁水 2 d, 分别于实验前 24 h 10 h 灌 结论 : CT, 200 ml/l 甘露醇 500 ml, 以清洁肠道. 麻醉后,, 在 DSA 透视下自犬口腔, 在导丝引导下, 将导管. 插至十二指肠屈氏韧带以下, iv ml, 2 min 后经导管注入对比剂纯水 480 ml, 注射速率 关键词 1.5 ml/s, 5 min 后进行螺旋 CT 平扫, 然后静脉注 射碘帕醇行 CT 增强扫描. 间隔 1 wk 后, 每条犬用 同样的方法注入对比剂纯牛奶 ( 脂肪含量 3.5%), 进行螺旋 CT 扫描成像. 再间隔 1 wk 后, 向每条犬 同法注入对比剂泛影葡胺 ( 浓度为 10 ml/l), 进 0 引言 行螺旋 CT 扫描成像. 小肠是胃肠道最长的器官, 因其走行弯曲, 肠管 : 犬取仰卧位, 应用 S i e m e n s 常互相重叠, 且小肠为空腔脏器, 生理情况下存 SOMATOM Sensation 16 螺旋 CT 检查, 扫描时应 在舒张和收缩状态 [1-3]. 为避免肠管收缩, 常服对 用 CARE DOSE 4D 智能剂量软件, 扫描范围从 比剂以充盈胃肠道, 形成良好的对比, 获得高质 膈顶至盆腔, 平扫后行 CT 增强扫描. 参数为 120 量的图像. 小肠检查时的肠道准备非常重要, 如 kv, 150 mas, 层厚 层距均为 2 mm, 球管旋转 果小肠内有食物残渣, 就会影响肠腔的充盈与 时间 0.5 s, 螺距为 1.0, 每周进床 12 mm, Kernel 系 扩张. 因此, 检查前尽量保证肠道的清洁度, 国 数 B31f smooth, FOV mm. 对比剂为 370 外学者大多运用插管法小肠灌肠进行肠道准 gi/l 碘帕醇 20 ml, 注射速率 1 ml/s, 分别于 20 备 [4]. 肠道清洁良好 肠腔充分扩张, 才能更好 s 30 s 40 s 50 s 进行扫描, 将数据传至工作 的观察肠腔内外及肠壁的情况. 影像新技术小 站后观察 分析图像, 并用多平面重建法 (MPR) 肠 CT 造影 (CT enteroclysis, CTE) 就是使用大剂 进行重建. 量对比剂充盈小肠肠腔, 进行 CT 平扫及增强扫 : 为便于测量计算, 本实验中将解 描, 将图像进行后处理, 使小肠肠腔 肠壁 壁 剖学上全部小肠分组进行合并后分为 3 组 : 第 1 外系膜 血管 后腹膜及腹内实质脏器全景式 组为十二指肠 ( 中上腹 ) 和上部空肠 ( 左上腹 ), 第 2 多方位显示出来 [5]. 小肠 CT 造影技术在临床上的 组为下部空肠 ( 左下腹 ) 和上部回肠 ( 中腹 ), 第 3 组 应用已不少见 [6-9], 逐渐成为诊断小肠疾病的重 为中部回肠 ( 右中腹 ) 和下部回肠 ( 中下腹 ), 分别 要手段 [10]. 使用合适的对比剂将小肠充分充盈扩 简称为第 组小肠. 张是小肠 CT 造影检查的关键所在. 本研究旨在 : 分别测量注入不同对比剂的每 初步探讨纯牛奶作为一种对比剂能够充分充盈 组小肠的肠腔宽度 肠壁厚度 ( 以 mean±sd 表 扩张肠腔, 更易于观察肠腔和肠壁的情况. 示 ), 分别进行组内 组间比较, 利用统计学分析 方法判断有无显著性差异. 分别测量平扫 增 1 材料和方法 强扫描后 20 s 30 s 40 s 50 s 时肠壁的 CT 值, 1.1 健康成年毕格犬 8 条, 体质量 kg, 计算肠腔与肠壁对比程度最好时, 肠腔与肠壁 雌雄不限, 由上海市第六人民医院实验动物中心 密度 CT 值差值范围. 最后由 2 名经验丰富的放射 提供. 纯水 ( 温白开水 ), 纯牛奶 ( 脂肪含量 3.5%, 上 科专科医师采用盲法阅片, 对小肠肠腔的充盈 海光明乳业股份有限公司 ), 10 ml/l 泛影葡胺 ( 上 扩张程度 肠壁结构的显示 肠壁密度及强化 海旭东海普药业有限公司生产 ), 碘帕醇 (Bracco, 程度的影像质量进行评估, 按照整段小肠的显 Italy 生产, 上海博莱科信谊药业有限责任公司包 示情况分别进行评分. 把整段小肠肠腔扩张的 装 ), 654-2( 山莨菪碱, 上海第一生化药业有限公 程度 <30% 30%-50% 50%-80% >80% 分别 司 ). 16 排螺旋 CT 机器 (SOMATOM Sensation 16, 记作 和 3 分 ; 肠壁结构的显示不满意为 0 德国西门子公司 ) 及同级工作站 (Volume Wizard), 分 满意为 1 分 ; 增强扫描后肠壁与肠腔的对比 CTEMSCT,,.,.

33 368 ISSN CN /R CTE,,,,. 表 1 注入三种对比剂后 3 组小肠的肠腔宽度和肠壁厚度 (mm) 分组 纯水牛奶泛影葡胺肠腔宽度肠壁厚度肠腔宽度肠壁厚度肠腔宽度肠壁厚度 表 2 肠腔与肠壁对比程度的 CT 值范围 (HU) 对比剂对比剂 CT 值肠壁平扫 20 s 30 s 40 s 50 s 表 3 三种对比剂的评分 程度差 一般 好分别记作 分 ( 每组对 比剂有 8 例实验对象 ). 各组数据以 mean±sd 表示, 用 SPSS11.0 统计软件, 采用方差分析 (F 检验 ), 分别 进行组间 组内比较, 具有显著性差异的标准 为 P < 结果 2.1 注入不同对比剂后, 肠腔 充盈扩张情况如图 1 所示. 由图像可看出, 在小 肠肠腔的充盈扩张程度及增强扫描后肠壁结构 的显示方面, 纯牛奶组优于纯水组, 且明显优于 泛影葡胺组. 2.2 在肠腔宽度之 间的比较上, 纯牛奶组与纯水组 泛影葡胺组 的差异有统计学意义 (F = , P <0.01), 纯水 组与泛影葡胺组无明显统计学差异 ; 在肠壁厚 度的比较上, 纯牛奶组与纯水组 泛影葡胺组 的差异无统计学意义, 纯水组与泛影葡胺组亦 无明显统计学差异 ( 表 1). 2.3 分别测量平扫 增强 后 20 s 30 s 40 s 50 s 时肠壁的 CT 值. 通过测 量 CT 值可知, 增强扫描 40 s 肠壁强化最明显 ; 观 肠腔充盈肠壁结构肠壁与肠腔察图像可知, 腔内对比剂为纯水及纯牛奶时, 肠对比剂扩张程度显示程度对比程度腔与肠壁对比程度最好 ( 图 1), 此时肠腔与肠壁 密度的差值为 69.25±6.28 HU. 而泛影葡胺为高 密度对比剂, 由于容积效应, 极易形成伪影, 平 扫时所测肠壁 CT 值高于纯水及纯牛奶组, 增强 扫描时肠壁 CT 值与肠腔内差异小, 肠壁显示效 果极差 ( 图 1, 表 2) 由 2 名经验丰富的放射科专科医师阅片后, 根据 评分可知, 纯牛奶在肠腔充盈扩张程度上, 优于 纯水及泛影葡胺 ; 在显示肠壁结构及其与肠腔 对比程度上, 纯牛奶与纯水相似 ; 泛影葡胺对肠 腔的充盈扩张尚可, 但在显示肠壁结构及其与 肠腔对比程度方面较差 ( 表 3). 3 讨论 小肠长度较长 走行弯曲, 随着呼吸及蠕动, 其 形态也在不断变化 [11]. 小肠肠管互相重叠, 空虚 状态下因其收缩性容易形成 假瘤征, 因而 小肠的检查比较复杂. 以往的常规钡剂造影检 查只能单纯的观察腔内结构及黏膜表现, 多层 螺旋 CT 具有扫描速度快 采集信息量大及强大 的图像后处理功能等优点, 能够比较完整的显 示肠腔内外的情况, 成为诊断肠道病变的一种 重要设备 [12-14]. 而小肠 CTE 就是把这二种检查方 法的优点结合起来 [15-19], 但只有在肠腔充分充盈 扩张时, 小肠腔内 黏膜 肠壁 邻近器官及

34 369 A1 A2 A3 B1 B2 B3 CT,,,. C1 C2 C3 图 1 注入不同对比剂小肠 CT 造影图像. 周围组织结构才能显示良好, 才更易发现病变. 小肠 CTE 检查技术的关键是用合适的对比剂将小肠充分充盈扩张 [20]. 因此, 选择能充分扩张肠管 不形成伪影而且对人体无害, 与肠壁的对比度良好的对比剂非常重要. 目前常用的阳性对比剂主要是泛影葡胺 硫酸钡的混悬液, 以泛影葡胺应用最多, 但伪影较重, 由于容积效应, 肠壁结构常常显示不清楚 [21-22] ; 而且增强扫描时, 肠腔内与肠壁 CT 值相仿, 对比程度较差, 不易发现病变. 中性对比剂水的应用较为广泛, 他可以增加肠腔与肠壁间的对比, 使腔内及黏膜显影, 而且经济 便捷, 易被患者接受, 但其常常快速通过肠道, 导致肠腔扩张较差, 充盈不均. 张联合 et al 报道, 用等渗甘露醇作为口服对比剂行小肠 CT 检查 [23], 肠腔充盈尚可, 但会引起腹泻. 植物油乳剂属于阴性对比剂, 但其脂肪含量太高 (12.5%), 患者常常难以耐受, 且价格较高, 临床上几乎没有应用. 国外 Hebert et al [24] 将聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 作为口服对比剂应用于腹盆部的 CT 检查, 与水 纤维素溶液及碘水溶液对比, 在肠壁的显示 肠腔的 扩张以及肠道的充盈方面, 均取得了良好的效 果. Doerfler et al [25] 应用新型口服阴性对比剂 Mucofalk 来诊断小肠 Crohn 病, 效果尚可. 国内报 [26-28] 道把脂肪对比剂应用于胃肠道, 提高了胃肠 道疾病的检出率. Thompson et al [29] 已经报道用牛奶作为胃 肠道对比剂, 他们的研究证明牛奶优于水 钡剂悬浮液等. 由于脂肪含量的差异, 纯牛奶 (whole milk, 脂肪含量 4%) 优于脱脂或低 / 减脂 牛奶. 纯牛奶脂肪含量不高, 患者耐受性好, 一 般无不良反应出现, 此外牛奶中含有的脂肪能 够减慢胃肠蠕动, 使肠腔充分充盈, 是较理想的 肠道对比剂 在芝加哥召开的 RSNA 年 会上, 纽约 St Luke's-Roosevelt Hospital 的研究 员们提出 [30], 在肠腔扩张及肠壁强化方面, 牛奶 和 VoLumen( 不含甘露醇, 是一种硫酸钡的混悬 液 ) 有相似的作用, 而在患者耐受性 口感 来 源 价格等方面, 牛奶明显优于 VoLumen, 他们 的实验证明牛奶是较优的对比剂. 刘智明 et al [31] 报道把纯牛奶作为口服低密度对比剂用于腹部 螺旋 CT 增强扫描中, 明显提高了对腹部淋巴结 的检出率.

35 370 ISSN CN /R 通过本实验可知, 纯水与纯牛奶对肠壁结构 C T (CTE): 的显示及对周围图像的影响无明显差异, 但在 肠腔充盈扩张方面, 纯牛奶明显优于纯水, 而扫, CT 描后进行的 MPR 重建, 能更立体直观地观察肠, 腔充盈扩张情况. 泛影葡胺对肠腔的充盈扩张, 尚可, 但其密度较高, 由于容积效应, 常常掩盖 肠壁结构, 显示不清楚 ; 尤其增强扫描后, 肠腔 内与肠壁 CT 值相仿, 不能形成良好的对比, 肠壁. 显示效果极差 ; 纯牛奶组肠壁结构显示效果好, 对周围结构无影响, 且增强扫描后, 肠腔内与肠 壁形成明显的对比, 易于观察肠腔内外 肠壁 及周围结构. 不同密度的肠腔对比剂对肠壁显 示的效果不同, 本实验通过测量 CT 值可知, 增强 扫描 40 s 时, 毕格犬肠壁强化最明显 ; 观察分析 图像可知, 腔内对比剂为纯水及牛奶时, 肠腔与 肠壁对比程度最好, 此时肠腔与肠壁密度的差 值约为 69.25±6.28 HU. 本实验选用的纯牛奶 ( 脂肪含量 3.5%), 与 植物油乳剂相比, 既可增加患者的耐受性, 又可 有效的减慢肠道蠕动, 从而使对比剂缓慢通过 消化道, 产生良好的肠腔内外 邻近器官及与 周围结构的对比, 而在患者耐受性 口感 来 源 价格等方面, 纯牛奶亦明显优于其他对比 剂, 因此是一种比较合适的小肠 CTE 对比剂. 本实验对插管技术要求较高, 导管到达合适 的位置, 才能够使小肠充分充盈扩张, 但插管属 于侵入性的有创检查, 同时 CT 扫描时患者会受 到辐射 [32], 而且部分患者可能对牛奶过敏. 另外, 毕格犬为标准实验动物, 价格较昂贵. 4 参考文献 1 Rogalla P. CT of the small intestine. Eur Radiol 2005; 15 Suppl 4: D142-D148 2 Laghi A, Paolantonio P, Passariello R. Small bowel. Magn Reson Imaging Clin N Am 2005; 13: Kerr JM. Small bowel imaging: CT enteroclysis or barium enteroclysis? Critically appraised topic. Abdom Imaging 2008; 33: Boudiaf M, Jaff A, Soyer P, Bouhnik Y, Hamzi L, Rymer R. Small-bowel diseases: prospective evaluation of multi-detector row helical CT enteroclysis in 107 consecutive patients. Radiology 2004; 233: Denys A. CT enteroclysis: technique and clinical applications. Eur Radiol 2006; 16: Schmidt S, Felley C, Vuilleumier H, Schnyder P, Denys A. CT-enteroclysis. Rev Med Suisse 2006; 2: Patak MA, Mortele KJ, Ros PR. Multidetector row CT of the small bowel. Radiol Clin North Am 2005; 43: , viii 12 Burkill G, Bell J, Healy J. Small bowel obstruction: the role of computed tomography in its diagnosis and management with reference to other imaging modalities. Eur Radiol 2001; 11: Leschka S, Alkadhi H, Wildermuth S, Marincek B. Multi-detector computed tomography of acute abdomen. Eur Radiol 2005; 15: Cahir JG, Freeman AH, Courtney HM. Multislice CT of the abdomen. Br J Radiol 2004; 77 Spec No 1: S64-S73 15 Horton KM, Fishman EK. The current status of multidetector row CT and three-dimensional imaging of the small bowel. Radiol Clin North Am 2003; 41: Maglinte DD, Bender GN, Heitkamp DE, Lappas JC, Kelvin FM. Multidetector-row helical CT enteroclysis. Radiol Clin North Am 2003; 41: La Seta F, Buccellato A, Tesè L, Biscaldi E, Rollandi GA, Barbiera F, Cappabianca S, Di Mizio R, Grassi R. Multidetector-row CT enteroclysis: indications and clinical applications. Radiol Med (Torino) 2006; 111: Parrish FJ. Small bowel CT-enteroclysis: technique, pitfalls and pictorial review. Australas Radiol 2006; 50: Di Mizio R, Rollandi GA, Bellomi M, Meloni GB, Cappabianca S, Grassi R. Multidetector-row helical CT enteroclysis. Radiol Med (Torino) 2006; 111: Reittner P, Goritschnig T, Petritsch W, Doerfler O, Preidler KW, Hinterleitner T, Szolar DH. Multiplanar spiral CT enterography in patients with Crohn's disease using a negative oral contrast material: initial results of a noninvasive imaging approach. Eur Radiol 2002; 12: Ramsay DW, Markham DH, Morgan B, Rodgers PM, Liddicoat AJ. The use of dilute Calogen as a fat density oral contrast medium in upper abdominal computed tomography, compared with the use of water and positive oral contrast media. Clin Radiol 2001; 56: MDCT 2005; 11: Zhang LH, Zhang SZ, Hu HJ, Gao M, Zhang M, Cao Q, Zhang QW. Multi-detector CT enterography with iso-osmotic mannitol as oral contrast for detecting small bowel disease. World J Gastroenterol 2005; 11: Hebert J.J, Taylor A.J, Winter T.C,., 2006: 7 CT 6 Maglinte DD, Sandrasegaran K, Lappas JC. CT 2006; 4: 7 enteroclysis: techniques and applications. Radiol 25 Doerfler OC, Ruppert-Kohlmayr AJ, Reittner P, Clin North Am 2007; 45: Hinterleitner T, Petritsch W, Szolar DH. Helical CT 7 Rajesh A, Maglinte DD. Multislice CT enteroclysis: technique and clinical applications. Clin Radiol 2006; 61: of the small bowel with an alternative oral contrast material in patients with Crohn disease. Abdom Imaging 2003; 28: Kermarrec E, Barbary C, Corby S, Béot S, Laurent V, Regent D. CT enteroclysis: a pictorial essay. J Radiol 2007; 88: CT 2005; 24: Schmidt S, Felley C, Meuwly JY, Schnyder P, 27

36 371 CT 30 Mitka M. Milk shows potential as CT contrast 2001; 17: agent. JAMA 2007; 297: CT CT, 2005; 21: ; 11: Thompson SE, Raptopoulos V, Sheiman RL, McNicholas MM, Prassopoulos P. Abdominal helical CT: milk as a low-attenuation oral contrast agent. Radiology 1999; 211: Hong SS, Kim AY, Byun JH, Won HJ, Kim PN, Lee MG, Ha HK. MDCT of small-bowel disease: value of 3D imaging. AJR Am J Roentgenol 2006; 187: ,. ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 世界华人消化杂志 为中国科技核心期刊 2003 年百种中国杰出学术期刊 中文核心期刊要目总览 2004 年版内科学类的核心期刊 中国科技论文统计源期刊, 世界华人消化杂志 发表的英文摘要被美国 化学文摘 (Chemical Abstracts), 荷兰 医学文摘库 / 医学文摘 (EMBASE/Excerpta Medica), 俄罗斯 文摘杂志 (Abstracts Journals) 收录. 世界华人消化杂志 报道消化疾病的评论及临床和基础研究, 包括消化肿瘤学 消化感染病学 消化内科学 消化外科学 消化内镜学 消化影像学 消化介入治疗学 消化中医药 中西医结合学 消化基础研究 消化病理学 消化循证医学等内容. 世界华人消化杂志 2008 年由北京报刊发行局发行, 国际标准刊号 ISSN , 国内统一刊号 CN /R, 邮发代号 , 出版日期每月 8, 18, 28 日, 月价 72.00, 年价 864 元. 欢迎广大消化科医务工作者及科教研人员 各大图书馆订阅. 联系地址 : , 北京市 2345 信箱. 联系电话 : ; 传真 : ; wcjd@wjgnet.com;

37 ; 16(4): ISSN CN /R BASIC RESEARCH PAF 对肠上皮细胞紧密连接的影响及 ITF 的保护作用 ent concentrations of PAF (0, 50, 100 and ng/l) for 24 hours until they became fused. The protective effect of ITF was observed. ritf (0.3 M S O F g/l) was treated 30 minutes before (prevention, group) and after PAF (treat proup) was given and cells were incubated for 24 hours. MTT was, used to detect cell vigor. Epithelial monolayer permeability was measured by trans-epithelial. electrical resistance (TER) and mucosal to serosal flux of paracellular marker luminal yellow., RT-PCR was used to detect mrna expression of ZO-1 and Occludin. Indirect immunofluorescence was used to localize ZO-1 and Occludin.. Effect of platelet-activating factor on tight junction in intestinal epithelial cells and protective effect of intestinal trefoil factor Ling-Fen Xu, Ya-Luo Dong, Mei Sun, Li Ma, Zhi-Qin Mao Ling-Fen Xu, Mei Sun, Zhi-Qin Mao, Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital (Shengjing Hospital) of China Medical University, Shenyang , Liaoning Province, China Ya-Luo Dong, Department of Clinical Epidemiology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang , Liaoning Province, China Li Ma, Department of Infectious Diseases Laboratory, the Second Affiliated Hospital (Shengjing Hospital) of China Medical University, Shenyang , Liaoning Province, China Supported by: the Applied Basic Research Program of the Education Commission Foundation of Liaoning Province, No Correspondence to: Mei Sun, Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital (Shengjing Hospital) of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang , Liaoning Province, China. sunm@cum2h.com Received: Revised: Abstract AIM: To explore whether platelet-activating factor (PAF) can disrupt the intestinal epithelial barrier and is associated with tight junction, and to observe the protective effect of intestinal trefoil factor (ITF). METHODS: Caco-2 cells were cultured with,, RPMI 1640 containing 15% fetal bovine serum for 7 days. Cells were then treated with differ- RESULTS: PAF had no effect on the Caco-2 s vigor and proliferation. Different concentrations of PAF increased the intestinal epithelial paracellular permeability. TER decreased and luminal yellow flux increased. Treatment and prevention group of ritf partially recovered the increased permeability (122.2 ± 14.7, ± 10.9 vs ± 26.4, P < 0.05; ± 556.2, ± vs ± 693.5, P < 0.05). RT-PCR demonstrated that the mrna expression of ZO-1 and Occludin in PAF groups treated with different concentrations (especilly 100 ng/l) for 24 hours was significantly different from that in the prevention group (1.07 ± 0.05 vs 1.28 ± 0.06, 0.81 ± 0.06 vs 1.13 ± 0.07, P < 0.05). However, treatment of ritf did not change the expression of mrna. In the control Caco-2 monolayers, ZO-1 and Occludin proteins were localized at the apical cellular junctions and appeared as continuous belt-like structures encircling the cells at the cellular borders. PAF caused a progressive disturbance in the continuity of ZO-1 and Occludin localization at the cellular borders characterized by zig-zagging appearance at points of multiple cellular contact. ritf could partially recover the disrupted distribution of ZO-1 and Occludin proteins. CONCLUSION: PAF disrupts the intestinal epithelial barrier. Its mechanism may be correlated to the decreased expression of ZO-1 and Occludin proteins, which can be partially recovered after treatment of ritf.

38 373 Key Words: Tight junction; Platelet-activating factor; Intestinal trefoil factor; Trans-epithelial electrical resistance; ZO-1; Occludin; MTT; Trans-epithelial electrical resistance; RT-PCR Xu LF, Dong YL, Sun M, Ma L, Mao ZQ. Effect of plateletactivating factor on tight junction in intestinal epithelial cells and protective effect of intestinal trefoil factor. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : (PAF), (ITF). 方法 : Caco-2, : ; : PAF, 50 ng/l 100 ng/l 200 ng/l; ITF: ITF0.3 g/l, 30 minpaf 100 ng/l; ITF: PAF 100 ng/l, 30 minitf0.3 g/l, 24 h. MTT; TER ; RT-PCR ZO-1Occludin mrna; ZO-1Occludin. 结果 : PAF. PAF 24 h,, (TER),. ITF TER (122.2±14.7, 100.3±10.9 vs 210.3±26.4, P <0.05), ( ±556.2, ±364.9 vs ±693.5, P <0.05),. PAF, ZO-1Occludin mrna, 100 ng/l, ITF(1.28±0.06 vs 1.07±0.05, 1.13±0.07 vs 0.81±0.06, P <0.05), ITF. ZO-1Occludin. PAF, ZO-1Occludin, ITF,. 结论 : PAF, ; ITF,. PA F, PAF 0 引言 肠黏膜屏障的破坏在儿科急慢性疾病的发生发 展中具有显著的意义 [1-4]. PAF : 急性期, 细菌移位可引 起败血症及多器官功能衰竭, 而婴儿时期的肠 黏膜屏障破坏将会成为随后产生的部分变应性 疾病的始发因素, 如 : 湿疹, 食物过敏, 腹部肠病,. 1 型糖尿病, 哮喘, 炎症性肠病及孤独症等. 而肠 黏膜通透性的升高是早期和主要的病理生理基 础. 紧密连接作为细胞间通路最主要的屏障直 接影响肠黏膜屏障的通透性 [5-6]. 血小板活化因子 (PAF) 是一种内源性脂性 介质, 目前被认为是一种独特的细胞因子, 具有 广泛的生物学特性, 研究认为 [7] PAF 在诸多参与 胃肠黏膜损害的炎症介质中可能起到 中心放 大 的介导作用. 动物实验也注意到 PAF 可引起 肠黏膜通透性的增高 [8]. 已有实验证实 [9], 用 PAF 和 LPS 引起的坏死性小肠结肠炎的改变相似, 用 PAF 受体拮抗剂可明显减轻 LPS 所致的肠坏死 [10]. 但其机制是否与紧密连接的破坏相关尚无报道. 肠三叶因子 (ITF) 属三叶肽家族, 因其对胃 肠道黏膜屏障有重要保护和修复作用而受到越 来越多的关注. 大量的动物实验证明 [11-13] ITF 在维持 肠上皮细胞的完整性, 恢复肠黏膜的正常通透 性方面起到重要作用. 本研究试图在细胞水平 观察 ITF 对紧密连接的保护作用从而为临床应 用提供依据. 1 材料和方法 1.1 人结肠腺癌细胞株 (Caco-2) 购于中国科 学院上海细胞所 ; RPMI 1640 培养基 胰酶和胎 牛血清 (fatal bovine serum, FBS) 购自 Gibco 公司 ; PAF 荧光黄购自 Sigma 公司 ; ZO-1 Occludin 单抗 异硫氰酸荧光素 (fluorescinisothiocyate, FITC) 标记羊抗兔 IgG 购自 Zymed 公司 ; ritf( 基 因重组肠三叶因子 ) 由北京大学蛋白质工程及 植物基因工程国家重点实验室提供 ; M T T 和 DMSO 为 AMRECO 产品 ; transwell 购自美国 Corning 公司 ; 电阻仪购自美国 Millipore 公司 ; RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ; 引物也由该公 关键词 司合成 : Caco-2 细胞常规培

39 374 ISSN CN /R 表 1 不同浓度 PAF 刺激后 Caco-2 细胞 MTT 比色结果 PAF TER, 每个 transwell 测定 3 个不同位置, 记录电阻值 (Ω/cm 2 ). 按照实验分组于 transwell 底层小室加, PA F PAF 给药入 PAF 及 ITF, 加药后 24 h 分别测电阻. 荧光黄测 LPS 分组 A 值 P 值 浓度 (ng/l) 定 : 加药后 24 h, 细胞用 HBSS(pH7.4) 小心冲洗 3, PAF 次, 37 孵育 30 min, 吸净孔内的 HBSS 以防止干 LPS 扰 ; 在 transwell 顶端加入 80 mg/l 荧光黄, 37 孵. 育 1 h 后收集基底侧液体, 4 避光保存, 用荧光 I T F 分光光度计测定荧光黄浓度 ( 激发波长 427 nm, Claudin-1 Claudin-2 发射波长 536 nm) ZO-1Occludin mrna. : 于 50 ml 细胞培养瓶中培养细胞至接近 融合时换无血清培养液, 按照实验分组加入 PAF 及 ITF, 24 h 后收集细胞. TRIzol 提取总 RNA, 行 养, 培养液为 RPMI 1640 培养基, 含 150 ml/l 进 口胎牛血清, 10 ml/l 青链霉素双抗液, 通入 50 ml/l CO 2( 相对湿度 90%), 置 37 培养箱, 传代 后在细胞生长达到各项实验要求时进行实验, 每项实验均选取 3 组非同代细胞进行 : 分别设正常对照组 实验组 ( 含 模型对照组 ) ITF 预防组 ITF 治疗组. 正常对 照组 : 不加刺激物及干预因素. 实验组 : 加入 PAF, 终浓度分别为 50 ng/l 100 ng/l 和 200 ng/l, 并把终 浓度 100 ng/l 的组作为模型对照组, 刺激 24 h. ITF 预防组 : 先加入 ITF 0.3 g/l, 30 min 后加入 PAF 100 ng/l, 24 h 后进行实验. ITF 治疗组 : 先加入 PAF 100 ng/l, 30 min 后加入 ITF 0.3 g/l, 24 h 后进 行实验 (MTT): 取对数生 长期 Caco-2 细胞, 消化后加入一定量的培养液, 制成细胞悬液, 按密度为 5000 细胞 /(100 μl 孔 ) 接种在 96 孔板, 通入 50 ml/l CO 2 ( 相对湿度 90%), 置 37 培养箱中进行培养. 24 h 细胞贴壁融合 后, 换无血清培养液, 加入不同浓度 PAF(0, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120 ng/l), 每个 浓度设 4 个复孔继续培养 24 h, 加入 5 g/l MTT 20 μl/ 孔, 继续培养 4 h, 吸去培养液, 加入 150 μl/ 孔 DMSO, 振荡 10 min, 用酶标仪在 492 nm 处测定 吸光度 : 跨上皮电阻 (TER) 的测定 : 肠上皮细胞 C a c o-2 以 10 5 /c m 2 接种于 transwell 的顶层小室微孔膜上 ( 直径 6.5 mm, 孔 径大小 0.4 mm) 培养, 待细胞长至融合, 形成致密 的单层屏障后开始实验 (10-14 d). 先将培养液换 成无血清培养液平衡 0.5 h, 然后用电阻仪测定 RT-PCR 反应, 反应条件 : 94 2 min; s; s; s, 32 个循环. 扩增产物经琼 脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察 RT-PCR 产物并拍 照, 用 Kodak ID 型凝胶成像系统输入计算机, 以 该软件进行扩增产物的半定量分析. ZO-1 引物 : 上游 : 5'-AGCCTGCAAAGCCAGCTCA-3', 下游 : 5'-AGTGGCCTGGATGGGTTCATAG-3'; 扩增片 段 131 bp. Occludin 引物 : 上游 : 5'-AAGAGTTGA CAGTCCCATGGCATAC-3', 下游 : 5'-ATCCACA GGCGAAGTTAATGGAAG-3'; 扩增片段 133 bp. GAPDH 引物 : 上游 : 5'-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3', 下游 : 5'-ATGGTGGTGAAGACGCC AGT-3'; 扩增片段 142 bp ZO-1Occludin : 置盖玻片于六孔板中接种细胞爬片生长至 融合, 换无血清培养液, 按照实验分组加入 PAF 及 ITF, 刺激 24 h. 弃培养液, PBS 洗涤, 40 g/l 多 聚甲醛固定, 0.5% Triton X-100 打孔, 10% BSA 封闭, 加一抗 4 过夜 (1 50), 加二抗 (1 100) 避 光染色 2 h 后甘油封片, 用荧光显微镜观察并拍照. 所有实验均重复 3 次以上, 结 果用 mean±sd 表示, 统计由 SPSS12.0 软件完成. 采用 One-Way ANOVA 法比较总体和组间差异, P <0.05 为有显著差异. 2 结果 2.1 PAF MTT 还原物甲攒是 细胞能量代谢的反映, 其生成量随细胞数的增 多而增加. 由表 1 可以看出, 即使大剂量的 PAF 也 未影响到细胞的增殖和细胞活力, 各加药浓度 与对照组相比无显著性差异. 2.2 PAFCaco-2ITF 各浓度 PAF 作用 24 h 后, TER 出现下

40 375 A B C 图 1 RT-PCR 电泳结果. 3 讨论 肠黏膜屏障包括肠上皮细胞屏障 免疫屏障和 表 2 PAF 作用后 Caco-2 单层细胞通透性的变化 微生物屏障, 肠上皮细胞屏障是最重要的一道 屏障, 是肠黏膜屏障具有选择性通透的基础. 目 前研究发现肠上皮细胞屏障通透性增高参与多 TER 下降值荧光黄透过量分组种疾病的发生, 如 : 炎症性肠病 [14] (Ω/cm 脓毒血症 2 ) (mg/l) 烧伤 终末期肝病 重症胰腺炎等. 而他在儿 科急慢性疾病的发生发展中所具有的显著意义 使得肠黏膜屏障功能及其完整性这一课题在儿 科领域也受到越来越多的关注. 正常情况下肠上皮细胞细胞旁间隙是由 连接复合体封闭的, 其中最重要的是紧密连接 (tight junction, TJ). 紧密连接由多种紧密连 降, 荧光黄透过增加. 给予 ITF 可明显提高 TER, 减少荧光黄透过. 预防组作用更明显 ( 表 2). 2.3 ZO-1Occludin mrnapaf 作用后, ZO-1 和 Occludin mrna 表达均有下降, 以 100 ng/l 组改变最为明显. ITF 预防组表达增加, ITF 治疗组改变不明显 ( 表 3, 图 1). 2.4 ZO-1Occludin 正常对照组上皮细胞 ZO-1 主要分布在细胞内近胞膜处, 排列紧密, 边缘光滑, 勾勒出内皮细胞典型的铺路石形状, 细胞间连接紧密, 无明显间隙. 小浓度 PAF(50 ng/l) 作用后, ZO-1 边缘粗糙呈锯齿状, 连接处可见 蜂窝 状改变. 随 PAF 浓度加大 (100 ng/l) 改变更加明显, 细胞间出现间隙, ZO-1 环断裂, 甚至崩解. 但 PAF 浓度继续加大, 改变并未继续加重. 预防性给予 ITF 后, 可明显减轻 ZO-1 的破坏, 边缘变得连续, 但没有完全恢复. ITF 治疗组改变较预防组重. Occlud i n 表达位置和变化规律与 Z O-1 基本一致 ( 图 2-3). 表 3 PAF 作用后 ZO-1 和 Occludin mrna 表达 分组 ZO-1 Occludin 接蛋白分子组成, 包括跨膜蛋白 O c c l u d i n Claudins 连接黏附分子 (junctional adhesion molecule, JAM) 和胞质附着蛋白 ZOs AF6 7H6 等. Occludin 是最先分离出来的 TJ 跨膜蛋 白 [15], 分子质量为 65 kda, 形成两个细胞外环和一 个短的细胞内环. 免疫电镜显示 Occludin 定位在 TJ 上 [16-18], 是 TJ 的主要功能蛋白, 对于屏障功能 的维持和紧密连接的完整性具有重要作用. 有 研究表明用 Occludin 转染 L- 纤维母细胞 ( 缺乏 TJ) 后, 相邻细胞之间可以形成 TJ 样结构 [19]. ZOs 是 一种外周膜蛋白, 有三种异构体即 ZO-1, ZO-2 和 ZO-3, 含有 PDZ 等保守序列. 这些保守序列能够 与细胞质内的其他蛋白如 Occludins 蛋白的 C 末 端连接, 而 ZO-1 的 C 末端则可结合肌动蛋白和应 力纤维, 从而将 Occludin 蛋白和肌动蛋白骨架系 统连接在一起, 构成稳定的连接系统. ZO-1 的 N 末端可直接与 α2 连锁蛋白 (catenin) 或细胞质 E- 钙黏连素结合, 介导紧密连接的开启和闭合 [20-25]. 因此, Occludin 和 ZO-1 蛋白对维持 TJ 的正常结构 和功能具有重要意义. 既往研究发现 PAF 可激活巨噬细胞和中性

41 376 ISSN CN /R A PA F, ITF. B C D E 图 2 药物作用 24 h 后 ZO-1 表达情况. A B C D E 图 3 药物作用 24 h 后 Occludin 表达情况. 粒细胞, 促进其黏附到血管内皮细胞, 释放氧自由基和蛋白水解酶, 破坏内皮细胞的形态和功能. 在血栓形成 休克 过敏性哮喘 内毒素血症和肠道坏死中均起重要作用 [26], 但 PAF 是否可以直接破坏紧密连接而引起肠上皮屏障破坏 肠通透性增高尚不清楚. Caco-2 细胞来源于人的直肠癌, 在细胞培养条件下, 可融合并分化为肠上皮细胞, 形成连续的单层, 细胞亚显微结构研究表明, Caco-2 细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似, 具有相同的细胞极性和紧密连接, 是国际上公认的研究紧密连接和药物小肠吸收的体外模型 [27].

42 377 本实验应用 Caco-2 细胞构建肠黏膜屏障的体外模型, 观察 PAF 破坏肠黏膜屏障的机制, 发 2006; 14: (ITF): 11 Renes IB, Verburg M, Van Nispen DJ, Buller, 现给予不同浓度的 PAF, 在不影响细胞活力的情 HA, Dekker J, Einerhand AW. Distinct epithelial responses in experimental colitis: implications for 况下, 已经引起了 TER 的降低及肠屏障通透性的 ion uptake and mucosal protection. Am J Physiol, 升高, 而且这种改变具有一定的剂量依赖性, 在 Gastrointest Liver Physiol 2002; 283: G169-G PAF 浓度为 100 ng/l 时最强, 研究认为 PAF 通过 8, PAF 受体起作用, 考虑这种浓度依赖性与受体饱 2003; 6: 和性有关. 进一步的研究发现构成紧密连接最重要的两个蛋白 - 膜周边蛋白 ZO-1 和跨膜蛋白 13, 2006; 8: Occludin 在基因和蛋白水平上均发生了改变, 推 14. TNF-α. 测 PAF 可以通过影响紧密连接蛋白的表达而影响肠上皮屏障. ITF 在肠道的自我保护和损伤后修复中占 2007; 15: Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol 1993; 123: 有重要地位, 其机制涉及促进细胞迁移 增殖 16 Hirase T, Staddon JM, Saitou M, Ando-Akatsuka Y, Itoh M, Furuse M, Fujimoto K, Tsukita S, Rubin LL. 和抗凋亡等作用. 近期研究发现, ITF 高表达的细 Occludin as a possible determinant of tight junction 胞, 其 TER 明显增高, 肠通透性降低 [28]. 本实验也 permeability in endothelial cells. J Cell Sci 1997; 110 : 证明 ITF 可以通过影响紧密连接蛋白的表达而 17 Saitou M, Ando-Akatsuka Y, Itoh M, Furuse M, 恢复紧密连接的结构, 恢复正常的肠屏障结构, Inazawa J, Fujimoto K, Tsukita S. Mammalian 从而发挥其保护作用. occludin in epithelial cells: its expression and subcellular distribution. Eur J Cell Biol 1997; 73: 参考文献 18 Fujimoto K. Freeze-fracture replica electron 1 Macintire DK, Bellhorn TL. Bacterial translocation: clinical implications and prevention. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2002; 32: microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling 2 Lichtman SM. Bacterial [correction of baterial] translocation in humans. J Pediatr Gastroenterol Nutr of intercellular junctional complexes. J Cell Sci 1995; 108: ; 33: Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S. 3 Farhadi A, Banan A, Fields J, Keshavarzian A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. J Gastroenterol Hepatol 2003; 18: Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol 1998; 141: Berkes J, Viswanathan VK, Savkovic SD, Hecht G. Intestinal epithelial responses to enteric pathogens: effects on the tight junction barrier, ion transport, 20 Citi S, Sabanay H, Jakes R, Geiger B, Kendrick-Jones J. Cingulin, a new peripheral component of tight junctions. Nature 1988; 333: and inflammation. Gut 2003; 52: Keon BH, Schäfer S, Kuhn C, Grund C, Franke WW. 5 Cereijido M, Contreras RG, Flores-Bentez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz A, Shoshani L. Symplekin, a novel type of tight junction plaque protein. J Cell Biol 1996; 134: New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med Res 2007; 38: Zhong Y, Saitoh T, Minase T, Sawada N, Enomoto K, Mori M. Monoclonal antibody 7H6 reacts with 6 Gonzalez-Mariscal L, Betanzos A, Nava P, Jaramillo BE. Tight junction proteins. Prog Biophys Mol Biol 2003; 81: 1-44 a novel tight junction-associated protein distinct from ZO-1, cingulin and ZO-2. J Cell Biol 1993; 120: Kalia N, Bardhan KD, Reed MW, Jacob S, Brown NJ. Mechanisms of Helicobacter pylori-induced rat gastric mucosal microcirculatory disturbances in vivo. Dig Dis Sci 2000; 45: Weber E, Berta G, Tousson A, St John P, Green MW, Gopalokrishnan U, Jilling T, Sorscher EJ, Elton TS, Abrahamson DR. Expression and polarized targeting of a rab3 isoform in epithelial cells. J Cell 8 Tan XD, Chang H, Qu XW, Caplan M, Gonzalez- Biol 1994; 125: Crussi F, Hsueh W. Platelet-activating factor increases mucosal permeability in rat intestine via tyrosine phosphorylation of E-cadherin. Br J Pharmacol 2000; 129: Yamamoto T, Harada N, Kano K, Taya S, Canaani E, Matsuura Y, Mizoguchi A, Ide C, Kaibuchi K. The Ras target AF-6 interacts with ZO-1 and serves as a peripheral component of tight junctions in epithelial 9 Ewer AK, Al-Salti W, Coney AM, Marshall JM, cells. J Cell Biol 1997; 139: Ramani P, Booth IW. The role of platelet activating factor in a neonatal piglet model of necrotising enterocolitis. Gut 2004; 53: Izumi Y, Hirose T, Tamai Y, Hirai S, Nagashima Y, Fujimoto T, Tabuse Y, Kemphues KJ, Ohno S. An atypical PKC directly associates and colocalizes 10 at the epithelial tight junction with ASIP, a mammalian homologue of Caenorhabditis elegans

43 378 ISSN CN /R polarity protein PAR-3. J Cell Biol 1998; 143: Rabinovici R, Yue TL, Farhat M, Smith EF 3rd, Esser KM, Slivjak M, Feuerstein G. Platelet activating factor (PAF) and tumor necrosis factor-alpha (TNF alpha) interactions in endotoxemic shock: studiwith BN 50739, a novel PAF antagonist. J Pharmacol Exp Ther 1990; 255: A r t u r s s o n P, P a l m K, L u t h m a n K. C a c o - 2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Adv Drug Deliv Rev 2001; 46: Meyer zum Büschenfelde D, Tauber R, Huber O. TFF3-peptide increases transepithelial resistance in epithelial cells by modulating claudin-1 and -2 expression. Peptides 2006; 27: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 编读往来 尊敬的马连生教授 : 今天我收到贵刊 生物医学核心指南, 恰好有时间, 就拜读了其中的几篇文章, 令人感触很深. 在如今改革开放的时代里, 虽然已革命了三十年, 但固守的 陈腐的 甚至是落后的东西还很多, 在现象上, 似乎人人都在崇尚革新与新的事物, 但一旦落到自己头上, 或者触碰到自己的利益, 往往是激烈的反对者. 作为医学事业的创新喉舌 医学期刊, 是反映当代医学科研创新成果主要途径, 本来就是纯自然的东西, 但因为大多数受我国国有单位的掌控, 也许与个人的爱好 职称的晋升 领导或权威的面子等有关, 使这些自然的东西就变得不太客观, 不甚自由了. 世界华人消化杂志 是一只绚丽的奇葩, 从他的孵育 出生到成长, 都是在自由的成长, 如今如此受到关注, 首先应该感谢他的母亲, 马连生教授, 这样一个向往自由 崇尚真实, 追求新意, 海纳百川, 又耐酸 耐碱 耐腐蚀的科学志士 ; 其次, 要感谢无数的学者, 是他们把自己最新成果, 信守在这样的平台上展示, 使得这个幼苗充满了向上的活力, 迅速成长壮大 ; 还要感谢祖广安 李镇西这样一批的好领导, 是他们给与了鼓励 鞭策和有力的支持. 然而, 直到今天我相信, 还有不少的领导 学者 同行, 还对该杂志处于观望 犹豫 甚至否定的态度. 但我更坚信, 他那种顺其自然的秉性, 快捷准确的性格, 以及其拥有的实力专家群, 让这棵由自由人种下的大树, 更广泛为世人所瞩目 发扬光大. 作为贵刊的编委, 我一直密切地注意和关心贵刊的发展, 也把自己及学生们的最新研究成果投寄贵刊发表, 以示对贵刊实力支持. 看到祖广安 李镇西的文章, 看到他们对马教授的评价, 我看到一个非常谦虚好学的人, 知弱图强的人, 这在当今对于有点成绩的人是难能可贵的, 我也希望马先生能够长期保持这种品格. 很希望静下来写一点文字献给尊敬的马先生, 但作为一个临床学科的主任, 患者 同事不时的打扰, 其实很难, 就把自己断断续续写出来的一点感言寄予你们, 也算是对我热爱贵刊的表示. 最后再次向全体编辑及相关的工作人员问好! 祝大家在新的一年里身体健康, 万事如意! 党双锁编委 西安交大二院感染科

44 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL RESEARCH 肝门部胆管癌神经浸润特征的临床病理学分析 RESULTS: The overall incidence of perineural invasion was 91.78% (67 of 73 patients). Howev- er, the incidence of perineural invasion did not show any remarkable difference in various differentiated adenocarcinomas. Logistic regression analysis identified that penetration of bile duct was significantly correlated with perineural invasion (P < 0.01). The microvessel density (MVD) was significantly lower in well-differentiated adenocarcinomas than in moderately- and poorly- differentiated adenocarcinomas (P < 0.05). Five patterns were observed as the tumor cells invaded nerve fibers. Although tumor cells were Clinical pathology of found to invade microvessels and microlymphatics, immunohistochemical staining for CD34 perineural invasion in hilar and D2-40 respectively showed no association cholangiocarcinoma between perineural invasion and lymphatic or vascular invasion. Cheng-Gang Li, Zhi-Qiang Huang, Li-Xin Wei, Jia-Hong Dong, Jun-Gui Liu, Yan-Sheng Wang Cheng-Gang Li, Zhi-Qiang Huang, Jia-Hong Dong, Jun-Gui Liu, Yan-Sheng Wang, Institute of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of Chinese PLA, Beijing , China Li-Xin Wei, Department of Pathology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing , China Correspondence to: Cheng-Gang Li, Institute of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of Chinese PLA, 28 Fuxing Road, Beijing , China. Received: Revised: CONCLUSION: Perineural invasion is common in hilar cholangiocarcinoma and does not develop via the lymphatic or vascular network, but is a continuous extension from the primary tumor. Nerve plexus around the membrana adventitia should be completely divested during radical excision of hilar cholangiocarcinoma. Key Words: Hilar cholangiocarcinoma; Perineural invasion; Immunohistochemical staining 50%,,,,. Abstract AIM: To elucidate the characteristics and mechanism of perineural invasion in hilar cholangiocarcinoma. METHODS: A clinicopathologic study was conducted on tissue sections from 73 patients with hilar cholangiocarcinoma to observe the incidence and modes of perineural invasion. Clinicopathologic factors, such as tumor differentiation and pathologic stage, were analyzed when perineural invasion was observed in the sections. Immunohistochemical staining for CD34 and D2-40 in cancer tissue samples was performed to clarify the association of perineural invasion with vessels. Li CG, Huang ZQ, Wei LX, Dong JH, Liu JG, Wang YS. Clinical pathology of perineural invasion in hilar cholangiocarcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 :,. 方法 : , ; ; CD34 D2-40. 结果 : 91.78%,,,

45 380 ISSN CN /R,,,,. (P >0.05). Logistic (P <0.01). (P <0.05).,,. 结论 : ;, ; : 鼠抗人 CD34 mab(1 50) 鼠抗人 D2-40 mab(1 50) 免疫组化 SP 试剂盒, 均购于北京中杉生物公司. 石蜡切片, 片厚 3-4 μm, 梯度酒精水化, 30 ml/l H 2 O 2 室温孵育 30 min, 微波炉抗原修复 10 min, 分别滴加 CD34 D2-40 一抗 (1 100) 工作液 4 孵育过夜 ; 加入即用型兔抗鼠二抗工作液, 37 孵育 30 min, 3, 3' 二氨基联苯胺 (DAB) 显色剂显色 ; 复染, 脱水, 中性树胶封片. 用 TBS 替代一抗 二抗作阴性对照, 已知阳性切片作阳性对照 (microvessel density, MVD) : 两名病理医师双盲法统计结果. MVD 计数方法用 Weidner [5] 方法计数 : 任何被 CD34 抗体 关键词 染色的单个内皮细胞或细胞团, 不管有没有形成管腔, 只要与周围的微血管 肿瘤细胞和其 他连接组织有一个清楚的分离, 都认为是一个 可计数的微血管. 每一标本先低倍镜 ( 10) 下选 5 个微血管数最多的区域即 热点, 在每一个区域中计数一个高倍镜 ( 20) 下的微血管数取其均值计为 MVD 值. 0 引言 结果以 mean±sd 表示, 经 SPSS 肝门部胆管癌在诊断和手术切除率上都取得了 11.0 统计软件处理, 依据资料类型的不同分别采很大的进展, 但大多数患者在得到确诊时已是用 χ 2 检验 Logistic 回归分析和单因素方差分析. 疾病的晚期, 总体预后仍然不佳 [1-5]. 只有根治性切除才能使患者获得最佳疗效, 但术后肿瘤的 2 结果复发率非常高 [2-3]. 在人体多种实体瘤中, 肿瘤常 2.1 本研究中 73 例患者, 病理学常围绕神经组织发生扩散, 因此很多学者都强诊断全部为腺癌 ( 表 1); 神经与淋巴结浸润发生调, 在切除肿瘤组织的同时, 应该注意对瘤组织率分别为 91.78%(67/73) 和 27.40%(20/73); 高 周围神经组织的清除. 尽管有研究表明, 肝门部中 低分化腺癌组肿瘤神经浸润发生率之间的胆管癌神经浸润对患者预后有不良影响 [4], 但各差异无统计学意义 (P >0.05). 组报道间的肿瘤神经浸润发生率差异很大, 肿 例中仅 2 瘤浸润神经的途径和确切机制尚不清楚. 本研例肿瘤未侵犯胆管壁全层 ( 高分化腺癌 1 例, 中究旨在阐明肝门部胆管癌神经浸润发生率及肿分化腺癌 1 例 ), 均未发生神经浸润 ; 其余 71 例侵瘤浸润神经的方式及其与血管和淋巴管的关系. 犯胆管壁全层, 其中 67 例 (94.37%) 发生神经浸润. 将淋巴结浸润 血清 CA19-9 水平 Bismuth- 1 材料和方法 Corllet 分型和胆管壁侵犯程度与神经浸润作 1.1 本组 73 例患者均为 / 在 Logistic 单变量回归分析, 结果显示肿瘤侵犯胆北京解放军总医院肝胆外科治疗的肝门部胆管管壁全层与神经浸润间的相关性具有统计学意癌病例, 男 41 例, 女 32 例, 男女比例 , 年龄义 (P <0.01) ( 平均 57.4±11.9) 岁. 共获得患者 1082 张组 2.3 胆管癌细胞浸润织病理切片. 神经主要方式可归纳为 5 种类型 : Ⅰ 型, 包绕神 1.2 经束膜生长 ; Ⅱ 型, 神经周围间隙内生长 ; Ⅲ 型, : 光镜下观察发神经纤维内弥漫性生长 ; Ⅳ 型, 神经内膜间隙内现肿瘤包绕神经外膜 侵入神经周围间隙和神生长 ; Ⅴ 型, 直接浸润无被膜包绕的神经末梢. 经纤维内部生长者, 即确认为肿瘤浸润神经. 图同一患者病灶内肿瘤浸润神经的方式相似, 但像采集应用奥林帕斯 BX51 型显微镜及 Image pro 可有多种浸润方式并存, 肿瘤浸润神经方式的 plus 5.0 图像处理软件. 发生频率由高至低依次是 : Ⅱ 型 >Ⅲ 型 >Ⅴ 型 >Ⅰ

46 381 A C B D,,,.,. E F 图 1 肿瘤浸润神经的方式 (A-C, F: HE 100; D: HE 200; E: HE 400). 表 1 73 例肝门部胆管癌患者临床病理学资料 病理类型 n 神经浸润淋巴结浸润 50 a 型 >Ⅳ 型 ( 图 1A-F). 2.4 CD34 特异性 染色于血管内皮细胞胞膜, 棕褐色着色. 高分化 腺癌与中 低分化组微血管密度之间的差异有 统计学意义 (P <0.05), 而中 低分化腺癌组之间 差异无统计学意义 (P >0.05)( 图 2). 肿瘤可以发生 微血管浸润 ( 图 3A-B), 肿瘤浸润神经时伴有微血 管增生 ( 图 3C), 但未发现肿瘤细胞通过血管途径 浸润神经 ( 图 3C-D). 2.5 D2-40 染色 于淋巴管内皮细胞膜, 棕褐色着色 ; 神经细胞胞 a 图 2 肝门部胆管腺癌微血管密度的比较.

47 382 ISSN CN /R,,,. A B C D N 图 3 肿瘤浸润神经与微血管的关系 (A-B: CD34 400; C-D: CD34 100). 质着色, 为棕褐色颗粒状 ; 血管不染色 ( 图 4A-B). 肿瘤区域内观察到丰富的淋巴管存在, 虽然有些患者未发现局部淋巴结侵犯, 但肿瘤已浸润局部微淋巴管 (4C-D); 肿瘤浸润神经时无淋巴管增生, 未发现肿瘤通过淋巴管途径浸润神经 ( 图 4E-F). 3 讨论肝门部胆管癌无法根治性手术的原因多为肝十二指肠韧带 淋巴结和门静脉的侵犯, 而行根治性手术后患者 5 年生存率仅能达到 30%-50%, 并且术后复发率很高 [1-3]. 肝门部胆管癌即使发现体积很小或患者无症状时, 已发生了胆管系统 神经纤维及局部淋巴结的转移 [6-7]. 有研究表明, 肿瘤发生神经浸润后, 患者生存时间显著缩短, 而第一站淋巴结转移对预后无显著影响 [4]. 然而, 近 15 年来国内外关于肝门部胆管癌神经浸润发生率的报道为 28.6%-100% [2,8-14], 结果极不一致. 我们分析原因主要来自两方面 : 一方面是研究样本量太少, 另一方面是病理医生未报告. 我们的研究表明, 肝门部胆管癌神经浸润率高达 91.78%. 观察中发现, 肿瘤主病灶区域内无神经纤维分布, 进展期肿瘤呈辐射状由胆管壁向周围组织浸润性生长, 肿瘤浸润神经常发生在肿瘤侵犯胆管壁全层之后. 虽然观察到肝门部胆管癌可以发生微血管和微淋巴管侵 犯, 但其发生的频率远低于神经浸润. 我们以前 的研究也发现, 肿瘤细胞可以在神经纤维内部 以 跳跃 性方式生长并发生远处转移 [15]. 因 此, 我们认为神经浸润可能是肿瘤切除后局部 复发的重要原因, 而肿瘤的局部残留, 微血管 微淋巴管的浸润也可能是潜在的复发因素. 肿 瘤的神经浸润应该引起临床医生的重视, 并研 究相应的治疗对策, 对提高患者预后并预防术 后肿瘤复发可能具有重要意义. 以往认为肿瘤是沿着 最小阻力 方向 侵犯神经的, 或是沿着血管和淋巴管途径转运 的 [16-17]. Hassan et al [18] 应用电镜观察发现, 神 经周围间隙与血管 淋巴管并不是连续 的 ; 肿瘤浸润神经的三维重建也显示肿瘤 浸润神经是肿瘤的直接延续 [15,19]. 在我们的 研究中, 通过微淋巴管和微血管特异性染 色, 未观察到肿瘤细胞通过血管 淋巴管浸 润神经. 我们的结果进一步证实了, 肿瘤浸 润神经是一相对 独立的事件, 不是经 过血管 淋巴管途径, 而是肿瘤侵犯胆管 壁全层后直接蔓延的结果, 这与 Ya m a g u c h i et al [6] 的研究结果相似. 但肿瘤浸润神经时伴有 血管增生, 增生的血管可能进一步促进了肿瘤 对神经的侵犯和远处转移. 另外, 我们还观察到, 肿瘤在神经纤维内部生长时也不是沿着 最小 阻力 方向生长的, 肿瘤在神经纤维内部的生

48 383 A C B D ML MV MN MA : Klatskin,, :,,. E F 图 4 肿瘤浸润神经与微淋巴管的关系 (A, D: D ; B-C, E-F: D ). 长方式也是多样的, 可以在神经纤维内部弥漫性生长, 最终破坏整条神经纤维. 有研究表明肿瘤浸润神经与神经营养因子 (neurotrophin, NT) 及其受体 ( 如 Trk) 有关 [20-23]. 基于他们针对肿瘤神经浸润的特异性实验治疗已有研究报道 [24-25], 但目前的研究尚处于动物试验阶段, 离临床实际应用尚有距离. 由于肝门部胆管癌具有高的神经浸润发生率, 肝门部胆管癌行根治性切除术时, 对肝十二指肠韧带及一 二级胆管所在的 Glisson 鞘 骨骼化 时, 应仔细剥除胆管与肝动脉和门静脉间的神经纤维组织, 以防肿瘤细胞通过浸润的神经组织而发生局部残留和术后的局部复发. 然而, 剥离血管外膜是否可以满足神经纤维清除的需要, 去神经支配 的肝脏功能是否受到影响, 尚需要更多的研究工作证实. 基于以上研究结果, 我们认为, 肝门部胆管癌神经浸润发 生率高, 术后应给予局部抗神经浸润治疗 ; 亟待 研制新型 高效亲神经的肿瘤化疗药物 ; 研究 活体组织中神经纤维染色剂, 指导术中对肿瘤 周围神经组织的清除, 确定肿瘤切除的范围 ; 从 而预防肿瘤通过神经浸润而发生的远处转移和 局部复发. 4 参考文献 ; 14: ; 44: ; 2: Silva MA, Tekin K, Aytekin F, Bramhall SR, Buckels JA, Mirza DF. Surgery for hilar cholangiocarcinoma; a 10 year experience of a tertiary referral centre in the UK. Eur J Surg Oncol 2005; 31: Weidner N. Current pathologic methods for

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50 REVIEW ; 16(4): ISSN CN /R 急性胰腺炎肝损伤的发病机制和治疗 Pathogenesis and treatment of acute pancreatitis with liver injury Hong-Hai Yu, Zhi-Jie Feng Hong-Hai Yu, Zhi-Jie Feng, Department of Gastroenterology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang , Hebei Province, China Correspondence to: Zhi-Jie Feng, Departement of Gastroenterology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang , Hebei Province, China. Received: Revised: Abstract Acute pancreatitis is a frequent acute abdomen in clinic, causes damages not only to pancreas, but also to distant organs. Liver is one of the mainly involved organs. The development of liver injury may aggravate pancreatitis. The pathogenesis of acute pancreatitis with liver injury is mainly related to cytokines, pancreatic enzyme, oxidative stress, microcirculation disturbance, apoptosis and pancreatitisassociated ascitic fluid, etc. Its treatment is also to eradicate these factors. However, more methods are still under animal studies. Their clinical application requires further study. Key Words: Acute pancreatitis; Liver injury Yu HH, Feng ZJ. Pathogenesis and treatment of acute pancreatitis with liver injury. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): (acute pancreatitis, AP),,,,,. AP,,,.. 关键词, 0 引言 急性胰腺炎 (acute pancreatitis, AP) 是临床常见的 急腹症, 其发病机制尚未完全阐明. 而急性重症 胰腺炎 (severe acute pancreatitis, SAP) 常常并发 肝 肾 肠道等胰外器官损伤, 进而发生多器 官功能障碍 (MODS), 死亡率较高. 在一项对 178 名 SAP 相关 MODS 患者的回顾性研究中, 具有最 高死亡率的是肝衰竭患者 (83%); 而联合器官衰 竭中, 又以肝肾衰竭死亡率最高 (91%) [1]. 围绕急 性胰腺炎相关肝损伤的机制和治疗有着众多的 研究, 现将目前研究进展作一综述. 1 急性胰腺炎肝损伤的发病机制 1.1 目前研究表明, AP 时中性 粒细胞分泌大量细胞因子, 在 A P 的病理生理 变化中起着重要的作用. 常见的致炎因子主 要有 TNF-a IL-1β IL-6 IL-8 等, 他们参与 了局部炎症和全身炎症级联反应, 不仅引起胰 腺水肿 出血坏死等, 还导致了胰外器官的损 伤 [2-3]. Pastor et al [4] 发现, 在雨蛙肽诱导的大鼠 AP 中, 给予抗中性粒细胞血清后胰腺等器官损伤 减轻, 肝脏中 IL-6 IL-10 水平明显降低, 认为中 性粒细胞的激活是 AP 时器官损伤的原因之一. Zhang et al [5] 在牛磺胆酸钠诱导的大鼠 AP 中发现, AP 时 TNF-a IL-6 IL-10 等炎症因子水平明显 升高, 且与胰腺炎严重程度和器官损伤程度密切 相关, 给予生长抑素后 TNF-a mrna 的表达降低,,,

51 386 ISSN CN /R 细胞因子水平也下降, 推测 TNF-a 在疾病的进展 7 中可能起很重要的作用. 另外, 有人在胆碱缺乏 和乙硫氨酸补充饮食 (choline-deficient/ethioninesupplemented diet, CDE) 诱导的 C57BL/6 大鼠 SAP, 中, 在实验 36 h 监测到肝脏中 NF-kappa B 的激活 并且随之出现 IL-6 MIP-2 和转氨酶的显著升高,. 认为 NF-kappa B 依赖的细胞因子参与了 AP 时的 肝损伤 [6-7]. 1.2 AP 时在致病因素作用下大量胰 酶在胰腺内激活, 胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶, 继而激活糜蛋白酶 弹力蛋白酶 磷脂酶 A2 等, 造成胰腺局部损伤, 刺激中性粒细胞产生大量炎 性介质. 这些介质入血后进一步引起机体炎性介 质释放形成瀑布似的连锁反应, 形成全身的炎症 反应造成多器官的损伤 [8]. Zhang et al [9] 从人体和 大鼠的胰液中分离出一种甘露糖结合蛋白, 他曾 从血清 肝脏 肺等器官分离出来, 证实在急性 宿主防御反应第一线发挥重要作用. 而该蛋白属 于一种胰弹性蛋白酶, 可以引起巨噬细胞激活 增强 TNF-a 的表达, 推测其可能在急性胰腺炎和 全身炎症反应中起中介作用. Jaffray et al [10] 的实 验证实了 AP 胰弹性蛋白酶造成了肝脏的炎症反 应和损伤. 而胰腺炎时胰酶的多少影响着胰腺 炎的严重程度, 这已得到 Coelho et al [11] 实验证实 : 在牛磺胆酸钠诱导的 AP 中, 造模前通过给予生 理剂量的雨蛙肽 [0.133 mg/(kg h)] 以降低胰酶和 胰蛋白酶原的含量, 从而减少了 AP 时致炎细胞 因子的生成以及肝细胞线粒体功能障碍的发生. 胰腺炎相关蛋白 (pancreatitis-associated protein, PAP) 是一种胰弹性蛋白, AP 时过度表达. Folch- Puy et al [12] 在牛磺胆酸钠诱导的大鼠 AP 中, 经腔 静脉外源注入 PAP(400 mg/kg), 发现 3 h 后肝脏中 NF-kappaB 激活 肝细胞中 TNF-a mrna 过度表 达 TNF-a 含量异常增加, 胰腺组织中的中性粒 细胞浸润 氧化应激程度均较对照组明显升高, 说明 AP 时 PAP 由胰腺释放后引起肝细胞 TNF-a 过度表达, TNF-a 生成增加引起炎症造成组织 损伤. 1.3 在 AP 的发展中, 被损坏的腺 泡细胞与激活的白细胞 巨噬细胞产生大量的 氧自由基及其衍生物, 氧自由基的失衡导致了 细胞的损伤, 这些自由基不仅仅局限在胰腺内, 也影响到身体的其他器官, 特别是在肝 肺等 器官中 [13]. Esrefoglu et al [14] 在雨蛙肽诱导的大鼠 AP 中发现, 肝脏细胞出现变性 空泡化 血管 充血 血窦膨大 炎症性浸润等病变同时伴有 显著的丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 升高 过 氧化氢酶 (catalase, CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GPx) 的活动降低. 给予抗 氧化剂褪黑素或 N- 乙酰半胱氨酸 + 维生素 C 后可 以明显改善肝脏的损伤. 认为氧化损伤在 AP 肝 损伤中起重要作用. Szabolcs et al [15] 采用 L- 精氨 酸 (3.2 g/kg, 2 次 ip) 诱导大鼠坏死性胰腺炎模型, 发现精氨酸引起肝脏脂质过氧化物反应水平升 高, 髓过氧化物酶激活, 造模 24 h 后 Cu/Zn 过氧化 物歧化酶 (Cu/Zn-SOD) 以及 CAT 和 GPx 显著增加. Czako et al [16] 在 L- 精氨酸诱导的大鼠 AP 模型中也 发现了胰腺 肝脏等器官中 MDA 浓度升高, 而 肝脏中 Mn 过氧化物歧化酶 (Mn-SOD) 和 GPx 的活 动在发病初降低, 胰腺腺泡细胞 肝细胞出现坏 死等病变, 认为在精氨酸诱导的 AP 早期, 胰腺 肝脏等器官产生的氧自由基造成了器官的损害. 但也有研究显示, 小剂量 L- 精氨酸对 AP 具有治 疗作用, Dobosz et al [17] 在雨蛙肽诱导的 AP 大鼠 中, 以 L- 精氨酸作为 NO 底物 (100 mg/kg) 给予大 鼠后, 发现可以改善胰腺 肝脏等脏器的微循环 灌注. 1.4 微循环的改变是 AP 早期重要的 病理生理过程, 他不仅仅发生于胰腺, 而是涉及 到众多器官诸如肝脏 肺脏和肠道等. 肝脏中微 循环的变化参与了肝组织损伤和肝功能障碍的 发生发展过程 [18]. Foitzik et al [19] 通过活体显微镜 检查法 (intravital microscopy) 和计算机图像分析 发现, 肝脏 胰腺等的微循环障碍在大鼠 SAP 模 型早期发生, 持续存在 48 h 以上, 不仅影响毛细血 管血流量, 还影响毛细血管渗透性和白细胞内皮 细胞的相互作用, 认为微循环障碍可能与胰腺炎 相关的 MODS 发生有关. Forgacs et al [20] 在雨蛙肽 诱导的 AP 大鼠中, 也观察到造模 6 h 后, 与对照组 相比, AP 大鼠肝脏毛细血管流量显著降低, 给予 雨蛙肽拮抗剂可以明显改善肝血流灌注. Dobosz et al [17] 的实验也证实了 AP 造成了肝脏微循环灌 注的显著下降, 而给予 L- 精氨酸后, 能够改善肝 脏微循环, 减轻器官损伤. 1.5 各种原因造成的肝损伤都可以 出现肝细胞凋亡. 肝细胞的凋亡是 AP 肝脏受损 的表现之一, 大量的肝细胞凋亡可造成肝功能 障碍, 严重时可进展至肝衰竭. Takeyama et al [21] 在大鼠 SAP 模型中发现肝细胞凋亡的存在, 同 时用 S A P 时产生的胰腺炎相关性腹水培养体 外大鼠肝细胞时发现细胞的死亡是通过凋亡 实现的, 给予转化生长因子 β1 的 (TGF β1) 中和

52 387 抗体可以部分阻止凋亡的诱导, 推测凋亡产 生可能部分与胰腺炎相关性腹水 (pancreatitisassociated ascitic fluid, PAAF) 中的 TGF β1 有关. Hori et al [22] 和 Nakamura et al [23] 也发现, 大鼠 AP 时 TGF β1 在血浆 PAAF 肝组织和腹膜巨噬 细胞中的水平都升高, 其中和抗体可以减少肝 细胞的凋亡 降低血清谷丙转氨酶, 而巨噬细 胞的清除明显降低了血浆和 PAAF 中 TGF β1 蛋 白的水平, 且明显抑制了肝组织中 TGF β1 的激 活, 因此认为 A P 肝损伤与巨噬细胞引起的凋 亡有关, 而其衍生的 T G F β1 是诱导肝细胞凋 亡的重要因子. 研究发现 AP 时 Kupffer 细胞衍 生的 Fas 配体 (FasL) p38- 促分裂原活化蛋白 激酶 (p38-mitogen-activated protein kinase, p38- MAPK) 细胞凋亡蛋白酶 -3(caspase-3) 表达增 加并且诱导了肝细胞的凋亡损伤 [24-25]. Gallagher et al [26] 又进一步发现, 在 Fas/FasL 基因敲除大鼠 中, AP 诱导的 p38-mapk 表达显著降低, 肝细胞 的凋亡也明显减少, 推测 Fas/FasL 在 AP 肝细胞的 凋亡中起关键作用. Peng et al [27] 通过 CDE 诱导大 鼠 AP 模型, 并用胰弹性蛋白酶在 p65 sirna 转染 的大鼠离体 Kupffer 细胞株中模拟 AP 损伤模型. 实验发现, CDE 胰腺炎引起 p65 NF-kappa B/RelA 核转位 Fas/FasL 和 caspase-3 表达增加以及大 鼠肝细胞核内 DNA 断裂. 而在体外实验中, p65 sirna 的转染减弱了弹性蛋白酶诱导的 p65 NFkappa B/RelA 核转位和 Kupffer 细胞的凋亡, 证明 AP 通过 NF-kappa B 途径诱导 Kupffer 细胞凋亡, 并推测 Kupffer 细胞衍生的 Fas/FasL 诱导的肝细 胞凋亡和 NF-kappa B 途径诱导的 Kupffer 细胞凋 亡之间的平衡失调决定了 AP 时肝脏损伤的程度. 1.6 (PAAF) AP 时形成腹水不 仅作为一种损伤体征出现, 而且具有很强的致 病性, 可以促使 AP 病情进一步加剧, 并造成胰外 器官的损害. Murr et al [28] 用 PAAF 灌注健康大鼠 肝脏 60 min 后, 发现血清中 AST ALT LDH 水 平升高 15 倍以上, 且不能被蛋白抑制因子所抑 制. 而将人肝细胞株 (CCL-13) 暴露于 PAAF 后, 死 亡细胞达到了 15% 而且 PAAF 的这一作用不受蛋 白酶抑制因子或热灭活所影响. 推测 PAAF 对 AP 时肝脏的影响并不是通过其含有的胰酶或者局 部 Kupffer 细胞诱导的细胞因子, 而是通过一种 热稳定因子实现的. Yang et al [29] 又进一步发现, 向大鼠 ip 灭菌的 PAAF, 同时将离体人肝细胞株 (CCL-13) 暴露于 PAFF, 24 h 后, 大鼠血清 ALT AST LDH 水平和肝细胞凋亡的数量都明显增 加. 在 CCL-13 中检测到 p38-mapk 的激活, 细胞凋亡出现了时间和剂量的依赖性, 而 caspase-3 抑制剂 Ⅱ 可以减少凋亡, 故而认为 PAAF 通过 p38-mapk 的激活和 caspase-3 依赖的途径引起肝细胞凋亡从而造成了肝损伤. Ueda et al [30] 认为 PAAF 通过其含有的细胞毒性物质造成了肝细胞凋亡, 并发现 PAAF 还可引起肝细胞酸中毒 细胞内钠潴留 线粒体内 ATP 衰竭等, 认为 PPAF 中含有的血色素可能是造成肝脏损伤的细胞毒性物质之一. 而此前 Ueda et al [31] 认为 PAAF 可造成肝细胞内钙超载, 这也可能是 AP 时肝脏受损以及 AP 造成多器官功能损伤的原因之一. 1.7 AP 发病初期, 病损的胰腺组织作为抗原或炎症刺激物激活巨噬细胞等炎症细胞释放各种细胞因子等, 他们对肝脏的损伤被认为是重要的引发效应和第一次打击, 继之而来的瀑布级联反应引发的全身炎症反应以及细菌移位 内毒素血症等具有感染性的打击构成了对肝脏的第二次打击. Okabe et al [32] 用雨蛙肽诱导大鼠 AP 模型形成第一次打击, 之后造成内毒素血症以形成第二次打击. 实验发现雨蛙肽 + 内毒素血症组的大鼠, 其肝脏对吲哚花青绿的血浆清除率较其他组显著降低, 提示肝脏功能受损严重, 而单纯的内毒素血症组该指标变化较轻微, 认为 AP 时的第一和第二次打击对造成肝脏损伤都具有重要作用. Gray et al [33] 用雨蛙肽诱导大鼠 AP 模型后注射内毒素, 24 h 后发现肝脏 NF-kappa B 激活, 推测内毒素通过肝脏 NF-kappa B 引起器官损伤. 2 急性胰腺炎肝损伤的治疗 AP 相关肝损伤的治疗与 AP 的治疗密切相关, 因为胰外器官的损伤程度取决于胰腺炎的严重程度. 根据 AP 肝损伤的机制, 进行抗炎 抗氧化 改善微循环 抑制凋亡 促进肝细胞再生以及支持疗法等. 2.1 一些细胞因子参与了肝脏炎症反应并造成损害, 故抑制这些细胞因子发挥作用或者阻断其激活和表达都可以起到保护作用 [34]. 抑制细菌移位以阻止其诱发炎症反应, 有人应用血小板活化因子抑制剂以及血小板活化因子受体抑制剂 -BN52021, 降低了大鼠 AP 时细菌移位的发生并减轻了器官损伤 [35-36]. Cevikel et al [37] 发现, NO 对 AP 时细菌移位可能具有调节作用, 通过每日给予 NO 合酶作用底物 -L- 精氨酸 (100 mg/kg)2 d 后, 细菌易位的发生明显低于对照组, 器官损害亦较轻. Chen et al [38] 经静脉给予 AP 大鼠表皮生长因子 (epidermal growth factor,,.,..

53 388 ISSN CN /R EGF) 后, 可以改善肠道的渗透性从而阻止细菌 (PAAF): 移位发生, 保护胰腺 肝脏等器官. IL-10 作为 一种内源性抗炎细胞因子, 可以抑制单核巨噬, 细胞合成和表达 TNF-a IL-1β IL-6 IL-8 等,, 减轻 AP 严重程度, 改善预后. Zou et al [39] 进行了. 针对人 IL-10(hIL-10) 基因治疗的研究, 给 AP 大 鼠 ip 一种 阳性脂质体 / 质粒 -hil-10(pcdna3- hil-10) 复合物 后, 胰腺 肝脏 肺脏 hil-10 水 平升高, TNF-a 水平降低和组织学改善, hil-10 基因治疗组的死亡率较对照组明显降低, 7 d 存 活率分别为 70% 和 10%, 认为该疗法可能具有积 极的临床意义. Wang et al [40] 在大鼠 SAP 实验中, 用阳性脂质体介导的 pcdna3-il-10 基因疗法治 疗也证明能够有效降低 SAP 严重程度和死亡率. Ueno et al [41] 给 AP 大鼠造模前注射重组大鼠 IL- 18(rmIL-18) 蛋白, 降低了 AP 时血清淀粉酶 脂 肪酶 腺泡细胞空泡化水平, rmil-18 还增加了 胰腺 肝脏等器官 NO 水平和 inos 基因表达, 认 为 rmil-1 在 AP 早期的保护作用可能是通过引起 inos 来源的 NO 释放形成的, 可能对 AP 具有治 疗作用. 早期给予抗生素治疗也可以减少肝脏 的损伤, Miyahara et al [42] 在狗胆汁反流性 AP 实 验中, 造模 6 h 后, 经肠系膜上动脉持续给予抗生 素亚胺培南治疗, 发现治疗组存活率较对照组 明显升高, 血清转氨酶和门静脉内毒素水平显 著降低, 发病 24 h 后, 对照组肝细胞和 Kupffer 细 胞损伤加剧, TNF-a 表达急剧增加, 而治疗组的 损伤则轻微. 认为抗生素可以控制内毒素易位, 从而减少肝损伤. Onek et al [43] 实验也证实抗生 素具有治疗效果, 并发现喹喏酮类的药物效果 要优于 β- 内酰胺类抗生素. 2.2 应用氧自由基清除剂可以降低 AP 时肝脏的氧化损伤. 褪黑素 (melatonin) 具有 很强的抗氧化作用, Szabolcs et al [15] 发现褪黑素 可以降低 AP 大鼠血清淀粉酶 过氧化氢酶的 水平, 降低脂质过氧化反应程度, 减少器官损害. 褪黑素还具有抑制中性粒细胞浸润作用, Barlas et al [44] 发现其在胰管梗阻性胰腺炎中可以保护 肝脏等胰外器官, 认为通过其清除氧自由基和 抗氧化剂活性抑制了嗜中性白细胞对组织的浸 润. 白藜芦醇 (resveratrol) 是葡萄属植物产生的一 种植物抗毒素, 为多酚类物质, 具有很强的抗氧 化和抗炎作用. Szabolcs et al [45] 发现, 在胆囊收缩 素诱导的大鼠 AP 中, 白藜芦醇可以增加肝脏还 原性谷胱甘肽含量并减少肝过氧化氢酶的激活. 此外还有维生素 C, N- 乙酰半胱氨酸等也具有抗 氧化的作用 [46-47]. Esrefoglu et al [14] 在其实验中发 现, 维生素 C 联合 N- 乙酰半胱氨酸可以增加大鼠 肝脏中 GPx 和 CAT 的活性, 减少了胰腺和肝脏的 损伤. 2.3 Dobosz et al [48] 通过激光多普勒 血流仪发现, 大鼠 AP 时各个器官微循环灌注都 显著降低, 而肝素钠增加了微循环灌注, 具有一 定的治疗作用. Machado et al [49] 发现 AP 时平均动 脉压显著降低, 而高渗盐水 (7.5% NaCl) 治疗可 以升高动脉压, 改善血液动力学并且降低 IL-6 IL-10 等细胞因子水平和髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO) 活性, 减轻肝脏等器官损伤, 死 亡率降低. Chen et al [50] 发现, 给予大鼠 ip 褪黑素 (2 或 10 mg/kg) 后, 可以减轻全身动脉压降低的程 度, 维持器官灌注水平, 大剂量组对于 AP 的治疗 效果要优于小剂量组, 能够降低促炎介质 - 前列 腺素的水平, 使之趋于正常. 2.4 生长抑素对 AP 的治疗疗效较为确 切, 能够进一步减轻肝脏的损伤 [51]. 研究发现, 生长抑素能够抑制 AP 大鼠血清 TNF-a mrna 的过度表达, 减轻胰腺和肝脏组织的损伤 [5,52-53]. Tang et al [54] 对 39 名 SAP 患者, 于发病早期给予生 长抑素 (250 mg/h) 治疗持续 72 h, 发现可以减少 炎症应答, 恢复细胞免疫功能, 改善患者一般状 况, 但对于死亡率的疗效还需进一步研究. Xia et al [55] 对 60 名 SAP 患者应用生长抑素治疗后, 血 清 C- 反应蛋白水平降低, APACHEⅡ 评分明显有 改善, 器官功能障碍的发生率较常规药物治疗 组降低. 2.5 糖皮质激素的使用存在有争议, 研究显示, 给予地塞米松或者氢化可的松后, 大 鼠肝脏中 ATP 水平明显升高, MPO 细胞间黏 附因子 -1(ICAM-1) 水平降低, 认为糖皮质激素 在 AP 早期炎症反应中发挥重要作用 [56-59]. Cosen- Binker et al [60] 则发现糖皮质激素对 AP 大鼠具有 预防损伤作用且与给药时间和剂量相关, 在诱 导 AP 前 30 min 给予氢化可的松 4 mg/kg 效果最 佳, 过高或过低则效果欠佳. Zhang et al [61] 观察到 地塞米松可以明显降低 AP 大鼠血清中淀粉酶 内毒素 TNF-a 的水平, 但并没有改变大鼠的死 亡率. 2.6 血液滤过作为一种净化血液的方 法, 在 A P 以及相关器官损伤的治疗中可能具 有重要意义. Yang et al [62], 对猪 SAP 模型使用高 容量零差额 (high-volume and zero-balance) 的 血液滤过疗法, 与对照组相比, 治疗组的平均

54 389 动脉压 动脉血氧分压显著增加, 而尿蛋白含 量 血清 ALT 水平则显著下降, 造模 6 h 后, 血清 TNF-a IL-1β 水平降低, IL-10/TNF-a 比率更高, 认为早期血滤可以有效清除猪血液中 TNF-a IL-1β, 升高 IL-10/TNF-a 比率, 改善血流动力学, 减轻肝 肾等器官损伤. Yang et al [63] 对 37 名 SAP 患者的随机分组实验, 采用连续性静脉 - 静脉血 液滤过 (continuous veno-venous hemofiltration, CVVH) 组的治疗效果明显优于常规治疗组, 死 亡率低 (18.2% vs 33.3%) 住院天数少 (18.3±5.7 d vs 27.5±8.6 d), 认为该法对 SAP 造成的组织和 器官损伤具有显著的保护效果. 2.7 研究证实, 肠内营养的方法可以有效减 少细菌移位的发生, 降低了血清淀粉酶 转氨 酶 [64-65]. 但 Alhan et al [66] 却发现肠道内营养和静 脉营养联合疗法对 AP 大鼠并没有显著效果. Yol et al [67] 对大鼠采用胰胆管结扎法诱导 AP, 并于 造模开始给予大量聚乙二醇持续灌肠 6 h, 结果 显示 72 h 后, 灌肠组血清淀粉酶 ALT LDH 乳酸水平和肝损伤的发生率均显著低于对照组. Alhan et al [68] 在大鼠 AP 实验中发现, 给予 Omega- 3(ω-3) 脂肪酸可以减少胰腺 肝脏等器官的细 菌感染, 降低血清 TNF-a IL-6 含量, 减少氧自 由基的破坏, 降低死亡率. Ueda et al [69] 发现肝 细胞生长因子在 AP 损伤器官中表达增加, 肝细 胞生长因子具有一定营养作用, 并且可以抑制 PAAF 引起的肝细胞凋亡. 3 结论 AP 肝损伤机制仍未完全阐明, 目前研究认为与 炎性细胞因子 胰酶活性 氧化应激 微循环 障碍 肝细胞凋亡 胰腺炎相关性腹水等损伤 因素有关, 这些方面相互影响, 构成了一个复杂 的病理生理过程. 治疗上包括抗炎 抗氧化 改善微循环 应用生长抑素 糖皮质激素和血 液滤过等方法, 目前 AP 肝损伤治疗的研究主要 为动物实验, 其临床疗效有待进一步证实. 4 参考文献 1 Halonen KI, Pettila V, Leppaniemi AK, Kemppainen EA, Puolakkainen PA, Haapiainen RK. Multiple organ dysfunction associated with severe acute pancreatitis. Crit Care Med 2002; 30: Martín Alonso MA, Santamaría A, Saracíbar E, Arranz E, Garrote JA, Almaraz A, Caro-Patón A. Cytokines and other immunological parameters as markers of distant organ involvement in acute pancreatitis. Med Clin (Barc) 2007; 128: Folch-Puy E. Importance of the liver in systemic complications associated with acute pancreatitis: the role of Kupffer cells. J Pathol 2007; 211: Pastor CM, Vonlaufen A, Georgi F, Hadengue A, Morel P, Frossard JL. Neutrophil depletion--but not prevention of Kupffer cell activation--decreases the severity of cerulein-induced acute pancreatitis. World J Gastroenterol 2006; 12: Zhang Q, Ni Q, Cai D, Zhang Y, Zhang N, Hou L. Mechanisms of multiple organ damages in acute necrotizing pancreatitis. Chin Med J (Engl) 2001; 114: Gray KD, Simovic MO, Blackwell TS, Christman JW, May AK, Parman KS, Chapman WC, Stain SC. Activation of nuclear factor kappa B and severe hepatic necrosis may mediate systemic inflammation in choline-deficient/ethioninesupplemented diet-induced pancreatitis. Pancreas 2006; 33: Rakonczay Z Jr, Hegyi P, Takacs T, McCarroll J, Saluja AK. The role of NF-kappaB activation in the pathogenesis of acute pancreatitis. Gut 2008; 57: Elfar M, Gaber LW, Sabek O, Fischer CP, Gaber AO. The inflammatory cascade in acute pancreatitis: relevance to clinical disease. Surg Clin North Am 2007; 87: , vii 9 Zhang H, Patel SA, Kandil E, Mueller CM, Lin YY, Zenilman ME. Pancreatic elastase is proven to be a mannose-binding protein--implications for the systemic response to pancreatitis. Surgery 2003; 133: Jaffray C, Yang J, Norman J. Elastase mimics p a n c r e a t i t i s - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y v i a inflammatory mediators. J Surg Res 2000; 90: Coelho AM, Machado MC, Cunha JE, Sampietre SN, Abdo EE. Influence of pancreatic enzyme content on experimental acute pancreatitis. Pancreas 2003; 26: Folch-Puy E, Garcia-Movtero A, Iovanna JL, Dagorn JC, Prats N, Vaccaro MI, Closa D. The pancreatitisassociated protein induces lung inflammation in the rat through activation of TNFalpha expression in hepatocytes. J Pathol 2003; 199: Tadao M, Yuji O. Role of free radicals in the development of severe acute pancreatitis. Nippon Rinsho 2004; 62: Eşrefoğlu M, Gül M, Ates B, Batçioğlu K, Selimoğlu MA. Antioxidative effect of melatonin, ascorbic acid and N-acetylcysteine on caerulein-induced pancreatitis and associated liver injury in rats. World J Gastroenterol 2006; 12: Szabolcs A, Reiter RJ, Letoha T, Hegyi P, Papai G, Varga I, Jarmay K, Kaszaki J, Sari R, Rakonczay Z Jr, Lonovics J, Takacs T. Effect of melatonin on the severity of L-arginine-induced experimental acute pancreatitis in rats. World J Gastroenterol 2006; 12: Czako L, Takacs T, Varga IS, Tiszlavicz L, Hai DQ, Hegyi P, Matkovics B, Lonovics J. Oxidative stress in distant organs and the effects of allopurinol during experimental acute pancreatitis. Int J Pancreatol 2000; 27: Dobosz M, Hac S, Mionskowska L, Dymecki D, Dobrowolski S, Wajda Z. Organ microcirculatory disturbances in experimental acute pancreatitis. A role of nitric oxide. Physiol Res 2005; 54: Panek J, Zasada J, Poźniczek M. Microcirculatory disturbance in the course of acute pancreatitis.,,,.

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57 REVIEW ; 16(4): ISSN CN /R IL-23 及其受体 IL-23R 与克罗恩病的关系 disease. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): ( ), IBD,. IL-23 and IL-23 receptor in Th 1 Crohn s disease.,, IL-23 Mei Li, Xiang Gao, Pin-Jin Hu Th 1. Mei Li, Xiang Gao, Pin-jin Hu, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou , Guangdong Province, China Correspondence to: Mei Li, Department of Gastroenterology, Huangpu Department, the First Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou , Guangdong Province, China. digoxin@126.com Received: Revised: Abstract Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammatory condition of the gastrointestinal tract and clinically presents either as Crohn s disease (CD) or as ulcerative colitis (UC). The incidence of IBD has increased in recent years and there is an increased risk for developing IBD in cohorts with a higher socioeconomic class. The underlying cause for the disease remains unknown. Studies have shown that IBD is associated with environmental, genetic and immunological factors. Immunoregulation disorder pays a key role in the development of IBD. IBD is a bacteria and cytokinedriven pathologic immune response and CD is mainly involved in the immune reaction mediated by type 1 helper T-cells (Th1). IL-23 plays an important role in the immune reaction mediated by Th1 cells. In this paper, w e r e v i e w t h e m o l e c u l a r i m m u n o l o g i c pathogenesis of IL-23 and IL-23R in CD for a better understanding of the etiology of and the therapy for IBD. Key Words: IL-23; IL-23 receptor; Crohn s disease;,, Inflammatory bowel disease Li M, Gao X, Hu PJ. IL-23 and IL-23 receptor in Crohn s (IBM, ),. IBD,,. Th 1.,, IL-23Th 1., IL-23 IL-23 (IL-23R). 关键词 0 引言克罗恩病 (crohn's disease, CD) 和溃疡性结肠炎 (UC) 合称炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD), 是一种非特异性肠道炎症性疾病. IBD 的发病率近年有所上升, 尤其是城市里社会经济地位较高的群体 [1]. IBD 病因学研究一直是该领域的研究重点. 大多数研究者认为该病主要由免疫反应介导, 并与遗传因素 环境因素密切相关, 属于自身免疫性疾病的一种, 免疫调节紊乱是发病的关键因素 [2]. 克罗恩病是 Th 1 介导的肠道免疫反应, 而溃疡性结肠炎是以 Th 2 介导的肠道免疫反应 [3-4]. 目前研究表明 IL-23 在 Th 1 介导的免疫反应中起重要作用. 因此研究 IL-23 及其受体 IL-23 受体 (IL-23R) 与克罗恩病之间的关系有重要意义, 本文就这一方面的研究进展作一综述. 1 IL-23 及 IL-23R 的结构 2000 年, 在异源二聚体细胞因子白细胞介素 IL- 12(p40p35) 被确定后的第 10 年, 人们发现了一个新的异源二聚体细胞因子 IL-23(p40p19) [5-6]. 因

58 393 为两者有共同的 p40 亚基, 所以早期人们用 p40 的拮抗剂作为 IL-12 的特异性抗体得到夸大的 IL-12 的功能. IL-23 的受体是由 IL-12Rβ1 以及 IL- 23R 两部分组成, 而 IL-12R 是由 IL-12Rβ1 及 IL- 12Rβ2 组成. 人类 IL-23R 定位在染色体 lp31 上, 与 IL-12Rβ2 基因的编码区处于同一区域内. IL-23R 的 ORF( 开放读码框 ) 由分布在长 92 kb 的人类基 因组 DNA 上的 12 个外显子组成, 由不同的剪接 构成已知 6 种亚型, 最常见的亚型为缺失外显子 7 或外显子 10. IL-23R 由胞外区 跨膜区和胞内 区 3 部分组成 [7]. IL-23 生物学作用的发挥是其两 种亚单位 (p40 和 p19) 分别和 IL-23 受体复合物的 两个亚单位 (IL-12β1 和 IL-23R) 相互作用的结果. 2 IL-23 对免疫的调控作用 人们发现细菌产物与 Toll-like 受体结合后可诱 导细胞表达 IL-23 [8]. 既往研究表明, LPS( 脂多糖 ) 和 SAC( 金黄色葡萄球菌 ) 是 IL-12 的最强诱生剂 [5], 马小彤 et al [9] 发现 LPS 和 SAC 也是 IL-23 的强 诱生剂 ; 用 LPS 和 SAC 处理外周血单个核细胞 (PBMC), 发现他们均可上调 p19 和 p35 mrna 的表达, LPS 和 SAC 可分别诱导 p19 mrna 表 达增加最高达 2.9 和 4.7 倍, p35 mrna 达 2.5 和 3 倍. IL-23 是由 p40 和 p19 组成的异源二聚体, 其 中 p19 mrna 可见于各种组织和细胞, 包括内皮 细胞 极化的 Th 1 型细胞和活化的 Mφ 和 DC 等, 而 p40 却表达受限, 由于有生物活性的异二聚体 的形成需要两种亚单位共同表达在同一细胞 内, 因而 IL-23 主要来源于活化的中性粒细胞 Mφ 和 DC 等具有吞噬功能的细胞 [6]. 研究发现 DC 细 胞的 Toll-like 受体被激活后, p19 基因成为转录 因子 NF-κB 的一个重要的靶基因 [8]. T 细胞 NK 细胞 Mφ 和 DC 的细胞膜上都有 IL-23 受体的表 达 [6]. 因此, Mφ 和 DC 能通过自分泌作用产生大量 的 IL-23, 使炎症反应级联放大. IL-23 与靶细胞膜上的 IL-23 受体结合后可 激活信号分子 JAK2 Tyk2 STAT1 STAT3 STAT4 和 STAT5 [10]. IL-23 最主要是经 STAT3 途径 转导信号, 而 IL-12 则是通过 STAT4. STAT4 被激 活后转移至细胞核, 结合到基因组的启动子区, 同时也包括 INF 的管辖区, 由此诱导 Th 0 细胞转 化为 Th 1 细胞, 并产生大量的 INF. 而 STAT3 被激 活后则是诱导记忆性 T 淋巴细胞分化为 IL-17 的 分泌细胞, 也称之为 ThIL-17 细胞 [11]. IL-23 细胞因子对宿主的先天和过继性免疫 均有重要的作用. IL-23 有前炎症反应活性, 通过 STAT3 信号通路激活记忆性 CD4 + T 细胞并刺激 CD4 + T 细胞增殖. 记忆性 T 细胞被 IL-23 因子激活后分泌大量前炎症介质 IL-17 IL-6 和 IFN-γ, 这正是慢性肠炎和其他自身免疫炎症性疾病发生的主要机制 [12]. IL-23 可趋化炎症细胞聚集与迁移, 在多种炎症病灶中都有 P40 和 P19 mrna 的高表达. IL-23 能与 DC 结合, 并激发 DC 和巨噬细胞产生 IL-1 和肿瘤坏死因子 (TNF), 并能刺激 DC 自分泌产生 IL-12. 而 IL-12 只激活 Th 0 细胞 ( 幼稚 T 细胞 ) [46] 以及 NK 细胞产生以 IFN-γ 为主的细胞因子 [13-15]. 起初对 IL-23 和自身免疫病关系的研究主要集中在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 的研究方面, 他作为人类炎性脱髓鞘性疾病 - 多发性硬化 (MS) 的实验模型, 是一种由 CD4 + Th 1 细胞介导的中枢神经系统的自身免疫性疾病. Cua et al [16] 发现 p40ko 小鼠 ( 特异性的缺乏 IL-12 和 IL-23) 和 p19ko 小鼠 ( 特异性的缺乏 IL-23) 对 EAE 的敏感性较之野生型的参照小鼠 (wild type mice, WT mice) 明显降低, 而 p35ko 小鼠 ( 特异性的缺乏 IL-12) 的敏感性明显升高. 对 p40ko 小鼠分别使用 IL-12 和 IL-23 重组蛋白, 只有后者才能重新形成 EAE. 使人们重新认识到 IL-23 才是这种自身免疫病发病的关键因子. 体内研究实验清楚证实 : 以前认为的由 IL-12 发挥作用的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 主要由两种细胞因子发挥作用, 即 IL-12 促进了幼稚 T 细胞 (Th 0 细胞 ) 的分化, 而 IL-23 促进中晚期 Th 1 细胞的进一步分化 [16], 参与后期免疫反应. IL-23 在中枢神经系统中由小胶质细胞和激活的吞噬细胞产生, 而 IL-23R 只表达于激活的吞噬细胞表面, 提示他在自身免疫性炎症反应中有组织特异性 [17]. IL-23 可以诱导巨噬细胞产生 IL-1 和肿瘤坏死因子 (TNF) 从而参与先天性免疫反应, 也能诱导激活的 CD4 + 记忆 T 细胞产生 IFN-γ, 但是 IL- 23 刺激记忆 T 细胞产生 IFN-γ 的能力明显小于 IL-12 [18]. IL-23 同时亦参与获得性免疫反应, 体外培养髓鞘蛋白脂质蛋白 (PLP) 特异性 CD4 + T 细胞发现, IL-23 能诱导并扩增分泌 IL-17 的 T 细胞 (ThIL-17 细胞 ), 而 IL-12 则诱导扩增分泌 IFN-γ 的 T 细胞. 过继转移这两种细胞, 发现接受了 IL-23 激活的 ThIL-17 细胞的小鼠发生了严重的 EAE, 而接受了 IL-12 激活的 Th 1 细胞的小鼠并没有发病. 利用抗体阻断 IL-17 对于主动诱导的 EAE 具有部分的保护作用, 说明 IL-23-IL-17 通路在 EAE 病理过程中发挥重要作用 [19]. 其他由 IL-23 诱导的, 2000 IL-23, IL-23, IL-12, ; IL-23 ; IL-23 IL-23R.

59 394 ISSN CN /R 因子如 IL-6 TNF 也在 EAE 发病中起了一定作 IL-23 用 [19]. 高水平的 IL-17 与几种以 Th 1 介导为主的 IL-23R 慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎 [20] 牛皮 癣 [21-22] [23]. 多发性硬化症和克罗恩病等有关, IL-23 7 IL-23 可促进 IL-17 的产生, 因此 IL-23 可能促进这, Th 些慢性炎症性疾病的发展 [24] 1. 实验证明 IL-23 在抵抗病原微生物中起重要, 的作用. 仙台病毒 (sendai virus) 感染的 Mφ 分泌的 IL-23 IL-12 IL-23 IFN-αβ IL-12 和 IL-18 协同作用于 NK 细胞和 T 细胞, 诱导 IFN-γ 的产生, 能促进病毒的 IL-23, 清除. 丙肝病毒感染过程中, IL-23 能引起针对 ; 丙肝病毒包膜蛋白 (envelope protein 2, E2) 较之 IL-23 Th 1 IL-12 更为强烈 更为长久的 CTL 和 Th 1 型免疫 反应 [25]. 虽然淋巴细胞活化的最为理想的调控, 因子是 IL-12, 但是在其缺失的情况下其作用可, 以被 IL-23 所替代, 并且后者可能在免疫反应的 晚期阶段或者感染的慢性期发挥更为主导的作. 用, 例如在肺结核分枝杆菌感染的小鼠模型中, 感染后肺部的 IL-23 来源于形成中的肉芽组织的 Mφ 和 DC [26]. IL-23 具有和 IL-12 相当的抗肿瘤和抗肿瘤 转移的活性. 但是二者的作用明显不同 : IL-12 能迅速引起肿瘤的消退, 而 IL-23 是在治疗 2-3 wk 后才能起效. 早期抗肿瘤作用是由 IL-12 激活 CD4 + T 细胞或 NK 细胞产生高水平的 IFN-γ 的结 果, 而 IL-23 诱导产生的 IFN-γ 水平较低, 发挥作 用的效应细胞是 CD8 + T 细胞. 另外经 IL-23 治疗 的小鼠模型在原有肿瘤消退后可以产生强烈 的抗肿瘤免疫记忆. IL-23 抗肿瘤的作用机制可 能包括 : IFN-γ 诱导骨髓来源的 Mφ 表达 IL-23R, IL-23 活化 Mφ 分泌促炎性因子 ; IL-23 直接作用于 DC 促进肿瘤肽的呈递 ; IL-23 对记忆性 T 细胞的 作用导致 T 细胞反应的扩增等 [27]. IL-12 和 IL-23 都具有较强的抗肿瘤作用, 但 IL-12 诱导的高水 平的 IFN-γ 出现严重的毒副作用而使其在临床上 的应用受到限制, 而 IL-23 因其所诱导的 IFN-γ 的 产生较少将有望成为肿瘤治疗中一种新的 更 为安全的选择. 3 IL-23 及其受体在 CD 中的作用 大量的遗传流行病学的统计结果和分子生物学 的实验室数据证实 IBD 的发病与遗传因素有关 年两个研究小组各自独立地报道 CD 易感 人群的第一个相关基因 -NOD2(CARD15) [28-29]. N O D2 位于 16q12, 大约 30% 的高加索人群的 CD 发病与该基因的突变有关 [30]. Richard et al 利用以第三代遗传标志系统 (S N P s) 为基础的 基因分型芯片技术进行全基因组扫描, 发现除 N O D2 基因外, 既往用 S TR( 微卫星扫描 ) 未发 现的 IL-23R 基因上有 10 个 SNP 与 IBD 有显著相 关. 10 个位点中, 4 个 O R 值 ( 相对危险度 ) 小于 1, 是保护性的 SNP, 其余 6 个位点 OR 值均大于 1, 表明是易感 SNP, 其中统计学差异最明显的 是位点 rs (r381q), 位于外显子, 是一 个非同义的 SNP, 碱基 G 由 A 代替, 使其编码的蛋 白质中的一个谷氨酸变成精氨酸 (c.1142g>a, p.arg381gln), 从而影响蛋白质功能 [31]. Marla et al 也证实 IL-23R 基因上的 R381Q 变异与非犹 太人儿童的 CD 显著相关 [32]. IL-23R 基因上 SNP 与 IBD 的密切联系提示 IL-23 在 IBD 的发病过程 中有举足轻重的地位. IBD 亦属于自身免疫性疾病的范畴, 多个 实验证明 CD 是以 Th 1 介导的肠道免疫反应, Th 1 介导的细胞因子和 IFN-γ TNF-α 升高 ; 而溃疡 性结肠炎是以 Th 2 介导的肠道免疫反应, Th 2 介 导的细胞因子 ( 如 IL-5 和 IL-13) 升高 [33-34]. 既往 用 p40 作为 I L-12 的特异性抗体所做的研究证 明 IL-12 是介导 Th 1 型免疫反应的重要因子 [35]. IL-23 的发现, 使人们进行一系列实验区分 IL-12 和 IL-23 的作用并且证明 IL-23 是介导肠道慢性 炎症的重要因子, 并且 IL-23 介导的免疫反应只 局限于受累器官, 而 I L-12 则引起全身性免疫 反应. Hue et al [36] 先用 H hepaticus ( 一种细菌 ) 激发 的不依赖 T 细胞的肠道炎症模型小鼠, 这些小鼠 出现的慢性盲肠结肠炎是通过先天性的免疫细 胞包括粒细胞和单核细胞介导的免疫反应, 代 表先天性免疫反应 ; 再用幼稚 CD4 + T 细胞过继 转染免疫缺陷的小鼠诱发严重的结肠炎模型, 这种小鼠的肠炎是由肠道固有层活化的 T 细胞 和树突状细胞介导的免疫反应, 代表继发性免 疫反应. 这两种模型均证明是 IL-23 而并非 IL-12 在这种口服细菌引起结肠炎中起重要的作用, 同时亦发现 IL-23 的升高只出现在盲肠和结肠, 与全身性的炎症反应无关. H o l m e t a l 给 T 和 B 细胞缺陷老鼠注射抗 CD40 的 mab 引发老鼠的局部和全身的炎症性疾 病, 包括消瘦 脾大 血清中炎症性因子升高 及结肠炎, 经研究发现全身性的炎症反应是由 IL-12 升高引起, 与 IL-23 无关, 而结肠的局部炎 症需要 IL-23 的存在, IL-12 可以不升高, 从而认 为抗 IL-23 是治疗 IBD 更特异性的靶点 [37].

60 395 Christoph et al 用能表达荧火虫荧光素酶的 IL-12 p40 增强子转基因小鼠研究 p40 基因在体内的转录调控机制, 只有在小肠中能检测到转基因的表达, 而全身的其他组织器官中并未检测到. p40 增强子的活性只局限末端回肠, 末端回肠的 CD11c+ 的固有层树突状细胞 (LPDCs)( 小肠固有层的主要细胞群 ) 表达高水平的 p40 mrna 和 p40 以及 p19 蛋白. 同时发现 p40 增强子的 NFκB 结合靶点有变异的转基因小鼠不能表达 p40, IL-12 p40 增强子转基因小鼠在无菌的环境中培养时却亦未检测到 p40 的表达. 通过上述实验表明细菌是引起 IL-23 升高最强的免疫原. 肠道固有层树突状细胞 (LPDCs) 吞噬病原体或 LPS 等抗原后激活核因子 NF-κB 引起 p40 和 p19 的表达增强, 从而使 LPDCs 分泌 IL-23 升高 [38]. LPDCs 主要分布在小肠, 而在结肠仅仅是在淋巴结和上皮下区可见极少量. 多个研究已经证明小肠和身体其他部位的树突状细胞 (DCs) 在平衡自身的免疫耐受和慢性炎症以及自身免疫性疾病中有重要的作用, 此功能的发挥很可能是通过吞噬凋亡的上皮细胞以及细菌并把抗原提呈给 T 细胞 [39-40]. 末端回肠的 IL-23 高表达也可能由于细菌较近端小肠相比更容易在此处定植有关 [38]. David et al [12] 建立了两种小鼠模型 (a)il-10 基因敲除小鼠 ( 能自发出现肠炎症状 ) 和 (b) 用 CD4 + T 细胞转染 Rag 基因敲除小鼠 (T 和 B 淋巴细胞缺陷小鼠 ) 发生了结肠炎的小鼠模型, 用于研究 IL-23 在结肠炎发病中的作用以及其触发的下游炎症因子. 他们观察 IL-12 p35 和 IL-10 双基因敲除小鼠发现其与 IL-10 基因敲除小鼠相似出生第 7 周就出现肠炎的表现并很快加重 ; 相反的是 IL-12 p19 和 IL-10 双基因敲除小鼠在出生后第 12 个月仍未发病, 从而证实了是 IL-23 并非是 IL-12 在 IL-10 基因敲除小鼠肠炎的发病中起重要的作用. 他们给 CD4 + T 细胞转染 Rag 基因敲除小鼠注入 IL-23, 发现 IL-23 能明显缩短这种小鼠出现结肠炎的时间 ; 并检测到多种炎症因子及基因的表达升高, 最引人注目的是 IL-17 基因的升高, IL-6 基因亦伴随升高 ; 同时发现记忆性淋巴细胞占了发生炎症部位结肠区 \ 淋巴细胞的 60% 80%. 已有研究表明 IL-23 能特异性诱导记忆性 T 淋巴细胞, 而 IL-12 只能诱导幼稚 T 淋巴细胞 [13-15]. 记忆性 T 淋巴细胞介导的免疫反应具有组织器官的靶向性 [41]. IL-17 主要由记忆性 T 淋巴细胞产生, IL-17 已经被证明了能刺激成纤维细胞 上皮细胞 内皮细胞 巨噬细胞分泌多种炎症因 子, 例如 IL-1 IL-6 TNF NOS-2 金属蛋白 酶 [42]. 某一部位的 IL-17 升高能诱导相应部位的 炎症反应, 具有部位的专一性 [43]. 他们还发现联 合抗 IL-17 和 IL-6 的治疗能明显减轻 IL-23 诱发的 肠炎. 以上实验都限于小鼠模型, 在人类身上所 做的研究发现, IL-23 p19 mrna 在 CD 患者的转 录水平明显升高, 在 UC 患者轻度升高, 在特异 性肠炎和正常人中没有升高 [44]. Fuss et al 也发现 CD 患者中 IL-23 水平升高, 并且用 IL-12 p40 mab 治疗后 IL-23 的水平下降 [45]. 可见 IL-23 主要介导肠道的免疫反应而并非 全身性. 针对 IL-23 或其受体的方案使 IBD 的治 疗更加有靶向性. 4 以 IL-23 为靶向治疗 CD 常用的治疗炎症性肠病的药物 ( 如 5-ASA 糖皮 质类固醇激素和各种免疫抑制剂 ) 对免疫系统 均表现出强大而广泛的抑制作用, 但均容易出 现严重感染等并发症, 且停药后容易复发. 因此, 寻找一种新的特异的针对炎症连锁反应的关键 步骤的治疗措施十分必要. 目前已经开展大量针对细胞因子的治疗策 略, 出现了抗 TNF mab 英利昔 (Infliximab) 人 类抗 IL- 6 受体 mab [46] 和抗炎因子 IL-10 [47] 等称之 为生物制剂的新一类药物. 其中英利昔 2003 年 获食品与药品管理局 (FDA) 批准用于治疗 IBD, 他是一种人 - 鼠嵌合抗 TNF-α mab, 其不仅与可 溶性 TNF 结合并可与膜结合 TNF 结合, 并通过激 活补体和抗体介导的细胞毒性反应 (ADCC) 诱 导炎症细胞溶解, 使表达 TNF 的 T 细胞克隆消除, 并通过增加凋亡蛋白 BAX/Bcl22 的活化来促进 T 细胞凋亡, 抑制炎症反应的发生. 临床试验已经 证实英利昔对难治性结肠 CD 及 CD 瘘管 ( 肛周或 腹部瘘管 ) 患者都有较好疗效 [48]. Schmidt et al [49] 用抗 p40 的 mab( 同时拮抗 IL-12 和 IL-23) 对 79 名 CD 患者进行随机双盲试验显示治疗组有效率 75%, 安慰剂组只有 25%, 同时观察到治疗组的 IL-12 和 IL-23 治疗前升高, 经过治疗后达正常水 平, IFN-γ TNF-α 及由 IL-23 诱生的 IL-17 和 IL-6 亦明显下降, 治疗后观察 18 wk, 治疗组及安慰剂 组副作用相当, 治疗组可见部分患者出现注射 部位疼痛反应. 有人发现 STA-5326, 一种三嗪类 的衍生物 (triazine derivative) 能阻断 p35 和 p40 的 转录, 从而选择性的抑制 Th 1 型的炎症反应. 口服 的 STA-5326 已经用于治疗克罗恩病和类风湿性 IL-23,.

61 396 ISSN CN /R 关节炎的 2 期临床试验中 [50]. 但无论是 Infliximab 1 Th 0 ( T ): Th 或是抗 IL-12 在 CD 的治疗都会出现或潜在抑制 CD4 + T 全身性免疫反应的副作用 ( 如诱发严重感染和结, Th 0 Th 核等 ) [51-52]. IL-23 在炎症反应中只局限于肠道, 特, IL-12 别是回肠末端, 针对 IL-23R 的拮抗剂更具有靶向 Th 1, IL-4 性. p19 mab 已经被证实能抑制 IBD 小鼠模型的 Th 肠道慢性炎症 [36] 2. 据此可以推断用特异性拮抗, T IL-23 的 p19 mab 治疗 CD, 特别是有末段回肠累. 及的患者可以得到很大的裨益. 2 Th 1 : Th 1 5 结论, 随着基因治疗的发展, 自身免疫性疾病也被纳 入基因治疗的范围, 可通过基因转移使机体表, Th 1 T 达免疫相关蛋白质, 从而下调致病的炎症和免, 疫反应, 上调保护性反应. 胃肠道上皮面积大 肠干细胞数量丰富 局部给药方法简单, 因而. 成为基因治疗的理想靶器官. 由于肠上皮细胞 3 Th 2 : Th 2 不断更新, 衰老的细胞脱落至肠腔, 新的细胞则 B 由位于肠隐窝底部的干细胞不断补充, 因此位. 于肠腺底部的干细胞成了基因治疗的最佳靶细 胞 [53]. 而 M 细胞是存在于黏膜集合淋巴结滤泡顶 部上皮中的一种特殊细胞, 其主要功能是将肠 腔内抗原和病原体跨上皮转运至上皮下淋巴组 织. 也可利用 M 细胞能广泛摄取各种抗原物质的 功能, 及其与免疫细胞之间的对话方式, 通过 M 细胞将载体导入黏膜淋巴组织, 从而调节局部 黏膜免疫反应和机体的系统免疫反应 [54]. 设想 构建表达 IL-23 反义寡核苷酸的载体, 予灌肠甚 至经肠镜局部给药可以达到特异性抑制肠道由 IL-23 介导的炎症反应. 而 IL-23R 基因上 IBD 的保 护性或易感 SNPs 对编码的 IL-23R 蛋白如何造成 结构功能的改变而发挥保护或易感的作用以及 如何利用 IL-23R 基因上的 IBD 的保护性 SNPs 进 行基因治疗值得进一步的研究. 6 参考文献 1 Ouyang Q, Tandon R, Goh KL, Ooi CJ, Ogata H, Fiocchi C. The emergence of inflammatory bowel disease in the Asian Pacific region. Curr Opin Gastroenterol 2005; 21: Ince MN, Elliott DE. Immunologic and molecular mechanisms in inflammatory bowel disease. Surg Clin North Am 2007; 87: Mariani P, Bachetoni A, D'Alessandro M, Lomanto D, Mazzocchi P, Speranza V. Effector Th-1 cells with cytotoxic function in the intestinal lamina propria of patients with Crohn's disease. Dig Dis Sci 2000; 45: MacDonald TT, Monteleone G, Pender SL. Recent developments in the immunology of inflammatory bowel disease. Scand J Immunol 2000; 51: Cooper AM, Kipnis A, Turner J, Magram J, Ferrante J, Orme IM. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 2002; 168: Oppmann B, Lesley R, Blom B, Timans JC, Xu Y, Hunte B, Vega F, Yu N, Wang J, Singh K, Zonin F, Vaisberg E, Churakova T, Liu M, Gorman D, Wagner J, Zurawski S, Liu Y, Abrams JS, Moore KW, Rennick D, de Waal-Malefyt R, Hannum C, Bazan JF, Kastelein RA. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity 2000; 13: Zhang XY, Zhang HJ, Zhang Y, Fu YJ, He J, Zhu LP, Wang SH, Liu L. Identification and expression analysis of alternatively spliced isoforms of human interleukin-23 receptor gene in normal lymphoid cells and selected tumor cells. Immunogenetics 2006; 57: Carmody RJ, Ruan Q, Liou HC, Chen YH. Essential roles of c-rel in TLR-induced IL-23 p19 gene expression in dendritic cells. J Immunol 2007; 178: IL-23IL ; 22: Parham C, Chirica M, Timans J, Vaisberg E, Travis M, Cheung J, Pflanz S, Zhang R, Singh KP, Vega F, To W, Wagner J, O'Farrell AM, McClanahan T, Zurawski S, Hannum C, Gorman D, Rennick DM, Kastelein RA, de Waal Malefyt R, Moore KW. A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R. J Immunol 2002; 168: Mathur AN, Chang HC, Zisoulis DG, Stritesky GL, Yu Q, O'Malley JT, Kapur R, Levy DE, Kansas GS, Kaplan MH. Stat3 and Stat4 direct development of IL-17-secreting Th cells. J Immunol 2007; 178: Y e n D, C h e u n g J, S c h e e r e n s H, P o u l e t F, McClanahan T, McKenzie B, Kleinschek MA, Owyang A, Mattson J, Blumenschein W, Murphy E, Sathe M, Cua DJ, Kastelein RA, Rennick D. IL-23 is essential for T cell-mediated colitis and promotes inflammation via IL-17 and IL-6. J Clin Invest 2006; 116: Belladonna ML, Renauld JC, Bianchi R, Vacca C, Fallarino F, Orabona C, Fioretti MC, Grohmann U, Puccetti P. IL-23 and IL-12 have overlapping, but distinct, effects on murine dendritic cells. J Immunol 2002; 168: Lankford CS, Frucht DM. A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity. J Leukoc Biol 2003; 73: Trinchieri G, Pflanz S, Kastelein RA. The IL-12 family of heterodimeric cytokines: new players in the regulation of T cell responses. Immunity 2003; 19: Cua DJ, Sherlock J, Chen Y, Murphy CA, Joyce B, Seymour B, Lucian L, To W, Kwan S, Churakova T, Zurawski S, Wiekowski M, Lira SA, Gorman D, Kastelein RA, Sedgwick JD. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature 2003; 421: Zhang GX, Gran B, Yu S, Li J, Siglienti I, Chen X,

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64 REVIEW ; 16(4): ISSN CN /R 炎症性肠病与免疫学关系研究进展 Advances in studies on relation between inflammatory bowel disease and immunity Hua-Xiu Shi, Jian-Lin Ren, Wei-Guo Dong Hua-Xiu Shi, Jian-Lin Ren, Department of Gastroenterology, Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen , Fujian Province, China Wei-Guo Dong, Department of Gastroenterology, People s Hospital of Wuhan University, Wuhan , Hubei Province, China Correspondence to: Wei-Guo Dong, Department of Gastroenterology, People s Hospital of Wuhan University, Wuhan , Hubei Province, China. dongwg@public.wh.hb.cn Received: Revised: Abstract Inflammatory bowel disease is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract. Its main clinical manifestations are abdominal pain and diarrhea. Its etiology is complicated. Immune system is very important. Following factors, such as intestinal environment, immune cells, human leukocyte antigens, antibodies, anti- laminaribioside antibody, anti-chitobioside antibody IgA, cytokines, cell adhesion molecules, NO and NF-κB, play a key factor in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Inflammatory bowel disease is related to all these factors. This paper reviews the possible role of these immune factors in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Key Words: Immune factors; Inflammatory bowel disease Shi HX, Ren JL, Dong WG. Advances in studies on relation between inflammatory bowel disease and immunity. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): ,,,,,, Laminaribioside(ALCA) Chitobioside IgA(ACCA) NF-κB,,. 关键词 0 引言炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD) 包括溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 和克罗恩病 (Crohn's disease, CD), 其病因和发病机制仍不清楚. 目前认为 IBD 发生与多因素有关, 即在遗传物质基础上, 由于抗原刺激和体内免疫系统的激活, 各种环境因素相互作用而引起的慢性肠道炎症 [1-5]. 本文就 IBD 与免疫学关系的研究进展作一综述. 1 IBD 与肠道内环境目前研究表明, 肠内细菌的存在是 IBD 发病的必要条件, 同一种小鼠在普通环境和无特定病原体环境中可以建立结肠炎模型, 而在无菌环境中无法形成炎症模型, 黏膜炎症经抗生素治疗后改善, 表明肠道内定居的微生物与本病的启动有关 [6-8]. Van et al [9] 证实微生物的代谢产物丁酸盐 异戊酸盐和铵能影响肠上皮细胞代谢的完整性, 从而诱发黏膜免疫反应. 胃肠道内有大量的抗原物质存在, 如致病菌 正常菌群 细菌毒素及病毒等, 肠免疫系统具有两个方面的 (inflammatory bowel disease, IBD),, I B D,.,,

65 400 ISSN CN /R 功能, 既要保护肠黏膜, 抵御致病因子的入侵, IBD, 又要吸取营养物质, 耐受正常的肠道菌群, 所有 I B D 这些肠内容物均可能是潜在的免疫原, 上皮细, 胞黏膜屏障的破坏为大量摄取肠抗原创造条件,, 无节制的免疫反应及免疫调节失衡是 IBD 的免, 疫学特性 [10].. 2 IBD 与免疫细胞 引起炎症反应的 T 细胞与调节性 T 细胞平衡是机, 体调节免疫反应的主要模式, 其紊乱可诱发 IBD 等免疫性疾病. 肠道共生的微生物抗原刺激肠, 黏膜 T 细胞, CD4 + T 细胞在 IL-12 的作用下分化. 为 Th1 细胞, 分泌干扰素 -γ(ifn-γ) 介导肠黏膜炎 症, IFN-γ 活化单核巨噬细胞, 使之释放前炎性 细胞因子肿瘤坏死因子 -α(tnf-α) IL-6 和 IL-1 参与炎症过程, 形成 IFN-γ TNF-α 升高的 Th1 型 黏膜炎症, 表现与 CD 相似 [11-14]. CD4 + T 细胞分泌 IL-4 IL-5 和 IL-13, 形成 Th2 型黏膜炎症, 表现与 UC 相似, 因此推测 UC 可能是 Th2 细胞介导的疾 病, 目前支持该观点的证据有 : (1)UC 患者比 CD 患者体内存在更多自身抗体, Th2 细胞有助于 B 细胞活化产生抗体 ; (2)UC 中增加的自身抗体主 要为 Th2 相关的抗体类型 ; (3)EB 病毒诱导的产 物现在被鉴定为 Th2 型细胞因子, 这种细胞因子 增加见于 UC [15-17]. 调节性 T 细胞被认为是一类能产生免疫抑制 作用的相对独立的 T 细胞亚群. 调节性 T 细胞 Tr1 可分泌高水平的 IL-10, 肠道内环境的稳定需要 Tr1, 当肠道病原体被清除后, Tr1 可通过 IL-10 下 调炎症反应 [18]. 在研究口服诱导耐受过程中发现 的 Th3 细胞可通过分泌转化生长因子 -β(tgf-β) 在黏膜免疫中承担调节作用, TGF-β 具有广泛的 抗炎症作用, 能抑制 Th1 和 Th2 细胞的活化, 是自 身免疫调节的重要因素. CD4 + CD25 + T 调节细 胞是目前研究的热点, 在正常个体体内, 生理性 CD4 + CD25 + T 细胞约占 CD4 + T 细胞的 5%-10%, 其数量及活性足以抑制自身免疫性疾病的发生. CD4 + CD25 + T 细胞的免疫抑制作用主要是抑制 自身反应性 T 细胞, 以维持自身免疫平衡, 研究 表明 CD4 + CD25 + T 调节细胞功能失调与 IBD 发 病有关 [19-21]. 3 IBD 与人类白细胞抗原 (human leucocyte antigens, HLA) I B D 的发病具有遗传倾向, 研究表明 U C 的发 病与 HLA-DR2 呈正相关, CD 患者 HLA-DR 1 和 HLA-DQ W5 明显升高. 国外研究表明, CD 患者的 HLA-DR 1 出现率增加, UC 患者的 HLA-DR 2 出现率增加, 而 HLA-DR 4 与 HLA-DR W6 出现率均减少. 无论细胞免疫还是体液免疫, HLA 在免疫反应中起了关键作用 [22-26]. 4 IBD 与自身抗体抗中性粒细胞胞质抗体 (antineutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) 是一类作用于中性粒细胞胞质成分的自身抗体, 最先发现于肾小球肾炎和系统性脉管炎等患者的血清中. ANCA 可通过毛细血管中的中性粒细胞 单核细胞或肠上皮细胞引起溶菌酶释放, 导致大面积血管或肠组织损害 ; ANCA 亦可引发 T 细胞介导的细胞免疫协同作用造成组织损伤 [27-29]. 近几年 ANCA 与 IBD 的关系是研究热点之一, Preda et al [30] 测定 UC 患者和 CD 患者血清, 发现 36.4% 的 UC 患者血清 ANCA 阳性, 而仅 15% CD 患者阳性, 且均限于结肠受累的情况. ANCA 可分为胞质型 (canca) 和核旁型 (panca), 后者与 IBD 相关. 研究发现普遍人群中 panca 阳性率为 2.9%, CD 患者阳性率为 10%-20%, 而 UC 患者的阳性率达 50%-85%, 反映了病变过程中机体存在免疫功能紊乱. 由于 ANCA 在 UC 患者中呈家族聚集现象, 有望成为 UC 较特异的血清标记物 [31-32]. 近年来研究报道抗酿酒酵母抗体 (a n t i- sacchromyces cerevisia antibody, ASCA), 是大多数 CD 患者的血清学标志物. 进一步研究表明, ASCA 在 CD 的特异性表达, 不仅是肠道受侵犯时的一种简单副现象 (epiphenomenon), 而且是 CD 患者的一种家族免疫性的表达. 文献报道, ASCA 在 CD 患者阳性率为 48%-69%, 在 UC 患者中的阳性率达 6%-15%. ASCA 研究的意义在于 : (1)CD 患者亲属中罹患 CD 易感性增高, ASCA 水平可作为有价值的 CD 标志物 ; (2)CD 患者 ASCA 阳性与阴性亚群, 可能在预后 治疗反应以及明确的遗传学标志物上均不同 [33-36]. 5 IBD 与抗 Laminaribioside 糖抗体 (ALCA) 和抗 Chitobioside IgA 糖抗体 (ACCA) 以色列 Dotan et al [37] 报道, ALCA 和 ACCA 是两种与 CD 密切相关的新的血清学标志物, 他们首次应用多聚糖间接免疫荧光芯片技术检测了 72 例 CD 患者 56 例 UC 患者和 41 例健康对照者血清中的抗多聚糖抗体谱, 再用 ELISA 技术对 124 例 CD 患者 106 例 UC 患者和 101 例健康对照者的

66 401 血清学进行筛查, 发现 ALCA 和 ACCA 是鉴别 CD 和 UC 最有诊断价值的两种新抗体, 其在 CD 患者的阳性率显著高于 UC 患者, 且在 44% ASCA 阴性的 CD 患者中, ALCA 或 ACCA 检测呈阳性. 如 IBD 患者对 ALCA 和 ACCA 中至少一种呈阳性结果, 其诊断 CD 敏感性为 77.4%, 特异性为 90.6%, 在 CD 患者中, 高水平的 ALCA 与小肠病变密切相关. 6 IBD 与细胞因子细胞因子 (cytokines, CK) 是由多种细胞产生的多肽或低分子糖蛋白. IBD 活动期患者肠黏膜固有层与肠系膜淋巴结中淋巴细胞产生的 IL-1 IL-6 和 TNF-α 水平增加, 增加程度与病变的活动性有关. 这些炎性前细胞因子可能通过下列机制介导肠道炎症反应 : (1) 对中性粒细胞和巨噬细胞有趋化作用 ; (2) 通过黏附分子的作用来增加白细胞对血管壁的黏附性 ; (3) 激活巨噬细胞 ; (4) 激活 T B 淋巴细胞, 具有上调免疫反应的作用 ; (5) 促使巨噬细胞 内皮细胞和成纤维细胞合成前列腺素 E2(PGE2) 前列腺素 12(PG12) 增加 ; (6) 使内皮细胞血小板激活因子 (PAF) 增多. 由活化的 T 细胞产生 与 IBD 发病有关的 CK 包括 IL-1 IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-11 IFN-γ 和 TNF-α 等. CK 既可以使大量的 T 细胞, 尤其是 CD4 + T 细胞迅速分裂 增殖, 形成致敏淋巴细胞, 又可以活化粒细胞, 增强 NK 细胞和 LAK 细胞的杀伤力, 并诱导黏附分子表达及肥大细胞脱颗粒, 以增进炎症反应 [38-43]. Fantini et al 研究认为 IL-1 IL-2 参与 IBD 发生, T 细胞活化产生的 IL-2 可通过激活 T 细胞 B 细胞和巨噬细胞产生多种 CK, 从而参与 IBD 的炎症过程 [44]. TNF-α 也是 CD 黏膜损伤的重要介质. 用抗 TNF 抗体治疗 CD 患者, 可以使肠道炎症很快消退 [45]. T 细胞分泌的 IL-22 作用于结肠上皮下肌纤维母细胞 (subepithelial myofibroblasts, SEMFs), 可以促进前炎性细胞因子表达 [46-47]. Yen et al 对 IL-23 缺失模型和 IL-12 缺失模型的研究表明 IL-23 是慢性肠道炎症出现临床表现的必需因子 [48]. IL-23 的一个重要靶细胞群是记忆性 T 细胞亚群, 他们可以被 IL-23 特异性激活, 产生促炎性细胞介质 IL-17 和 IL-6, 这一途径可能与慢性肠道炎症和其他慢性自身免疫性炎症性疾病密切相关 [49]. IL-25 由肠道 T 细胞分泌, 也可由嗜酸性粒细胞产生, 近年来研究表明, 他能促进 Th2 细胞活 化增殖 分泌 IL-4 IL-5 和 IL-13, 抑制 Th1 细胞 分化增殖进而抑制 Th1 型细胞因子的产生, 说明 IL-25 在调节胃肠道炎症中起重要作用 [50]. Whittall et al [51] 研究发现在 CD 患者中分离出的树突 状细胞被热休克蛋白 70(HSP70) 刺激后分泌的 TNF-α 浓度明显增高, 这与细胞外信号转导途 径有关. IFN-γ 诱导的蛋白 -10(interferon-gammainducible protein-10, IP-10) 是一个 T 细胞和单核 细胞的趋化因子, Inatomi et al [52] 研究发现 IFN-γ 能强烈诱导 IP-10 mrna 表达, IP-10 能介导 IBD 慢性炎症. 此外, 肾素血管紧张素系统 (RAS) 也 与结肠的免疫系统相关, RAS 可通过调节结肠内 的前炎症性和抗炎症性细胞因子而参与三硝基 苯磺酸 (TNBS) 诱导的结肠炎的发病过程 [53]. 7 IBD 与细胞黏附分子 细胞黏附分子 (cell adhesion molecules, CAMs) 是 一类介导免疫与内皮细胞相互作用的糖蛋白分 子. 淋巴细胞功能相关抗原 -1(LFA-1) 与细胞间 黏附分子 -1(ICAM-1) 结合能使吞噬细胞移出血 管进入肠道病变组织, 在 IBD 初期, 内皮细胞表 达 ICAM-1 明显增加, 同时伴有单核巨噬细胞表 达 LFA-1 增加, 提示黏附分子在炎性细胞进入病 变组织过程中起重要作用 [54-57]. Bachmann et al [58] 报道黏膜地址素细胞黏附分子 -1(MAdCAM-1) 在 U C C D 和肠易激综合征的表达是不同的, MAdCAM-1 丰富地表达于 UC CD 的炎症黏 膜, 且 CD 在溃疡基底部表达比 UC 丰富, 提示 MAdCAM-1 可能与 CD 透壁性炎症相关. Rijcken et al [59] 研究应用 UC CD 及对照的肠标本检测多 种黏附分子在肠道的表达, 结果提示活动性 UC 患者黏膜中静脉及血管周围的单核细胞上血小 板内皮细胞黏附分子 -1(PECAM-1) 表达明显增 强, PECAM-1 在炎症时淋巴细胞跨越移行中起 重要作用, 与 IBD 炎症细胞的渗出机制有关. 选择素及他们的配体 I C A M - 1 VCAM-1 VLA-4 和整合素 β 等 CAMs 在 UC 和 CD 患者肠病变中有重要作用, 用于治疗 IBD 的 经典药物糖皮质激素和 5- 氨基水杨酸的作用 机制即部分与 CAMs 的合成与功能有关, 说明 CAMs 与 IBD 发病有关 [60-61]. 8 IBD 与 NO 一氧化氮 (NO) 是一种多效性的自由基信号分子, 他可促进和抑制氧自由基介导的组织损伤. 大 量资料证实, NO 参与了 UC 发生过程中的炎症 D o t a n et al, ALCA ACCA CD, CD U C, ALCA ACCACD UC, CD 77.4%, 90.6%..

67 402 ISSN CN /R 和组织损伤. 检测 UC 活动期患者结肠黏膜的还 I B D 原型辅酶 Ⅱ(NADPH) 发现 : 黏膜隐窝中 NADPH, 依赖性酶 (NADPH-diaphourase, Nd) 染色增多,, 表明在 UC 中有一氧化氮合酶 (NOS) 诱导存在. NOS 分为原生酶 (cnos) 和诱生酶 (inos) 两种,, I B D 在 UC 结肠黏膜层主要以 inos 为主. NO 在 UC 炎, 症过程中充当了双重角色, 既有保护作用, 又有 I B D 杀伤毒性和促炎作用. 在炎症初期, 可抑制激活. 的巨噬细胞和 T 细胞的功能, 并能抑制血小板聚 集, 防止血栓形成, 同时抑制髓过氧化物酶的活 性, 保护上皮屏障及促进上皮修复. 随着炎症的 发展, 大剂量 NO 由 inos 催化产生, 从而一方面 可通过伴随产生的自由基损伤组织, 另一方面 启动机体免疫防御系统, 如巨噬细胞 中性粒 细胞, 抑制靶细胞内 DNA 复制, 降低靶细胞内 camp/cgmp 比例, 激活 NK LAK 细胞, 直接增 强其细胞毒性, 若作用过强, 即可造成正常组织 的损伤. 在体外实验或体内急性炎症研究中表 明 NO 有较强的抗黏附作用, NO 在 IBD 的抗黏附 作用, 参与调节体内内皮细胞黏附分子 (ECAM) 表达的分子机制, 抑制所谓的趋集瀑布机制中 各步骤的反应剂, 有望成为新药来控制和逆转 IBD 的炎症反应 [62-68]. 9 IBD 与核因子 NF-κB 血液循环和肠道细胞因子表达异常是 IBD 发病 的重要机制, 核因子 NF-κB 是一种调节各种细 胞因子 趋化因子 黏附分子的转录因子, 在 IBD 复杂的细胞因子网络失调中, NF-κB 活化是 一个中心环节. IBD 中 NF-κB 活性增高的同时伴 有 IL-1 IL-6 TNF-α 等升高, IL-1 和 TNF-α 可 促进 NF-κB 进一步活化, 后者通过正反馈使 IL-1 和 TNF-α 分泌进一步增加, 同时使其他细胞因子 IL-6 IL-8 等表达增加, 产生级联反应, 使炎症 过程得以持续和放大. 研究表明, 在 IBD 患者肠 浆膜组织纤维母细胞中 NF-κB 和 ICAM-1 表达 明显增强 [69-70]. Guidi et al [71] 研究发现活动期 IBD 患者的黏膜固有层单核细胞中可检测到增加的 NF-κB, 说明 NF-κB 在 IBD 中调节炎症性细胞因 子的分泌. 总之, IBD 病因和发病机制复杂, 涉及免疫 学 遗传学以及环境因素等多方面问题, 免疫 因素在 IBD 发病过程中起重要作用, 但究竟哪一 种免疫因素起主要作用, 各免疫因素之间有哪 些相互联系及针对哪一免疫因素治疗更有效, 都有待于进一步研究. 10 参考文献 1 Baumgart DC, Carding SR. Inflammatory bowel disease: cause and immunobiology. Lancet 2007; 369: Young Y, Abreu MT. Advances in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Curr Gastroenterol Rep 2006; 8: Yamamoto-Furusho JK, Podolsky DK. Innate immunity in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2007; 13: Schmidt C, Stallmach A. Etiology and pathogenesis o f i n f l a m m a t o r y b o w e l d i s e a s e. M i n e r v a Gastroenterol Dietol 2005; 51: D a n e s e S, F i o c c h i C. E t i o p a t h o g e n e s i s o f inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol 2006; 12: Gueimonde M, Ouwehand A, Huhtinen H, Salminen E, Salminen S. Qualitative and quantitative analyses of the bifidobacterial microbiota in the colonic mucosa of patients with colorectal cancer, diverticulitis and inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2007; 13: Barnich N, Darfeuille-Michaud A. Role of bacteria in the etiopathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2007; 13: Lakatos PL, Fischer S, Lakatos L, Gal I, Papp J. Current concept on the pathogenesis of inflammatory bowel disease-crosstalk between genetic and microbial factors: pathogenic bacteria and altered bacterial sensing or changes in mucosal integrity take "toll"? World J Gastroenterol 2006; 12: van Nuenen MH, de Ligt RA, Doornbos RP, van der Woude JC, Kuipers EJ, Venema K. The influence of microbial metabolites on human intestinal epithelial cells and macrophages in vitro. FEMS Immunol Med Microbiol 2005; 45: Ohkusa T, Nomura T, Sato N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med 2004; 43: Dubinsky MC, Taylor K, Targan SR, Rotter JI. Immunogenetic phenotypes in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2006; 12: Kaliora AC, Stathopoulou MG, Triantafillidis JK, Dedoussis GV, Andrikopoulos NK. Alterations in the function of circulating mononuclear cells derived from patients with Crohn's disease treated with mastic. World J Gastroenterol 2007; 13: Yamamoto-Furusho JK, Korzenik JR. Crohn's disease: innate immunodeficiency? World J Gastroenterol 2006; 12: Monteleone G, Monteleone I, Fina D, Vavassori P, Del Vecchio Blanco G, Caruso R, Tersigni R, Alessandroni L, Biancone L, Naccari GC, MacDonald TT, Pallone F. Interleukin-21 enhances T-helper cell type I signaling and interferon-gamma production in Crohn's disease. Gastroenterology 2005; 128: Alkim C, Balci M, Alkim H, Dagli U, Parlak E, Tezel A, Ulker A. The importance of peripheral immune cells in inflammatory bowel disease. Turk J Gastroenterol 2007; 18: Li MC, He SH. IL-10 and its related cytokines for treatment of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2004; 10: Shiobara N, Suzuki Y, Aoki H, Gotoh A, Fujii

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71 REVIEW ; 16(4): ISSN CN /R 肝素酶 : 肿瘤治疗的新靶标,,.,.,. β-,,,,..,, Heparanase: a novel target of tumor metastasis therapy Shu-Guang Tian, Hong-Wei Gao, Hong-Yu Chang, Su- Bo Li, Xuan-Lin Wang, Yang-Pei Zhang, Feng Gong Shu-Guang Tian, Hong-Wei Gao, Hong-Yu Chang, Su- Bo Li, Xuan-Lin Wang, Yang-Pei Zhang, Feng Gong, Institute of Blood Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing , China Correspondence to: Feng Gong, Institute of Blood Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing , China. gongfeng@nic.bmi.ac.cn Received: Revised: Abstract Heparanase plays a key role in promoting tumor angiogenesis, vasiveness and metastasis. This predominant enzyme is primarily responsible for cleaving heparin sulphate, the main polysaccharide constituent of extracellular matrix and basement membrane, thus having become a novel target of tumor therapy. It can prevent tumor growth and metastasis by inhibiting its expression and reducing its activity. This paper reviews the biological characteristics of heparanase as a target of tumor therapy, its significance in cancer progression and certain tumor therapies as well as its prospect in clinical applications. Key Words: Heparanase; Tumor metastasis; Inhibitor; Antibody; Vaccine Tian SG, Gao HW, Chang HY, Li SB, Wang XL, Zhang YP, Gong F. Heparanase: a novel target of tumor metastasis therapy. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 关键词 0 引言肿瘤已经成为人类生存和健康的重要威胁, 全世界每年有 600 多万人死于各种肿瘤, 而且死亡人数呈递增趋势. 癌症的预防和治疗已经成为全世界生命科学研究共同瞩目的课题. 肿瘤治疗药物一直是药物研究领域的热点. 传统的细胞毒类抗癌药物特异性差 毒副作用高, 在捕杀肿瘤细胞的同时对患者正常细胞造成严重损伤, 影响组织或器官功能恢复. 新型肿瘤药物的研究突破传统的抑制核酸合成 有丝分裂的理念, 向针对肿瘤发展过程中某一重要分子设计药物的方向发展具有良好选择性 高特异性 无 ( 或低 ) 毒副作用的新型抗肿瘤药物将成为研究和开发的新目标. 近 20 年来, 肿瘤分子生物学 肿瘤细胞生物学 肿瘤免疫学等学科取得长足的发展, 肿瘤的发生机制日渐明朗, 越来越多的肿瘤相关蛋白被发现, 为肿瘤的治疗提供了新靶点. 肝素酶 (heparanase, HPA) 是一种 β- 葡萄糖醛酸酯酶, 为迄今发现唯一作用于细胞外基质多聚糖的内切酶 [1]. 能够特异性识别硫酸肝素 (heparan sulfate, HS) 结构, 并能将其降解为 糖单位的寡糖链 [2-3]. 其基因定位于 4q21.3, 全长约为 40 kb, 编码一个由 543 个氨基酸残基组成 相对分子质量为 kda 的蛋白前体. HPA 前体经蛋白酶切除 N 端 157 个氨基酸残基, 形成由 386 个氨基酸组成 相对分子质量约为 kda 的成熟高活性蛋白. 在

72 407 肿瘤发生时 HPA 特异性高表达, 通过降解细胞外基质 (extracelluar matrix, ECM) 及血管基底膜 (basement membrane, BM) 上乙酰肝素蛋白多糖 (heparan sulfate protoglycan, HSPG) 的 HS 侧链, 破坏细胞间质的屏障功能, 同时释放结合于 HS 的各种生长因子, 促进肿瘤组织新生小血管生成, 对肿瘤细胞的侵袭 转移和定居发挥关键作用 [4-9]. 1 肝素酶与肿瘤发生 发展的相关性 HPA 主要表达于细胞内, 分布于高尔基体和溶酶体, 细胞间质和细胞膜上也有少量存在 [10]. HPA 的表达和分泌受严格控制, 以避免过量降解 ECM 和 BM 上的 HSPG, 造成细胞迁徙和组织损伤, 引起机体病变 [11-12]. HPA 在胚胎的形成 机体的发育 免疫应答 炎症反应 血管生成 创伤愈合 组织修复和肿瘤转移等方面发挥重要作用 [13-17]. 生理条件下, 胚胎 脾脏 淋巴 胸腺 骨髓等组织以及白细胞 血小板中 HPA 含量较高, 其他组织中含量则很低. 机体处于病理状态时 HPA 被激活而过量表达, 活化后发挥高效的酶活力 [18-19]. 例如炎症发生时, HPA 通过降解 HSPG 使血管通透性增高, 帮助炎性因子 ( 如 IL-2) 和白细胞突破分子屏障到达炎症部位. 同时 HPA 能够促进 HS 上的细胞因子释放, 如血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factors, VEGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 血小板源性生长因子 (PDGF) 等, 他们通常以非活性形式结合于 HS, 释放到组织后, 有利于新生血管形成和组织修复 [20-21]. 特别是 HPA 与肿瘤的发生 发展以及转移的密切相关性, 引起了生命科学领域的广泛关注 [22-24]. 大量的研究结果证明, 恶性肿瘤及转移性肿瘤组织中 HPA 明显高于良性肿瘤和正常组织, 即 HPA 与肿瘤转移密切相关 [25-33]. 目前的研究提示 HPA 促进肿瘤转移机制主要包括以下几个方面 : (1) 破坏 ECM 和 BM 屏障. 肿瘤细胞的浸润和转移需要首先突破细胞外间质形成的包裹和穿透毛细血管内皮细胞. 基质金属蛋白 (matrix metalloproteinases, MMP) 胶原酶 Ⅳ(collagenase Ⅳ) 血纤溶酶原激活物(plasminogen activator) 组织蛋白酶 B(cathepsin B) 和 HPA 等参与了 ECM 和 BM 中蛋白和蛋白多糖的降解, 其中 HPA 通过作用于 HS 链的特异性位点, 破坏 ECM 和 BM 结构完整性, 使肿瘤细胞得以突破屏障, 侵袭邻近器官和组织, 或通过血管转移到机体的其他部 位. (2) 促进新血管生成. HPA 不仅仅通过降解 ECM 和 BM 屏障而发挥促肿瘤转移的作用, 而且能以间接方式诱导新血管的生成. bfgf 和其他细胞生长因子通常以无活性的方式固定或局限于 HS 链上, 在 HPA 降解 HSPG 过程中得到释放和活化, 共同诱导肿瘤血管生成, 为肿瘤的生长 浸润和转移提供营养和通道 [34-35]. COX-2 (cyclooxygenase-2) 能够促进微血管的生成, 而 HPA 与 COX-2 的表达有密切的联系, 他对 COX-2 的表达具有正调控作用 [36]. (3) 通过促进释放尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase type-plasminogen activator, upa) 和组织型纤溶酶原激活物 (tissue type-plasminogen activator, tpa), 激活纤溶酶原, 活化 MMP, 酶解 ECM 和 BM 中的结构蛋白 [37], 降低屏障功能. (4) 通过破坏 ECM 和 BM 屏障, 释放多种细胞因子, 诱导 T 细胞介导的迟发性超敏反应, 促进以渗出 黏附和趋化作用为主的炎症反应, 从而加剧 ECM 和 BM 的损伤, 引起肿瘤细胞与 ECM 和 BM 的黏附, 提高肿瘤细胞的渗透和迁徙能力. (5) 随着研究的深入, 有人提出 HPA 促进肿瘤的转移和生长的作用不仅仅依赖他的 HPA 活性 ( 降解 HS), 而且与他启动了信号转导通路密切相关. Goldshmidt et al [38] 认为细胞表面或分泌型的 HPA 具有介导细胞与细胞间质的黏附作用. Zetser et al [39] 实验证明 HPA 超表达时, VEGF mrna 水平明显增加, 并伴有细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK) 的磷酸化水平增加, 说明 VEGF 等细胞因子增加不仅仅由于 HPA 降解 HS 导致细胞因子的释放, 而是启动了信号通路 [40]. 2 肝素酶与肿瘤的治疗随着基因组学 蛋白组学 细胞生物学 药理学研究的飞速发展以及在肿瘤学上的深入研究, 细胞周期的调控 细胞凋亡的诱导 血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用过程得到了进一步认识, 肿瘤形成的分子机制 肿瘤细胞的信号转导过程也被逐步阐明, 一些与肿瘤细胞分化增殖以及转移相关的关键酶逐步被发现. 以这些关键酶作为药物筛选新靶点, 研究和开发靶向抗肿瘤药物将是肿瘤预防和治疗有力武器. 通过不断深入的研究, HPA 的生物学特性及作用机制逐步得到揭示, 他与肿瘤转移的高度相关性也不断得到证明. 这一特定靶点受到越来越多研究者的关注, 以 HPA 为靶点而进行的抗肿瘤药物的研发将可能在肿瘤治疗上获得突破,,,.,. PI-88( ),..

73 408 ISSN CN /R 性进展, 具有十分光明的前景 [41-42]. V l o d a v s k y et al 对于 HPA 抑制剂的研究已有 20 年, 早期的 研究已经部分揭示了 HPA 抑制剂具有抗炎和抗, 肿瘤的作用, 但是 HPA 用于肿瘤治疗的概念始, 于 1991 年. 当时 Nakajima et al [43] 报道了苏拉明, (surnamin), 一种杀寄生虫药物, 具有抗肿瘤转移 的作用, 进一步的研究证实他是通过抑制 HPA 活. 性发挥作用的. 此后一些硫酸化多糖或寡糖作 1991Nakajima et al 为 HPA 抑制剂的研究受到关注, 但是由于当时 (surnamin) HPA 生物特性及其促肿瘤转移的机制尚不清晰,, 以 HPA 作为肿瘤治疗靶标的研究进展缓慢. 1999, 年 HPA 基因克隆的研究结果报道后 [44], 有关 HPA 生物特性以及在促肿瘤转移机制上的研究获得. 突破, 许多科学家从抑制 HPA 过量表达和降低 其酶活性以及机体免疫清除为出发点展开了一 系列的研究, 并且取得了很好的成绩 [45]. 目前以 HPA 为靶标的肿瘤治疗方案主要有三种 : HPA 抑 制剂 HPA 抗体 HPA 疫苗, 其中有许多药物和 方案已获得专利, 另外有几种药物已经被批准 进入临床试验. 2.1 HPA 的异常高表达是 造成肿瘤转移的关键因素, 有效抑制 HPA 的表达 及降低其活性可以保护 ECM 和 BM 免遭破坏, 抑 制新生血管生成, 防止肿瘤细胞突破屏障迁徙 到正常组织和器官 [46]. 实验发现硫酸海带多糖 (laminarin sulfate) 能够显著的降低 (>90%)B16 恶 性黑素素瘤 Lewis 肺癌 乳腺癌细胞在肺内 转移范围, 说明抑制 HPA 活性能够有效阻止肿瘤 的侵袭和转移 [47-49]. 同时实验还发现, 通过抑制 HPA 活性可以治疗或减缓炎症反应和一些自身 免疫疾病, 如实验性自身免疫脑脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 佐 剂性关节炎 (adjuvant arthritis) 和移植排斥反应 (graft rejection). 最近人们还发现可以通过抑制 HPA 的活性能够治疗心血管疾病和动脉粥样硬 化等, 所以 HPA 抑制剂的开发具有更加重要的临 床意义. HPA 抑制剂的研究现已获得突破性进展, 在 1999 年后的几年内就有多项专利和大量论文发 表. 这些抑制剂按照化合物结构可分为以下几 类 : (1) 模拟硫酸肝素的多阴离子化合物 ; (2) 硫 酸化单糖 多糖或寡糖 ; (3) 卡巴唑衍生物 ; (4) 二苯基醚衍生物 ; (5) 吲哚类衍生物 ; (6) 多肽类 化合物 ; (7) 制唾酸酶 B 的衍生物等 [50]. 其中模拟 硫酸肝素的多阴离子化合物活性最为明显, 他 能够竞争性的与 HPA 结合, 从而降低 HPA 对底物 HS 的酶解, 发挥抗肿瘤转移的作用 [51-55]. PI-88, 一种五糖成分的硫酸化低聚甘露醇糖磷酸酯 (phosphomannopenlaose sulfate), 具有良好的抑 制血管生成和抑制 HPA 活性的作用, 是目前最受 关注的肿瘤抑制药物之一. 动物试验发现他对 高侵润性鼠乳腺癌 1376MAT 细胞抑制率达 50%, 同时发现肿瘤周围的血管生成减少了 30%. 采用 PI-88 抑制了 HPA 活性后, 白血病动物模型中恶 性程度高的细胞明显减少. 通过第 Ⅰ 期 第 Ⅱ 期临床实验, PI-88 对转移性肿瘤良好的抑制作 用也得到了证实 [56]. 最近, 一种新型的来源于海 洋的硫酸化低聚糖 JG3 被报道 [57], 他在体内外都 能够抑制肿瘤的发生和转移. JG3 通过与 HPA 分 子的 KKDC 和 QPLK 肽段结合形成 JG3-HPA 复合 物, 竞争性地抑制其与小分子质量的肝素结合, 从而抑制 HPA 的活性. 同时, JG3 抑制细胞外基质 HS 所锚定的 bfgf 释放. 而且, JG3 作为一个拟 HS 物和竞争性抑制剂, 能阻止 bfgf 与其受体的结 合. 但是这类化合物抑制剂存在着不同的缺陷 : 抗凝血 毒性以及影响组织修复等, 例如 PI-88 可引起免疫介导的剂量限制性的血小板减少症, 这些副作用很大程度上阻碍了抑制剂的开发, 所以人们需要找到一些更加有效 无 ( 或低 ) 毒 副作用的 HPA 抑制剂用于肿瘤的治疗. 随着基因技术高速发展, 人们将基因技术 也应用于抑制 HPA 的表达, 特别是通过反义核 酸技术和 RNA 干扰技术实现了对 HPA 表达的抑 制 [58-60] 年 Uno et al [61] 成功构建了 HPA 反义 腺病毒载体 (adenoviral-delivered antisense heparanase, AD-AS/hep), 经 AD-AS/hep 转染的食道 癌细胞和 A549 肺癌细胞 HPA 表达明显受到抑制, 而且被 AD-AS/hep 转染 A549 肺癌细胞 BALB/c 小鼠体内肿瘤数量和体积显著降低. Edovitsky et al [62] 曾尝试使用 sirna 技术降低 HPA 的表达, 结果显示实验模型中肿瘤细胞的转移活性明显 的削弱, 研究的肿瘤细胞包括 : 黑色素瘤 乳腺 癌 淋巴瘤 神经胶质瘤细胞. 他们的实验不 仅进一步证实了 HPA 在肿瘤转移中所起到的关 键作用, 而且为抗肿瘤治疗提供了一个全新的 方案. 2.2 随着人源化技术的日益 成熟, 治疗性抗体的应用越来越广泛, 目前全世 界在临床试验中的治疗性抗体产品有 100 多个, 占所有基因工程蛋白质药物的 70% 以上, 治疗肿

74 409 瘤的抗体药物也不断的被开发出来. 抗体作为肿瘤治疗性药物具有十分突出的优点 : 他能与相关抗原特异性结合 对肿瘤细胞选择性的杀伤作用 在机体内靶向分布 对肿瘤治疗中作用显著等, 与小分子药物 毒素或放射性有效载荷有关的结合性抗体相比在理论上显示出了强大的潜力, 部分治疗性抗体药物在临床使用中也已取得十分优越的疗效. 同时人们广泛关注的还有其较低甚至几乎可以忽略的毒副作用. 所以治疗性抗体药物有望成为传统肿瘤治疗手段的替代方法. 近年来由于抗体药物的兴起, 特别是一些治疗肿瘤的抗体药物的相继上市, 抗体治疗已经成为继外科手术 放疗 化疗 激素治疗之后的恶性肿瘤临床治疗的常规手段之一. 肿瘤组织中细胞表面 HPA 表达量增高, 使得针对 HPA 的抗体药物更具特异性. 针对 HPA 分子靶标的抗体, 主要通过三种途径发挥作用 : 一是抗原与抗体特异性结合, 使 HPA 分子结构发生改变而失去酶活性 ; 二是使效应细胞将其吞噬破坏 ; 三是使抗原表面弱化被补体破坏, 从而减弱 HPA 在肿瘤侵袭和转移中发挥的作用, 达到治疗肿瘤的目的 [63]. 基于以上原理一些研究单位和公司已经研究和开发出治疗性的 HPA mab, 他们能够与 HPA 活性中心的部分氨基酸序列结合的抗体, 引起 HPA 活性丧失. Myler et al [64] 获得了治疗性 HPA 抗体, 他与 HPA 有很强的结合力, 可以抑制 HPA 活性, 降低细胞的活动性, 阻碍肿瘤细胞的迁徙和转移. 2.3 治疗性疫苗已经出现 200 多年. 利用致病因子增强机体的特异免疫应答, 尤其是细胞免疫应答, 是治疗性疫苗的发展方向, 其目标是使特异性抗原具有免疫原性及免疫反应性, 产生保护性细胞免疫应答. 针对 HPA 的疫苗已经出现, 主要分为两类 : 一类是多肽型疫苗, 另一类为核酸型疫苗. 他们分别由 HPA 来源的多肽和核酸构成, 能够作为肿瘤患者的疫苗发挥作用, 从而达到抑制其促肿瘤生长和转移的目的. Schirmacher et al [65] 获得了人 HPA 来源的九肽, 既可以作为治疗性疫苗, 也可以促进机体产生特异性免疫细胞发挥细胞免疫作用, 还能够提高机体对肿瘤转移关键酶 HPA 的免疫反应. 也有些学者开始了核酸型 HPA 疫苗的研究. Cai et al [66-67] 试验证实通过 HPA 基因刺激细胞毒性 T 细胞 (CTL) 能够有效的诱导机体的 免疫应答, 而对自身同源的淋巴细胞没有杀伤 作用, 所以 HPA 将可以作为肿瘤基因治疗的新靶 标. 随着研究的不断深入, HPA 治疗性疫苗将会 逐步进入临床应用, 在肿瘤治疗中发挥越来越 重要的作用. 3 结论 HPA 的研究经历了一个较长的时期, 他在肿瘤转 移中的关键作用得到研究者的广泛认可, 特别 是 1999 年 HPA 基因克隆的研究结果报道后 [44,68], 有关 HPA 的研究发展迅速, 对其促肿瘤转移的机 制的认识也不断深入, 并为肿瘤的临床治疗提 供了新方向. 但是目前还存在一些尚待解决的 问题 : (1)HPA 促肿瘤转移的机制尚有许多未知 因素, 特别是 HPA 在调控信号通路方面的作用和 途径存在分歧. (2)HPA 能否像常规肿瘤标志物 一样作为肿瘤检测 恶性程度分析 疗效的监 测等的指标有待探讨. 而且目前 HPA 的检测操作 繁琐 成本昂贵, 应用于临床需要在方法上进 行探索和改进 [69]. (3)HPA 在除肿瘤之外的组织 和细胞中也有表达, 如胎盘 白细胞等, HPA 在 机体内发挥复杂而又重要的作用 [70], 是否还有 尚未触及的领域需要进一步考证. 相信, 随着对 HPA 研究的不断深入, 上述问题将会凸现答案, 以 H PA 为靶标的肿瘤治疗也将随之获得重要 突破. 4 参考文献 1 W a t a n a b e M, A o k i Y, K a s e H, T a n a k a K. Heparanase expression and angiogenesis in endometrial cancer. Gynecol Obstet Invest 2003; 56: Patel VN, Knox SM, Likar KM, Lathrop CA, Hossain R, Eftekhari S, Whitelock JM, Elkin M, Vlodavsky I, Hoffman MP. Heparanase cleavage of perlecan heparan sulfate modulates FGF10 activity during ex vivo submandibular gland branching morphogenesis. Development 2007; 134: Bisio A, Mantegazza A, Urso E, Naggi A, Torri G, Viskov C, Casu B. High-performance liquid chromatographic/mass spectrometric studies on the susceptibility of heparin species to cleavage by heparanase. Semin Thromb Hemost 2007; 33: Ma P, Beck SL, Raab RW, McKown RL, Coffman GL, Utani A, Chirico WJ, Rapraeger AC, Laurie GW. Heparanase deglycanation of syndecan-1 is required for binding of the epithelial-restricted prosecretory mitogen lacritin. J Cell Biol 2006; 174: Ilan N, Elkin M, Vlodavsky I. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. Int J Biochem Cell Biol 2006; 38: Zhou J, Cheng Y, Ding J. The basement membrane and metastasis. Sheng Li Ke Xue Jin Zhan 2006; 37: :,,,.

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77 412 ISSN CN /R,,. Vlodavsky I. Heparanase gene silencing, tumor invasiveness, angiogenesis, and metastasis. J Natl Cancer Inst 2004; 96: Gingis-Velitski S, Ishai-Michaeli R, Vlodavsky I, Ilan N. Anti-heparanase monoclonal antibody enhances heparanase enzymatic activity and facilitates wound healing. FASEB J 2007; 21: Myler HA, Lipke EA, Rice EE, West JL. Novel heparanase-inhibiting antibody reduces neointima formation. J Biochem 2006; 139: Schirmacher V, Förg P, Dalemans W, Chlichlia K, Zeng Y, Fournier P, von Hoegen P. Intra-pinna antitumor vaccination with self-replicating infectious RNA or with DNA encoding a model tumor antigen and a cytokine. Gene Ther 2000; 7: Cai YG, Fang DC, Chen L, Wang DX, Luo YH, Tang XD, Chen T, Yang SM. Immune response of heparanase gene modified dendritic cell-based vaccine on gastric cancer cells. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2006; 86: Cai YG, Fang DC, Chen L, Tang XD, Chen T, Yu ST, Luo YH, Xiong Z, Wang DX, Yang SM. Dendritic cells reconstituted with a human heparanase gene induce potent cytotoxic T-cell responses against gastric tumor cells in vitro. Tumour Biol 2007; 28: Kussie PH, Hulmes JD, Ludwig DL, Patel S, Navarro EC, Seddon AP, Giorgio NA, Bohlen P. Cloning and functional expression of a human heparanase gene. Biochem Biophys Res Commun 1999; 261: Shafat I, Zcharia E, Nisman B, Nadir Y, Nakhoul F, Vlodavsky I, Ilan N. An ELISA method for the detection and quantification of human heparanase. Biochem Biophys Res Commun 2006; 341: Pang RW, Poon RT. From molecular biology to targeted therapies for hepatocellular carcinoma: the future is now. Oncology 2007; 72 Suppl 1: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯世界华人消化杂志 (WCJD ) 和 World Journal of Gastroenterology (WJG ) 为了确保刊出文章的质量, 即将开始实行接受稿件的同行评议公开策略, 将同行评议者姓名, 职称, 机构的名称与文章一同在脚 注出版. 如 : 同行评议者 : 房静远教授, 上海交通大学医学院附属医院仁济医院, 上海市消化疾病研究所 ; 韩新巍教授, 郑州大学第一附属医院放射科 ; 匡安仁教授, 四川大学华西医院核医学科. ( 总编辑 : 马连生 )

78 ; 16(4): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 抗胃癌抗体重链可变区序列分析及空间结构模拟 determined by Kabat analysis. The spatial structure of the V H was constructed and optimized with molecular mechanism method to obtain the stable 3-D structure. CONCLUSION: The primary and three-dimensional structures of V H are reasonable and reliable and lay the theoretical foundation for fur- ther biological experiments. Analysis of primary structure and modeling of spatial structure of heavy chain variable region of antibody against human gastric cancer Li-Juan Yang, Ying-Chun Hou, Li-Bo Yao, Cheng-Zhi Su Li-Juan Yang, Department of Endocrinology, Chinese PLA General Hospital, Beijing , China Ying-Chun Hou, School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi an , Shaanxi Province, China Li-Bo Yao, Cheng-Zhi Su, Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University, Xi an , Shaanxi Province, China Correspondence to: Dr. Li-Juan Yang, Department of Endocrinology, Chinese PLA General Hospital, Beijing , China. ljyang2828@163.com Received: Revised: Abstract AIM: To confirm the primary structure of heavy chain variable regions (V H ) of antibody against human gastric cancer based on the sequence analysis method and to model its threedimensional structure using homology modeling method. METHODS: The V H gene selected from the phage display library of antibodies against human gastric cancer was sequenced and analyzed. Its three-dimensional structure was modeled with computer homology modeling techniques and optimized using molecular mechanism method. Key Words: Gastric cancer; Computer homology modeling techniques; Variable region Yang LJ, Hou YC, Yao LB, Su CZ. Analysis of primary structure and modeling of spatial structure of heavy chain variable region of antibody against human gastric cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : (V H ),. 方法 : V H,., V H. 结果 : V H, Kabat FR CDR;,. 结论 : V H,.,.,,,. 关键词 RESULTS: The sequence of V H was in agreement with the characteristics of the mouse antibody variable region. The FR and CDR were 0 引言自人源化抗体 Herceptin 被美国 FDA 批准上市后,,,

79 414 ISSN CN /R 更多的实践表明, 抗体可能成为较理想的肿瘤 诊断和治疗的新型药物 [1]. 本研究利用噬菌体抗, 体库技术, 绕过杂交瘤技术, 获得了鼠抗人胃癌 HAMA 重链可变区片段, 为今后胃癌的显像和导向治, 疗奠定了一定的基础. 然而, 由于其为鼠源性,,, 在应用过程中会引发 HAMA 反应而限制了其应 用. 必须先进行人源化改造, 才能更好地应用于. 临床. 而进行人源化设计必须了解其三维结构. 因此本研究利用同源蛋白结构模建及分子力学 优化技术, 采用 Biosym 公司开发的计算机辅助 分子设计系统搭建了 V H 的三维结构. 1 材料和方法 1.1 细菌菌株 E.coli TG1, 克隆及表达载体 pcantab5e, 扩增 V H 可变区基因引物 RS Primer Mix, S3 和 S6 引物均为 Pharmacia 公司产品. 其他 有关分子生物学试剂系华美公司和 Promega 公司 产品. InsightⅡ(2005) 软件包为 MSI 公司产品. 1.2 抗人胃癌单链抗体基因文库及噬菌体 表面呈现文库的构建和筛选见文献 [2] V H : 从 4 贮存的阳 性克隆菌种取 100 μl 接种于 25 ml 含氨苄青霉 素 (100 mg/l) 的 SOC 培养液中, 30 振荡培养过 夜, 碱裂解法大量制备噬菌粒 DNA, 经 FPLC Hi Trap Q 柱纯化, 经 Eco RⅠ Hin dⅢ 双酶切鉴定 后, 作为测序模板, 用 S3 和 S6 引物从基因两端测 序. 将所测得的 DNA 序列通过 进 行氨基酸序列的翻译, 并通过 gov/blast 对其序列进行相似性比较 V H : 通过 www. ncbi.nlm.nih.gov/blastp, 利用 BLASTp [3] 软 件搜索蛋白质晶体结构数据库 (PDB), 获得 V H 的同源蛋白, 利用 InsightⅡ(2000) 软件, 选择 HOMOLOGY [4] 程序包, 经过同源蛋白结构叠加 以确定结构保守区 (structural conserved region, SCR) 和 Loop 区, 以该同源蛋白为模板对 V H 的 主链 侧链进行结构模建. 模建获得的 V H 初始 结构利用 DISCOVERY-3 [5] 程序包, 应用 CVFF/ Gromos96 力场通过最陡下降 共轭梯度 牛顿 力学对初始模型进行分子力学优化及常温分子 动力学动态模拟, 获得 V H 的三维结构的能量最低 构象. 所有工作均在 SGI Indigo 2 工作站上完成. 2 结果 2.1 V H 用 S3 和 S6 引物从基因两端测序, 测出相应的核 苷酸序列并进行同源性分析 ( 图 1). 将 V H 基因序列输入计算机与 Internet 网中的所有基因数据库中的已知基因进行同源性比较, 其同源序列均为鼠 Ig 重链可变区基因, 与之同源性最高的为 MM2F2A(Score 1464). 2.2 V H V H 基因长度为 354 bp, 系一开放读框, 利用 ch 对其进行序列分析, 对应的翻译模式见图 2. 根据推导的氨基酸序列进行 Kabat 分类分析, 确定 4 个 FR 区和 3 个 CDR 区 ( 图 2). 通过确定的 FR CDR 区以及抗体结构所必须的两个恒定半胱氨酸残基, 表明其结构符合鼠 Ig 重链可变区的氨基酸序列特征. 2.3 V H 以 V H 序列为探针, 用 BLASTp 程序在 PDB 库中搜索 V H 的同源蛋白. 选择模板蛋白免疫球蛋白重链 (PDB 号 : 1E4X) 和目标蛋白 V H 两者具有 85% 的序列相似性. 将 1E4X 和 V H 进行序列比对, 考虑残基的理化性质, 确定 6 个 SCR 区, 5 个 Loop 区. 利用模板蛋白 1E4X 重链可变区晶体结构的 Cα 原子坐标确定了 V H 主链构象并完成了侧链安装, 组装出完整的 V H 三维结构. 对模建的 V H 三维结构在 CVFF 力场下, 经过最陡下降, 牛顿力学等方法进行能量的分子力学优化, 获得能量最低构象. 该稳定构象为全 -β 模式, N 端 5 个反平行 β 片层, C 端 6 个反平行 β 片层, N 端 2 个高度保守的半胱氨酸残基形成 1 对二硫键结构 ( 图 3). 模建获得的 V H 空间构象与 1FVB 晶体结构进行主链 C 原子的 Cα 迭合, 迭合后的均方根位移 RMS = 0.15 nm, 表明理论模建的 V H 空间结构是可靠的. 应用 Profile- 3D 对优化后的 V H 三维结构进行理论评估. 结果显示, 模建结构中无不兼容的残基, 说明结构较合理, 而且优化后结构更合理. 3 讨论在肿瘤的诊断和治疗方面, 小分子抗体具有极高的理论和应用价值. 因为其具有分子小, 免疫原性弱, 穿透力强易于进入实体瘤周围的微循环, 血清和全身廓清快, 无肾脏蓄积作用, 肿瘤显像时清晰度高, 可作载体与药物 同位素 毒素等结合之优点 [6]. 本研究从已构建的抗人胃癌单链抗体基因文库及噬菌体表面呈现文库中筛选出了抗人胃癌 V H 基因, 经序列测定及同源性分析表明其结构符合鼠 Ig 重链可变区的氨基酸序列特征, 为今后的基因工程改造提供了条件. 为了能更好地应用于临床, 必须将鼠源性

80 415 Query: 1 CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTAGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTG 60 Sbjct: 1 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG 60 Query: 61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGG 120 Sbjct: 61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCGGAGG 120 Query: 121 CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTAC 180 Sbjct: 121 CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAA TATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTGACTAC 180 Query: 181 AATGAGAACTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTTGACAAATCCTCCAGCTCAGCCTAC 240 Sbjct: 181 AATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC 240 Query: 241 ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATATGAG 300 Sbjct: 241 ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGAGGAC 300 Query: 301 GACTACGATCTCCATGACTACTGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCCTCA 354 Sbjct: 301 TACGGTAGTGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 354,. 50%, 90%Cα 0.3 nm, 0.1 nm,.,.,. 图 1 V H 基因序列及同源性分析结果. Q V Q L Q Q S R A E L V K P G A S V K L S C K A CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTAGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCT CDR1 S G Y T F T S Y W M H W V K Q R P G Q G L E W I TCTGGCTACACCTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATT CDR2 G E I N P S N G R T N Y N E N F K S K A T L T V GGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAACTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTT D K S S S S A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y C GACAAATCCTCCAGCTCAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT CDR3 A R Y E D Y D L H D Y W G Q G T S V T V S S GCAAGATATGAGGACTACGATCTCCATGACTACTGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCCTCA 图 2 V H CDR 区 FR 区的确定. 图 3 以 1EXB 晶体结构为模板同源模建获得的目标蛋白 V H 的三维空间结构. 的抗体先进行人源化改造. 而进行人源化设计 必须了解其三维结构. 人们通过对类似蛋白质 空间结构的对比发现, 蛋白质的三维结构较其 一级序列更为保守. 氨基酸残基序列有 50% 相 同的蛋白质, 约有 90% 的 Cα 原子偏差不超过 0.3 nm, 均方根偏差约 0.1 nm, 氨基酸的残基替换通常发生在蛋白质表面回折区域. 蛋白质主链结构, 特别是疏水中心的结构受序列变异的影响很小 [7]. 因此, 用类似蛋白来预测目标蛋白的空间构象是比较可靠的. 根据此原理, 人们已成功预测了许多目标蛋白, 在抗体的结构预测中尤为突出 [8-14]. 本研究利用 Biosym 公司的 Homology 软件包, 同源模建了用噬菌体抗体库技术获得的抗人胃癌抗体 V H 结构域的三维空间结构. 经过分子力学和分子动力学优化, Profile-3D 的合理性评价, 提示所获得的 V H 结构域的三维结构有较高的可靠性, 为今后制备人源化单链抗体

81 416 ISSN CN /R 奠定了基础.,, 4 参考文献,.,. 1 Bradbury AR, Marks JD. Antibodies from phage antibody libraries. J Immunol Methods 2004; 290: Thompson AJ, Price KL, Reeves DC, Chan SL, Chau PL, Lummis SC. Locating an antagonist in 1998; 19: Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997; 25: Molecular Simulation Inc. Homology User Guide, Version 2000[EB] San Diego, Molecular Simulation Inc. Discover-3 User Guide, Version 2000[EB] San Diego, Colcher D, Bird R, Roselli M, Hardman KD, Johnson S, Pope S, Dodd SW, Pantoliano MW, Milenic DE, Schlom J. In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. J Natl Cancer Inst 1990; 82: Blundell TL, Sibanda BL, Sternberg MJ, Thornton JM. Knowledge-based prediction of protein structures and the design of novel molecules. Nature 1987; 326: Fontayne A, Vanhoorelbeke K, Pareyn I, Van Rompaey I, Meiring M, Lamprecht S, Roodt J, Desmet J, Deckmyn H. Rational humanization of the powerful antithrombotic anti-gpibalpha antibody: 6B4. Thromb Haemost 2006; 96: Paula S, Monson N, Ball WJ Jr. Molecular modeling of cardiac glycoside binding by the human sequence monoclonal antibody 1B3. Proteins 2005; 60: the 5-HT3 receptor binding site using modeling and radioligand binding. J Biol Chem 2005; 280: Mendez R, Leplae R, Lensink MF, Wodak SJ. Assessment of CAPRI predictions in rounds 3-5 shows progress in docking procedures. Proteins 2005; 60: Gee GV, Tsomaia N, Mierke DF, Atwood WJ. Modeling a sialic acid binding pocket in the external loops of JC virus VP1. J Biol Chem 2004; 279: Arndt MA, Krauss J, Schwarzenbacher R, Vu BK, Greene S, Rybak SM. Generation of a highly stable, internalizing anti-cd22 single-chain Fv fragment for targeting non-hodgkin's lymphoma. Int J Cancer 2003; 107: Mohan S, Sinha N, Smith-Gill SJ. Modeling the binding sites of anti-hen egg white lysozyme antibodies HyHEL-8 and HyHEL-26: an insight into the molecular basis of antibody cross-reactivity and specificity. Biophys J 2003; 85: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 WCJD 和 WJG 即将开始实行在每篇文章的脚注内注明每个作者对文章的贡献率, 如 : 作者贡献分布 : 陈湘川与庞丽娟对此文所作贡献均等 ; 此课题由陈湘川, 庞丽娟, 陈玲, 杨兰, 张金芳, 齐妍及李洪安设计 ; 研究过程由陈玲, 杨兰, 张金芳, 蒋金芳, 杨磊, 李锋及曹秀峰操作完成 ; 研究所用新试剂及分析工具由曹秀 峰提供 ; 数据分析由陈湘川, 杨兰及庞丽娟完成 ; 本论文写作由陈湘川, 庞丽娟及李洪安完成. ( 总编辑 : 马 连生 )

82 ; 16(4): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 注射用血栓通对肝星状细胞基因表达的影响 of some genes was unknown. CONCLUSION: Panax notoginseng saponins can change the gene expression in HSCs by regulating their expression and inhibiting the function of HSCs. Key Words: Panax notoginseng saponins; Total notoginseng saponins; Hepatic stellate cell; Liver fibrosis; Genechip Effect of panax notoginseng saponins on gene expression of cultured human hepatic stellate cells Guo-Li Li, Hong-Shan Wei, Shuang Qiu, Hui Zeng Guo-Li Li, Hong-Shan Wei, Hui Zeng, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Peking University, Beijing , China Shuang Qiu, Clinical Laboratory, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing , China Supported by: National Natural Science Foundation of China, No Correspondence to: Guo-Li Li, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Peking University, 13 Ditan Park, Anwai Street, Beijing , China. Received: Revised: Abstract AIM: To explore the effects of panax notoginseng saponins (PNS) on gene expression of cultured human hepatic stellate cells (HSCs) and its mechanism. METHODS: PNS (10-3 mg/l) and HSCs (LX02 cells) were cultured for 48 h. Total RNA was isolated from HSCs, reverse transcrpted into cdna and hybridized with GeneChip. The expression of mrna was examined with the human GeneChip analysis system. RESULTS: Differential expression was found in 41 genes of HSCs, of which, 20 were downregulated and 21 up-regulated. Some differentially expressed genes were associated with metabolism, cell adherence, DNA binding phosphorylation and methylation. The function Li GL, Wei HS, Qiu S, Zeng H. Effect of panax notoginseng saponins on gene expression of cultured human hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : LX02. 方法 : 10-3 mg/l LX02 48 h, mrna, cdna.,. 结果 : 41, 21, 20, D N A,. 结论 :,,. 关键词 0 引言三七总皂甙中的人参皂甙 Rg1 Rb1 和三七皂甙 R1 三种组分的含量达 80% 以上, 其具有较好的,,,.,,

83 418 ISSN CN /R 扩血管和改善微循环的作用. 近年来研究表明, 2005, et al 三七总皂甙对肝星状细胞生物功能具有抑制作 用 [1], 提示其对肝纤维化可能具有一定疗效. 注 射用血栓通是用特殊工艺从三七主根中提取出 三七总皂甙制成, 其特点是纯度高 生物活性. 高 水溶性好和毒性低. 我们以基因芯片技术 对注射用血栓通作用的肝星状细胞 LX02 基因表 达进行分析, 初步探讨注射用血栓通对肝星状 细胞功能抑制的机制. 1 材料和方法 1.1 肝星状细胞株 LX02 为徐列明教授惠赠, 细胞培养相关试剂及总 RNA 提取试剂 TRIzol 均 购自 Invitrogen 公司, 注射用血栓通为广西梧桐 制药有限公司产品 : 在 25 cm 2 培养瓶中常规培养 LX02 细胞, 细胞生长至对数期时分别将三七总 皂甙及溶剂 DMEM 加入细胞培养液中, 使终浓 度达到 10-3 mg/l( 根据 MTT 实验提示三七总皂甙 在此浓度时对肝星状细胞增殖抑制最明显 ), 72 h 后收获细胞约 , 按每 个细胞加入 1 ml TRIzol 试剂, 立即于液氮中保存 RNAmRNA : 使用 TRIzol 试 剂一步法提取三七总皂甙和 DMEM 处理的 LX02 细胞总 RNA( 分别标记为实验组和对照组 ), 样 品经分光光度计检测吸光度 A 值, 并行热稳定实 验, 于 -20 和 70 保温 1 h 后, 经琼脂糖凝胶电 泳检测 28 S 18 S 条带变化 : 总 RNA 逆转录标记 cdna 探针 并纯化, Cy3-dUTP 标记对照组细胞 mrna(5 μg), Cy5-dUTP 标记实验组细胞 mrna(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在 20 μl 5 SSC+0.2% SDS 杂 交液中 : 芯片包含的 4096 个 cdna 由上 海博星基因芯片有限公司提供, 包括原癌基因 和抑癌基因 免疫调节相关基因 细胞凋亡和 应激反应蛋白相关基因 信号转导相关基因 等. 以通用引物进行 PCR 扩增, PCR 产物长度为 bp. 靶基因以 0.5 g/l 溶解于 3 SSC 溶 液中, 用 Cartesian 公司的 Cartesian 7500 点样仪 及 TeleChem 公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片 经水合 (2 h) 室温干燥 (0.5 h), UV 交联, 再分别 用 0.2% SDS 水及 0.2% 的硼氢化钠溶液处理 10 min, 晾干备用 : 将基因芯片和杂交探针在 图 1 肝星状细胞总 RNA 电泳. 95 水浴变性 5 min, 将混合探针加在基因芯片 上, 置于 60 杂交 h. 依次以 2 SSC+0. 2% SDS 0.1% SSC+0.2% SDS 0.1% SSC 洗涤 10 min, 室温晾干 : 用 General Scanning 公司的 ScanArray3000 扫描芯片. 为了监控芯片杂交技 术体系的整个过程, 用预先选定的内参照基因 (24 条管家基因, 每个基因点 2 个点, 共 48 个点 ) 对 Cy3 和 Cy5 的原始提取信号进行均衡和修正. 用 ImaGene3.0 软件分析 Cy3 Cy5 两种荧光信 号的强度, 计算 Cy5/Cy3 比值. 阳性结果判断 : Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强 ; Cy5/ Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱 ; 黄色代表 表达水平无差异. 2 结果 2.1 RNAmRNA 总 RNA 的吸光度 A 260 /A 280 >1.80, 热稳定实 验 70 保温 1 h 与 h 电泳条带比较, 显示 28 S 条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度 的总 RNA( 图 1). mrna 主要集中于 bp 的连续条带. 2.2 实验组探针标记 Cy5( 红色 ), 对照组探针标记 Cy3( 绿色 ), 红绿颜 色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基 因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差 异 ( 图 2-3). 2.3 本研究共筛选出 41 条 差异表达的基因, 其中 20 条基因表达下调, 21 条基因表达上调, 差异表达的基因中有 6 条基 因功能未知 ( 表 1). 3 讨论 活化的肝星状细胞能大量增殖, 分泌大量胶原 成分 [2], 是肝纤维化 肝硬化时细胞外基质的主 要来源和细胞学基础 [4]. 魏红山 et al 在国内首次 发现肝纤维化大鼠肝星状中血管紧张素 Ⅰ 的表 达, 提示肾素 - 血管紧张素系统在主导循环系统 疾病之外, 对肝纤维化的发病也有一定影响, 动 物实验证明依那普利等循环系统疾病的治疗药 对肝纤维化也具有较好的治疗作用 [5].

84 419 表 1 三七总皂甙上调和下调 LX02 细胞的表达基因 序号 编码基因 Cy5/Cy3. 近年来研究表明, 常用于循环系统疾病的中药提取物三七总皂甙在实验性肝损伤和肝纤维化中也具有一定的防治作用 [6-7], 提示三七总皂甙在肝脏疾病方面具有一定的应用前景. 注射用血栓通是用特殊工艺从三七主根中提取出三七总皂甙制成, 其特点是纯度高 生物活性高 水溶性好. 注射用血栓通作用的 LX02 细胞共有 41 条基因表达发生差异变化, 其 中 21 条基因表达上调, 20 条基因表达下调. 表 达下调的基因包括与合成代谢, 细胞增殖 抑 制凋亡等信号传导相关的基因 : F O L H1 为叶 酸吸收所必需 [8] ; COASY 是辅酶 A 合成酶, 参 [ 9 与细胞的能量代谢和多种生物合成过程 ] ; S L C1A6 是谷氨酸和天冬氨酸的转运载体 [10] ;

85 420 ISSN CN /R :, Rg1 Rb1 R1 80%,. 图 2 双色荧光标记叠加图 SUPT3H 是 STAGA 乙酰基转移酶复合体的重 要成分, STAGA 与 DNA 复制纠错, 损伤修复相 关 [11], Myc 蛋白在与靶基因启动子结合时需要 STAGA 的辅助 [12] ; APEH 能够从肽段中水解末 F2 Median( 10 4 ) 图 3 杂交信号强度散点图 端酰基化的氨基酸, 该反应对水解活细胞中氧 2000; 8: 化损伤的蛋白十分重要, 与机体抗氧化损伤密切相关, 在多种肿瘤中都能够监测到此基因位点的缺失 [13] ; PECAM1 即 CD31, 研究显示 CD31 4 Wei H, Lu H, Li D, Zhan Y, Wang Z, Huang X. The expression of AT1 receptor on hepatic stellate cells in rat fibrosis induced by CCl4. Chin Med J (Engl) 2001; 114: 在某些肿瘤表面表达升高, 以往研究显示其可以抑制线粒体依赖的凋亡和 Bax 介导的凋亡 [14]. 封闭肿瘤细胞表面的 CD31 能够诱导细胞凋亡, 从而抑制细胞增殖 [15] ; RAB5C 属于 RAS 癌基因 5 瑢 2005; 15: TGF-β1 2001; 17: 7-8 家族, 与细胞增殖及肿瘤形成密切相关 [16] 7 Shafizadeh TB, Halsted CH. gamma-glutamyl ; ILK hydrolase, not glutamate carboxypeptidase II, 位于细胞增殖等信号传递的上游, 在 TGF-β1 介 hydrolyzes dietary folate in rat small intestine. J 导的肝星状细胞增殖过程中非常重要 [17] Nutr 2007; 137: ; HCN1 8 Zhyvoloup A, Nemazanyy I, Babich A, Panasyuk 能够介导肌细胞等细胞的兴奋性动作电位, 注 G, Pobigailo N, Vudmaska M, Naidenov V, Kukharenko O, Palchevskii S, Savinska L, 射用血栓通作用后肝星状细胞表达该基因下调, Ovcharenko G, Verdier F, Valovka T, Fenton T, 提示肝星状细胞活化表型减少 [18]. 表达上调的基 Rebholz H, Wang ML, Shepherd P, Matsuka G, Filonenko V, Gout IT. Molecular cloning of CoA 因中 : OPCML: 最近研究发现其表达能抑制肿 Synthase. The missing link in CoA biosynthesis. J 瘤生长 抑制细胞增殖 [19] ; CYP2J: 属于细胞色 Biol Chem 2002; 277: Poulsen MV, Vandenberg RJ. Niflumic acid 素 P450 家族, 参与药物和甾体类激素的代谢, 其 modulates uncoupled substrate-gated conductances 表达升高有助于维持细胞稳定状态, 降低对激 in the human glutamate transporter EAAT4. J 素的反应 [20] Physiol 2001; 534: ; ID1 具有抑制细胞表型转化的作用, 10 Martinez E, Palhan VB, Tjernberg A, Lymar 能拮抗 TGF-β1 促分化 增殖的作用 [21] ; SEPT4 ES, Gamper AM, Kundu TK, Chait BT, Roeder 能够促进多种途径诱导的凋亡过程 [22]. RG. Human STAGA complex is a chromatinacetylating transcription coactivator that interacts 总之, 通过基因芯片筛选, 经注射用血栓通 with pre-mrna splicing and DNA damagebinding 作用后肝星状细胞基因表达发生变化, 提示注射用血栓通可能通过调控这些基因的表达实现了其对肝星状细胞功能的抑制作用. 目前实验结果的验证工作正在进行, 这些基因在肝星状细胞中的具体生物功能还需进一步研究. factors in vivo. Mol Cell Biol 2001; 21: Liu X, Tesfai J, Evrard YA, Dent SY, Martinez E. c-myc transformation domain recruits the human STAGA complex and requires TRRAP and GCN5 acetylase activity for transcription activation. J Biol Chem 2003; 278: Perrier J, Giardina T, Durand A, Puigserver A. 4 参考文献 Specific enhancement of acylase I and acylpeptide hydrolase activities by the corresponding 1 N-acetylated substrates in primary rat hepatocyte 2005; 13: cultures. Biol Cell 2002; 94: Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000; 275: Bergom C, Goel R, Paddock C, Gao C, Newman DK, Matsuyama S, Newman PJ. The cell-adhesion and signaling molecule PECAM-1 is a molecular 3 mediator of resistance to genotoxic chemotherapy. CY F2 Median( 10 4 ) CY3

86 421 Cancer Biol Ther 2006; 5: Lutzky VP, Carnevale RP, Alvarez MJ, Maffia PC, Zittermann SI, Podhajcer OL, Issekutz AC, Chuluyan HE. Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) recycles and induces cell growth inhibition on human tumor cell lines. J Cell Biochem 2006; 98: Amaar YG, Minera MG, Hatran LK, Strong DD, Mohan S, Reeves ME. Ras association domain family 1C protein stimulates human lung cancer cell proliferation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 291: L1185-L Lin SW, Ke FC, Hsiao PW, Lee PP, Lee MT, Hwang JJ. Critical involvement of ILK in TGFbeta1- s t i m u l a t e d i n v a s i o n / m i g r a t i o n o f h u m a n ovarian cancer cells is associated with urokinase plasminogen activator system. Exp Cell Res 2007; 313: Herrmann S, Stieber J, Ludwig A. Pathophysiology of HCN channels. Pflugers Arch 2007; 454: Mei FC, Young TW, Liu J, Cheng X. RAS-mediated epigenetic inactivation of OPCML in oncogenic transformation of human ovarian surface epithelial cells. FASEB J 2006; 20: Yamazaki H, Okayama A, Imai N, Guengerich FP, Shimizu M. Inter-individual variation of cytochrome P4502J2 expression and catalytic activities in liver microsomes from Japanese and Caucasian populations. Xenobiotica 2006; 36: Damdinsuren B, Nagano H, Kondo M, Natsag J, Hanada H, Nakamura M, Wada H, Kato H, Marubashi S, Miyamoto A, Takeda Y, Umeshita K, Dono K, Monden M. TGF-beta1-induced cell growth arrest and partial differentiation is related to the suppression of Id1 in human hepatoma cells. Oncol Rep 2006; 15: Elhasid R, Sahar D, Merling A, Zivony Y, Rotem A, Ben-Arush M, Izraeli S, Bercovich D, Larisch S. Mitochondrial pro-apoptotic ARTS protein is lost in the majority of acute lymphoblastic leukemia patients. Oncogene 2004; 23: ,. ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 WCJD 和 WJG 即将开始实行网络版的每篇文章上都有该文发表前纪录的链接, 包括首次提交的稿 件, 同行评议人报告, 作者给审稿人回信和作者修回稿, 以 PDF 格式上传. 读者可以针对论文 审稿意见和 作者的修改情况发表意见, 指出问题与不足 ; 作者也可以随时修改完善自己发表的论文. 使文章的发表成为 一个编者 同行评议者 读者 作者互动的动态过程. ( 总编辑 : 马连生 )

87 ; 16(4): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 血红素氧合酶 2 在吗啡诱导的结肠慢传输型便秘小鼠结肠中的表达及意义 each group were killed. The remaining as test A2, test B2 and control group 2 mice received no, treatment and were observed for 15 days, and ; then killed. The intestinal transit rate for mice in each group was detected by activated charcoal, suspension pushing test, and the expression of ; HO-2 + cells in proximal colon tissue was determined by immunohistochemistry., RESULTS: The intestinal transit rate was decreased obviously in all test groups than in the. control group, which was lower in test B than in test A. The intestinal transit rate for all test groups was significantly lower 15 days after colon slow transit motility constipation induced by morphine than 45 days before colon slow transit motility constipation induced by morphine. Expression of heme oxygenase-2 in mouse model of colon slow transit motility constipation induced by morphine and its significance,, Liu-Qin Jiang, Lin Lin, Hong-Jie Zhang, Ye-Dong Hu, Zheng Lin, Mei-Feng Wang Liu-Qin Jiang, Lin Lin, Hong-Jie Zhang, Ye-Dong Hu, Zheng Lin, Mei-Feng Wang, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China Supported by: 135 Program for Medical Key Person Foundation of Jiangsu Province, No. RC Correspondence to: Dr. Lin Lin, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China. lin9100@yahoo.com.cn Received: Revised: Abstract AIM: To study the expression and changes of heme oxygenase-2 (HO-2) in a mouse model of morphine induced colon slow transit motility and the role of HO-2 in the development of slow transit motility constipation. METHODS: Forty-eight mice were randomly divided into test A group (n = 16), test B group (n = 16) and control 1 group. A mouse model was established by subcutaneous injection of morphine (2.5 mg/(kg d) in test A1) and 3.5 mg/(kg d) in test B1) for 45 days, and the control group 1 was established by normal saline injection at the same dosage. On the 45 day, 8 mice from CONCLUSION: The c-kit + cells are more obviously decreased in mouse proximal colon tissue with slow-transit motility constipation induced by morphine, and correlated with the dose and time of morphine used, suggesting that changes in nerve transmitter CO are one of the factors for colon slow-transit motility constipation. Key Words: Colon slow transit; Morphine; Heme oxygenase-2; Immunohistochemistry Jiang LQ, Lin L, Zhang HJ, Hu YD, Lin Z, Wang MF. Expression of heme oxygenase-2 in mouse model of colon slow transit motility constipation induced by morphine and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : 2(HO-2),. 方法 : 48 A, B, 16. sc, A: 2.5 mg/(kg d) B: 3.5 mg/(kg d), 45 d,, ; 45 d.

88 423 A2, B2 2, 15 d,. HO-2. 结果 : HO-2 ; ; B A; 15 d 45 d. 结论 : HO-2,, CO. 关键词 状 1-2 级较对照组 4-5 级明显干硬. 第 60 天各实验 组小鼠粪便性状较第 45 天时无明显改变, 但较 对照组明显干硬. 2.2 第 45 天各实验组小鼠的肠 道碳墨推进率较对照组明显减慢 (P <0.01). 第 60 天各实验组小鼠的肠道碳墨推进率较对照组明 显减慢 (P <0.01), 且比 45 d 时相应实验组的肠道 碳墨推进率也减慢 (P <0.05, 表 1). 0 引言 2.3 结肠黏膜下神经丛与肌内源性一氧化碳 (CO) 是肠道非肾上腺素非胆碱间神经丛可见丰富的深棕色颗粒, 即 HO-2 阳性能神经 (NANC) 分泌的抑制性神经递质, 对调节神经纤维, 环肌和纵肌内 HO-2 阳性细胞较黏膜胃肠运动有重要作用 [1]. 血红素氧合酶 (HO) 是下 肌间层明显减少. 各实验组阳性细胞较对照 CO 合成的关键酶, 有三种同工酶 [2], 即诱导型组明显减少 ; 大剂量吗啡处理的实验组比小剂量 HO(HO-1), 原生型 HO(HO-2) 和 HO-3 [3] ( 不产生组阳性细胞明显少 ; 第 60 天时各实验组较第 45 天 CO, 功能尚不清楚 ). CO 和 NO 在人体某些功能时各实验组 HO-2 阳性细胞的表达减少 ( 图 1). 中的作用较相似, 是重要的化学信号物质, 调节 神经递质传导 平滑肌的紧张性及其对细胞损伤的反应 [4], 并在细胞功能和信息联络发挥重要的信号转导作用. 3 讨论内源性 CO 和 NO 都是气体分子, 两者在理化性质 分子结构和生物学作用上有许多相似之 处 [1]. NO 作为抑制性神经递质, 其在体内的生理 1 材料和方法 1.1 清洁级 ICR 小鼠 48 只, 雌雄各半, 每只体质量 g, 购于江苏省实验动物中心 ( 南京医科大学实验动物中心 ) [5] : 将 48 只小鼠随机分为实验组 A, 实验组 B 和对照组 (n = 16). 实验组 A 和 B 分别 病理作用已得到广泛的肯定 [1]. 而内源性的 CO 与 NO 一样起着抑制性神经递质的作用, 在消化系统影响胃肠运动 [1,6] ; 其含量异常增多时, 胃肠道有效的推进性收缩幅度 频率减少 ; 其含量异常减少时, 兴奋性和抑制性神经活动失平衡, 导致胃肠道持续性剧烈地非推进性收缩幅度 频率增加, 使胃肠平滑肌不协调运动. sc 吗啡 2.5 mg/(kg d) 和 3.5 mg/(kg d), 对照组以 HO-1 和 HO-2 都位于细胞内质网中 [7] ; HO-1 等量生理盐水, 处理 45 d. 各组随机处死小鼠一主要分布于单核 - 巨噬细胞系统 ( 脾 肝和骨髓 ) 半 ( 为实验组 A1 B1 及对照组 1). 其余小鼠继续, 及网状内皮细胞内, H O-2 则主要分布于脑和 CO 饲养并停药观察 15 d( 实验组 A2 B2 及对照组 2). 胃肠道平滑肌 [8], 胃肠道的 HO-2 主要分布于肠 HO; 第 60 天处死全部小鼠, 处死前予炭末推进法评价道黏膜下神经丛与肌间神经丛 [9], 应激能提高 结肠传输运动功能符合结肠慢传输运动小鼠模 HO-2 活性 [10-11].. 型 [5], 取各组小鼠近端及远端结肠组织各 0.5 cm. 小鼠粪便性状采用 Bristol 分级 [5] HO-2 : HO-2 一抗及免疫组化试剂盒均购自 Promega 公司, 二抗 ( 羊抗兔抗体, 工作液浓度 ) 购自北京中山生物科技公司, 按说明书进行常规免疫组化检测, PBS 代替一抗作为阴性对照. 阳性结果判断 : 胞质染色呈棕色者判定为阳性细胞. 实验数据采用 mean±sd 表示, 录入 SPSS 软件包, 采用两均数 t 检验, P <0.05 为有显著性差异. 2 结果 2.1 第 45 天各实验组小鼠粪便性, ;, CO.

89 424 ISSN CN /R CO ;. A A' B B' C C' 图 1 小鼠近端结肠组织 HO-2 的表达 ( 400). 表 1 各组小鼠的肠道碳墨推进率 本实验用吗啡诱导的小鼠结肠慢传输运动 模型, 根据大便性状改变及肠道推进率基本符 合慢传输型便秘的临床特征 [5]. 在本实验中, 各 实验组小鼠近端结肠组织内 HO-2 + 细胞面积的 表达均较对照组的明显减少, 并且随着吗啡剂 量的增加减少更明显, 推测吗啡诱导的结肠慢 传输运动小鼠其内源性 CO 生成减少可能导致结 肠运动异常, 胃肠道内源性 CO 可能参与了结肠 慢传输运动的发生, 与 NO 的作用机制可能相似. 分组小鼠肠道碳墨推进率 (%) 而停药观察 15 d 后, 各实验组较 45 d 组进一步减 少, 说明短期停药不能逆转吗啡诱导的结肠传 输运动障碍, 可能其停药时间过短发生的病理 改变尚未恢复, 也可能其改变为不可逆性的. 胃肠道平滑肌细胞 HO-2 免疫活性阴性, 而 其临近的 ICC 为阳性 [12]. 肠道某些非神经细胞也表达 HO-2, 包括黏膜上皮细胞 血管平滑肌细 胞 血管内皮细胞和 ICC [13-14]. CO 在 ICC 与平滑 肌间作为第二信使而调节胃肠运动 [15]. 本实验中 吗啡诱导的结肠慢传输运动小鼠近端结肠组织 内 HO-2 的表达减少, 是否与 ICC 自身产生减少或 与 ICC 调节 CO 对胃肠平滑肌的作用减弱有关尚 待进一步研究. 4 参考文献 1 Xue L, Farrugia G, Miller SM, Ferris CD, Snyder SH, Szurszewski JH. Carbon monoxide and

90 425 nitric oxide as coneurotransmitters in the enteric nervous system: evidence from genomic deletion of biosynthetic enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: McCoubrey WK Jr, Huang TJ, Maines MD. Isolation and characterization of a cdna from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase-3. Eur J Biochem 1997; 247: Farrugia G, Miller SM, Rich A, Liu X, Maines MD, Rae JL, Szurszewski JH. Distribution of heme oxygenase and effects of exogenous carbon monoxide in canine jejunum. Am J Physiol 1998; 274: G350-G358 4 Gibbons SJ, Farrugia G. The role of carbon monoxide in the gastrointestinal tract. J Physiol 2004; 556: Piotrowska AP, Solari V, de Caluwé D, Puri P. Immunocolocalization of the heme oxygenase-2 and interstitial cells of Cajal in normal and aganglionic colon. J Pediatr Surg 2003; 38: Porcher C, Orsoni P, Berdah S, Monges G, Mazet B. Distribution of heme oxygenase 2 in nerves and c-kit(+) interstitial cells in human stomach. Histochem Cell Biol 1999; 112: M i l l e r S M, R e e d D, S a r r M G, F a r r u g i a G, Szurszewski JH. Haem oxygenase in enteric nervous system of human stomach and jejunum and co-localization with nitric oxide synthase. Neurogastroenterol Motil 2001; 13: Battish R, Cao GY, Lynn RB, Chakder S, Rattan S. Heme oxygenase-2 distribution in anorectum: colocalization with neuronal nitric oxide synthase. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2000; 278: 2006; 5: G148-G155 6 Farrugia G, Lei S, Lin X, Miller SM, Nath KA, Ferris CD, Levitt M, Szurszewski JH. A major role for carbon monoxide as an endogenous hyperpolarizing factor in the gastrointestinal tract. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: van Ginneken C, van Meir F, Sys S, Weyns A. Stereologic description of the changing expression of constitutive nitric oxide synthase and heme oxygenase in the enteric plexuses of the pig small intestine during development. J Comp Neurol 2001; 7 Chakder S, Cao GY, Lynn RB, Rattan S. Heme oxygenase activity in the internal anal sphincter: effects of nonadrenergic, noncholinergic nerve stimulation. Gastroenterology 2000; 118: : Farrugia G, Miller SM, Rich A, Liu X, Maines MD, Rae JL, Szurszewski JH. Distribution of heme oxygenase and effects of exogenous carbon 8 Doré S, Takahashi M, Ferris CD, Zakhary R, Hester LD, Guastella D, Snyder SH. Bilirubin, formed by activation of heme oxygenase-2, protects neurons against oxidative stress injury. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: monoxide in canine jejunum. Am J Physiol 1998; 274: G350-G358 Farrugia G, Szurszewski JH. Heme oxygenase, carbon monoxide, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech 1999; 47: ,,,,. ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯自 起, 世界华人消化杂志正式开通了在线办公系统 ( aspx), 所有办公流程一律可以在线进行, 包括投稿 审稿 编辑 审读, 以及作者 读者 编者之间的信息反 馈交流. 凡在在线办公系统注册的用户, 将可获得世界华人消化杂志最新出版消息.

91 ; 16(4): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b 和 HMT 在不同结肠癌细胞系的表达及其意义 RESULTS: Dnmt3b mrna was over-expressed in HT-29 and Lovo cells, while Dnmt1 and HMT were,, moderately expressed and Dnmt3a was poorly expressed in colon cancer cell lines. A significant dif- ference was found in the expression of Dnmt3b and Dnmt3a in HT-29, Lovo and Caco-2 cells., CONCLUSION: Differentiated colon cancer cell, lines may have a different epigenetic mechanism. Dnmt3b may play a vital role in the pro- DNA, cess of establishing and maintaining the DNA methylation pattern.. Expression of Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b and HMT in different colonic cancer cell lines and its significance Rong-Lin Zhai, Kai-Lin Cai, Guo-Bin Wang, Fei Xu, Yuan Tian, Jing-Hui Zhang Rong-Lin Zhai, Kai-Lin Cai, Guo-Bin Wang, Fei Xu, Yuan Tian, Jing-Hui Zhang, Department of General Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan , Hubei Province, China Supported by: National Natural Science Foundation of China, No Correspondence to: Kai-Lin Cai, Department of General Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan , Hubei Province, China. caikailin@yahoo.com.cn Received: Revised: Abstract AIM: To determine the expression of DNA methyltransferase and histone methyltransferase (HMT) mrna in different colonic cancer cell lines. METHODS: Expression of Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b and HMT mrna was detected in HT-29, Lovo and Caco-2 cells by RT-PCR. Key Words: DNA methyltransferases; Histone methyltransferase; Methylation; Epigenetics; Colon cancer; Reverse transcription-polymerase chain reaction Zhai RL, Cai KL, Wang GB, Xu F, Tian Y, Zhang JH. Expression of Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b and HMT in different colonic cancer cell lines and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 :. 方法 : R T- P C R HT-29 LovoCaco-2Dnmt1 Dnmt3a Dnmt3bHMT mrna. 结果 : Dnmt3b mrnaht-29 Lovo, Dnmt1HMT, Dnmt3a ; Dnmt3b Dnmt3a. 结论 : ; Dnmt3b DNA. 关键词

92 427 0 引言 基因的表遗传学修饰是一种不依赖 DNA 序列改 变的可逆的基因表达调控过程. 主要包括 DNA 甲基化与去甲基化 组蛋白乙酰化与脱乙酰化 和组蛋白甲基化去甲基化等改变. 这些可逆的 表遗传学修饰可以方便地关闭和开放某些特定 基因, 有选择性表达基因组的信息, 在维持染色 体结构的稳定 基因组的完整 组织特异性基 因的表达调节 胚胎发育 基因组印记 女性 X 染色体失活 细胞分化和个体成长等过程中 发挥着至关重要的作用 [1-3]. 回顾性的研究资料 也表明, 肿瘤细胞中存在异常的 DNA 甲基化模 式 : 基因组整体甲基化水平降低, 导致遗传不稳 定性增加 ; 组织特异性基因的启动子区域出现 从头甲基化 ; 原癌基因多为低甲基化或不充分 甲基化, 低甲基化使原癌基因活化, 导致重新开 放或异常表达, 形成突变热点, 增加染色体的不 稳定性 ; 某些调控细胞生长分化的基因和抑癌 基因启动子因异常甲基化而失活关闭 [4-6]. 这些 都提示我们, 甲基化等表遗传学修饰与癌症的 发生密切相关 [7]. 甲基化必然离不开甲基化酶的 催化作用 [8], Dnmt1, Dnmt3a 和 Dnmt3b 的过度表 达在很多恶性肿瘤中都有报道 [9-10], 本文分析比 较了不同结肠癌细胞系中表遗传学酶谱的表达 水平, 为进一步研究结肠癌表观遗传学发生机 制打下基础. 1 材料和方法 1.1 DMEM(Hyclone), 胎牛血清 (Gibco), T R I z o l( 武汉晶美 ), 逆转录酶 S u p e r s c r i p tⅡ (Invitrogen), RevertAidTM First Strand cdna Synthesis Kit(MBI Fermentas), PCR 仪 (Rotor Gene 3000), PCR 引物由上海生工合成 : 结肠癌细 胞株 H T-29 L o v o C a c o-2 培养于高糖型 DMEM+100 ml/l 胎牛血清. 在 ph ml/l CO 2 培养箱中孵育. 每天观察细胞生长 状况, 每 2 d 换液, 每 3-4 d 传代 RT-PCR Dnmts HMT mrna 为中低度表达 ; Dnmt3a 也是如此, 在 HT-29 中表 : 收集 HT-29 Lovo Caco-2 细胞, 采用 TRIzol 分别抽提各种细胞的总 RNA, 以人 18 S rrna 为内参照, 行逆转录 PCR 扩增. 15 g/l 琼脂 糖凝胶电泳分别检测各自扩增产物, 凝胶成像 分析系统进行半定量分析, 以目的基因与内参 的灰度比代表 mrna 表达丰度. 反应条件 : 94 Dnmt1 Dnmt3b HMT Dnmt3a 18 S Marker H L C H L C H L C H L C H L C 图 1 RT-PCR 检测不同结肠癌细胞系中 Dnmts 与 HMT mrna 表达水平 预变性 5 min, 94 变性 30 s, Tm 退火 45 s, 72 延 伸 30 s, 72 终末延伸 7 min, 共进行 45 个循环. 引 物序列及 Tm 值见表 1. 各组实验数据之间的比较采用 方差分析 t 检验. P <0.05 有统计学意义. 2 结果 2.1 不同 酶之间, 从头甲基化酶 Dnmt3b mrna 在结肠癌 细胞系 HT-29 中呈现高度表达, 维持甲基化酶 Dnmt1 与组蛋白甲基化酶 HMT 次之, 从头甲基 化酶 Dnmt3a mrna 在结肠癌细胞系中的表达水 平最低 (P <0.05, 图 1, 图 2). 这表明不同的 DNA 甲 基化酶在建立和维持 DNA 甲基化过程中的作用 和份量不同, Dnmt3b 在结肠癌形成中可能扮演 更为重要的角色 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp H: HT-29 L: Lovo C: Caco-2 Dnmt1 Dnmt3b HMT Dnmt3a 图 2 Dnmts 与 HMT mrna 在不同结肠癌细胞系中的相对表达量. 2.2 不同细 胞之间, 维持甲基化酶 Dnmt1 与组蛋白甲基化 酶 HMT 的 mrna 表达水平没有显著差异, 从头 甲基化酶 Dnmt3b Dnmt3a mrna 表达水平存 在明显的差异 (P <0.05). HT-29 细胞中 Dnmt3b 呈 现为高度表达, Lovo 和 Caco-2 细胞中 Dnmt3b 则 现为中度表达水平, 在 Lovo 和 Caco-2 中则几乎 不表达 (P <0.05, 图 1, 图 2). HT-29 为高分化的结 肠癌细胞株, 呈上皮细胞样, Caco-2 为中分化结 肠癌细胞, Lovo 则为未分化, Dnmt3b 和 Dnmt3a 在 HT-29 Lovo 和 Caco-2 细胞中不同表达水平 提示, 不同类型与分化程度的结肠癌细胞系可,.

93 428 ISSN CN /R,. 表 1 RT-PCR 检测引物序列表 Gene accession no. Primer sequence Position Tm( ) Products 能存在着迥然不同的表观遗传学发生机制, Dnmt3b Dnmt3a 尤其在分化程度良好的结肠癌细 胞株中表现为高表达状态 ( 与在正常结肠上皮中 的表达水平类似 ), 而在分化不良或未分化的癌 细胞中表现为中低表达水平. 3 讨论 Dnmt1 的正确表达和阶段特异性的翻译后调节, 是维持胚胎正常 DNA 甲基化模式和顺利发育所 不可或缺的 [1]. Dnmt1 Dnmt3a 3b 这三个基因 在几乎所有的正常组织中均呈现广泛的共同表 达, 在肿瘤组织中则为过度表达 [9]. Dnmt1 高表 达是甲基化的重要因素之一, 与 CpG 岛甲基化紊 乱有关, Dnmt1 高表达总是伴有总基因组 DNA 低甲基化和癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基 化 [11-12] ; RNA 干扰抑制 Dnmt1 表达后 RASSF1A 和 p16 等肿瘤相关基因启动子发生去甲基化而重 新表达 [13], Dnmt1 基因敲除则与染色质不稳定性 密切相关 [14]. 与结肠黏膜和良性病变相比, 结肠 癌组织 Dnmt1 和 Dnmt3a 表达显著增高, 结直肠 癌的表遗传学调节是通过甲基化活性增强而不 是去甲基化活性减弱来实现的 [9]. 有研究表明, Dnmt1 蛋白在胃癌和结直肠癌患者中的表达与 年龄 性别不相关, 与肿瘤分化程度显著相 关 [15-16]. Girault et al [17] 检测 130 例乳腺癌中 Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b 的 mrna 表达情况, 结果显示 Dnmt3b 的表达量最高, 而 Dnmt1 Dnmt3a 表达 丰度较低. 我们的研究也发现, 结肠癌细胞株 HT-29 中 Dnmt3b mrna 表现为高表达, Dnmt1 和 Dnmt3a 则分别为中低度表达. 不过也有报道认 为, 结肠癌组织中 DNA 甲基化酶与 CpG 岛的甲 基化并不相关 [18-19], 说明基因启动子的甲基化过 程有多种蛋白和机制参与. 尽管在哺乳动物中, Dnmt1 的主要功能被认 为是维持甲基化, 而 Dnmt3a 和 Dnmt3b 的功能主 要是从头甲基化, 有研究却表明这三个酶很可 能共同参与 协同作用于维持和建立 DNA 甲基 化模式的过程 [20-22]. Dnmt1 和 Dnmt3a 同时起作用 时, 表现出近 5 倍的相比于各自单独作用的甲基 化酶活性, Dnmt3a 始发启动从头甲基化后, 半甲 基化 DNA 底物激活 Dnmt1 完成后续的从头甲基 化修饰, 两者在从头甲基化过程中发挥协同作 用 [20]. Hsieh [21] 分析比较了 Dnmt1 和 Dnmt3a 的作 用发现, Dnmt1 可以催化基因组上瞬时出现的单 链 DNA( 如复制起始区 ) 的局部位点发生从头甲 基化并向周围扩布, 也可以被甲基化的 CpG 岛底 物所激活. 而 Dnmt3a 则不能催化单链 DNA 底物 发生甲基化, 也不被甲基化的 CpG 岛所激活. 这 表明尽管两者都具有从头甲基化活性, 但是作 用机制却是完全不同的. 在从头甲基化过程中 Dnmt3a 扮演启动始发的作用, 他启动双链 DNA 中的其中一条链发生从头甲基化, 形成的半甲 基化位点激活 Dnmt1 完成后续的从头甲基化和 维持甲基化修饰. 深入研究发现, Dnmt1 可以催 化未修饰的 DNA 发生甲基化, 他的从头甲基化 活性是通过甲基化的 DNA 结合到 Dnmt1 酶位于 N 端的变构位点上而被激活的 [23-24]. Rhee et al [25] 通过同源重组将 Dnmt1 基因敲 除后发现, 结肠癌细胞 DNA 甲基转移酶活性明 显下降, 然而基因组甲基化程度却只下降了 20% 左右, p16 等很多基因仍处于甲基化致转录失活 的状态. Dnmt1 与 Dnmt3b 的共同灭活则几乎消 除了甲基化转移酶的活性, 基因组 DNA 甲基化 程度减少了 95% 以上, p16 基因重新表达, 肿瘤

94 429 细胞生长受到抑制 [26]. Leu et al [27] 应用 RNAi 下 调 Dnmt1 和 Dnmt3b 在卵巢癌细胞 CP70 中的表 达水平后发现, 单独抑制 Dnmt1 能部分消除目的 基因 (TWIST, RASSF1A, HIN-1) 的高甲基化状 态并诱导表达, 单独下调 Dnmt3b 的去甲基化和 转录激活效应非常小, 但同时下调这两个酶却 能明显增加去甲基化效应, 目的基因的表达增 加 7-15 倍. Ting et al [28] 的研究也表明, 即使采用 RNA 干扰技术下调人结肠癌细胞中 Dnmt1 基因 的表达, 细胞基因组 CpG 岛甲基化模式仍然能 够得以维持. 正反两方面的资料告诉我们, Dnmt 不同成员在细胞中并不单独发挥作用, 他们在 维持 DNA 甲基化和基因甲基化致沉默过程中协 同作用, 共同发挥生物学效应. 此外, DNA 甲基 化酶 (Dnmt) 与组蛋白甲基化酶 (HMT) 之间也可 能存在着协同作用 [29-30], DNA CpG 岛甲基化与 组蛋白 H3-K9 甲基化在异染色质形成与基因沉 默过程中共同发挥作用, 新发现的组蛋白甲基 化酶 (HMT)SETDB1/ESET 与 DNA 甲基化酶尤其 是从头甲基化酶 Dnmt3a 和 Dnmt3b 之间在功能 上有密切的关联, 而与维持甲基化酶 Dnmt1 之间 没有关系 [31]. 然而 Espada et al [32] 的研究却发现, Dnmt1 在维持组蛋白 H3 位点正常甲基化和乙酰 化模式方面发挥重要的作用. 对此有待进一步 的研究. 总之, 我们的研究发现, Dnmt1 Dnmt3a Dnmt3b 和 HMT 在结肠癌细胞系中呈现不等的 表达水平, Dnmt3a Dnmt3b 在分化良好的结肠 癌细胞系中呈现过度表达状况, 而在分化不良 或未分化的癌细胞则被抑制表达. 这提示表遗 传学酶谱之间在建立和维持 DNA 甲基化过程中 的作用和份量可能并不相同, 不同分期与分化 程度的结肠癌细胞系可能存在着不同的表观遗 传学发生机制. 此外, 既然癌基因低甲基化与抑 癌基因高甲基化在恶性肿瘤组织中是个普遍事 件, 那么对在甲基化过程中发挥枢纽作用的甲 基化酶的研究必然为结肠癌等肿瘤的防治提供 了一个重要的靶点和方向. 下一步我们将在此 实验资料基础上通过对特定基因的调控来进一 步研究结肠癌表观遗传学发生机制. 4 参考文献 1 Chung YG, Ratnam S, Chaillet JR, Latham KE. Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression in cloned mouse embryos. Biol Reprod 2003; 69: Li E, Bestor TH, Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 1992; 69: Turek-Plewa J, Jagodziński PP. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cell Mol Biol Lett 2005; 10: Herman JG, Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med 2003; 349: Cui H, Cruz-Correa M, Giardiello FM, Hutcheon DF, Kafonek DR, Brandenburg S, Wu Y, He X, Powe NR, Feinberg AP. Loss of IGF2 imprinting: a potential marker of colorectal cancer risk. Science 2003; 299: Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science 2001; 293: Luczak MW, Jagodzinski PP. The role of DNA methylation in cancer development. Folia Histochem Cytobiol 2006; 44: Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 2000; 9: Schmidt WM, Sedivy R, Forstner B, Steger GG, Zöchbauer-Müller S, Mader RM. Progressive u p - r e g u l a t i o n o f g e n e s e n c o d i n g D N A methyltransferases in the colorectal adenomacarcinoma sequence. Mol Carcinog 2007; 46: Robertson KD, Uzvolgyi E, Liang G, Talmadge C, Sumegi J, Gonzales FA, Jones PA. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mrna expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res 1999; 27: Hermann A, Gowher H, Jeltsch A. Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell Mol Life Sci 2004; 61: Robert MF, Morin S, Beaulieu N, Gauthier F, Chute IC, Barsalou A, MacLeod AR. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet 2003; 33: Suzuki M, Sunaga N, Shames DS, Toyooka S, Gazdar AF, Minna JD. RNA interference-mediated knockdown of DNA methyltransferase 1 leads to promoter demethylation and gene re-expression in human lung and breast cancer cells. Cancer Res 2004; 64: Karpf AR, Matsui S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Cancer Res 2005; 65: Zhu YM, Huang Q, Lin J, Hu Y, Chen J, Lai MD. Expression of human DNA methyltransferase 1 in colorectal cancer tissues and their corresponding distant normal tissues. Int J Colorectal Dis 2007; 22: Etoh T, Kanai Y, Ushijima S, Nakagawa T, Nakanishi Y, Sasako M, Kitano S, Hirohashi S. Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression correlates significantly with poorer tumor differentiation and frequent DNA hypermethylation of multiple CpG islands in gastric cancers. Am J Pathol 2004; 164: Girault I, Tozlu S, Lidereau R, Bièche I. Expression analysis of DNA methyltransferases 1, 3A, and 3B in sporadic breast carcinomas. Clin Cancer Res 2003; 9: Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Danenberg PV, Laird PW. CpG island,,,,,.

95 430 ISSN CN /R hypermethylation in human colorectal tumors is not associated with DNA methyltransferase overexpression. Cancer Res 1999; 59: Oue N, Kuraoka K, Kuniyasu H, Yokozaki H, Wakikawa A, Matsusaki K, Yasui W. DNA methylation status of hmlh1, p16(ink4a), and CDH1 is not associated with mrna expression levels of DNA methyltransferase and DNA demethylase in gastric carcinomas. Oncol Rep 2001; 8: Fatemi M, Hermann A, Gowher H, Jeltsch A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem 2002; 269: Hsieh CL. The de novo methylation activity of Dnmt3a is distinctly different than that of Dnmt1. BMC Biochem 2005; 6: 6 22 Gowher H, Stockdale CJ, Goyal R, Ferreira H, Owen-Hughes T, Jeltsch A. De novo methylation of nucleosomal DNA by the mammalian Dnmt1 and Dnmt3A DNA methyltransferases. Biochemistry 2005; 44: Araujo FD, Croteau S, Slack AD, Milutinovic S, Bigey P, Price GB, Zannis-Hadjopoulos M, Szyf M. The DNMT1 target recognition domain resides in the N terminus. J Biol Chem 2001; 276: Fatemi M, Hermann A, Pradhan S, Jeltsch A. The activity of the murine DNA methyltransferase Dnmt1 is controlled by interaction of the catalytic domain with the N-terminal part of the enzyme leading to an allosteric activation of the enzyme after binding to methylated DNA. J Mol Biol 2001; 309: Rhee I, Jair KW, Yen RW, Lengauer C, Herman JG, Kinzler KW, Vogelstein B, Baylin SB, Schuebel KE. CpG methylation is maintained in human cancer cells lacking DNMT1. Nature 2000; 404: Rhee I, Bachman KE, Park BH, Jair KW, Yen RW, Schuebel KE, Cui H, Feinberg AP, Lengauer C, Kinzler KW, Baylin SB, Vogelstein B. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells. Nature 2002; 416: Leu YW, Rahmatpanah F, Shi H, Wei SH, Liu JC, Yan PS, Huang TH. Double RNA interference o f D N M T 3 b a n d D N M T 1 e n h a n c e s D N A demethylation and gene reactivation. Cancer Res 2003; 63: Ting AH, Jair KW, Suzuki H, Yen RW, Baylin SB, Schuebel KE. CpG island hypermethylation is maintained in human colorectal cancer cells after RNAi-mediated depletion of DNMT1. Nat Genet 2004; 36: Geiman TM, Sankpal UT, Robertson AK, Chen Y, Mazumdar M, Heale JT, Schmiesing JA, Kim W, Yokomori K, Zhao Y, Robertson KD. Isolation and characterization of a novel DNA methyltransferase complex linking DNMT3B with components of the mitotic chromosome condensation machinery. Nucleic Acids Res 2004; 32: Kang MY, Lee BB, Kim YH, Chang DK, Kyu Park S, Chun HK, Song SY, Park J, Kim DH. Association of the SUV39H1 histone methyltransferase with the DNA methyltransferase 1 at mrna expression level in primary colorectal cancer. Int J Cancer 2007; 121: Li H, Rauch T, Chen ZX, Szabó PE, Riggs AD, Pfeifer GP. The histone methyltransferase SETDB1 and the DNA methyltransferase DNMT3A interact directly and localize to promoters silenced in cancer cells. J Biol Chem 2006; 281: Espada J, Ballestar E, Fraga MF, Villar-Garea A, Juarranz A, Stockert JC, Robertson KD, Fuks F, Esteller M. Human DNA methyltransferase 1 is required for maintenance of the histone H3 modification pattern. J Biol Chem. 2004; 279: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯世界华人消化杂志要求所有署名人写清楚自己对文章的贡献. 第一方面是直接参与, 包括 : (1) 酝酿和设计实验, (2) 采集数据, (3) 分析 / 解释数据. 第二方面是文章撰写, 包括 : (1) 起草文章, (2) 对文章的知识性内容作批评性审阅. 第三方面是工作支持, 包括 : (1) 统计分析, (2) 获取研究经费, (3) 行政 技术或材料支持, (4) 指导, (5) 支持性贡献. 每个人必须在第一至第三方面至少具备一条, 才能成为文章的署名作者. 世界华人消化杂志不设置共同第一作者和共同通信作者.

96 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL PRACTICE 血管内皮生长因子 C 与其受体在食管鳞癌中的表达及临床意义 RESULTS: The positive expression rate of VEGF-C was 43.24% in esophageal carcinoma V E G F - C tissue samples (16/37), which was much higher, than that in para-tumorous tissue samples V E G F - C (7.69%, P < 0.05) and correlated to lymph node VEGFR-3 metastasis and depth of tumor invasion (P = 0.000, P = 0.026), but not to the patient age, tumor size or differentiation. Immunohistochem-, istry showed that the mean number of VEGFR-3 in stained lymphatic vessels of the VEGF-C positive group was higher than that in the VEGF-C. negative group (5.50 ± 1.37/HPF vs 2.81 ± 1.12/ HPF, P < 0.05). The mean number of VEGFR-3 in stained lymphatic vessels in patients with lymph node metastasis was higher than that in those without metastasis (5.60 ± 1.45/HPF vs 2.86 ± 1.04 /HPF, P < 0.001). Expression of vascular endothelial growth factor-c and its receptor in esophageal squamous carcinoma tissues and its clinical significance Peng-Fei Liu, Bing-Tuan Liu, Wei-Dong Shen, Rui-Hua Shi, Hong Zhu Peng-Fei Liu, Bing-Tuan Liu, Wei-Dong Shen, Department of Gastroenterology, Affiliated Jiangyin Hospital of Southeast University, Jiangyin , Jiangsu Province, China Rui-Hua Shi, Hong Zhu, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China Correspondence to: Peng-Fei Liu, Department of Gastroenterology, Affiliated Jiangyin Hospital of Southeast University, 163 Shoushan Road, Jiangyin , Jiangsu Province, China. jylpf@163.com Received: Revised: Abstract AIM: To investigate the expression of vascular endothelial growth factor-c (VEGF-C) and its receptor VEGFR-3 in esophageal squamous carcinoma and para-tumorous tissue samples and the relationship between VEGF-C and VEGFR-3. METHODS: Expression of VEGF-C and VEG- FR-3 was tested by immunohistochemistry in 37 esophageal squamous carcinoma and 12 paratumorous tissue samples. The number of stained lymphatic vessels in VEGFR-3 positive tissue samples was recorded. CONCLUSION: The positive expression rate of VEGF-C is higher in carcinoma tissue samples than in para-tumorous tissue samples. Expression of VEGF-C is closely related with lymph node metastasis and depth of tumor invasion. VEGF-C and VEGFR-3 may promote the growth of canalis haemalis and metastasis of esophageal squamous carcinoma. Key Words: Vascular endothelial growth factor-c; Vascular endothelial growth factor-receptor; Esophageal squamous carcinoma; Immunohistochemistry Liu PF, Liu BT, Shen WD, Shi RH, Zhu H. Expression of vascular endothelial growth factor-c and its receptor in esophageal squamous carcinoma tissues and its clinical significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : C(VEGF-C) VEGFR-3,. 方法 : V E G F - C V E G F R - 3,,,

97 432 ISSN CN /R VEGFR-3. V E G F - C VEGFR-3,,,,. 结果 : VEGF-C43.24%(16/37) 7.69%(1/12), (P <0.05). V E G F-C (P = 0.000, P = 0.026), ; VEGF-C VEGFR-3 VEGF-C, (5.50±1.37/HPF vs 2.81±1.12/HPF, P <0.05); VEGFR-3 (5.60±1.45/HPF vs 2.86±1.04/HPF, P <0.001). 结论 : VEGF-C,. VEGF-CVEGFR-3,. 关键词 统计分析, 运用 χ 2 检验 t 检验及 Fisher 确切概率 法统计. P <0.05 差异有统计学意义. 2 结果 V E G F-C 主要定位于肿瘤细胞质内 ( 图 1A-B), 0 引言食管癌是我国常见恶性肿瘤之一, 发病率高, 预后较差, 鳞癌为其主要病理类型, 发生淋巴结转移是造成预后不佳的主要原因之一. 研究认为, 血管内皮生长因子 C(VEGF-C) 及其受体 VEGFR-3 的结合可以参与胃癌等多种肿瘤的淋巴管的形成 [1-4], 参与淋巴结转移 [5-7], 但对于二者在食管癌组织中表达的研究较少. 本研究即应用免疫组化法检测了 37 例食管鳞癌组织中 VEGF-C 和 VEGFR-3 的表达, 旨在探讨二者在食管癌发生 发展和淋巴管生成中的作用及其与食管癌临床病理特征之间的关系, 从而为食管癌的临床诊断以及判断预后提供参考. 1 材料和方法 例食管鳞癌 12 例癌旁组织标本取自 / 经江苏省人民医院和江阴市人民医院病理科组织病理学证实, 患者年龄 36-80( 平均年龄 58) 岁, 男 27 例, 女 10 例, 其中发生淋巴结转移的有 15 例. 山羊抗人 VEGF-C 抗体购自 R&D 公司, 兔抗人 VEGFR-3 抗体购自 CHEMICON 公司, S-P 免疫组化试剂盒及 DAB 染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司. 1.2 免疫组织化学法按朱宏 et al [8] 报道方法操作, 本实验以 PBS 液代替一抗作为阴性对照. VEGF-C 免疫组化染色结果的判断 : 在放大 200 倍视野下, 每张切片观察 5 个视野, 根据染色程度和染色细胞百分比进行评分. 染色程度 : 基本不着色为 0 级 ; 着色呈淡黄色为 1 级 ; 着色呈黄色为 2 级 ; 着色呈棕褐色为 3 级. 染色阳性细胞百分比 : 着色阳性细胞占计数细胞 <5% 为 0 级 ; 6%-25% 为 1 级 ; 26%-50% 为 2 级 ; 超过 51% 为 3 级. 将染色程度分级与着色细胞百分比分级相乘, 乘积大于 4 者为阳性表达, 0-3 者为阴性表达 [9]. VEGFR-3 免疫组化染色结果判断 : 首先低倍镜下确定脉管着色最密集区 ( 热区 ), 然后在高倍视野 (high power field, HPF) 下计数 5 个高倍视野中阳性脉管密度, 取均数作为淋巴管数. 应用 SPSS10.0 统计软件包进行 37 例食管癌组织中 V E G F-C 的阳性表达率为 43.24%(16/37), 12 例癌旁组织的阳性表达率为 7.69%(1/12), 二者有显著性差异 (P<0.05). 肿瘤组织中 VEGF-C 的表达与淋巴结转移和肿瘤浸润深度显著相关 (P <0.05), 与年龄 肿瘤大小 肿瘤分级和肿瘤位置等无明显相关性 ( 表 1); 根据 S-P 法免疫组化的结果我们还发现, 在 VEGF-C 表达阳性的 16 例肿瘤组织中 VEGFR-3 阳性脉管的平均计数为 (5.50±1.37)/HP, 显著高于 VEGF-C 阴性组织 (2.81±1.12)/HPF, 二者有明显相关性 (P <0.05, 图 1C). 淋巴结转移组 VEGFR-3 阳性染色脉管计数 (5.60±1.45/HPF) 与无转移组的计数 (2.86±1.04/HPF) 有显著性差异 (P <0.001). 3 讨论食管癌是严重危害人民生命安全的疾病, 在我国发生率高, 手术为主要治疗手段, 但手术切除率较低, 术后复发率高, 预后较差. 目前认为, 食管癌发生淋巴结转移是造成预后不佳的主要原因之一, 因此研究肿瘤细胞淋巴管转移有重要的临床意义. 人类 V E G F 基因位于染色体 6 p 上, 全长 24 kb, 编码 VEGF 的基因长约 14 kb, 有

98 433 A B C Skobe et al V E G F - C, Sergio Dias et al VEGF-C FLT-4 (VEGFR-3). 图 1 食管鳞癌组织及癌旁组织 VEGF-C 的表达 (DAB 染色 400). 表 1 VEGF-C 的表达与临床病理特征之间的关系 VEGF-A VEGF-B VEGF-C VEGF-D 和 PIGF 等五种亚型, 目前认为 VEGF 与肿瘤的血 管和淋巴管等生成有密切的关系 [10]. VEGF-C 是 Joukov et al [11] 最先在前列腺 PC-3 细胞系中 提纯出来, 目前被认为是淋巴管生长因子之一, 在促进淋巴管内皮细胞的增殖过程中发挥重 要作用 [12], 其受体主要是位于内皮细胞膜上的 VEGFR-2(KDR) 和 VEGFR-3(Flt4), 其中 VEGF-C 对 VEGFR-3 的亲和能力较 VEGFR-2 高得多, 主 要参与淋巴管生成. 近年研究发现 VEGF-C 在多 种恶性肿瘤如乳腺癌 甲状腺癌等都高表达, 且与淋巴结转移有一定相关性 [3,13-17], 并影响患 者的预后 [18]. Wang et al [19] 发现胃癌患者的血浆 临床特征 n VEGF-C VEGF-C 水平和淋巴管密度与肿瘤的淋巴管转 χ 2 P 值 + - 移及其患者的预后有关. 有人发现在肿瘤边缘生长旺盛的部分 VEGF 的表达强度高于中心位 置, 原因尚不清楚. Kitadai et al [21] 用 RT-PCR 法 检测食管鳞癌中 VEGF-C mrna 的表达, 发现 66.7% 的食管癌表达而正常食管黏膜无表达, 并 发现在 5 种食管癌细胞株中有 4 种表达. 有人研 究了食管鳞癌中 VEGF-C 和 P53 的表达, 发现二 者与肿瘤的淋巴结转移有相关性 [22]. VEGFR-3 即血管内皮生长因子受体 3, 在 胚胎时期, 他主要表达于淋巴管从胚胎静脉发 芽处, 在胚胎后期以及出生以后则主要表达在 淋巴管内皮细胞. 他是目前发现的淋巴管生成 的主要受体, 也是淋巴管较为特异的标志物 [23], Valtola et al [24] 发现在正常乳腺组织和乳腺癌组 织内的淋巴管内皮细胞皆有 VEGFR-3 的高表达. Roberts et al [25] 的动物实验研究显示 VEGFR-3 可以介导乳腺癌的淋巴转移和肺转移, 而通 过对其抑制可以降低转移风险. 有研究发现, VEGF-C 可以和 VEGFR-3 结合并使受体自身磷 酸化, 引起淋巴内皮细胞的增殖, 促进淋巴管生 成 [26]. VEGF-C 和 VEGFR-3 对肿瘤转移的诱导作 用已经在多种肿瘤中发现 [27-29]. 实验结果显示, 37 例食管鳞癌组织中 16 例 VEGF-C 表达阳性, 阳性率为 43.24%, 明显高于 癌旁组织表达 (7.69%, P <0.05). 提示 VEGF-C 可 能与肿瘤的发生有一定相关性. 同时我们也研 究了 VEGF-C 与食管鳞癌临床病理特征之间的 关系, 发现 VEGF-C 的表达与淋巴结转移和浸润 深度相关, 已发生淋巴结转移或浸润已达到浆 膜层的组织 VEGF-C 表达高 (P <0.05), 表明其表 达可能与食管癌的浸润 转移有一定相关性, 这与 Kitadai 的研究结果基本一致 [21]. 本研究未发

99 434 ISSN CN /R 现 VEGF-C 与患者年龄 性别 肿瘤大小 肿 VEGF-C 瘤分化程度和肿瘤位置等临床病理特征之间有 VEGFR-3 明显相关性. 我们对肿瘤组织中 VEGFR-3 染色,, 阳性的淋巴管进行计数, 并将其进行统计分析, 发现 VEGF-C 阳性组染色淋巴管计数较 VEGF-C, 阴性组高, 二者有统计学差异 (P <0.05), 提示. VEGF-C 与 VEGFR-3 之间有相关性, 且发生淋巴 结转移组的 VEGFR-3 计数较未发生转移组的计 数要高, 提示 VEGF-C 可能通过激活食管癌淋巴 管内皮细胞膜上的受体 VEGFR-3 引起淋巴管增 生, 从而促进肿瘤的转移. 我们通过对食管鳞癌组织中 V E G F-C 和 VEGFR-3 的联合检测, 发现他们是浸润 转移 情况的一项重要指标, 具有一定的临床应用前 景. 但目前对 VEGF-C 和 VEGFR-3 作用于肿瘤的 确切机制尚不完全清楚, 需要进一步深入研究. 4 参考文献 K. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J 1996; 15: Oh SJ, Jeltsch MM, Birkenhager R, McCarthy JE, Weich HA, Christ B, Alitalo K, Wilting J. VEGF and VEGF-C: specific induction of angiogenesis and lymphangiogenesis in the differentiated avian chorioallantoic membrane. Dev Biol 1997; 188: Krzystek-Korpacka M, Matusiewicz M, Diakowska D, Grabowski K, Blachut K, Kustrzeba-Wojcicka I, Banas T. Serum midkine depends on lymph node involvement and correlates with circulating VEGF-C in oesophageal squamous cell carcinoma. Biomarkers 2007; 12: Siironen P, Ristimaki A, Narko K, Nordling S, Louhimo J, Andersson S, Haapiainen R, Haglund C. VEGF-C and COX-2 expression in papillary thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2006; 13: Su JL, Yen CJ, Chen PS, Chuang SE, Hong CC, Kuo IH, Chen HY, Hung MC, Kuo ML. The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis in cancer progression. Br J Cancer 2007; 96: Yu XM, Lo CY, Chan WF, Lam KY, Leung P, Luk JM. Increased expression of vascular endothelial growth factor C in papillary thyroid carcinoma correlates with cervical lymph node metastases. Clin Cancer Res 2005; 11: Kondo K, Kaneko T, Baba M, Konno H. VEGF-C and VEGF-A synergistically enhance lymph node metastasis of gastric cancer. Biol Pharm Bull 2007; 30: Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M, Yang Q, T s u k i y a m a A, I m a b u n S, N a k a h a r a M, Nakao K, Nakamura M, Mori I, Kakudo K. Clinicopathological significance of vascular endothelial growth factor-c in breast carcinoma with long-term follow-up. Mod Pathol 2003; 16: W a n g T B, D e n g M H, Q i u W S, D o n g W G. Association of serum vascular endothelial growth factor-c and lymphatic vessel density with lymph node metastasis and prognosis of patients with gastric cancer. World J Gastroenterol 2007; 13: 1 Skobe M, Hawighorst T, Jackson DG, Prevo R, Janes L, Velasco P, Riccardi L, Alitalo K, Claffey K, Detmar M. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med 2001; 7: Veikkola T, Alitalo K. VEGFs, receptors and angiogenesis. Semin Cancer Biol 1999; 9: Dias S, Choy M, Alitalo K, Rafii S. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-C signaling through FLT-4 (VEGFR-3) mediates leukemic cell proliferation, survival, and resistance to chemotherapy. Blood 2002; 99: L i u X E, S u n X D, W u J M. E x p r e s s i o n a n d significance of VEGF-C and FLT-4 in gastric cancer. World J Gastroenterol 2004; 10: Li L, Liu Q, Dong P. The expression and role of VEGF-C and its receptor FLT-4 in laryngeal and hypopharyngeal squamous cell carcinoma metastasis. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2005; 19: ; discussion Tanigaki Y, Nagashima Y, Kitamura Y, Matsuda H, 20 VEGF Mikami Y, Tsukuda M. The expression of vascular ( ) 2006; 26: endothelial growth factor-a and -C, and receptors and 3: correlation with lymph node metastasis and 21 Kitadai Y, Amioka T, Haruma K, Tanaka S, prognosis in tongue squamous cell carcinoma. Int J Yoshihara M, Sumii K, Matsutani N, Yasui W, Mol Med 2004; 14: Chayama K. Clinicopathological significance of 7 Kishimoto K, Sasaki A, Yoshihama Y, Mese H, vascular endothelial growth factor (VEGF)-C in Tsukamoto G, Matsumura T. Expression of vascular human esophageal squamous cell carcinomas. Int J endothelial growth factor-c predicts regional lymph node metastasis in early oral squamous cell Cancer 2001; 93: carcinoma. Oral Oncol 2003; 39: Han U, Can OI, Han S, Kayhan B, Onal BU. 8 Expressions of p53, VEGF C, p21: could they be 1α used in preoperative evaluation of lymph node 2004; 24: metastasis of esophageal squamous cell carcinoma? 9 Dis Esophagus 2007; 20: Damasio H. A computed tomographic guide to the 2007; 15: identification of cerebral vascular territories. Arch 10 Neurol 1983; 40: VEGF, F1t1P53 24 Valtola R, Salven P, Heikkila P, Taipale J, Joensuu 2004; 14: H, Rehn M, Pihlajaniemi T, Weich H, dewaal R, 11 Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, Chilov D, Lahtinen I, Kukk E, Saksela O, Kalkkinen N, Alitalo Alitalo K. VEGFR-3 and its ligand VEGF-C are associated with angiogenesis in breast cancer. Am J

100 435 Pathol 1999; 154: Roberts N, Kloos B, Cassella M, Podgrabinska S, Persaud K, Wu Y, Pytowski B, Skobe M. Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2. Cancer Res 2006; 66: Karkkainen MJ, Petrova TV. Vascular endothelial growth factor receptors in the regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Oncogene 2000; 19: Da MX, Wu XT, Wang J, Guo TK, Zhao ZG, Luo T, Zhang MM, Qian K. Expression of cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor-c correlates with lymphangiogenesis and lymphatic invasion in human gastric cancer. Arch Med Res 2008; 39: Takizawa H, Kondo K, Fujino H, Kenzaki K, Miyoshi T, Sakiyama S, Tangoku A. The balance of VEGF-C and VEGFR-3 mrna is a predictor of lymph node metastasis in non-small cell lung cancer. Br J Cancer 2006; 95: Clarijs R, Schalkwijk L, Ruiter DJ, de Waal RM. Lack of lymphangiogenesis despite coexpression of VEGF-C and its receptor Flt-4 in uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: VEGF-C 2005; 13: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯为了满足读者的多样化需求, 解决一些作者因为资金不足而导致订阅印刷版的困难, 自 2007 年开始, 世界华人消化杂志 (WCJD ), 推出以下个性化服务策略来为广大读者服务. 1 精彩专家述评专辑印刷版杂志 WCJD 旬刊的服务方式 : (1) 每月 8, 18, 28 日通过 发送精彩专家述评 PDF; (2)2007 年底将精彩专家述评专 辑一本挂号邮寄用户收. 定价 : 50 元 / 年. 2 WCJD 电子杂志 WCJD 旬刊的服务方式 : (1) 每月 8, 18, 28 日通过 提醒 PDF 电子杂志 (1-36 期 ). 定价 : 180 元 / 年. 3 WCJD 网络版杂志 WCJD 旬刊的服务方式 : (1) 每月 8, 18, 28 日通过 提醒网络版杂志 (1-36 期 ). 定价 : 160 元 / 年. 4 WCJD 印刷版杂志 WCJD 印刷版 1-36 期. 定价 : 864 元 / 年. 5 订购信息 邮政编码, 姓名, 地址, 部门, 机构名称, , 手机号. 6 汇款的方式邮局汇款 : 世界胃肠病学杂志社收, , 北京市 2345 信箱. 附言注明订购的内容. 银行汇款 : 户名 : 北京百世登生物医学科技有限公司 ; 开户银行 : 中国工商银行北京商务中心区支行国贸大厦分理处 ; 账号 : 附言注明 : 订购的内容和发票的抬头. 总之, WCJD 将尽自己的最大努力, 满足广大读者的需求, 同时欢迎更多个性化服务的意见和建议 发至 : h.n.zhang@wjgnet.com. 谢谢! ( 世界胃肠病学杂志社 ).

101 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL PRACTICE 进展期胃癌化疗疗效的中国文献分析 ed regimens was 23.53%-75.00%, 20.00%-66.67%, and 29.17%-71.88%, respectively. CONCLUSION: Drugs and regimens used for gastric cancer are in agreement with the those reported abroad. However, there are certain short- comings in the design of domestic clinical studies, thus affecting the results of studies., 2.,, 6-9 mo, 5 20%-30%.,,.,, Chinese Reports on the effect and safety of systemic chemotherapy for advanced gastric cancer Ni-Da Cao, Ai-Guang Zhao, Ying-Jie Zhu, Jin-Kun Yang Ni-Da Cao, Ai-Guang Zhao, Ying-Jie Zhu, Jin-Kun Yang, the First Department of Oncology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai , China Correspondence to: Jin-Kun Yang, the First Department of Oncology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 725 Wanping Southern Road, Shanghai , China. amandatsao_tsao@yahoo.com.cn Received: Revised: Abstract AIM: To study the effect and safety of systemic chemotherapy for gastric cancer. METHODS: Articles on systemic chemotherapy for gastric cancer published in 2002 to 2006 were retrieved using the key word "Gastric Cancer" with the secondary retrieval key word "Treatment" or "Chemotherapy" from "Vip Chinese Science and Technology Periodicals database", then the whole text was read to get all-related information. The data were descriptively analyzed. RESULTS: There were 274 articles on systemic chemotherapy for gastric cancer, 156 of which were on oxaliplatin, paclitaxel, docetaxel, capecitabine and irinotecan. Among the 134 articles statistically studied, randomized controlled test was reported in 31, median survival time in 53, and median time of tumor progress in 30, respectively. The response rate of FOLFOX4, FOLFOX6, and other oxaliplatin-related regimens was 21.21%-56.00%, 38.78%-61.29%, and 34.09%-66.67%, respectively. The response rate of paclitaxel-, docetaxel- and capecitabine-relat- Key Words: Gastric cancer; Chemotherapy; Document study Cao ND, Zhao AG, Zhu YJ, Yang JK. Chinese Reports on the effect and safety of systemic chemotherapy for advanced gastric cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 :. 方法 :,, ,,. 结果 : 274, 156, 134, 31, 53, 30. FOLFOX %-56.00%, FOLFOX %-61.29%, OXA+CF/5-FU 34.09%-66.67%, 23.53%-75.00%, 20.00%-66.67%, 29.17%-71.88%. 结论 :,,. 关键词

102 437 0 引言胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一, 居恶性肿瘤死因的第 2 位 [1]. 外科手术彻底扫除癌灶仍是胃癌治疗的首选方法. 但除日本外大多数国家由于没有实施筛查, 早期诊断率较低, 超过 50% 的病例早期症状不明显或不典型, 一经诊断, 常常已达到局部晚期或发生侵犯腹膜, 包围大血管或远处转移而无法手术. 30%-50% 的胃癌患者可以进行手术切除, 但 60% 的根治切除术后患者出现复发或远处转移. 晚期胃癌患者的中位生存期仅为 6-9 mo, 总体 5 年生存率 20%-30%. 为提高胃癌术后的疗效, 辅助化疗已受到日益重视, 针对局部与全身的抗癌药物治疗有重要的地位与作用, 围手术药物起辅助治疗作用, 对于局部进展转移期 ( 晚期 ) 胃癌, 药物治疗发挥主要作用 [2-5] 年 Panzini et al Meta 分析统计 17 篇文献共 3118 例患者, 分析辅助化疗对于胃癌患者生存期的影响, 结果为接受辅助化疗的患者在生存期上有明显优势. Janunger et al Meta 分析也得出类似结果 [6-7]. 近 10 年来, 随着化疗新药物的不断出现, 胃癌的化学治疗已得到长足的进步, 虽然目前尚缺乏一致公认的 金标准 方案, 但新化学药物治疗晚期胃癌研究已出现高潮, 其客观缓解率 (RR) 多已超过 40%. 目前, 晚期胃癌全身化疗新药研究主要有 4 大类 6 种新药, 口服 5-FU 前药 : 卡培他滨 (capecitabine, CAPE, xeloda) 和替吉奥 (S-1). 紫杉类 : 紫杉醇 (paclitaxel, taxol, TAX, PCT) 和多西紫杉醇 (docetaxel, taxotere, TXT, DTX). 第三代铂 : 奥沙利铂 (oxaliplatin, LOHP, OXA, eloxatin). 拓扑异构酶 Ⅰ 抑制剂 : 伊立替康 (irinotecan, camptosar, IRI, CPT-11) [3,5]. 本文对国内已发表的中文文献进行研究, 尤其关注含有上述新药的化疗方案之疗效, 以对胃癌术后全身化疗的疗效及安全性进行评价. 1 材料和方法 1.1 搜索 维普中文科技期刊数据库 年国内已发表的文献, 以 胃癌 为关键字, 治疗 或 化疗 为二次检索关键字, 分别搜索胃癌全身化疗 ( 静脉及口服给药 ) 的临床试验观察类文献. 1.2 纳入标准 : (1) 全身化疗 ( 包括静脉及口服用药 ) 的临床疗效观察类试验 ; (2) 提及病例的纳入条件 ( 如病理证实为胃癌 ; 有客观可测量的指标 ; 不能手术或术后转移复发 ; 复治病例末次 表 1 各类药物相关文献一般情况描述 随机排除纳入统, 总数比例 (%) 对照篇数计篇数. 接受化疗结束时间 ; 体力评分 ; 预计生存期等 ); (3) 有明确纳入试验病例数及可评价疗效病例 数 ; (4) 有疗效评估标准和化疗副反应评估标准 ; (5) 有疗效评价情况 ; (6) 包括随机对照试验与不 设对照试验. 排除标准 : (1) 不符合以上纳入标准 者 ; (2) 全身化疗同时接受局部化疗 ( 包括腹腔灌 注化疗 介入治疗 免疫生物治疗及放疗等其 他抗肿瘤治疗 ). 观察指标 : 化疗组所用的化疗药 物 剂量和用法等以及疗效评价情况. 2 结果 2.1 共搜索到胃癌全身化疗文献 274 篇, 其中术后化疗 265 篇, 新辅助化疗 9 篇. 此外, 另有 4 篇为全身静脉化疗为主并同时辅以腹腔 灌注化疗. 经过阅读摘要 查阅全文等过程后, 统计 胃癌术后全身化疗文献的化疗方案中, 治疗对 象均为晚期胃癌或进展期胃癌患者. 化疗方案 中, 含草酸铂的化疗方案文献共有 125 篇, 含卡 培他滨的 16 篇, 含 CPT-11 的 1 篇, 含羟基喜树碱 的 47 篇, 含蒽环类的 30 篇, 含多西紫杉醇的 23 篇, 含紫杉醇的 38 篇, 其他还用到的化疗药物包括 5- 氟脲嘧啶 ( 包括口服制剂如优福定, FT-207 和方 克等 ) 顺铂 卡铂 庚铂 VP-16 VM-26 丝裂霉素 长春花碱 氨甲喋呤及吉西他滨等, 所用到的化疗方案多达 64 种之多. 2.2 本次研究主 要统计以草酸铂 紫杉类药物 卡培他滨及伊 立替康为主化疗方案文献的情况. 各类药物相 关文献搜索所得篇数 所占比例 是否随机对 照等情况见表 1. 以草酸铂 亚叶酸钙 /5- 氟脲嘧啶联合化疗 方案的文献中, 另有 1 篇记录 1, 3 年的生存率及 疾病进展率, 2 篇提及总生存率, 1 篇提及总无疾 病进展期 (PFS). 84 篇文献中, 未提及疗效及副反 应评价标准的 1 篇, 文中所述病例数与实际参加

103 438 ISSN CN /R et al,,. 表 2 以草酸铂为主化疗方案疗效比较 化疗方案文献篇数 n 可评价数 (n ) 疗效 CR(n ) PR(n ) RR(%) MS(mo)( 篇 ) PFS(mo)( 篇 ) TTP(mo)( 篇 ) 表 3 以紫杉醇为主化疗方案疗效比较 化疗方案文献篇数 n 可评价数 (n) 疗效 CR(n) PR(n) RR(%) MS(mo)( 篇 ) PFS(mo)( 篇 ) TTP(mo)( 篇 ) 表 4 以多西紫杉醇为主化疗方案疗效比较 化疗方案文献篇数 n 可评价数 (n ) 疗效 CR(n ) PR(n ) RR(%) MS(mo)( 篇 ) PFS(mo)( 篇 ) TTP(mo)( 篇 ) 疗效评价例数不符者 7 篇, 观察化疗后总生存率的文献 2 篇, 胃癌与其他病种肿瘤混合统计疗效无法分开者 2 篇, 上述 4 种情况均不纳入统计范围. 余下 72 篇进行化疗方案及疗效的统计. 以紫杉醇为主的化疗方案的文献中, 有 2 篇作者 单位 病例数 病例情况 用药 疗效评价标准完全一致, 但疗效评价结果不同, 均予以排除在统计范围之外 ; 另外无疗效及副反应评价标准的 1 篇, 胃癌与其他病种肿瘤混合统计疗效无法分开者 1 篇, 观察化疗后血清免疫学指标者 1 篇, 均不纳入统计范围内. 剩余 32 篇进行化疗方案及疗效的统计. 以多西紫杉醇为主的化疗方案 的文献中, 有用药剂量明显错误者 2 篇, 不纳入统计范围内. 其余 19 篇进行化疗方案及疗效的统计. 以卡培他滨为主的化疗方案的文献中, 文中所述病例数与实际参加疗效评价例数不符者 1 篇, 胃癌与其他病种肿瘤混合统计疗效无法分开者 2 篇, 上述两种情况不纳入统计范围, 余下 10 篇进行化疗方案及疗效的统计. 2.3 在所有提及疗效评价标准的文献中, 评价标准基本有两种 : 一为 WHO 实体瘤近期客观疗效评价标准 (1981 年 ); 另一种为 1998 年欧洲癌症研究与治疗协会 (EORTC) 美国国立癌症研究所 (NCI) 加拿大国立癌症研究所(NCIC)

104 439 表 5 以卡培他滨为主化疗方案疗效比较 化疗方案 文献篇数 n 可评价数 (n ) 疗效, CR(n ) PR(n ) RR(%) MS(mo)( 篇 ) PFS(mo)( 篇 ) TTP(mo)( 篇 ),. 表 6 随机对照文献情况表 化疗方案随机对照文献数 n 可评价数 (n ) 疗效 CR(n ) PR(n ) RR(%) 提出的 抗肿瘤药对实体肿瘤客观疗效评定标 准 (RECIST) 以草酸铂的化疗方案 : 需要提 出的是, 以标准 FOLFOX6 方案为基础化裁的 全身化疗文献共 9 篇, 但化疗药物剂量严格符 合 FOLFOX6 方案的文献仅为 2 篇, 其余文献中 L-OHP 用量在 mg/m 2 之间, CF 的用量有 200 mg/m 2 与 400 mg/m 2 不同, 快速静滴 5-FU 的剂 量也有 400 mg/m 2 与 500 mg/m 2 不同, 但因 5-FU 静 脉维持静滴的剂量与时间均符合 FOLFOX6 标 准, 故本研究将上述文献均归于 FOLFOX6 为基 础的化疗方案中. 其余 53 篇均为草酸铂 亚叶 酸钙 /5- 氟脲嘧啶联合组成的化疗方案, 但药物 剂量与用法都不符合 FOLFOX 系列方案用法. 以 紫杉醇 多西紫杉醇和卡培他滨为主的化疗方 案见表 : 关于使用拓扑异构酶 Ⅰ 抑制剂单药 或联合其他药物治疗胃癌的文献在本次国内文 献的搜索中较少, 仅为 1 篇, 并且提及为随机对 照试验, 使用药物为 CPT-11 顺铂及 5- 氟脲嘧 啶, 病例数 25 例, 可评价疗效病例 25 例, 完全缓 解 (CR)0 例, 部分缓解 (PR)13 例, 有效率 (RR) 为 52%. 关于含 S-1 的文献在此次搜索中没有所获 : 将纳入统计的文献中 提及为随机对照的文献单独分析 ( 表 6). OXA CF/5-FU 联用方案中, 因各试验药物剂量 用法 均不相同, 主要体现在 5-FU 的用量和用法上, 故 严格意义上无法将其全部进行合并统计有效率, 只能按用药方法的基本类似将其分成 3 类 : 一是 5-FU 单纯静脉点滴, 但用药剂量各有不同, 500 mg/m 2 的 4 篇, 300 mg/m 2 的 4 篇, 375 mg/m 2 和 750 mg/m 2 的各 1 篇 ; 二是先用 5-FU 400 mg/m 2 快速静 脉推注, 再用 600 mg/m 2 静脉维持 22 h; 三是单用 5-FU 静脉维持 22 h 的方法. 2.4 在提及毒副反应评价标准的文献 中, 所使用的标准有以下几种 : (1)WHO 抗癌药 物急性与亚急性毒性表现和分度标准观察和判 断, 分为 0-Ⅳ 度 ; (2) 按照美国国立癌症研究所 (national cancer institute, NCI) 通用不良反应分 级标准 (common terminology criteria for adverse events, CTCAE)3.0 进行评价. (3) 在使用草酸铂 类药物的方案中, 神经毒性按照奥沙利铂专用

105 440 ISSN CN /R 分级法评价, 包括肢端感觉异常或感觉迟钝 麻木, 咽喉部感觉异常, 面部感觉异常和喉部痉 挛综合征或 Caussanel et al 描述的感觉神经毒性, 标准评分 : 1 级为感觉异常和 / 或感觉迟钝, 持续 不超过 7 d; 2 级为感觉异常和 / 或感觉迟钝持续, 8-14 d; 3 级为感觉异常和 / 或感觉迟钝, 在化疗间. 歇期持续存在 ; 4 级为感觉异常和 / 或感觉迟钝引 起功能障碍. 因为并非全部进入统计的文献都分别列出 各项不良反应的具体人数, 大多文献将不良反 应按种类统计, 也有仅在文中列出几个 3/4 度不 良反应的项目, 个别文献统计总周期数中发生 不良反应的例数, 因此无法作详尽的统计及讨 论, 故在此仅列举各化疗方案常见的不良反应. 文献中提及的各化疗方案的血液学毒性主 要为白细胞减少 贫血及血小板减少, 以白细 胞和血小板减少为主, 可出现 3/4 度毒性. 非血 液学毒性中, 主要有恶心呕吐 腹泻等消化道 反应, 口腔黏膜炎, 轻中重度各有分布, 肝肾功 能的损害以轻度为主, 少见 3/4 度毒性, 脱发以含 紫杉醇类药物为多见, 多在轻中度, 少数为重度. 含有草酸铂类药物的, 观察外周神经毒性 ; 含有 卡培他滨的化疗方案, 加观察手足综合征的发 生率 ; 含紫杉醇类药物的方案, 亦有少数文献记 录过敏反应的情况 ; 其他有个别文献记录化疗 的心脏毒性等毒副反应. 3 讨论 在本次搜索到的全部文献中, 出现的化疗方案 达 64 种之多, 一方面表现出目前胃癌术后化疗 尚无统一的标准方案, 应用的药物种类较多, 而 应用以草酸铂 紫杉类 卡培他滨 伊立替康 为主的化疗方案占到总数的 57%, 另一方面也表 现目前国内胃癌术后化疗用药与国际上的趋势 相符. 同时, 国内的临床研究尚存在诸多问题. 草酸铂为主化疗方案的有效率较高, FOLFOX4 有效率为 21.21%-56.00%, 其中 1 篇 为随机对照, 有效率 50%; FOLFOX6 有效率为 38.78%-61.29%, 其中有 4 篇为随机对照试验, 有 效率为 45.00%-58.53%, 略高于 FOLFOX4, 不排 除与两者总病例数相差较多有关, 但这一情况 与国外类似报道结果相仿. 意大利 De Vita et al [8] 用 FOLFOX4 方案治疗晚期胃癌患者 61 例, 全部 参加评价疗效及毒副反应评价, CR 4 例 PR 19 例, 有效率 38%. Louvet et al [9] 用 FOLFOX6 方案 治疗 53 例晚期胃癌患者, 有效率为 45%. 其他 用草酸铂 亚叶酸钙及 5- 氟脲嘧啶联合化疗方案的有效率在 34.09%-66.67%, 与 FOLFOX6 接近, 此间提及为随机对照的文献有效率在 43.75%-66.67% 之间, 但因此类文献中, 3 种药物剂量 用药途径均各有出入, 其有效率难以与单纯 FOLFOX4 或 FOLFOX6 方案相比. 以紫杉类为主的化疗方案在本次研究中方案比较多, 但大多与顺铂 亚叶酸钙及 5- 氟脲嘧啶多药联用, 因此存在每种方案文献篇数较少 病例数也较少的问题, 相应的, 提及随机对照的文献更少, 不同方案的仅各有 1 篇. 紫杉醇与多西紫杉醇为主的化疗方案有效率分别为 23.53%-75.00% 与 20.00%-66.67%, 均高于国外的随机对照试验结果. 目前唯一完成的紫杉类药物治疗晚期胃癌 Ⅲ 期多国多中心试验 V325, 其 Ⅱ 期试验 TCF 和 DC 的有效率分别为 43% 和 26%, 中位疾病进展时间 (TTP) 为 5.9 mo 和 5.0 mo, 中位生存期的比较结果是 9.6 mo 和 10.5 mo [10] ; Ⅲ 期试验中 TCF 的有效率为 38.7% [11]. 而本研究中 DCF 方案的有效率高达 41.18%-56.52%, DC 方案也有 33.33%-40.00%, 故考虑两者出现较大差异仍与样本量过小及是否随机化而产生偏差有关. 以卡培他滨为主的化疗方案中, 卡培他滨联合草酸铂方案占到大多数, 10 篇文献中有 8 篇使用此方案, 有效率在 29.17%-71.88%, 悬殊较大. 国外文献中此方案的报道较少. 韩国的 Ⅱ 期试验用卡培他滨单药 1250 mg/m 2 po 2 次 /d, 每 3 周一次, 治疗 45 例晚期或转移性胃癌患者, 44 例可评价疗效病例, CR 0 例, PR 15 例, 有效率 34%, 中位 TTP 3.2 mo, 中位生存期 (MS)9.5 mo [12]. 一项包括中国在内的多国多中心随机 Ⅲ 期临床研究比较了 XP 方案与 5-FU/DDP(FP) 方案一线治疗晚期胃癌的疗效及安全性. 结果显示两组的疾病无进展时间分别为 5.6 mo 和 5 mo, 总体生存时间分别为 10.5 mo 和 9.3 mo, XP 组均优于 FP 组 [13]. 尚在继续进行中的 REAL-2 Ⅱ 期试验, ECF EOX ECX 以及 EOF 4 组有效率分别为 31% 48% 35% 和 39%, EOX 组明显高于其他 3 组 [14]. 含伊立替康的化疗方案在本次研究中仅一篇文献, 有效率为 52%. 这一结果与日本 Hiroshi et al 的实验结果相仿, 具体用伊立替康 60 mg/m 2, 第 1 15 天静脉维持输注, 联合顺铂 10 mg/m 2, 第 天使用, 治疗 31 例晚期胃癌患者, CR 0 例, PR 16 例, 有效率为 52%, 中位生存时间为 378 d [15]. 而随机 Ⅱ 期试验 V306 的第一阶段, 比较了 CPT-11+DDP( 欧洲方案 ) 与 CPT-11

106 441 联合静脉滴注 5-FU 和 LV 治疗晚期胃癌的疗效, 前者的有效率为 40% [16]. 从本次研究中, 看到国内临床试验中存在的不少问题, 或多或少影响到试验的结果. 首先, 国内的临床研究缺乏多中心的随机对照实验, 所收集病例多为作者本医院的门诊或住院患者. 金懋林教授 et al 用奥沙利铂联合亚叶酸钙及 5- 氟脲嘧啶先静脉快速静滴, 后大剂量静脉维持的试验在目前国内较为权威和标准的临床试验结果. 病例来自 7 个研究中心, 最终可评价疗效例数 40 例, CR 4 例, PR 13 例, 有效率达 42.5% [17]. 国内其他使用该三药联合化疗的临床试验亦与此结果作比较. 其次, 随机对照试验的文献为数相当少, 各方案的随机对照试验篇数在 10% 左右, 不超过 25%. 且对于随机的分配方法也缺乏具体交待, 对随机组患者与对照组患者的同质性没有分析, 不能排除其对试验结果的偏倚影响. 再次, 临床实验的纳入样本量也相对较少, 大多为门诊或病房收集的病例, 没有样本量需求的计算, 在本次收索的文献中, 治疗组病例数最多不超过 60 例, 最少的仅 16 例, 故试验结果可能有因样本量过小而产生的误差. 此次统计虽然尽量将使用药物 剂量 方法相同的方案一并统计, 但因胃癌本身尚无国际统一的所谓 金标准 方案, 各临床试验使用的药物组合各不相同, 相同药物联合应用时, 剂量及用药途径 时间亦各不相同, 从严格意义上而言, 难以合并病例总数以进行综合的疗效评价, 或与国外类似文献进行比较. 此外, 国内文献对生存期的关注度尚不足, 进行统计的 134 篇文献中, 仅 48 篇提到了中位生存时间, 占 35.82%(48/134), 提及中位疾病进展时间的文献也仅为 29 篇, 占 21.65%(29/134). 与此同时, 国外同类文献中对生存期 疾病进展期等及有效率均给予相当的重视. 这提示我们, 国内临床试验需要对病例进行更长时间的随访并进行生存期 疾病进展时间等资料的收集. 值得注意的是, 如各化疗药物或方案之间有效率相近, 则生存期 生存质量等对患者有更重要的意义, 在今后的研究中应予更多的重视. 另外, 在我国, 有越来越多的文献报道中医药治疗晚期胃癌在延长生存期 延迟术后复发转移时间或降低复发转移率 改善生活质量 减轻化疗副反应等有一定的作用, 中医药治疗胃癌日益受到关注, 开展大样本多中心的临床 研究客观评价中医药治疗胃癌的疗效是我国胃 癌研究的重要课题之一. 总之, 晚期胃癌术后化疗目前在国内外尚 无明确的 标准方案, 所用方案众多, 但在药 物应用上已基本趋向于草酸铂 紫杉类 卡培 他滨等药物为主的联合用药方案, 有待在药物 联合 剂量及给药途径上做进一步的研究, 加 之靶向药物联合化疗的研究也逐渐成为热点, 以期提高有效率和延长生存期 提高生存质量. 而国内的临床试验在试验设计上存在不足, 如 缺少多中心的随机对照试验 随机的设计缺乏 严密性 样本量较少 对生存期的关注度不够 等, 需要我们在今后的研究和工作中加以重视 和改进. 4 参考文献,,,. 1 Van Cutsem E. The treatment of advanced gastric cancer: new findings on the activity of the taxanes. Oncologist 2004; 9 Suppl 2: Hejna M, Wohrer S, Schmidinger M, Raderer M. Postoperative chemotherapy for gastric cancer. Oncologist 2006; 11: ; 11: Varadhachary G, Ajani JA. Gastric cancer. Clin Adv Hematol Oncol 2005; 3: ; 4: Panzini I, Gianni L, Fattori PP, Tassinari D, Imola M, Fabbri P, Arcangeli V, Drudi G, Canuti D, Fochessati F, Ravaioli A. Adjuvant chemotherapy in gastric cancer: a meta-analysis of randomized trials and a comparison with previous meta-analyses. Tumori 2002; 88: J a n u n g e r K G, H a f s t r o m L, G l i m e l i u s B. Chemotherapy in gastric cancer: a review and updated meta-analysis. Eur J Surg 2002; 168: De Vita F, Orditura M, Matano E, Bianco R, Carlomagno C, Infusino S, Damiano V, Simeone E, Diadema MR, Lieto E, Castellano P, Pepe S, De Placido S, Galizia G, Di Martino N, Ciardiello F, Catalano G, Bianco AR. A phase II study of biweekly oxaliplatin plus infusional 5-fluorouracil and folinic acid (FOLFOX-4) as first-line treatment of advanced gastric cancer patients. Br J Cancer 2005; 92: Louvet C, Andre T, Tigaud JM, Gamelin E, Douillard JY, Brunet R, Francois E, Jacob JH, Levoir D, Taamma A, Rougier P, Cvitkovic E, de Gramont A. Phase II study of oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid in locally advanced or metastatic gastric cancer patients. J Clin Oncol 2002; 20: Ajani JA, Fodor MB, Tjulandin SA, Moiseyenko V M, C h a o Y, C a b r a l F i l h o S, M a j l i s A, Assadourian S, Van Cutsem E. Phase II multiinstitutional randomized trial of docetaxel plus cisplatin with or without fluorouracil in patients with untreated, advanced gastric, or gastroesophageal adenocarcinoma. J Clin Oncol

107 442 ISSN CN /R 2005; 23: Van Cutsem E, Moiseyenko VM, Tjulandin S, Majlis A, Constenla M, Boni C, Rodrigues A, Fodor M, Chao Y, Voznyi E, Risse ML, Ajani JA. Phase III study of docetaxel and cisplatin plus fluorouracil compared with cisplatin and fluorouracil as firstline therapy for advanced gastric cancer: a report of the V325 Study Group. J Clin Oncol 2006; 24: Hong YS, Song SY, Lee SI, Chung HC, Choi SH, Noh SH, Park JN, Han JY, Kang JH, Lee KS, Cho JY. A phase II trial of capecitabine in previously untreated patients with advanced and/or metastatic gastric cancer. Ann Oncol 2004; 15: Kang Y, Kang WK, Shin DB, Chen J, Xiong J, Wang M, Lichinitser M, Philco M, Suarez T, Santamaria J. Randomized phase III trial of capecitabine/cisplatin (XP) vs. continuous infusion of 5-FU/cisplatin (FP) as first-line therapy in patients (pts) with advanced gastric cancer(agc): efficacy and safety results. J Clin Onc 2006; Sumpter K, Harper-Wynne C, Cunningham D, Rao S, Tebbutt N, Norman AR, Ward C, Iveson T, Nicolson M, Hickish T, Hill M, Oates J. Report of two protocol planned interim analyses in a randomised multicentre phase III study comparing capecitabine with fluorouracil and oxaliplatin with cisplatin in patients with advanced oesophagogastric cancer receiving ECF. Br J Cancer 2005; 92: Imamura H, Ikeda M, Furukawa H, Tsujinaka T, Fujitani K, Kobayashi K, Narahara H, Kato M, Imamoto H, Takabayashi A, Tsukuma H. Phase II study of protracted irinotecan infusion and a lowdose cisplatin for metastatic gastric cancer. World J Gastroenterol 2006; 12: Ajani J.. zt/003/01.htm ; 25: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 世界华人消化杂志 对所有文章进行在线同行评价, 采用匿名方式. 通常每篇文章邀请 2-3 位专家审 阅, 至少 2 人通过方可录用, 否则退稿. 每期最后一页致谢本期所有审稿人 ( 含退稿 ). 文章等级评定 : A 级 B 级 C 级 D 级 E 级 不清楚. 其中 A 和 B 属于很好, C 和 D 不算太好, E 是很差, 还有一部分是不清楚.

108 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL PRACTICE 含左氧氟沙星 雷贝拉唑的三联方案治疗幽门螺杆菌 94 例 Key Words: Levoflaxacin; Rebeprazole; Helicobacter pylori Zhang XM, Zhang ZY. Levofloxacin and rebeprazolebased triple regimen therapy for 94 cases of Helicobacter pylori infection. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): Levofloxacin and rebeprazolebased triple regimen therapy for 94 cases of Helicobacter pylori infection Xi-Mei Zhang, Zhen-Yu Zhang Xi-Mei Zhang, Zhen-Yu Zhang, Department of Gastroenterology, Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China Correspondence to: Xi-Mei Zhang, Department of Gastroenterology, Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China. Received: Revised: Abstract AIM: To evaluate the efficacy and tolerability of levofloxacin-based triple regimen therapy for Helicobacter pylori infection. METHODS: Ninety-four patients with H pylori infection accompanied with peptic ulcer or chronic gastritis were randomly divided into clarithromycin treatment group and amoxicillin treatment group combined with levofloxacin and rebeprazole. The course of treatment was six days. The eradication rate of H pylori was evaluated 1 week before and 4-8 weeks after treatment. RESULTS: The eradication rate of H pylori for levofloxacin-based tripel regimen therapy was 81.9%. The eradication rate of H pylori (85.4%) in clarithromycin treatment group was not significantly higher than that (78.3%) in amoxicillin treatment group (P = 0.368). CONCLUSION: Levofloxacin and rebeprazolebased triple regimen therapy is effective and safe for H pylori infection. 目的 : 方法 : 94 (H e l i c o b a c t e r, H pylori ),,, 6 d. 1 wk 4-8 wk H pylori. 结果 : H pylori 81.9%, H pylori (85.4% vs 78.3%, P = 0.368). 结论 :. 关键词 0 引言幽门螺杆菌 (Helicobacter, H pylori ) 是慢性活动性胃炎 消化性溃疡 胃癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要病因 [1]. 目前临床上 H pylori 推荐根除方案包括抑酸剂或铋剂联合两种抗生素 ( 如阿莫西林 克拉霉素 甲硝唑和四环素等 ). 据统计有近 20% 的患者初次根除失败 [2], 抗生素耐药被认为是根除失败的主要原因. 我们应用含左氧氟沙星的三联方案治疗幽门螺杆菌, 观察其疗效和安全性.,,.,,

109 444 ISSN CN /R 1 材料和方法 1.1 收集我院 / 消化科门诊 经胃镜确诊的胃 十二指肠溃疡及慢性萎缩性, 胃炎患者 94 例, 年龄 l8-65 岁, 其中 H pylori 阳性作, 为入选对象, 排除严重肝 肾及肺等器官功能 障碍, 有关药物过敏史 孕妇和哺乳期妇女以, 及近 4 wk 内已接受抗菌素或 PPI 治疗的患者. 随 H pylori 机分为克拉霉素治疗组和阿莫西林治疗组. 治 疗前 1 wk 内和治疗结束后 4-8 wk 进行胃镜和. H pylori 检测 H pylori : 采用快速尿素酶试验 胃黏 膜组织学检查和 14 C- 尿素呼气试验 ( 14 C-UBT). 胃 镜检查时, 于胃窦和胃体各取 2 块进行快速尿素 酶试验或胃黏膜组织学检查, 试验阳性者即诊 断 H pylori 感染. 治疗结束后至少 4 wk 后进行 14 C-UBT 检测, 结果为阴性, 确定为 H pylori 已 根除 : 克拉霉素治疗组 : 雷贝拉唑 10 mg, 克拉霉素 0.5 g, 左氧氟沙星 0.2 g, 2 次 /d. 阿 莫西林治疗组 : 雷贝拉唑 10 mg, 阿莫西林 1.0 g, 左氧氟沙星 0.2 g, 2 次 /d, 各组疗程均为 6 d. 采用 χ 2 检验, P <0.05 为结果有显 著性差异. 2 结果 含左氧氟沙星的三联方案 H p y l o r i 根除率为 81.9%, 克拉霉素治疗组 H pylori 根除率 (85.4%) 与阿莫西林治疗组 (78.3%) 间无显著性差异 (P >0.05, 表 1). 本研究过程中克拉霉素治疗组 6 例 (12.5%)( 男 2 例, 女 4 例 ), 阿莫西林治疗组 3 例 (6.52%) ( 男 1 例, 女 2 例 ). 在治疗结束后, 第 1 次随 访时诉口苦 纳差 腹胀, 在第 2 次随访时上述 症状消失. 本研究中 9 例 (9.57%) 不良反应轻微, 停药后消失, 总体安全性良好. 3 讨论 H p y l o r i 是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病 因, 是人类胃癌的 I 类致癌源, 因此, 临床上根除 H pylori 极其重要. 根据 Maastricht 共 [3] 识中初次根除方案治疗后仍有近 20% 的患者 6 d, 根除失败 [2]. 随着根除治疗的普遍开展, H pylori 耐药率呈上升趋势. Ling et al [4] 报道, H pylori 对甲硝唑 克拉霉素的耐药率也在逐渐 H pylori, 上升. 因此更换敏感抗生素进行根除治疗是解. 决根除失败的要点. 表 1 克拉霉素组和阿莫西林组 H pylori 根除率 分组 n 根除率 (%) P 值 左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋体, 抗菌活 性两倍于后者, 且抗菌谱广泛. 现已有多项研究 表明左氧氟沙星可安全 有效地初次和补救 治疗 H pylori. 其中左氧氟沙星联合质子泵抑制 剂 阿莫西林或替硝唑初次根除率逾 90% [5-6], 联合质子泵抑制剂 阿莫西林补救根除率分别 为 63% 69.7% [7-8]. 阿莫西林尽管应用广泛, 但 H pylori 对该药的耐药仍少见, 克拉霉素的耐药 率虽在逐渐上升, 但仍是目前根除 H pylori 的一 线用药. 故选择左氧氟沙星联合克拉霉素或阿 莫西林可作为治疗方案中抗生素之选. 雷贝拉 唑是新一代 PPI, 具有较高的解离常数, 起效快, 作用持久稳定, 同时, 由于其独特非酶代谢形式, 药物之间的影响较小, 在人体中的清除不因同 工酶代谢的强弱而明显不同 [9], 个体差异小, 均 为强效抑酸, 有利于提高整体 H pylori 根除率, 对 本方案取得较好的效果具有重要意义. 国内舒建昌 et al [10] 和唐丽安 et al [11] 报道雷 贝拉唑联合克拉霉素 阿莫西林对 H pylori 的根 除率分别为 78.79% 70.97%; 不良反应发生率 分别为 10.62% 3.23%. 本试验含左氧氟沙星的 三联方案对 H pylori 的根除率同上述报道基本一 致, 且不良反应发生率亦较低. 由此本试验提示含雷贝拉唑 左氧氟沙 星 克拉霉素或阿莫西林的新三联 6 d 疗法, 是一种短程 高效 依从性好 安全的根除 H pylori 的治疗方案, 值得在临床上进一步推广 应用. 4 参考文献 1 Current European concepts in the management of Helicobacter pylori infection. The Maastricht Consensus Report. European Helicobacter Pylori Study Group. Gut 1997; 41: Graham DY. Antibiotic resistance in Helicobacter pylori: implications for therapy. Gastroenterology 1998; 115: Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain C, Hungin AP, Jones R, Axon A, Graham DY, Tytgat G. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht Consensus Report. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16: Ling TK, Cheng AF, Sung JJ, Yiu PY, Chung SS. An

110 445 increase in Helicobacter pylori strains resistant to metronidazole: a five-year study. Helicobacter 1996; 1: Cammarota G, Cianci R, Cannizzaro O, Cuoco L, Pirozzi G, Gasbarrini A, Armuzzi A, Zocco MA, Santarelli L, Arancio F, Gasbarrini G. Efficacy of two one-week rabeprazole/levofloxacin-based triple therapies for Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2000; 14: Di Caro S, Zocco MA, Cremonini F, Candelli M, Nista EC, Bartolozzi F, Armuzzi A, Cammarota G, Santarelli L, Gasbarrini A. Levofloxacin based regimens for the eradication of Helicobacter pylori. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002; 14: Perri F, Festa V, Merla A, Barberani F, Pilotto A, Andriulli A. Randomized study of different 'second-line' therapies for Helicobacter pylori infection after failure of the standard 'Maastricht triple therapy'. Aliment Pharmacol Ther 2003; 18: Watanabe Y, Aoyama N, Shirasaka D, Maekawa S, Kuroda K, Miki I, Kachi M, Fukuda M, Wambura C, Tamura T, Kasuga M. Levofloxacin based triple, therapy as a second-line treatment after failure of, helicobacter pylori eradication with standard triple. therapy. Dig Liver Dis 2003; 35: Kawakami Y, Akahane T, Yamaguchi M, Oana K, Takahashi Y, Okimura Y, Okabe T, Gotoh A, Katsuyama T. In vitro activities of rabeprazole, a novel proton pump inhibitor, and its thioether derivative alone and in combination with other antimicrobials against recent clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: ; 23: ; 24: ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯世界华人消化杂志 2007 年 1-12 月份收稿及发稿数字统计结果 : 自 / , 世界华人消化杂志共收到稿件 1525 篇, 退稿 627 篇, 退稿率 41.11%. 发表文章 773 篇, 其中述评 47 篇 (6.1%), 基础研究 198 篇 (25.61%), 临床研究 94 篇 (12.16%), 文献综述 109 篇 (14.10%), 研究快报 91 篇 (11.77%), 临床经验 201 篇 (26.00%), 病例报告 10 篇 (1.29%), 焦点论坛 19 篇 (2.46%). 会议纪要 4 篇 (0.5%), 英文摘要 740 篇 (95.98%). 其中受国家级基金资助的 177 篇 (22.96%), 省部级基金资助的 247 篇 (32.04%). 作者分布遍及全国各地, 绝大多数来自高等院校及附属医院. ( 常务副总编辑 : 张海宁 )

111 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL PRACTICE 肠胆反流与 Oddi 括约肌压力之间的关系 and in 10 of the 33 randomly selected patients, Oddi while no duodenobiliary reflux was detected in, the remaining 23 patients of the control group. The basal pressure and contraction amplitude of Oddi sphincter and the pressure of common, T bile duct were significantly lower in the reflux group than in the control group (7.2 ± 3.9 mmhg, vs 14.7 ± 11.0 mmhg, 53.5 ± 24.5 mmhg vs Oddi ± 65.6 mmhg, 5.1 ± 1.6 mmhg vs 11.5 ± 7.4 mmhg, P < 0.05). No significant difference was. found in the frequency of contractions, duration of contractions or pressure of common bile duct between the two groups. Relationship between duodenobiliary reflux and pressure of Oddi sphincter Shao-Long Sun, Dong-Xu Cui, Xian-Wei Dai, Shuo- Dong Wu, Yong-Qing Xu Shao-Long Sun, Dong-Xu Cui, Xian-Wei Dai, Shuo- Dong Wu, Yong-Qing Xu, Department of General Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang , Liaoning Province, China Correspondence to: Shao-Long Sun, Department of General Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang , Liaoning Province, China. doublegragons@yahoo.com.cn Received: Revised: Abstract AIM: To observe the relationship between d u o d e n o b i l i a r y r e f l u x i n p a t i e n t s w h o underwent choledocholithotomy plus T-tube drainage and pressure of Oddi sphincter. METHODS: A total of 51 patients who underwent choledocholithotomy plus T-tube drainage were studied. After duodenobiliary reflux due to oral 185 MBq (5 mci) of technetium-99m diethylenetriaminepentaacetatic acid ( 99m Tc-DTPA) was observed, the patients were divided into reflux group positive for duodenobiliary reflux and control group negative for duodenobiliary reflux. Thirty-three of them were selected randomly and the pressure of Oddi sphincter was assessed by choledochoscope manometry to find if there is a certain relationship between them. RESULTS: Duodenobiliary reflux was detected,, in 31% (16/51) of the patients who underwent choledocholithotomy plus T-tube drainage CONCLUSION: The occurrence of duodenobiliary reflux is related with the contraction amplitude and basal pressure of Oddi sphincter and the common bile duct pressure, but not with the contraction frequency and duration of Oddi sphincter and the pressure of common bile duct. Duodenobiliary reflux may paly a role in the pathogenesis of choledocholithiasis. Key Words: Cholelithiasis; Duodenobiliary reflux; Manometry; Biliary kinetics Sun SL, Cui DX, Dai XW, Wu SD, Xu YQ. Relationship between duodenobiliary reflux and pressure of Oddi sphincter. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : Oddi. 方法 :, 51, 33Oddi, O d d i. 结果 : 51 T 16 (31%); 3310 (), 23, Oddi

112 447 (7.2± 3.9 mmhg vs 14.7±11.0 mmhg, 53.5±24.5 mmhg vs 117.2±65.6 mmhg, 5.1±1.6 mmhg vs 11.5±7.4 mmhg, P <0.05). (DP) Oddi(SOF) (SOD) (P >0.05). 结论 : Oddi, Oddi. 流组, 其余作为对照组 ; 并从中随机双盲的选择 33 名患者, 男 10 例, 女 18 例, 年龄 27-73( 平均 56.6) 岁, 进行 Oddi 括约肌测压研究. 测压器械为 PC polygram HR 高分辨 多通道胃肠功能测定仪及相应测压软件 三通道测压导管 低顺应性水灌注系统 氮气泵及 PENTEX LX-750p 纤维胆道镜. 三通道测压导管长 2 m, 直径 1.7 mm, 末端有 3 个侧孔, 相隔 2 mm, 每孔开口于不同方向. 1.2 患者于检查前禁食 1 夜, po 1 ml 含有 185 MBq(5 mci) 的 99m Tc-DTPA 水, 接着 240 ml 水 漱服, 患者立即平卧位. 经 T 型引流管收集接下关键词 来的 2 h 胆汁, 取其中的 20 ml, 采用放射活度检 测仪计数放射性活度. 如果胆汁中可以检测到 放射性活度, 则该患者存在十二指肠胆道反流. 所有的 99m Tc-DTPA 均在服用前配制, 并且经放射色谱检测其放射化学纯度 (radiochemical purity). 0 引言所有选用的药品, 99m Tc-DTPA 的放射化学纯度大胆道探查取石加 T 管引流术后的患者有较高的于 99%, 即游离 99m Tc 小于 1% [2-3]. 受试者检查前 2 胆石复发率, 为 6.4%-18% [1], 其复发率因结石的 d 不使用对胆道压力有影响的药物, 禁食 1 夜. 设部位 类型及手术的不同而不同. 一些因素, 如置电脑测压系统参数, 氮气压力为 40 kpa, 水流 Oddi 括约肌狭窄 残余结石 慢性胆管炎 胆速度为 0.5 ml/min, 连接测压导管, 经 T 型管窦道道细菌感染 胆管狭窄 不健康的饮食习惯 导入胆道镜, 观察乳头部是否蠕动良好 有无不适当的治疗或不正规的操作等, 可能与胆管狭窄及纤维化或结石, 取净结石后, 由胆道镜侧结石的高复发率有关. 关于胆道中的细菌, 目前孔插入测压导管, 直视下经乳头达十二指肠, 稳公认是来源于肠道, 或者经过十二指肠大乳头定 30 s 后测压, 后拽导管至 Oddi 括约肌部, 直视逆行感染, 或者穿透肠黏膜进入胆道, 但是这方结合电脑出现时相波可明确导管处于 Oddi 括约面的证据并不多见 ; 而且, 关于胆石症患者肠肌内, 测压后导管拽至胆总管内进行测压 [4]. 胆反流的发生率如何, 以及肠胆反流的发生与 数据结果以 mean±sd 表示, 组 Oddi 括约肌压力之间的关系怎样, 国内外鲜见间差异采用 Student's t 检验, P <0.05 认为有显著报道. 由于 Oddi 括约肌在维持胆道压力, 调节胆性差异. 汁排泄及防止十二指肠胆道反流方面起重要作 2 结果用, 因此, 我们采用放射性核素标记大分子物质 51 例行胆道取石 T 型管引流术后的患者中有 16 锝 -99m 二乙三胺五乙酸 (technetium-99m diethyle netriaminepentaacetatic acid, 简称 99m 例检测到十二指肠胆道反流 (31%), 此 16 例反 Tc-DTPA) 来流阳性患者的 2 h 胆汁中锝计数为 209.5±264.0 观察 T 管引流术后的患者十二指肠胆道反流的 kbq, 占摄入剂量的 1.1% 左右, 其余 35 例胆汁样发生情况, 并且经胆道镜测量这些患者 Oddi 括品中未检测到放射性活度. 从所有患者中按照约肌压力 ; 对于有无发生肠胆反流的患者之间, 随机双盲原则选择了 33 例进行 Oddi 括约肌测比较其 Oddi 括约肌的压力差异. 压, 经 po 99m Tc-DTPA 证实, 10 例存在十二指肠胆 1 材料和方法道反流 ( 反流组 ), 其余 23 例无反流 ( 对照组 ). 两 / 因胆道残石在中国医科组 Oddi 括约肌测压结果见表 1. 两组患者在年大学附属二院住院治疗的患者 51 例, 男 15 例, 女龄及性别组成方面无显著性差异. 反流组 Oddi 36 例, 年龄 27-90( 平均 59.2) 岁, 全部患者均已行括约肌基础压 (SOBP) 收缩波幅(SOCA) 胆胆囊切除 胆总管探察取石及 T 型管引流术, 平总管压 (CBDP) 显著低于对照组 (P <0.05), 特别均手术后时间 2 mo. 观察所有患者肠胆反流的发是 SOCA, 其平均值在反流组尚不及对照组的生情况, 将发生十二指肠胆道反流的患者作为反 1/2(53.5±24.5 mmhg vs 117.2±65.6 mmhg). 两, Oddi.

113 448 ISSN CN /R 表 1 T 型管引流术后患者 Oddi 括约肌测压结果 (mean±sd, mmhg) 分组 n 男 / 女年龄 ( 岁 ) DP SOBP SOCA SOD SOF CBDP,,. 组十二指肠压 (DP) Oddi 括约肌收缩频率 (SOF) 及收缩间期 (SOD) 无显著性差异. 3 讨论消化道反流是一种不正常现象, 临床上多见的有十二指肠胃反流和胃食管反流, 分别形成反流性胃炎和反流性食管炎 ; 除此之外, 还有十二指肠胆道反流和胰液胆道反流, 分别与胆管炎和胆总管囊肿的发病有关. 十二指肠胆道反流发生后, 由于会有十二指肠液 肠道细菌及内毒素 食物等进入胆道, 这些物质都有可能引起胆结石的发病, 因此肠胆反流有可能与胆石形成有关. 目前用于检测十二指肠胆道反流的方法主要有 : po 泛影葡胺后放射线检查 [5], po 苏打后超声波检测 [6], 以及服用核素标记的大分子物质, 如 99m Tc-DTPA 等, 闪烁扫描检测 [7-8]. 这些方法有一个共同特点, 就是都需要使用复杂且昂贵的医疗检测设备 ( 如 X 线发射仪, 超声仪, SPECT 等 ), 其中的一些结果只有依靠影像专家才能识别, 个体判定变化大, 灵敏度不高, 难定量评价. 我们首次对胆道取石 T 管引流术后的患者采用 99m Tc-DTPA 检测十二指肠胆道反流, 此方法唯一用到的设备就是 RM905 型放射活度检测仪. 其原理是高分子质量的 99m Tc-DTPA(M r ) 难以穿透肠道黏膜 [9], 并且经过肾脏而非肝脏排泄. 因此如果我们在患者的胆汁中检测到放射性活度, 就可以判断其存在十二指肠胆道反流. 因为 99m Tc-DTPA 再没有其他的途径进入胆汁了, 这就是可以用 po 99m Tc-DTPA 检测十二指肠胆道反流的原理. 此方法简单易行, 廉价 安全, 由于锝半衰期短 ( 仅 6 h), 可以在短时间内重复研究. 其检测结果可以很容易的被那些不是很精通影像诊断学的研究者所理解. 此方法有很高的特异性 ( 可达 100%), 但敏感性尚不清楚, 因为十二指肠胆道反流的发生可以被一些因素影响, 如 O d d i 括约肌的功能状态 十二指肠的蠕动及胆道运动情况等. 这意味着在胆道取石术后的 患者中实际反流发生率比我们的研究结果可能要高. 本研究首次对 T 管引流术后的患者采用 99m Tc-DTPA 检测十二指肠胆道反流, 发现这些患者中肠胆反流的发病率为 31%, 反流的核素剂量占摄入量的 1.1% 左右, 尽管此方法无法用于健康志愿者, 缺乏对照, 但是我们认为正常人是不应该存在肠胆反流的. 这是因为正常的 Oddi 括约肌具有单向阀门作用, 可以维持胆道压力, 调节胆汁排泄, 防止十二指肠胆道反流的发生. 那么是否说明在 T 管引流术后的患者中, 其较高的肠胆反流发病率与 Oddi 括约肌功能异常有关呢? 由于目前 Oddi 括约肌测压是公认的研究 Oddi 括约肌功能的金标准, 在胆道动力学及 Oddi 括约肌功能判断上有重要意义, 于是我们从所有受试对象中随机双盲的选择了 33 例 ( 经 po 99m Tc- DTPA 证实, 10 例存在肠胆反流, 反流发病率 30.3%, 卡方检验证实与总体发病率无显著性差异 ) 进行 Oddi 括约肌测压, 结果发现, 反流组 Oddi 括约肌收缩波幅显著低于对照组, 而且该组 Oddi 括约肌基础压和胆总管压亦低于对照组, 而两组在十二指肠压 Oddi 括约肌收缩间期及频率方面无显著性差异. 进一步的分析发现, 由于反流组胆总管压低于对照组, 两组间十二指肠压无显著性差异, 二者的差值即胆肠压力差 (CBDP-SOBP), 反流组低于对照组, 经统计学分析, 此差异具有显著性. Oddi 括约肌的存在, 维持了胆道的压力, 使胆总管压力高于十二指肠压, 即胆肠压力差为正值. 本项研究中, 反流组胆肠压力差 (1.0± 0.8 mmhg) 与对照组 (5.2±1.3 mmhg) 比较, 差异具有显著性 (P <0.05). 可见, 胆肠压力差减小是发生十二指肠胆道反流的直接原因. 然而, 如果 Oddi 括约肌的功能正常, 即使胆肠压力差下降至负值, 即胆总管压力小于十二指肠压, 也可以不发生肠胆反流. 这个负值是有一定限度的, Calabuig et al [10] 研究发现, 以 100 cm 水柱的压力灌注负鼠十二指肠, 未观察到有十二肠液

114 449 反流进入胆道. 如果 Oddi 括约肌的功能正常, 那 么胆肠压力差是不可能减小的, 更不可能为负 值. 也就是说, 反流组胆肠压力差的下降, 归根 于 Oddi 括约肌的功能异常. 本研究发现, 反流组 O d d i 括约肌的基础压和收缩波幅显著低于对 照组, 尤其以 SOCA 的降低明显, 不及对照组的 1/2. SOCA 和 SOBP 的下降, 说明 Oddi 括约肌的 泵 的功能减弱, 其后果是胆肠压力差下降, 肠胆反流发生. 胆道取石 T 管引流术后的患者存在十二指 肠胆道反流, 可能与胆总管结石取石术后较高 的结石复发率有关, 因为在存在十二指肠胆道 反流的患者中, 肠道细菌和内毒素更容易进入 肝胆系统, 而该实验则为此细菌易位提供了间 接的证据. 这些细菌进入肝胆系统后, 其中的一 些可以产生 β- 葡萄糖苷酸酶和磷脂酶 A, 分别水 解胆汁中的结合胆红素和卵磷脂, 其产物非结 合胆红素和软脂酸可以与钙离子结合成沉淀, 作为色素结石的主要成分. 而且, 内毒素可以通 过细胞毒效应或其他机制激活肝脏细胞 胆道 上皮细胞或胆汁中的白细胞, 释放内源性 β- 葡萄 糖苷酸酶 [11], Ho et al [12-13] 发现内源性 β- 葡萄糖苷 酸酶在色素结石的发病中可能也起重要作用. 除了细菌和内毒素以外, 十二指肠液和食 物也有可能通过反流进入胆道. 在离体实验中, 成石性胆汁中加入十二指肠液可以促进结石的 形成, 说明十二指肠胆道反流在结石的形成中 起一定的作用. 而且, 反流入胆道的食物, 如鱼 [14] 骨 樱桃柄等, 可以作为胆道异物起到结石的 成核作用, 胆汁中的黏蛋白 胆红素钙 细菌 及其他物质会围绕此核心聚集, 形成结石 [15]. 所 有这些证明十二指肠胆道反流在结石的发病中 起到一定的作用. 总之, 根据以上研究, 我们推测, 由于某种 原因造成 Oddi 括约肌功能障碍 (sphincter of oddi dysfunction), 表现在 SOCA SOBP 及胆肠压力 差显著性下降, 导致肠胆反流的发生, 反流物 ( 包 括十二指肠液 食物等异物 肠道细菌及毒素 等 ) 通过不同的途径参与胆总管色素结石的发 病. 但是, 由于本研究所选择的对象均为那些因 胆总管结石已经行手术治疗的患者, 故究竟是 先有胆石症的发病, 还是先有 Oddi 括约肌功能 障碍的发生, 尚有待于进一步的研究. T 管引流术后的患者中存在肠胆反流, 其发 病率在 31% 左右 ; 肠胆反流的发生与 Oddi 括约肌收缩波幅 基础压及胆肠压力差显著性下降有关, 而与 Oddi 括约肌的收缩频率 间期及十二指肠压无关. 肠胆反流有可能参与胆总管结石 :, 的发病., 4 参考文献, 1 Uchiyama K, Onishi H, Tani M, Kinoshita H, Kawai. M, Ueno M, Yamaue H. Long-term prognosis after treatment of patients with choledocholithiasis. Ann Surg 2003; 238: Sun SL, Wu SD, Zhang XB. Oral (99m)Tc-DTPA simultaneous determination of duodenobiliary reflux and intestinal permeability in patients after choledocholithotomy plus T-tube drainage. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2005; 4: ; 87: Wu SD, Zhang ZH, Jin JZ, Kong J, Wang W, Zhang Q, Li DY, Wang MF. Effects of narcotic analgesic drugs on human Oddi's sphincter motility. World J Gastroenterol 2004; 10: Roux-en-Y 2003; 11: Wu CH, Chiu HM, Liu KL, Lin JT, Wang HP. Sonographic demonstration of duodenobiliary reflux with soda enhancement. J Clin Ultrasound 2004; 32: ; 25: Germain A, Proux C, Oury F. Significance of radiocinematography in the diagnosis of duodenobiliary reflux and biliodigestive fistulas. Mem Acad Chir (Paris) 1961; 87: Tc- 1998; 5: Calabuig R, Weems WA, Moody FG. Choledochoduodenal flow: effect of the sphincter of Oddi in opossums and cats. Gastroenterology 1990; 99: O s n e s T, S a n d s t a d O, S k a r V, O s n e s M. Lipopolysaccharides and beta-glucuronidase activity in choledochal bile in relation to choledocholithiasis. Digestion 1997; 58: H o K J, L i n X Z, Y u S C, C h e n J S, W u C Z. Cholelithiasis in Taiwan. Gallstone characteristics, surgical incidence, bile lipid composition, and role of beta-glucuronidase. Dig Dis Sci 1995; 40: Ho KJ, Hsu SC, Chen JS, Ho LH. Human biliary beta-glucuronidase: correlation of its activity with deconjugation of bilirubin in the bile. Eur J Clin Invest 1986; 16: Kelly MD, Hugh TB. Cherry stalk in the common bile duct. Aust N Z J Surg 1993; 63: Chen HH, Zhang WH, Wang SS, Caruana JA. Twenty-two year experience with the diagnosis and treatment of intrahepatic calculi. Surg Gynecol Obstet 1984; 159: ,,.

115 ; 16(4): ISSN CN /R CLINICAL PRACTICE 实时荧光定量 PCR 检测 IL-8 mrna 在大肠癌的表达 tissue (1.106 ± vs ± 0.374, P < 0.05). IL-8 mrna expression was closely related with the pathologic parameters, such as presence of venous invasion, lymph node metastasis, histo- logical type, liver metastasis and clinicopathological stage (Dukes) (P < 0.05). However, tumor, site was not significantly related to the age and,, sex of the patients. PCR CONCLUSION: IL-8 mrna expression is significantly correlated with the biological behavior IL-8 mrna of colorectal carcinoma. The high expression, of IL-8 may be related with the occurrence and. progress of colorectal cancer.,, Expression of interleukin-8 mrna in patients with colorectal carcinoma detected by real-time quantitative PCR Wen-Peng Zhou, Qing-Xia Fan, Kui-Sheng Fan, Rui-Lin Wang, Jin-Min Wu Wen-Peng Zhou, Qing-Xia Fan, Kui-Sheng Fan, Rui-Lin Wang, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou , Henan Province, China Jin-Min Wu, Oncology Center, Sir Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou , Zhejiang Province, China Correspondence to: Rui-Lin Wang, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 1 Jianshe Eastern Road, Zhengzhou , Henan Province, China. zhwpeng@sohu.com Received: Revised: Abstract AIM: To investigate the IL-8 mrna expression in cancerous tissue from patients with colorectal carcinoma and to evaluate its clinic significance. METHODS: Fluorescent quantitative PCR (FQ- PCR) was used to detect the IL-8 mrna expression in cancerous tissue from 56 patients with colorectal carcinoma and to observe its relationship with pathologic parameters. RESULTS: The expression of IL-8 mrna was significantly higher in cancerous tissue from patients with colorectal carcinoma than in normal Key Words: Colorectal carcinoma; Interleukin-8; Fluorescent quantitative PCR Zhou WP, Fan QX, Fan KS, Wang RL, Wu JM. Expression of interleukin-8 mrna in patients with colorectal carcinoma detected by real-time quantitative PCR. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(4): 目的 : IL-8 mrna. 方法 : PCR 56 IL-8 mrna, IL-8 mrna. 结果 : IL-8 mrna (1.106±0.420 vs 0.792±0.374, P <0.05). IL-8 mrna,. 结论 : IL-8,. 关键词 0 引言趋化因子是一组对白细胞有趋化作用和激活功

116 451 能的细胞因子. 近年来研究表明, 趋化因子与肿瘤生长和转移有密切关系, 其中研究较为深入的是白介素 -8(IL-8). 在许多肿瘤组织中均可检测到 IL-8 蛋白质分泌及其 mrna 表达, 而在其相应正常组织 IL-8 不表达或呈低表达状态, 说明 IL-8 与肿瘤发生 发展有关. 因此, 我们应用实时荧光定量 P C R 法检测大肠癌患者癌组织 IL-8 mrna 表达, 并分析其与临床病理因素之间关系. 1 材料和方法 / 浙江大学附属邵逸夫医院肿瘤外科的住院大肠癌患者 56 例. 男 33 例, 女 23 例. 年龄 31-85( 中位年龄 55) 岁. 所有标本均经过病理证实. 其中, 结肠癌 22 例, 直肠癌 34 例. 组织学类型 : 乳头状腺癌 7 例, 管状腺癌 44 例, 黏液腺癌 5 例. 我们将乳头状腺癌和高 中分化腺癌定为分化好型, 将低分化及黏液腺癌定为分化差型. 临床病理分期按 Dukes 分期. 全部病例术前均未接受化疗及放疗. FQD-33A 荧光定量 PCR 仪由杭州大和热磁电力有限公司提供. 总 RNA 抽提试剂盒和 M-MuLV 逆转录酶购自 Promega 公司. 逆转录实时荧光定量 PCR 试剂购自 Roche 公司 : 引物和探针在 G e n B a n k 查到基因序列, 使用软件 P r i m e r- E x p r e s s 2. 0 进行设计. I L - 8 上游引物 : 5 ' - AGAGTGGACCACACTGCGC-3', 下游引物 : 3'-ACATCCCAACGGTCTACGTTA-5', 扩增片段为 251 bp; GAPDH 上游引物为 5'-GAAGATGG TGATGGGATTT-3', 下游引物为 5'-CAAGCTTC CCGTTCTCAGCC-3', 扩增产物长 226 bp. 上述引物均由上海博亚生物技术服务公司合成 RNAcDNA : 标本采集后迅速放至液氮中冷冻, -80 保存. 使用 TRIzol RNA 提取液, 按照其说明书对大肠癌组织和癌旁正常组织提取总 RNA, 通过甲醛变性凝胶电泳定性和紫外分光光度仪定量. 取总 RNA 1 µg, 进行逆转录, 按照说明书进行 cdna 合成, 所得 cdna 置于 -20 保存. GAPDH 和 IL-8 mrna 的 PCR 反应 : 反应体系为 25 µl, l0 PCR buffer 2.5 µl, 25 mmol/l MgCl 21.5 µl, l0 mmol/l dntp 0.5 µl, l0 nmol/l Primer 1 µl/l, l nmol/l probe 2.5 µl, 5 µl/l Taq 0.25 µl, cdna 2.5 µl, 无菌双蒸水 15 µl, 反应条件 : 94 变性 5 min, s, s, s, 共 40 个循环, 循环结束后 72 延伸 10 min, 每个标准品和标本 均作复管 PCR 反应 PCR : 采用 GAPDH 作为内参照. IL-8 mrna 和 GAPDH m R N A 根据标准曲线得出 m R N A 的分子拷贝 数. 用 GAPDH 的拷贝数作为校正基数, 即目的 基因 mrna 精确含量 = 目的基因 CT 值 / 内参照 GAPDH CT 值, 以此比值作统计处理. 根据 FQ- PCR 原理, 被激发的荧光信号达到一定阈值后被 荧光探头采集, 最后将其转换成 CT 值, 该数值与 扩增片段的实际拷贝数呈反比, 即 CT 值越低, 实 际拷贝数含量越高. 各数据均以 mena±sd 表示, 进 行配对 t 检验, 应用 SPSS11.0 统计软件对所得数 据进行统计学处理, 以 P <0.05 为有显著性差异. 2 结果 2.1 IL-8 大肠癌癌旁正常组织和大肠癌组织均表达 IL-8 mrna, 其表达水平分别为 1.306±0.448 和 ±0.456, 大肠癌组织 IL-8 mrna 表达明显高于 癌旁正常组织 (P <0.05). 2.2 IL-8 IL-8 mrna 在乳头状腺癌和管状腺癌组织中 的表达明显高于黏液腺癌组织 (1.106±0.420 vs 0.792±0.374, P <0.05). 在有淋巴结转移者中的 表达明显低于无淋巴结转移者 (P <0.05). 肝脏转 移者 IL-8 mrna 表达低于无肝脏转移者 (0.756± vs 1.103±0.424, P <0.05). 按大肠癌 Dukes 分期标准, 本组 A 期和 B 期 20 例, C 期和 D 期 36 例. C D 期 IL-8 mrna 表达平均指数为 0.891± 0.349, A B 期为 1.223±0.449, 前者 IL-8 mrna 表达明显低于后者 (P <0.05, 表 1). 3 讨论 浸润 转移及复发是肿瘤生物学主要特性, 具 有重要的临床意义, 因而备受关注. 而血管形成 在肿瘤浸润 复发及转移过程中有非常重要的 作用. 肿瘤的持续生长必须依赖新生血管的形 成, 如果肿瘤不能血管化, 生长至 2-3 mm 便发生 退化. 血管化不仅能通过 灌注 效应促进肿 瘤生长, 并为肿瘤细胞进入血液循环和转移提 供可能, 在肿瘤形成中起着重要的作用 [1]. 目前 的研究显示, IL-8 参与肿瘤血管形成, IL-8 与肿瘤 的侵润 转移密切相关 [2-5]. Lee et al [6] 检测 35 例 胃癌患者癌组织和癌旁正常组织中的 IL-8 表达, 癌组织中 IL-8 表达显著高于癌旁正常组织, 随,,., IL-8, IL-8.

117 452 ISSN CN /R 表 1 IL-8 mrna 与大肠癌临床病理指标 IL-8 mr- NA 密切相关, Inoue et al [19] 用 IL-8 反义 cdna 全序列抑制肿瘤组织血管形成和肿瘤转移, 而 Hjortoe n IL-8 mrna et al [20] 用乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 接种动物,. 对产生肿瘤的动物分别用抗 IL-8 抗体和对照抗 体处理, 结果表明, 与对照组相比, 抗 IL-8 抗体处 理的肿瘤生长明显延缓, 出现转移时间明显延 长. Zhang et al [21] 研究前列腺癌细胞 PC-3MM2 时 也有类似发现. 提示 IL-8 可成为抗肿瘤治疗的一 个新的靶点. 4 参考文献 1 Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86: Murphy C, McGurk M, Pettigrew J, Santinelli A, Mazzucchelli R, Johnston PG, Montironi R, Waugh DJ. Nonapical and cytoplasmic expression of interleukin-8, CXCR1, and CXCR2 correlates with cell proliferation and microvessel density in prostate cancer. Clin Cancer Res 2005; 11: Luppi F, Longo AM, de Boer WI, Rabe KF, Hiemstra PS. Interleukin-8 stimulates cell proliferation in non-small cell lung cancer through epidermal growth factor receptor transactivation. Lung Cancer 2007; 56: Takehara H, Iwamoto J, Mizokami Y, Takahashi K, Ootubo T, Miura S, Narasaka T, Takeyama H, Omata T, Shimokobe K, Ito M, Matsuoka T. Involvement of cyclooxygenase-2--prostaglandin E2 pathway in interleukin-8 production in gastric cancer cells. Dig Dis Sci 2006; 51: Trevino JG, Gray MJ, Nawrocki ST, Summy JM, Lesslie DP, Evans DB, Sawyer TK, Shakespeare WC, Watowich SS, Chiao PJ, McConkey DJ, Gallick GE. Src activation of Stat3 is an independent requirement from NF-kappaB activation for constitutive IL-8 expression in human pancreatic 着病理分期的升高, IL-8 的表达也逐步升高, 二者有显著相关性. 同时 IL-8 的表达与病理分型也有显著的相关性, 而 IL-8 的高表达与胃癌患者的生存时间有显著负相关性, 这表明 IL-8 的表达在预测胃癌癌变过程中是非常重要的有效的指标. [7-9] 研究者在肺癌和卵巢癌 [10] 乳腺癌 [11] 肝 [12] 癌等也得出了类似的结果, 提示 IL-8 参与肿瘤 adenocarcinoma cells. Angiogenesis 2006; 9: Lee KH, Bae SH, Lee JL, Hyun MS, Kim SH, Song SK, Kim HS. Relationship between urokinasetype plasminogen receptor, interleukin-8 gene expression and clinicopathological features in gastric cancer. Oncology 2004; 66: Tas F, Duranyildiz D, Oguz H, Camlica H, Yasasever V, Topuz E. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin-8 (IL-8) levels in small cell lung cancer. Cancer Invest 2006; 24: 的发生和发展. 本研究显示, 大肠癌患者癌组织 IL-8 mrna 表达强度明显高于正常组织, 而且随着大肠癌临床病理分期的升高而明显上升, 呈 8 Henriquet C, Gougat C, Combes A, Lazennec G, Mathieu M. Differential regulation of RANTES and IL-8 expression in lung adenocarcinoma cells. Lung Cancer 2007; 56: 显著正相关, 癌组织 IL-8 mrna 的高表达与血管侵犯 淋巴结转移和肝脏转移呈显著正相关, 提示 IL-8 参与大肠癌的浸润和转移. 9 Tas F, Duranyildiz D, Oguz H, Camlica H, Yasasever V, Topuz E. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin-8 (IL-8) levels in small cell lung cancer. Cancer Invest 2006; 24: 研究表明 IL-8 除参与肿瘤血管形成外, 还通 10 Lokshin AE, Winans M, Landsittel D, Marrangoni 过阻滞细胞凋亡 [13] AM, Velikokhatnaya L, Modugno F, Nolen 促进细胞和细胞及细胞和 BM, Gorelik E. Circulating IL-8 and anti-il-8 基质间黏附 [14] 自分泌 [15-16] 上调基质金属蛋 autoantibody in patients with ovarian cancer. [17] 白酶及通过调节 EGFR [18] Gynecol Oncol 2006; 102: 等作用而参与肿瘤 11 Derin D, Soydinc HO, Guney N, Tas F, Camlica H, 的发生发展. 由于 IL-8 与血管形成及肿瘤生长 Duranyildiz D, Yasasever V, Topuz E. Serum IL-8

118 453 and IL-12 levels in breast cancer. Med Oncol 2007; 24: Lin Q, Huang MS, Hu B, Dong M, Wen JY, Wu XY. Serum levels of macrophage migration inhibitory factor and interleukin-8 in hepatocellular carcinoma patients: their correlations with tumor progression and prognosis. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2007; 15: Abdollahi T, Robertson NM, Abdollahi A, Litwack G. Identification of interleukin 8 as an inhibitor of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in the ovarian carcinoma cell line OVCAR3. Cancer Res 2003; 63: Barshishat M, Ariel A, Cahalon L, Chowers Y, Lider O, Schwartz B. TNFalpha and IL-8 regulate the expression and function of CD44 variant proteins in human colon carcinoma cells. Clin Exp Metastasis 2002; 19: Huang J, Yao JL, Zhang L, Bourne PA, Quinn AM, di Sant'Agnese PA, Reeder JE. Differential expression of interleukin-8 and its receptors in the neuroendocrine and non-neuroendocrine compartments of prostate cancer. Am J Pathol 2005; 166: Kamohara H, Takahashi M, Ishiko T, Ogawa M, Baba H. Induction of interleukin-8 (CXCL-8) by tumor necrosis factor-alpha and leukemia inhibitory factor in pancreatic carcinoma cells: Impact of CXCL-8 as an autocrine growth factor. Int J Oncol 2007; 31: Watanabe H, Iwase M, Ohashi M, Nagumo M. Role of interleukin-8 secreted from human oral squamous cell carcinoma cell lines. Oral Oncol 2002; 38: Luppi F, Longo AM, de Boer WI, Rabe KF, Hiemstra PS. Interleukin-8 stimulates cell proliferation in non-small cell lung cancer through epidermal growth factor receptor transactivation. Lung Cancer 2007; 56: Inoue K, Slaton JW, Kim SJ, Perrotte P, Eve BY, Bar-Eli M, Radinsky R, Dinney CP. Interleukin 8 expression regulates tumorigenicity and metastasis in human bladder cancer. Cancer Res 2000; 60: Hjortoe GM, Petersen LC, Albrektsen T, Sorensen BB, Norby PL, Mandal SK, Pendurthi UR, Rao LV. Tissue factor-factor VIIa-specific up-regulation of IL-8 expression in MDA-MB-231 cells is mediated by PAR-2 and results in increased cell migration. Blood 2004; 103: Zhang F, Lee J, Lu S, Pettaway CA, Dong Z. Blockade of transforming growth factor-beta signaling suppresses progression of androgenindependent human prostate cancer in nude mice. Clin Cancer Res 2005; 11: ,,. ISSN CN /R 2008 年版权归世界胃肠病学杂志社 消息 本刊讯 世界华人消化杂志 采取开放存取出版方式, 自 1995 年起, 发表的文章可以在线免费阅读全文 ( 自 至 , 电子版的点击次数为 , 平均 每天点击 次. 总下载次数 , 平均每天下载 164 次. ( 世界胃肠病学杂志社 )

119 ; 16(4): ISSN CN /R MEETING MINUTES 世界胃肠病学杂志 西安地区编委及作者读者座谈会纪要 世界胃肠病学杂志 西安地区编委及作者读者座谈会于 在西安交通大学医学院第二附属医院召开 ( 图 1). 杂志社社长兼总编辑马连生教授 名誉总编辑潘伯荣教授 副总编辑王苑本教授 副总编辑杨思凤教授及西安地区编委 作者读者共 40 余人出席会议. 会议由西安交通大学医学院第二附属医院副院长李宗芳教授主持 ( 图 2). 马连生社 ( 图 3) 长首先介绍了本刊的工作流程及发展现状, 包括编辑 组稿 出版 发行 被引频次和影响因子等, 并提出了不断提升本刊质量和学术水平, 更好地服务于广大读者 作者和编委的工作方针. 大家就本刊的发展方向 读者群定位 期刊的审稿形式 以及如何将杂志办得更好等问题进行了热烈的座谈与会专家仁者见仁, 智者见智, 集思广益, 共谋发展. 一致认为, 本刊发表的文章学术水平近年来不断提高, 并且受国家基金资助的文章及国外作者的文章也逐年增多, 为促进国际学术交流 推动学科进展发挥了重要的作用. 参会专家还建议, 本刊的中 英文两个杂志在刊登文章的选择上应该有不同的侧重, 中文版 世界华人消化杂志 应更加重视对临床有指导作用的 优秀的临床实用性论文的刊出, 既要确实显示出国家级的水平, 又要照顾对广大临床医师的可读性及实用性, 而英文版 World Journal of Gastroenterology 则应该更多的增加原创性和基础研究类文章, 以提高期刊的国际学术影响力, 同时也要适当刊登一些有争议性的文章, 以便更好地促进学术发展, 今后应该更加发挥本刊的自身优势, 加快特色化建设的进程, 打造 精品, 提高知名度, 吸引更多的高水平 图 1 世界胃肠病学杂志 西安地区编委及作者读者座谈会会场. 图 2 西安交通大学医学院第二附属医院副院长李宗芳教授主持会议. 图 3 本刊社长兼总编辑马连生教授在会上. 文章投稿, 为国内外学者更好地提供展示自己的平台.

120 455 图 4 本刊名誉总编辑潘伯荣教授在会上. 图 5 与会人员合影. 名誉总编潘伯荣教授 ( 图 4) 指出 : 今后的工作要更加脚踏实地, 文章发表要注重创新性 可读性及临床实用性, SCI 的影响因子是办好杂志的结果, 而不是目的. 他对杂志今后的发展寄予了深切期望. 最后总编马连生教授对本次会议作总结, 本次 座谈会的圆满召开给予高度评价, 并充分肯定西安地区编委及其作者 读者多年来对杂志的积极支持给与 ( 图 5). 同时, 还表明今后将增加稿件评审意见的内部评价系统 并在在欧美 日本等地设立办事处 邀请国际学术权威为本刊撰写述评等, 使本刊的学术水平更上一层楼, 发表更多的精品文章. ISSN CN /R 2008 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会决定于 在上海市召开第二十次全国中西医结合消化系统疾病学术会议, 并同时举办全国中西医结合消化疾病 ( 重点为肝病 内镜与胃癌 ) 新技术新理论继续教育学习班. 学习班招收对象 ; 中西医结合 中医或西医的消化专业医师 科研人员 研究生等. 参加学习班者授予国家级 1 类继续教育学分 ; 大会论文报告者另授继续教育学分 6 分. 1 征稿内容消化内镜技术及其中西医结合临床应用 ; 脂肪肝 慢性肝炎与肝硬化等常见肝病的中西医结合基础与临床研究 ; 消化道肿瘤中西医结合诊疗 ; 脾胃学说及其临床应用 ; 其他消化系统疾病 ( 包括食管 胃 肝 胆 胰腺等疾病 ) 的基础研究 临床研究与实践等. 2 征稿要求 请注明作者姓名 单位 详细通讯地址 邮编. 稿件请附 800 字论文摘要, 尽可能以电子信件的形式将稿件传 送, 截稿日期 : 联系方式 刘成海, , 上海市浦东新区张衡路 528 号上海中医药大学附属曙光医院肝病所, 传真 : 或 , shxhhy2008@yahoo.cn 或 czs.xiaohua@163.com