超临界流体色谱 基础导论 Terry A. Berger

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1 更多信息 查找当地的安捷伦客户中心 安捷伦客户服务中心 免费专线 手机用户 超临界流体色谱 联系我们 基础导论 在线询价 本文中的信息 说明和指标如有变更 恕不另行通知 安捷伦科技公司 年 7 月 1 日 中国印制 CHCN 超临界流体色谱 基础导论

2 超临界流体色谱 基础导论 Terry A. Berger

3 本文中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技公司, 年 7 月 1 日, 中国印刷 CHCN

4 目录 目录前言作者简介引言符号缩写 III VI XI XIII XIV XIV 1 超临界流体色谱简介 什么是 SFC 为什么采用 SFC SFC 能够分离哪些化合物 这一名称的含义 16 2 流动相 为什么使用 CO 2? 使用 1% CO 改性剂或共溶剂 添加剂 添加水以扩展溶质极性 34 3 固定相 材料 非手性键合相 固定相比较 填料粒径与色谱柱尺寸之间的关系 推荐的色谱柱尺寸 用于手性分离的色谱柱 48 III

5 4 流动相变量对保留值和选择性的影响 改性剂浓度 温度 压力 流速 可控变量对保留时间和选择性的影响概述 57 5 方法开发 溶质与固定相极性的匹配 极性窗口 入门指南 极性溶质 低极性溶质 多变量方法 65 6 非手性分离 案例研究 1 典型的低极性样品 案例研究 2 中等极性样品 案例研究 3 磺胺类药物 其他结果 89 7 手性分离 背景 对映体过量率测定 用于手性分离的正相技术 可控变量对手性分离的影响 开发手性方法 98 IV

6 8 SFC 定量分析 验证阶段 开发方法用于定量分析饮料和食品中的山梨酸盐 苯甲酸盐和咖啡因 校正 苯甲酸盐 山梨酸盐和咖啡因的定量分析结果总结 手性分离 仪器注意事项 泵 UV 检测器优化 双梯度 自动进样器注意事项 其他 SFC 的超高性能 在 SFC 与 HPLC 之间切换的混合型系统 质谱接口 其他检测器 156 参考文献 159 V

7 前言 作者 Terry Berger 在我们如今称之为超临界流体色谱 (SFC) 的领域中拥有独特的丰富经历, 是撰写本基础导论的不二人选 他早期与 SFC 的接触多属偶然, 并未特别关注, 但后来逐渐开始了深入了解 他与 SFC 相关从业人员保持有近 4 年的联系, 并拥有 35 年以上的直接经验 近 6 年前 (1958 年 ), Jim Lovelock 率先提出 SFC, 他在 2 世纪 8 年代和 9 年代与作者就 SFC 进行了大量讨论, 成为作者的私人朋友 Ernst Klesper 于 1962 年通过实验展示了 SFC, 采用高密度氯氟烃作为流动相对金属卟啉进行分离 作者后来与 Klesper 教授在很多场合有过交流 ( 从 2 世纪 7 年代后期到 8 年代中期在美国和德国 ), 并就 SFC 进行过大量讨论 在 2 世纪 6 年代和 7 年代, 该技术停滞不前, 全球每年最多只有十几个研究组做出零星的科学贡献 应用领域倾向于将气相色谱 (GC) 扩展至分子量更大 沸点更高 相对非极性的溶质 2 世纪 7 年代早期, 作者在印第安纳州普渡大学攻读研究生, 当时隔壁实验室是颇受尊敬的色谱专家 L.B. Buck Rodgers 的实验室 自参加过 1971 年的一次科学研讨会之后, 他再次决心探索这一全新的色谱形式 流动相的压力控制是主要的可控变量, 压力从低到高的程序是那个时期的常用操作 那个时期的所有设备都是自制的, 仪器控制性较差, 人们对流动相的理化特性最多也只是取得初步了解 Rodgers 利用仓库中的超高压加氢泵, 并使用 2 英寸厚的家用泡沫绝缘材料制造了一个看起来像小棺材的约 4 英尺长的柱温箱 色谱柱为 3 英寸长或更长, 并填充以具有宽粒径分布的不规则颗粒 作者看着这些开发进展, 回想当时曾经怀疑这一奇特的色谱形式是否有用 Rodgers 的结果表明沿着色谱柱柱长的密度梯度是个严重的问题 这一结果及随后 Milos Novotney 的研究似乎表明该技术不可能得到与当前高效液相色谱 (HPLC) 相媲美的结果 这一看法在一定程度上阻碍了填充柱 SFC 的后续研究 VI

8 作者曾于 2 世纪 7 年代早期在伦敦帝国学院接受过有关 HPLC 的培训, 那时他开发出了用于 HPLC 的安培电化学检测器 在巴西教学一年后, 他在俄亥俄州克里夫兰参与了大量有关航天仪器的开发项目 然后, 作者于 1979 年开始供职于惠普公司, 并加入 Avondale 部门的研究小组 惠普实验室或 Avondale 部门的所有科学家或工程师 Dennis Gere Henk Lauer Doug McManigill 和 Harry Weaver 在当年的匹兹堡会议上就高密度气相色谱做了一系列报告 ( 作者正是在此次会议上获得聘任 ) 这些报告中的某些成果随后发表于诸如 Analytical Chemistry 和 Science 等期刊以及相关的应用简报中 这些工作引导了一项客户需求, 促使了商品化套装的开发, 从而使 Hewlett-Packard HP 184 型 HPLC 仪器转化为 SFC 系统 因此, 商品化 SFC 就此诞生 这一版本的 SFC 使用机械反压调节器 二元泵和组分程序, 非常类似于 HPLC 流速 组分 柱温和色谱柱出口压力均独立控制 与先前的自制仪器不同, 该系统不存在压力程序 随着粒径仅为 3 µm 的球形硅胶颗粒相关大量研究工作的进展, 色谱柱更加现代化 作者所在的研究组承担了该装备的设计工作 几乎在使用纯 CO 2 压力程序的毛细管型 SFC 问世的同时, 惠普公司推出不兼容 SFC 的 HP 19 HPLC 仪器, 取代了过时的 HP 184 仪器 Milos Novotny 和 Milton Lee 是毛细管 SFC 发展的背后推手 本书作者所在的惠普公司研究小组那时刚刚开发出熔融石英毛细管色谱柱, 该型色谱柱能够耐受毛细管 SFC 所必需的高压 (4 至 6bar) 条件 Milton Lee 是将固定相键合到毛细管色谱柱这一新领域的学术带头人 VII

9 由于缺少市售仪器, 填充柱 SFC 几乎销声匿迹, 而毛细管 SFC 则被视作 未来的发展趋势 当时, 人们对流体的理化性质及其与固定相的相互作 用还知之甚少 仅剩的少数填充柱用户与毛细管柱支持者之间展开了许 多争论 作者于 1985 年开始作为高级研究科学家在惠普公司从事 SFC 研发工作, 被委任解决这些争议问题 在该过程中, 他访问了每位欧洲 用户 ( 大约 16 位 ), 就争议问题和发展潜力进行了广泛的讨论 当时, 人们普遍认为密度是主要的可控变量, 并且改变流动相密度对保留性能的影响最大 很遗憾的是, 由于 Giddings 的误解, 人们认为高密度 CO 2 的极性类似于异丙醇 1 如果确实如此, 添加醇类改性剂将明显改变流动相的密度, 但对溶剂强度的影响则微乎其微 这一误解数十年来都未受到质疑 当时, 缺乏直接的密度测量手段对 SFC 中所用的甲醇 / CO 2 ( 或任何其他 ) 混合物的密度进行测量 二元混合物的状态方程并不准确 作者随后从特拉华大学借来了比重计, 对甲醇 /CO 2 的密度进行了一些首次测量, 发表在文献中 然后他测量了密度不变的情况下甲醇浓度对保留值的影响, 结果表明改性剂确实能够显著提高流动相的洗脱强度 不久之后, 溶剂化变色染料被证明是一种可在 HPLC 中测量染料分子周围溶剂化微球强度和极性的简单方法 2 然后, 作者将相同的原理应用于 SFC 45 结果表明二元流体的溶剂强度呈现出高度非线性, 最初少量的添加剂即可产生过度的影响 CO 2 的极性和溶剂强度被证明类似于戊烷 1 在密度和溶剂化变色染料测量中,Giddings 的洗脱系列公式最终获得了修正 ( 尽管仍有许多追随者 ) 结果证明, 至少对于改性的流体而言, 改变改性剂浓度对保留值的影响远大于压力 温度和密度的影响 2 世纪 8 年代后期, 经广泛证实, 使用 CO 2 和醇类改性剂 ( 甲醇或乙醇 ) 组成二元流路时, 许多极性溶质 ( 例如有机酸和碱 ) 洗脱得到的峰形很差或根本无法洗脱出来 一般认为这一现象表明固定相活性过高或包含与这些极性溶质相互作用过强的活性位点 当时提议的解决方案是 VIII

10 使用低极性的固定相以及进一步的脱活处理, 但是该方法根本无效, 极性分子通常不发生保留并且严重拖尾 作者提出使用极性添加剂 ( 例如, 强酸和 / 或碱 ) 与有机改性剂的混合液, 同时使用极性更强的色谱柱, 此方法被证明能够显著改善峰形 此类添加剂的使用开启了现代 SFC 的潜能, 目前此技术已经能够洗脱和分离包含高达 4 聚体肽在内的极性溶质 我们可以至少追溯到 Buck Rodgers 的论文 3, 他们存在这样一种看法 : 色谱柱的压降将导致密度梯度的产生, 造成严重的柱效损失 这一观点在 2 世纪 7 年代中期得到 Novotny 的支持 4 到 2 世纪 8 年 5 代中期, 出现了多种竞争理论, 其中至少一种理论认为填充柱 SFC 无法生成超过大约 2 的塔板数, 因为伴随色谱柱压降将产生密度梯度 作者将 11 根柱长为 2 cm 且填充以 5 µm 填料的色谱柱串联, 在高达 25bar 压降的条件下获得了 22 的塔板数, 有力地反驳了大多数争论 密度梯度的影响仍然是人们感兴趣的一个领域, 大量最新的出版物均以此为主题 作者说服密西西比大学的 Jon Parcher 采用示踪物脉冲 MS 实验测量流动相组分在固定相上的吸附情况 结果表明大量的吸附涂层对固定相的性质具有显著影响, 从而会影响到色谱性能 澄清了大多数的误解后, 作者说服惠普公司管理层投资开发新一代的 SFC 开发出的产品于 1992 年问世, 此产品兼具毛细管柱和填充柱性能 该仪器 (HP G125A) 能够同时 独立地控制流速 组成 压力和温度, 它还能够使用内部状态方程执行密度程序 自 2 世纪 9 年代早期至中期以来, 随着对流动相特性的了解日益深入, 人们普遍认为毛细管 SFC 被过分吹嘘, 尤其针对极性溶质 这一认知很大部分来源于对 Giddings 洗脱系列公式的修订 令人痛心的是, 这种情况导致了毛细管 SFC 的消亡, 即使该技术经证实与其他技术相比, 对极性较低的溶质具有众多优势 IX

11 1995 年, 作者得到从惠普公司购买 SFC 业务的机会, 并与另外一位前雇员和外部投资者一起创建了 Berger Instruments (BI) BI 再次投入设计工作中, 主要针对填充柱 SFC 以及降低成本 BI 推出了首款手性方法开发系统 首款成功用于克级 ( 主要为手性 ) 和高通量库纯化的半制备型仪器 首款市售 SFC-MS 系统 首款成功的气体输送系统以及大量其他的次要产品 公司于 2 年底被出售给 Mettler Toledo, 作者从此担任首席技术官直至 23 年 28 年, 作者创立了 Aurora SFC Systems, 该公司能够生产一种将近似标准 HPLC 仪器转换为最先进的 SFC 系统的模块 Aurora 于 212 年出售给安捷伦科技公司, 其升级模块如今已成为安捷伦分析型 SFC 系统的核心 作者的研发小组获得了两项不同的 R&D1 奖, 一项是在 BI, 另一项在 Aurora( 这两个奖项分别用于表彰 24 年和 28 年的 1 项顶尖发明 ) 作者目前拥有一个最先进的 SFC 实验室, 开展 SFC 咨询业务 (SFC Solutions, Inc.) 从必须的业务经营中解脱出来后, 他积极开展研究并发表了有关仪器装置 色谱柱和应用 ( 包括本基础导论 ) 的原创性研究成果 作者对流体理化性质 SFC 应用和仪器装置方面长期 深入的见解在行业内独树一帜 他见识过许多应用潮流的来去, 看着许多否定理论逐渐消失 他对 SFC 的未来非常乐观, 希望他的深入见解能够传递给本基础导论的读者, 帮助读者在实验室中成功实施 SFC X

12 作者简介 Terry A. Berger 从佛罗里达 威斯康辛和普渡大学研究生毕业后, 于 1976 年获得英国伦敦大学帝国理工学院的分析化学博士学位 Berger 博士被许多人视作现代超临界流体色谱 (SFC) 之父 24 年,Berger 博士荣获英国色谱学会授予的 Martin 金质奖章 ( 色谱领域最重要的奖项之一 ) Terry A. Berger 博士,DIC 总裁,SFC Solutions, Inc. 自 1985 年起, 他在惠普公司 ( 如今的安捷伦科技公司 ) 花费十几年时间系统地破除了当时流行的许多有关填充柱 SFC 的误解 在这个过程中, 他搞清楚了密度和溶剂强度效应 ( 已成为主要焦点 ) 他证明( 与许多已有理论相反 ), 高压降不会导致柱效产生严重损失 ( 仍备受关注的问题 ) 他提出使用添加剂并系统研究了各种添加剂对峰形和保留值的影响, 首次展示了对各种化合物的分离,( 与常见认识相反 ) 证明填充柱 SFC 广泛适用于比以前预想更多的极性溶质 示例包括似药物类小分子, 例如伯胺 1995 年,Royal Society of Chemistry 出版了 Berger 博士的专著 填充柱 SFC (Packed Column SFC), 该著作从根本上改变了分离科学中对 SFC 的看法, 使现代 SFC 更类似于 HPLC 而非 GC 此书一直是了解该技术基本原理的主要来源, 本基础导论的出版旨在取代这本专著 在本基础导论之前出版的其他 SFC 相关著作基本都是许多作者就特定主题的论文汇编 Berger 博士还出版了大约 75 篇同行评审科学论文 7 篇专著章节 13 项百科全书和参考工作条目以及几十篇应用简报 他还将讲授过 2 多次有关 SFC 的短期课程, 提供了数百次口头报告和海报, 并获得或申请了大约 25 项有关 GC SFC 和 HPLC 的专利 XI

13 1995 年, 他创立了 Berger Instruments 公司, 推出了首款 SFC 手性方法系统 首款成功用于库纯化和克级分离的半制备型 SFC 系统 首款市售 SFC-MS 以及首款气体输送系统 后来, 他创立了 Aurora SFC, 该公司制造一种将分析级 HPLC 仪器转换为 SFC 系统的模块 此模块已成为安捷伦分析型 SFC 系统和安捷伦分析型 SFC/UHPLC 混合型系统的基础 他的技术团队在过去 12 年已经两次荣获 R&D 1 奖项, 还获得过能源部颁发的 NICE III 环境奖 Berger 博士依然是许多色谱出版物和学会的编辑和评审员 XII

14 引言 本基础导论旨在取代作者在 1995 年首次由 Royal Society of Chemistry 出版的著作 填充柱 SFC (Packed Column SFC) 这本原著从根本上改变了分离科学中对 SFC 的看法, 使现代 SFC 更类似于 HPLC 而非 GC 这一观念将在本基础导论中得到延续和扩展 第一章介绍了 SFC 的一些基本原理, 同时还讨论了在现代分析实验室采用该技术的理论依据 动机和优势 后续章节将更详细地回顾流动相和固定相及其对重要色谱特性 ( 保留值和选择性 ) 的影响 一本关于分离科学的基础导论离开对目标技术实施 ( 包括应用领域 ) 的深入讨论肯定是不全面的, 这些内容将包含在有关方法开发 非手性和手性分离以及定量分析的章节中 最后, 本书还将讨论仪器注意事项, 包括对流动相输送 进样和检测各方面关键信息的详细解释 XIII

15 符号 A van Deemter 方程中涡流扩散的影响 B van Deemter 方程中纵向扩散的影响 C van Deemter 方程中径向扩散的影响 D 流动相中的溶质二元扩散系数 dp H k 粒径塔板高度分配比 µ 流动相的线速度 P 分配系数 P 洗脱强度 ( 根据 Snyder) ΔP 分离柱的压降 缩写词 ACN BPR CZE EtOH FID GC HPLC id IPA IPAm MeOH MS RI RSD SFC TEA TFA THF UHPLC UV 乙腈反压调节器毛细管区带电泳乙醇火焰离子化检测器气相色谱高效液相色谱内径异丙醇异丙胺甲醇质谱仪折射率相对标准偏差超临界流体色谱三乙胺三氟乙酸四氢呋喃超高效液相色谱紫外 XIV

16 超临界流体色谱简介 什么是 SFC 超临界流体色谱 (SFC) 是一种分离技术, 其使用的仪器装置与高效液相色谱 (HPLC) 几乎完全相同 此技术可分离复杂的混合物, 并可测定混合物中各个组分的含量, 有时还可以鉴定组分 样品溶液注入高压液流之后, 液流会将样品带入填充有细颗粒的管或色谱柱中 样品中的各个组分会与颗粒表面发生不同的相互作用, 当其穿过色谱柱时即可在时间和空间上实现分离 组分将以不同的时间从色谱柱中流出, 得到高斯或伪高斯峰, 然后流过检测器 此技术与 HPLC 的最显著差异在于用高密度压缩气体替代了大多数液体流动相, 该高密度压缩气体几乎都采用二氧化碳 (CO 2) 在高压条件( 例如高于 8 bar) 下,CO 2 充当溶剂 由于它是一种压缩气体, 因此系统出口需要配备反压调节器以确保整个色谱仪中的流动相保持单一的密度 于是, 这就要求一些检测器, 如紫外 (UV) 检测器, 能够在高压下运行 CO 2 是一种高度非极性溶剂, 类似于烃类, 但属于不同的溶剂系列 因此, 对于极性较强的溶质, 需要向流动相中加入有机改性剂 ( 有时称作共溶剂 ), 主要为醇类 洗脱时通常采用由低到高的改性剂浓度进行梯度洗脱, 色谱峰则按极性由低到高的顺序洗脱出来 对于许多强极性溶质, 它们与固定相的相互作用过强, 通常无法洗脱出来或洗脱得到的峰形很差 此问题通常通过向流动相添加强极性添加剂 ( 例如, 将强酸或 碱溶解于改性剂中 ) 得到解决 1

17 SFC 通常是一种正相技术, 因为组分按极性由低到高的程序运行 然而, SFC 与正相 HPLC 相比具有显著的优势, 其平衡速度极快, 重现性非常出色, 甚至可以进行水性样品分析 对于极性溶质, 需使用极性固定相 经典的极性固定相包括裸硅胶 氰基 二醇和氨基固定相 过去几年中, 研究人员专门针对 SFC 开发出了大量新型固定相 这些固定相包括多种乙基吡啶固定相和许多专利固定相 对于极性较低的溶质, 有时会使用反相柱, 如 C18 C8 C4 和甲基柱 最近几年, 亚 2 µm 颗粒的使用变得相当普遍 然而, 过去几十年中, 6, SFC 的主要应用领域为手性分离 7 SFC 使用的色谱柱与 HPLC 相同 虽然最高效的老式手性色谱柱为涂覆且未经键合的色谱柱, 但新型键合固定相尚未取代涂覆色谱柱, 因为涂覆色谱柱具有卓越的选择性且比较容易优化 SFC 还可用于分离极性很低的化合物, 例如许多天然产物, 包括脂溶性维生素 类胡萝卜素和脂质 对于此类样品, 常以 C18 作为固定相 1.2 为什么采用 SFC 分析速度更快 van Deemter (Knox) 方程描述了色谱柱的动力学性能 在其最简单的形式中, 该方程由三项组成, 每项描述了不同形式的扩散, 参见公式 B D H = A.33 1,2 C d p µ + + µ D 1,2 公式 1.1 van Deemter (Knox) 方程 B 项和 C 项分别表示纵向扩散和径向扩散的影响, 并且方程中包含流动相中溶质二元扩散系数 D 1,2 与流动相线速度 µ 之比 B 项说明扩散系数越高将导致最佳线速度越高 在 C 项中, 较高的扩散系数将使较高流速下的柱效损失较小 2

18 纯 CO 2 中的扩散系数比水或水性混合物中的扩散系数大约快 1 至 15 倍 例如, 苯甲酸在水中的扩散系数为 cm 2 s -1 ( 在 2 C 下 ) 8 在 1% CO 2 中, 苯甲酸的扩散系数为 cm 2 s -1 ( 在 1 bar 和 4 C 下 ), 3 bar 时下降至大约 cm 2 s -19 类似地, 一些稍大 的二甲基苯胺类化合物在 15 和 35 bar 之间 (4 至 6 C 条件下 ) 的 扩散系数介于 7 至 cm 2 s -1 之间 1 CO 2 分子的分子间相互作用很弱 因此, 它在室温和大气压下为气体 当这些分子被迫接近 ( 压缩 ) 时, 所得到的高密度流体可充当溶剂 然 而, 即使在较高的密度下, 其分子间力仍然较弱 因此, 溶解在 CO 2 中 的其他化合物可以迅速扩散 近年来,SFC 已经很少使用纯 CO 2 进行操作 添加极性改性剂 ( 例如, 甲醇 乙醇或异丙醇等醇类 ) 能够显著减小扩散系数 仅添加 5.5% 甲 醇即可使扩散系数减小近一半 11, 浓度更高, 此效应将更显著 例如, 12 锦葵色素 -3,5- 二葡糖苷的分子量为 67, 与许多药物类小分子相比是 一个相当大的分子且具有许多极性官能团 采用含 2% 甲醇的 CO 2 并在 2 bar 条件下操作时, 其扩散系数仍然比在大气压 (4 至 6 C) 条件 下纯甲醇中的扩散系数高出 4.7 至 5.1 倍, 如图 1.1 所示 经证实, 极 性溶质被极性改性剂团簇包围, 并且由于团簇的横截面积增大, 导致这 一较大的溶剂化体扩散速度减慢 11, 13 3

19 D 1,2 x1-5 [cm 2 s -1 ] HO HO O O OH OH HO CI - O + O O OH OH O OH OH O OH 摩尔分数 [%] 6 C 5 C 4 C 图 1.1 分子量为 67 的锦葵色素 -3,5- 二葡糖苷在 CO 2 /MeOH 混合物中的扩散系数 在 2 bar 下采集得到 CO 2 /MeOH 数据 在大气压下采集得到纯 MeOH 数据 在相同温度下, 采用 2% 改性剂时得到的扩散系数比纯 MeOH 中的扩散系数高出 和 4.7 倍 由于 SFC 通常采用 5 至 5% 的改性剂, 通常认为 SFC 采用改性的流动 相时在相同的色谱效率和相同粒径的填料下, 分析速度比 HPLC 高出 3 至 5 倍 这一结果在使用以亚 2 µm 颗粒填充的色谱柱时仍然成立 这意味 着使用相同粒径的色谱柱时,SFC 的运行时间只有 HPLC( 或 UHPLC) 的 1/3 至 1/5, 而通量则高出 3 到 5 倍 平衡速度很快, 使得梯度分析的 循环时间缩短 分子越小, 扩散系数越高 遗憾的是, 文献中有关小分子在改性 CO 2 中 的扩散系数数据非常少 文献中的大多数扩散系数值如表 1.1 所列 4

20 溶质温度压力 D1,2 [cm 2 s -1 ] 5% MeOH 5.5% MeOH 1% MeOH 2- 硝基苯甲醚 4 C 2 bar bar C 2 bar bar 二氯苯 4 C 2 bar bar 叔丁基苯 5 C 2 bar 吖啶 55 C 173 bar 苯甲酸 55 C 173 bar 菲 55 C 173 bar , 11 表 1.1 几种小分子在添加有低浓度甲醇的 CO 2 中的扩散系数 压降较低 较弱的分子间相互作用在导致扩散系数升高的同时, 还将使纯 CO 2 及改 性 CO 2 的粘度降低 如果我们暂时忽略 1% CO 2 并将重点集中在改性 14 CO 2 上, 图 1.2 展示了文献报道的水 / 甲醇混合物在 4 和 6 C 下的 粘度值以及水 / 乙腈在 6 C 下的粘度值 将这些 HPLC 类似条件与 CO 2/ 甲醇混合物的值 ( 根据测得的 SFC 色谱柱在 5 C 下的压降 (ΔP) 估算所 得 ) 进行比较, 外推获得 1% 甲醇 ( 虚线 ) 的相应值 水基测量结果 在恒定压力下获得,CO 2 / 甲醇的测量结果在压力 2-4 bar, 恒定流速 条件下获得 5

21 粘度 [mpa s] 改性剂的摩尔分数 H 2 O/MeOH, 4 C H 2 O/MeOH, 6 C H 2 O/ACN, 6 C CO 2 /MeOH, 5 C 图 1.2 H 2 O/MeOH H 2 O/ACN 和 CO 2 /MeOH 混合物的粘度作为改性剂摩尔分数的函数, 色谱柱的压降与粘度直接相关 2 世纪 9 年代后期, 重新流行使用亚 2 µm 颗粒, 但这些填料大多为薄壳型且通常填充于毛细管中, 随后出现了小粒径的表面多孔颗粒 23 年, 安捷伦推出了首款全多孔亚 2 µm 颗粒 根据 van Deemter 方程, 此类颗粒与 5 µm 颗粒相比, 在柱效相同的情况下, 能够使分析速度提高九倍或十倍 2 这些较小的颗粒产生的压降 (ΔP) 远大于老式较大的颗粒, 因为 ΔP 与 d p 成正比 ( 在柱效相同的情况下 ) 在 HPLC 中使用亚 2 µm 颗粒有时需要泵能够耐受 1 bar 以上的压力 在 SFC 中,CO 2/ 改性剂混合物的粘度明显低于水性流体, 如图 1.2 底部曲线所示 那么, 即使在更高的流速下,ΔP 值也远低于 HPLC 在 SFC 中, 即使在柱长 1 mm 的色谱柱中使用 1.8 µm 颗粒, 压降超过 4 bar 的情况实际上也是不常见的 实验在出口压力恒定但流速不同的条件下, 绘制了几根 3.5 和 1.8 µm 颗粒填充色谱柱的 ΔP 与改性剂百分比的关系图 结果分别如图 1.3 和图 1.4 所示 6

22 色谱柱压降 [bar] 甲醇含量 [%] mm,1.8 µm,5 ml/min, 出口压力 15 bar mm,1.8 µm,5 ml/min, 出口压力 1 bar mm,3.5 µm,3 ml/min, 出口压力 15 bar mm,5 µm,2 ml/min, 出口压力 15 bar 图 1.3 当 CO2 中包含不同浓度的甲醇时, 几根 ZORBAX RX-Sil 色谱柱在 5 C 下的压降 ( 扣 除了管路造成的 ΔP) 柱头压力 [bar] P 流速 [ml/min] 图 1.4 使用 3 1 mm 1.8 µm ZORBAX RX-Sil 色谱柱在含有 22.5% 甲醇的 CO 2 15 bar 出口压力和 5 C 条件下得到的柱头压力, 最佳流速大约为 1.8 ml/min 7

23 简而言之, 采用亚 2 µm 颗粒的现代 HPLC 通常在 4 至最高 7 C 的高温下操作, 以便降低粘度和压降 SFC 通常在 4 至 6 C 之间操作, 但原因则截然不同 根据经验, 在流速高出 3 至 - 5 倍的情况下,SFC 中的 ΔP 仅为 HPLC 中 ΔP 的 1/3 到 1/5 在 SFC 中实际上不需要使用超高压泵, 除非使用以亚 2 µm 颗粒填充的长色谱柱或在极高的流速下操作 与反相 HPLC 相正交 次要组分通常与主要组分具有化学相似性, 使用任何一种技术时, 次要组分均在主要组分附近甚至紧靠着主要组分洗脱出来 对于个别样品, 也许需要使用不同选择性的多种方法 然而, 人们通常使用两种不同的反相方法, 均采用 C18 固定相以分离此类共洗脱物 如同正相 HPLC 或 SFC 那样的正交技术提供了一种出色的替代选择, 能够显著降低丢失此类共洗脱化合物的风险 SFC 应该是优选的技术, 因为它更快速 更少使用有害改性剂, 而且产生的有毒废液也少得多 SFC 中任何一组色谱峰的保留顺序都与反相 HPLC 中的保留顺序大致相反, 15 图 1.5 所示是一个典型的示例 其中各溶质代表了多种官能团, 包括磺胺类 皮质类固醇和氧杂蒽 这种选择性上的重大变化非常有用, 具有不同化学相互作用的两种分离机制有很好的效果 在信号未能及时返回基线时, 主要组分通常会出现拖尾峰 如果次要组分共洗脱或在主要组分的尾部洗脱出来, 就很难 ( 或不可能 ) 对次要组分进行任何精度的定量分析 但是, 如果次要组分在主要组分之前 ( 基线平坦处 ) 洗脱出来, 则可能更容易地获得具有更高精密度和准确度的定量分析结果 8

24 [mau] SFC 12 次重叠进样 HPLC 1 次重叠进样 时间 [min] 图 1.5 SFC 与反相 HPLC 互为正交 比较下列混合物的 SFC 和 HPLC 色谱图 :1. 咖啡因, 2. 茶碱,3. 可的松,4. 强的松,5. 氢化可的松,6. 泼尼松龙,7. 磺胺甲基嘧啶, 8. 磺胺喹恶啉 SFC 条件 :4 ml/min, 含 5% 至 25% 甲醇的 CO2,3 min 出口压力 15 bar, 采用 mm 5 µm RX-SIL 色谱柱 HPLC 条件 :1.5 ml/min,1% 至 9% 甲醇水溶液,4.5 min,4 C, 采用 mm 2.7 µm Poroshell C18 色谱柱 15 安捷伦分析型 SFC/UHPLC 复合系统能够在几分钟内实现反相 HPLC 与 SFC 之间的快速来回切换 用户可以对操作序列进行编程, 自动完成此 类比较 这有利于对同一样品连续运行两种方法, 使用截然不同的选择 性 ( 一种为反相, 另一种为正相 ) 并在很短的时间内完成 图 1.5 所示 的色谱图仅作为示例 执行六次 SFC 分析, 然后执行六次反相 HPLC 分 析, 再执行四次 SFC 分析和四次反相 HPLC 分析, 最后执行两次 SFC 分 析 然后将所有的 SFC 和反相 HPLC 分析结果叠加在一起 , 4, 5, 分离手性及其他异构体 反相 HPLC 主要依靠疏水作用的差异来分离化合物 正相技术则主要依靠极性 - 极性相互作用, 并可更好地区分形状的细微差异, 尤其是极性官能团周围的分子形状 因此, 正相 HPLC 的典型应用领域是异构体的分离, 此类分离是基于分子形状的差异来实现 9

25 大多数药物都具有手性, 意味着它们具有成对的异构体, 彼此互为镜像, 称为对映异构体 包含相同浓度对映异构体混合物称为外消旋体, 以前的合成方法几乎总是得到外消旋体 然而, 各种对映异构体通常具有独特的生物活性 因此, 美国食品药品监督管理局及许多其他监管机构要求全面测试每种纯对映异构体 纯对映异构体的药物还可能再次获得专利授权, 因为纯对映异构体通常药效更快, 且毒性低于以往的外消旋体 基于这些因素, 人们对通过色谱分离对映异构体的需求日益增长 过去 2 年来, 已证实 SFC 在分离对映异构体及其他异构体方面优于正相 HPLC 事实上, 许多大型制药公司均已关注 SFC 在这些应用中的潜力 例如,Craig White 6 ( 当时运营一家分析型和半制备型纯化服务实验室 ) 在一年中分析了实验室收到的所有手性样品, 共计数百个样品 在 96% 的分离中, 均证实 SFC 在分析速度和分离度方面更加出色 事实上, SFC 随后被指定为分析型和半制备型手性分离的主要技术, 而 HPLC 仅用于评估 SFC 的疑难样品 类似的是,Mohammed Maftouh 7 对 5 种专利药物进行了评估, 通过 SFC 仅用四种过去的 ( 涂覆 未键合 ) 手性固定相即可获得 95% 的分析成功率 采用同一系统对一组 98 种市售药物进行分析, 获得了 98% 的成功率 自 26 年以来, 他们使用 SFC 作为初筛方法, 采用毛细管区带电泳 (CZE) 作为备用方法 Pfizer 和 Merck 对于 SFC 在手性分离领域的价值也都发表了类似但稍欠明确的看法 效率更高 在 SFC 中,ΔP 值较低, 使其易于获得较高的柱效 色谱柱可以 ( 并且通常 ) 串联使用, 通过这种方式, 可将相同或不同的固定相结合起来 15 手性与非手性色谱柱均可联接 在最早的示例中, 将柱长均为 2 mm 的 11 根色谱柱联接起来得到长 2.2 m 的色谱柱 (5 µm 颗粒 ), 在 4 bar 的系统下能够获得 22 以上的塔板数 在另一个示例中, 将多达 16 五根不同的手性柱联接后可得到伪通用固定相 1

26 或者, 使用亚 2 µm 颗粒填充的长色谱柱可获得相当高的柱效, 因为压降 很低 安捷伦分析型 SFC 系统能够在 6 bar 条件下运行, 它支持采用 柱长大约为.5 m 的色谱柱, 理论上能够获得高达 139 的塔板数 运行成本更低 SFC 中使用的 CO 2 大多数为食品或饮料级, 由于可供人们食用, 因此其纯度受到监管 碳酸饮料无所不在, 其配送设施几乎遍布全球, 且消费量巨大 因此,CO 2 比较廉价 在高压 (5 至 7 bar) 钢瓶中 (25 kg), 液态 CO 2 的价格仅为 1 美元 / 千克 SFC 中所用的典型流速为 1 至 3 ml/min, 意味着一瓶气能够持续使用大约 2 小时 CO 2 还提供杜瓦瓶和贮罐配置, 两种形式均在 -3 至 -4 C(2 至 3 bar) 条件下低温操作 杜瓦瓶一般可容纳大约 15 kg, 但是不如钢瓶或贮罐方便 杜瓦瓶装 CO 2 的成本与钢瓶大致相同, 但持续使用时间要长 6 倍 贮罐通常仅在机构致力于大规模使用 SFC 时才会安装 贮罐装 CO 2 的成本可下降一个数量级, 达到.1 美元 / 升 其成本与庚烷相比更具优势, 购买四瓶庚烷 (4 升 / 瓶 ) 的成本可超过 7 美元 / 升 杜瓦瓶和贮罐都需要使用升压泵或气体输送系统将压力由大约 2 bar 升至 7 bar 以上, 从而使往复泵能够泵送气体 采用贮罐时,CO 2 通常通过管路连接至机构内的多个位置 在 SFC 中, 很少使用昂贵且有毒的乙腈 代之以廉价的醇类 而且, 典型操作由较低的 %B( 如 5%) 开始, 但很少超过 4% 因此, 大多数流动相都是廉价的 CO 2 在色谱分析结束时, 流动相会减压并出现两相形态, 一相为气态, 另一相为液态 气态 CO 2 会被排出, 而液态改性剂将被收集到捕集阱中 由于大多数流动相都会蒸发, 因此会大大减少废液的体积 产生的废液毒性也较小 人工成本是色谱运行过程中最重要的一项费用 由于较高的扩散系数决定了在色谱柱尺寸相同的情况下 SFC 能够采用比 HPLC 更高的流速和更短的运行时间, 一个操作者在同一时间段内能够完成三至五倍的更多工作量 11

27 1.2.7 环境友好 尽管使用 CO 2 作为主要流体,SFC 仍可视为一种环境友好或绿色技术, 因为 CO 2 能够从其他行业中回收利用 在 HPLC 中, 流动相通常在使用后 燃烧生成新的 CO 2 使用低浓度醇类代替乙腈能够降低毒性 由于 CO 2 会在系统末尾处蒸发, 因此大大减少了处置大量有毒废液的昂贵成本 1.3 SFC 能够分离哪些化合物 根据经验, 任何可溶于甲醇或低极性溶剂中的化合物均可通过 SFC 得到 17 良好的分离 相反, 需要使用完全水性的缓冲溶液来溶解的化合物可能很难通过 SFC 进行分离 此现象不应理解为 SFC 无法兼容流动相中的水 水性样品或许多生物样品 关于以水作为 SFC 流动相的组成部分, 18 可参阅相关综述 尽管认为 SFC 不适用于较大的生物分子 ( 如蛋白质 ), 但实验中已经洗 脱出高达 4 聚体的肽 而且, 仅有一个氨基酸位置不同的肽异构体 22, 23 可在很短的时间内得到良好的分离 这是一个活跃的研究领域, 如果肽能够被洗脱出来, 那么相比于 HPLC 就有可能显著改善色谱分析速度 在 SFC 的早期, 大多数应用都涉及分离相对非极性的溶质, 通常为同系物, 例如硅油 表面活性剂 蜡质 脂类等分子量过高或热不稳定性过强而无法通过高温气相色谱 (GC) 进行分析的物质 大多数此类工作都使用纯 CO 2 压力程序和火焰离子化检测器 (FID) 这一状况在 2 世纪 8 年代后期慢慢改变, 在首批手性 SFC 分离成果发表后, 此改变尤为明 显 过去 15 年来,SFC 已广泛应用于制药行业, 用于快速洗脱似药物类小分子, 尤其适用于手性分离 最近随着稳定性的改善, 特别是随着 UV 灵敏度的提高,SFC 开始重新扩展至更广泛的应用领域 SFC 的应用领域与各种形式液相色谱的应用领域对比如图 1.6 所示 由图中可以看出, 采用各种流动相组合的 SFC 涵盖的应用范围几乎与各种形式的 HPLC 完全相同, 唯一未能明显涵盖的领域是离子色谱 12

28 SFC 相对于 HPLC 更适合哪些应用? SFC: 纯 CO2 SFC:CO2 和有机改性剂 SFC:CO2, 改性剂, 添加剂和水 SFC:CO2, 改性剂, 添加剂 正相 HPLC HILIC 反相 HPLC 离子色谱 离子对 极性增加 烃类 脂肪酸和蜡 醚类和酯类 醛类和酮类 苯胺和苯甲酸 羟基酸和多元酸 伯胺类 两性离子 肽 离子 蛋白质 DNA/RNA 图 1.6 各种形式的 SFC 与 HPLC 子设备类的应用领域对比, 表明 SFC 基本涵盖了与 HPLC 相 同的应用范围 SFC 中保留值特性 正相 SFC 涉及溶质与极性固定相之间的极性 - 极性相互作用 空间位阻在 SFC 中非常重要 同一分子内大部分被非极性基团包围的极性官能团容易导致该分子在极性固定相上的保留值大大减小 ( 相比未受阻的极性官能团的分子而言 ) 例如, 在同系物苄胺 二苄胺和三苄胺中, 碱性随 27 氮原子取代程度的增加而增加 因此, 三苄胺的碱性和极性均强于二苄胺, 而二苄胺的碱性和极性则依次强于苄胺 在该同系物中, 分子量也随着苯基取代数目的增加而增加 分子越大, 则保留性趋于更强 如果极性和分子量为决定因素, 则极性色谱柱上的洗脱顺序应当为苄胺 然后是二苄胺 最后三苄胺 然而, 三苄胺几乎未得到保留, 二苄胺的洗脱顺序排第二, 而分子最小且碱性最弱的苄胺的保留性能最强 很明显, 氮原子上增加的每个苯基取代基逐渐阻碍氮原子上的孤电子对, 接近极性固定相并与其发生相互作用 由于类似的原因, 环中的氮原子容易与极性固定相发生弱相互作用, 几乎不需要添加剂来获得良好的峰形 13

29 固定相的选择对分析速度具有重要影响, 某些固定相的保留性能远强于另外一些 如果两种不同的固定相均可针对某一分析问题提供合理的解决方案, 应优选采用较低浓度改性剂的解决方案, 因为改性剂浓度越低, 则粘度和色谱柱压降也会越低 LogP 药物开发中广泛用于衡量亲脂性的指标是 logp, 它是化合物在辛醇与水之间分配系数 (P) 的对数值 辛醇是一种醇, 其羟基头部具有中等极性, 而 C8 骨架则是非极性的 辛醇与水不混溶, 彼此接触时会形成两个不同的相态, 目标化合物分子可选择性地分配于其中一个相态中 logp 为正表示药物优先分配于辛醇中,logP 为负则表示其优先分配于水 29 中 Lapinski 提出了一套有效的药物开发法则, 称之为五规则 其中一条规则称, 要作为有效的口服药物, 化合物的 logp 应当介于 到 5 之间 当 logp 为 2.5 时, 相对于分配至水中的各个分子而言, 将有 3 多种分子分配至极性较低的辛醇中 5 种市售药物的实际 logp 值的分布如图 1.7 所示, 其中表明绝大多数药物都介于 -1 到 6 之间, 平均值大约为 3, 与 Lipinski 的建议值一致 logp 小于 -2 到大于 7 范围内的溶质均可使用基于 CO 2 的流动相进行洗脱和分离 因此,SFC 非常适用于洗脱和分离似药物类小分子 14

30 展示的 SFC 区域 几乎所有的药物类小分子 LogP 注射剂 肽和蛋白质图 种市售药物在辛醇与水之间分配系数对数值 (logp) 的曲线, 图中表明绝大多数药物仅具有中等极性, 非常适合采用 SFC 进行分析 过去的经验提出 SFC 不适用于需要水性缓冲环境的化合物, 这一经验被误解为 SFC 仅适用于非极性溶质, 这是不正确的 许多有机物在水中的溶解性非常差 (logp 远大于 5), 这使得它们很难成为候选药物, 因为它们会永久吸附到脂肪组织中而不会与相应的生物受体发生相互作用 药物开发中的一项重要工作是提高水溶性, 从而降低化合物贮存在脂肪组织中的可能性 这点也可能被误解为建议似药物类分子必须极易溶于水 ( 和生物体液 ) 中 这种看法同样是不正确的 如果化合物水溶性过强, 它们将很难作为候选药物, 因为它们会快速地排出体外 提高水溶性通常意味着仅从不溶提高至微溶 此类化合物可能在细胞中存留较长的时间, 与相应的受体发生相互作用 因此, 此类化合物被视作具有中等嗜脂性或亲脂性 五规则中的另外一条规则指出理想口服药物的分子量应当不大于 5 28 图 1.7 展示了 logp 为 -2 甚至更低的几种药物 这些主要是蛋白质和大分子肽, 它们因分子过大容易受到破坏而难以完整通过肠道, 因此不适合口服, 但是它们可进行注射 此类化合物基本上无法采用 SFC 进行分离 15

31 1.4 这一名称的含义 超临界 中的前缀 超字通常会令人产生很多联想, 这似乎表明越界时将会发生什么特殊的现象 然而, 超仅仅是指之上而已 类似地, 临界也很骇人, 通常会受到误解 临界点是指某个温度和压力点, 超过该点后只会存在一种相态 超临界就是指超出临界点之上 超临界不可视为一种独立的物质状态 物质状态仅包括气态 液态 固态和等离子体态 超临界区属于过渡区, 在这个区域中通过改变温度和压力可使气态转化为液态 ( 反之亦然 ), 而不是相临界点 选用超临界流体色谱这个名称是令人遗憾的, 因为它并未涵盖所有感兴趣的流体特性 所用的条件通常是亚临界状态, 通常意味着压力高于临界压力但温度却低于临界温度 通常很难进行区分 当流体的定义改变时, 保留值 密度 效率或线速度并不会发生突变 显然, 作者并不愿使用一个技术上不妥的名称并错误地使用 超临界 一词 然而, 强调流体并非处于超临界状态会暗示这两种条件存在着根本的差异, 这也是不正确的 这一混淆导致了许多不同名称的诞生, 不过它们在本质上是相同的 在 1957 年一次气相色谱会议的公开讨论中,Jim Lovelock 提出使用压缩的无机气体 ( 如 SO 2 ) 作为流动相进行强极性物质色谱分离 他提出临界态色谱的名称, 但并没有开展实验 他有一封至今尚存经过公证的 1958 年的信件, 其中介绍了他的看法 3 Ernst Klesper 率先投入高压和高于其临界温度的流体作为色谱流动相, 他使用氟碳流动相通过填充柱对卟啉进行分离 在有史以来的第一篇 SFC 论文中, 他将其描述为高于临界温度的高压气相色谱 大量论文中所用的温度均高于临界温度, 尽管压力很高, 却仍低于临界压力 按照定义, 该条件下的流体属于气体, 该技术可称作 ( 高压 ) 气相色谱 然而, 这一名称没有表达出该技术的性质 流体在此技术中充当溶剂, 而在通常理解的气相色谱中, 流动相只是惰性载体 ( 即, 并非溶剂 ) 16

32 31, 年,Giddings 发表了有关湍流气相色谱和超高压气相色谱的论文 在多年后的另一篇论文中, 他将名称改为高密度气相色谱以试图将该技术与常规 GC 区分开来, 因为此技术中的流动相充当溶剂并且溶剂强度与 33 密度成正比 有趣的是, 后两篇论文均使用了高达 2 个大气压的压力, 这一压力大大高于如今称为超高效液相色谱的技术中所用的压力 1967 年,Sie 和 Rijnders 率先将该技术称为超临界流体色谱 这一名称好过将 流体 称作 气体, 但暗示流体需要始终处于超临界状态才可表现出目标特性, 这点是不正确的 年,Caude 似乎已经提出亚临界流体色谱的名称 按照定义, 在高于临界压力但低于临界温度的条件下操作时, 流体 从技术层面来说属于 液体 然而, 他们正确地推断出将其称为液体也容易产生混淆, 因为该流体处于高度可压缩状态, 需要采用特殊硬件 ( 如泵 ) 及有效提升和控制出口压力的方法 虽然术语 亚临界 继续得到广泛采用, 但许多人似乎认为亚临界流体与超临界流体的特性之间确实存在显著差异 36 Olesik 自 1991 年起提出增强流动性色谱的名称, 成为一个独特的叫法 她还将其称作具有增强流动性的高效液相色谱, 采用 CO 2 作为流动相的重要组成部分, 但通常只占 1 至 25%, 在高压但低于临界温度的条件下操作 流体保留了 SFC 所固有的一些较高的扩散系数 低粘度等特性, 但也保留了更多水性流体所固有的极性 增强流动性色谱 是其他人称为亚临界流体色谱的延续 两个研究组均认为, 按照定义, 如果流体并非处于超临界状态, 那么它必然为液体或处于亚临界状态 如上文明确指出的, 这些技术名称随时间不断地变化, 其目的都在于试图阐明其中所涉及过程的本质 然而, 这些新名称在某种程度上人为制造了边界或障碍, 而这些边界或障碍并不具有实际的化学或色谱意义 将 流体 称作 液体 或 气体 并未完整把握到该技术的本质 称为 流体超临界 也不能很好地描述相关过程, 因为按照定义, 该流体有时具有与亚临界相同的性质 17

33 所有这些名称试图描述的内容中有几个一致的方面 首先, 采用流体作为溶剂, 并且可通过改变组成和 / 或密度 ( 温度和压力 ) 调节溶剂强度 其次, 流体处于高度可压缩状态, 需要采用特殊的泵和维持较高出口压力的方法 无论流体在任何特定温度或压力下的定义如何, 这两个方面都真正适用于所有感兴趣的流体 我希望说明的是所有这些名称描述的是同样的技术, 并使用同样的硬件 可压缩溶剂色谱这个名称可能更好些, 但现在要改变已经太晚了 我们已经有了太多的名称, 只要采用 SFC 描述所有这些技术就足够了 18

34 流动相 为什么使用 CO 2? 如今, 几乎所有 SFC 应用中都采用经有机溶剂 ( 有时是强极性添加剂 ) 改性的 CO 2 CO 2 作为优选流体是因为它 : 方便易得 廉价 易达到临界点 相对安全 因可回收利用而被视作绿色流体, 并且 能够与各种强极性改性剂混溶 可用性 37 许多流体都曾用作 SFC 中的主要流体 这些流体包括一氧化二氮 (N 2O) 卤代烃 氨 (NH 3) 二氧化硫 (SO 2) 和超临界水 有些流体至今仍在使用 有些流体具有危险性 ( 一氧化二氮 氨 ) 尽管有几种流体具有特殊的地位, 但没有一种流体的总体性能接近 CO 2 全球饮料行业中使用了极大量的 CO 2, 相关配送设施完善, 甚至覆盖到 相对偏远的地区 原材料是许多其他行业的废弃物, 这些因素相结合确 保能够以极低的成本随时供应 CO 成本 纯度 配备多台 SFC 仪器的机构或执行重要半制备型 SFC 分离的用户通常会安装贮罐 此类贮罐可容纳数吨 CO 2, 通常由大型罐车进行补给 在该规模下,CO 2 成本仅为大约.1 美元 / 升 杜瓦瓶和不锈钢瓶装的成本则大约为 1. 美元 / 升 几乎所有增加的成本都源于额外的处理费用, 但其成本仍然大大低于最常用的溶剂 SFC 级 CO 2 在 2 世纪 8 年代后期到 9 年代初期开发出来, 为新兴的 SFC 业务提供了高纯度流动相 此产品的推出顺应了当时的需求, 因为订购市售工业级 CO 2 钢瓶气时, 送到的气瓶中往往会填充有少量玉米油 ( 作者的亲身经验!) 另外, 饮料行业中所用的 CO 2 不锈钢瓶有时会重新填充水或过期啤酒, 导致不锈钢氧化生成胶态铁颗粒, 这些胶态铁颗 19

35 粒对色谱性能具有不利影响且很难清除 当时一般采用汲取管从钢瓶底部吸取液态 CO 2 以最大程度减少所需的冷却功率 这意味着溶解在 CO 2 中的所有物质都将伤害到色谱仪 2 世纪 8 年代后期, 这些负面的经验促使人们开发出 ASTM 认证的保证纯度的 SFC 级 CO 2 这些产品至今仍在售 它通常以 3 磅铝制气瓶的形式运输, 成本为大约 2 美元 / 升, 这也使 SFC 操作成本的优势失效 此产品与其他等级产品的主要差别在于, 每批次均经过纯度测试并出具分析证书以表明其符合特定的标准 当前可能除超痕量工作以外, 似乎没有必要再购买此等级的产品 散装 CO 2 通常具有高纯度 大多数污染发生在流体重新包装到较小容器的过程中 如今供应状况已得到大大改善, 高纯度工业级产品通常即可满足要求 许多等级产品均为纯度高于 99.99% 的 CO 2, 饮料或食品级产品为便捷 安全的选择 应当指出, 安捷伦分析型 SFC 系统配备有强大的冷却器, 具有使气瓶中的蒸汽液化的独特功能 因此, 不需要使用由阀门延伸到气瓶底部上方的排放管或汲取管 通过使用气相而非液相 ( 流体会在使用前蒸馏 ), 任何不挥发性污染物都会被留在气瓶中 易达到临界点 纯 CO 2 的临界点在 31 C 和 7 bar 以上的条件下即可轻松达到 这就意味着 CO 2 能够在相对较低的温度和压力下压缩成高密度流体 处于相对较低温度下的高密度溶剂不易破坏温度敏感的不稳定化合物 只需适中的压力即可轻松获得高密度溶剂, 不会带来显著的技术障碍和能源损耗 安全性 CO 2 的毒性 CO 2 是人类呼吸产物之一, 正因如此, 低浓度条件下没有毒性 然而, 高浓度二氧化碳可致命 人们不需要对实验室中的 CO 2 过度紧张 许多便利店 餐厅和咖啡馆都具有与其软饮机配套的高压 CO 2 气瓶 许多灭火器中也包含高压 CO 2, 并且广泛分布于工厂和办公楼中 SFC 实验室中的 CO 2 浓度经过精心计算, 远低于会议室或影剧院中的常见浓度 实验室中很少直接储存大量 CO 2, 因此不大可能发生大规模泄漏 CO 2 的密度大于空气, 在通风不良的空间内易于积聚在地板附近 传感器和警报器应安装于靠近腰部高度处 氧气传感器无法提供所需的信息, 因为在任何潜在危险的状况下, 即使 CO 2 处于危险水平时, 氧气含量也可能接近正常值 2

36 火灾和爆炸危险 在正相 HPLC 中, 流动相通常由庚烷与另一种有机改性剂 ( 如异丙醇 ) 混合而成 特别是, 庚烷高度易燃且蒸气可具有爆炸性 在许多司法管辖区域中, 实验室中该溶剂的量是受限的 在 SFC 中使用 CO 2 作为流动相的主要组分, 其几乎不可能使流动相发生燃烧 2.2 使用 1% CO 2 纯 (1%) CO 2 的溶剂强度是其密度的函数 大约 1984 年至 1995 年之间, 许多 SFC 工作都采用毛细管柱 火焰离子化检测器 (FID), 使用 38 1% CO 2 作为流动相的等度或压力或密度程序 人们也开发出了几种 37 填充柱的应用方法 在这些应用中采用纯 (1%) CO 2 的压力或密度梯度以及火焰离子化检测器, 尤其适用于分离较低极性的同系物 ( 如硅油和表面活性剂 ) 压力或密度程序在很大程度上已经销声匿迹 CO 2 密度在宽范围内随温度和压力的变化如图 2.1 所示 在 4 C 下, 大部分密度变化仅发生在大约 7 至 11 bar 之间很窄的压力范围内 在此区域操作意味着很小的压力变化将导致密度和保留值发生较大的变化 随着温度提高, 曲线趋向于平坦, 对于压力来说构成了小角度的密度梯度 大多数压力程序均在高温下完成, 因为如图 2.1 所示, 在较低的斜率下更容易小幅改变密度 21

37 密度 [g/cm 3 ] 压力 [bar] 4 C 6 C 8 C 1 C 图 2.1 在四种温度下, 纯 CO 2 的密度是压力的函数 自上而下依次为 :4 6 8 和 1 C 在石油工业中, 纯 CO 2 仍然配合填充柱使用 出于环境考虑, 人们在较 低的温度下 ( 如 28 至 4 C), 采用合适的硅胶柱对石油混合物进行分 离以测定柴油燃料中的芳烃含量 该方法还可用于测定原油中的芳烃含 量 在适当的条件下, 所有脂肪族化合物都将以单个窄峰洗脱 烯烃也 易于洗脱成单个峰, 但经常在脂肪族化合物色谱图上形成拖尾 芳烃洗 脱得到一系列色谱峰, 各个色谱峰代表苯环数的增加 自 2 世纪 9 年 代中期该应用已成为测定柴油燃料中芳烃的 ASTM 方法 (D5186), 是少 数几种能够准确定量测定低含量芳烃的技术之一 有一种相关的方法 (ASTM 7347), 使用配备阀切换的硅胶柱与银负载色 谱柱能够更好地从脂肪族化合物中分离出烯烃 脂肪族化合物与烯烃在 硅胶柱上得到部分分离, 然后进入银色谱柱 脂肪族化合物将通过银色 谱柱进入 FID 烯烃将发生高度保留, 必须通过反吹从银色谱柱中除去 芳香族化合物不进入银色谱柱, 而直接通过 FID 进行定量分析 这已经 成为测定汽油中烯烃的重要方法 当前的大多数应用难以使用纯 CO 2 作 为流动相 22

38 2.3 改性剂或共溶剂 如今, 大多数 SFC 应用都采用极性相对较强的固定相以及经过有机溶剂 ( 有时为其他强极性组分, 如酸和碱 ) 改性的 CO 2, 这些用于改性的化合 物称作添加剂 甲醇 甲醇是到目前为止应用最广泛的改性剂, 并且是与 CO 2 完全混溶的改性 剂中极性最强的改性剂之一 甲醇的优势包括 : 易得 价格低廉 与 CO 2 完全混溶 UV 截止波长低 ( 大约 25 nm) 毒性相对较低 甲醇 /CO 2 混合物的密度 过去, 改变纯 CO 2 的密度是改变弱极性溶质保留值的主要手段, 因此改变混合物的密度应当也会对保留值具有相同的效果 几种甲醇 CO 2 混合 39, 4 物的密度已经被测量出来 人们发现测得的密度随甲醇浓度的增加及压力的增加而提高, 如图 2.2 所示 通过调节压力使密度保持不变, 而在组成发生改变时, 这些值可用于重叠方法分析密度和组成对保留值的影响 此类研究已表明密度的影响较小, 但是一旦添加改性剂后, 改性剂浓度对保留值的变化具有最重要的影响 然而, 改性剂的极性越弱, 则保留值受密度的影响程度越显著 23

39 密度 [g/cm 3 ].85 5 C 压力 [bar] 2 % 4 % 8 % 16 % 图 2.2 在 5 C 下,MeOH/CO 2 混合物的密度是压力的函数, 纯甲醇的密度为.791 g/cm 3 开放符号表示的数据摘自参考文献 39 实心符号表示的数据摘自参考文献 4 将方法中的 5 µm 颗粒换为亚 2 µm 颗粒时, 色谱柱的压降将显著增加因此, 色谱柱中的平均密度将改变 保留值和选择性都将明显改变 然而, 这 通常是副效应, 如后续章节所示 5.63 % 1.35 % 15.4 % % 改性剂溶剂强度等级 几乎任何有机溶剂都可用作改性剂 它们的洗脱强度大致符合 Snyder 的 41, P' 洗脱强度等级或针对硅胶的 Hildebrand 溶剂强度等级, 这两种溶 剂强度等级均是多年前在正相 HPLC 中针对硅胶洗脱开发而得 几种常 用有机改性剂的值列于表 1.1 中 实际值已经随时间发生了变化 例如, 与最初的看法相比, 如今认为甲醇更接近于水 甲醇 乙腈 乙醇和异 丙醇的最新 P' 值分别为 和 4.3 如果使用相同浓度的改 性剂, 则相对保留值往往符合表 2.1 所示的溶剂强度等级顺序, 但也有 例外 24

40 改性剂 P Hildebrand 洗脱强度 ( 基于硅胶 ) 水 9 甲醇 乙腈 甲氧基乙醇 5.7 丙酮 乙醇 异丙醇 乙酸乙酯 四氢呋喃 二氯甲烷 二氯甲烷 四氯化碳 1.7 庚烷,CO2.1 乙酸 6.2 辛醇 3.4 表 2.1 一些与 CO 2 完全混溶的改性剂的 Snyder P' 值和 Hildebrand 值 44 在某一手性分离中, 当改性剂由甲醇换为乙醇和异丙醇时, 第二洗脱峰 的保留时间将由 7.98 分钟增加至 8.32 分钟和 1.48 分钟, 与预期结果 一致, 如图 2.3 所示 分离度实际上随保留时间的增加而降低 使用相 同浓度的乙腈作为改性剂时, 能够分离与上述相同的对映异构体对 最 后一个色谱峰的保留时间大幅增加至 分钟, 但分离效果得到显著 改善 情况通常如此, 因为乙腈是一种比大多数醇类要弱得多的溶剂 根据 Hildebrand 等级, 所有三种醇类的值均高于乙腈, 与图 2.3 所示的 结果一致 显然, 氢键对于 SFC 异常重要 25

41 极性 时间 [min] 甲醇 α = 乙醇 α = 1.86 异丙醇 α = 1.67 乙腈 α = 1.49 图 2.3 手性分离结果表明, 根据 P' 和 Hildebrand 溶剂强度等级, 保留时间随改性剂极性的 降低而增加 根据 P'( 而非 Hildebrand 溶剂强度 ) 预测的结果, 乙腈的极性比预期更低 除改性剂的成分以外, 所有其他条件均保持不变 非线性溶剂强度 41, 42 Snyder 的 P' 等级假设流动相溶剂强度 ( 以 P' 来衡量 ) 为两种纯液体 的摩尔分数的线性函数, 参见公式 2.1, 其中 x 为 A 的摩尔分数 P AB = c P A + (1 c )P B 公式 2.1 计算流动相溶剂强度的 Snyders 法 不适用于 SFC 因此, 逐渐将流动相的组成由一种纯溶剂改为另一种纯溶剂应当与溶剂强度之间存在线性关系 然而, 保留值 ( 洗脱强度 ) 为 %B 的非线性函数 在正相 HPLC 中, 这种非线性可解释为由于改性剂 (B) 与溶质之间存在竞争吸附 在 SFC 中,log k 对 %B 的曲线也是非线性的, 如第 4 章 流动相变量对保留值和选择性的影响 所述 不过,SFC 中的解释则不同 26

42 溶剂致变色染料 测量实际流动相溶剂强度 ( 与洗脱强度相反 ) 的一种方法涉及到溶剂致变色染料 此类染料吸收光谱中的 UV 顶点会根据溶解染料的溶剂的极性而改变 尼罗红就是这样一种染料 根据吸收最大值的波长计算得到的尼罗红能量等级 (E NR) 与 P' 进行绘图, 把 E NR 与 P' 关联起来 使用尼罗红作为溶剂致变色染料, 所得到的纯溶剂数据显示于图 E NR 溶剂强度的相对顺序与 P' 值一致 尼罗红还可用于测量这些相同改 45, 46 性剂与 CO 2 构成混合物的极性 所得到的几个结果如图 2.5 所示 与 Snyder 假定的线性关系不同, 测得的溶剂强度是改性剂浓度的非线性函数 由于不存在固定相, 因此竞争吸附机制无法解释这种非线性现象 另外, 在改性剂浓度为至少大于约 1% 的情况下, 替换 %B 的 E NR 能量等 46 级可得到 log k 的线性曲线 27

43 P` 12 1 甲酰胺 水 8 二甲基甲酰胺 6 乙腈 乙酸 甲醇 4 2 四氯化碳 二氯甲烷 THF 乙醇 1- 丙醇 1- 辛醇 2- 丙醇 戊烷 E NR [ 千卡 / 摩尔 ] 图 2.4 纯溶剂的 Snyder P 等级与尼罗红溶剂强度等级之间的关系 请注意, 根据 P' 等级 来看,ACN 的极性强于 MeOH, 而根据尼罗红等级, 前者的极性则弱得多, 这与图 2.3 所 示的结果一致 28

44 利用尼罗红测得的非线性溶剂强度 % 含甲醇的 CO % 含乙腈的 CO % 含二氯甲烷的 CO 2 CO 2 辛醇甲醇 水 P` 图 2.5 尼罗红还可用于测量 CO 2 与有机溶剂混合物的溶剂强度 结果再次表明,ACN 的溶 剂强度弱于 MeOH 请注意, 溶剂强度与改性剂浓度之间主要为非线性关系 聚类 已取得的普遍共识是, 极性改性剂分子会与 CO 2 形成局部非均一的混合物 看起来, 当改性剂的极性大大强于 CO 2 时, 极性改性剂分子将团簇 47 在一起, 尤其会在极性溶质分子周围形成团簇 溶质颗粒被溶剂化球包围, 导致局部改性剂浓度高于体相流体中的浓度 这些团簇不适合用 胶束 来定义 固定相上的吸附作用 示踪物脉冲 MS 实验结果表明向 CO 2 中最初添加的第一种少量极性改性剂就导致改性剂分子大量吸附于极性固定相上 事实表明, 大约 1% 的 48 甲醇即可使多层改性剂覆盖到二醇基色谱柱上 在更高的浓度下, 额外吸附的量相对较少 被改性剂覆盖往往会改变固定相的化学性质 同时, 多个单层 CO 2 也可发生吸附 49 因此, 在极性固定相上有大量高密 度改性后的流体, 其组成取决于温度 压力和组分 5 这些影响尚未得 到详细研究 29

45 利用改性剂改变选择性 表 2.2 中所列的洗脱强度绝对值仅是溶剂强度全貌的一部分 Snyder 还以乙醇 二氧六环和硝基甲烷在 82 种溶剂中的 Rohrschneider 气 - 液分配 41, 42 系数为基础设计了一张溶剂选择性分类图 其中假定范德华力是普遍存在的 因此, 他将数据绘制在三角图上, 三角形的各条边分别表示溶剂与质子供体 质子受体或偶极子发生相互作用的能力 简化结果如图 2.6 所示 在组内溶剂趋于堆积在一起,Snyder 将其分为八组系列溶剂, 各组溶剂具有相似的选择性 在一个选择性系列中换用不同的改性剂并保持改性剂的 P' 不变, 将不会显著改变绝对保留值, 但会改变选择性 换句话讲, 如果一种改性剂无法使密切相关的化合物得到充分分离, 可尝试其他溶剂系列中的改性剂溶剂, 而不要使用同一系列中的其他改性剂 H- 受体 II c d.4.3 IV 乙酸 醇类 III THF DMF DMSO I 醚类胺类.45.5 VIII 氯仿水 乙腈丙酮乙酸乙酯 VII 硝基苯甲苯 VI V 二氯甲烷.35 c e H- 供体 偶极 c n 图 2.6 Snyder 的溶剂三角, 将溶剂分为八个系列 要显著地改变选择性, 可换用不同溶剂系列中的改性剂 3

46 添加剂异丙胺二甲基乙胺三乙胺 备注与某些酮类发生反应具有挥发性且有恶臭味由于存在空间位阻, 有时不太有效 许多其他胺类 氨 相对较新 烷基叔铵盐烷基磺酸三氟乙酸甲酸乙酸柠檬酸醋酸铵甲酸铵水 表 2.2 广泛应用于 SFC 中的添加剂 2.4 添加剂 使用 CO 2 与诸如甲醇或乙醇等改性剂组成的二元混合物进行洗脱时, 许多强酸和强碱以及大多数两性化合物都无法洗脱出来或洗脱得到的峰形 51, 52 很差 溶于改性剂中的强极性添加剂的少量加入通常能够显著改善峰形, 如图 2.7 所示 添加剂的浓度通常介于改性剂的.1% 至 2% 之间 31

47 [mau] 保留时间 [min] 图 2.7 使用药物阿得拉 (Adderall) 作为示例, 展示添加剂对峰形和洗脱效果的影响 阿得 拉是安非他命对映异构体的非外消旋混合物, 其中包含过量的 D 型对映异构体 下方色谱 图展示了不加添加剂时的洗脱结果 ; 上方色谱图展示了添加三乙胺时的洗脱效果 所有其 他条件均不变 通常, 强酸添加剂有助于改善强酸的峰形, 而强碱添加剂则有助于其他 53 强碱的峰形 然而, 这仅是一般情况, 有时会出现相反的状况 ( 酸用作碱的添加剂, 反之亦然 ), 原因可能类似于 HPLC 中的离子对 两性溶质通常最难以洗脱, 可能需要多种离子或对离子 常用添加剂的列表如表 2.2 所示 添加剂能够 : 抑制溶质电离 覆盖固定相的活性位点, 并 与溶质形成中性离子对 54 强烈吸附到极性固定相上的添加剂有时会形成接近单层, 甚至在浓度只占改性剂 1% 以下 ( 远远低于总流动相的 1%) 时也会如此 添加剂最初导入流动相后, 在几分钟内通常没有添加剂被洗脱出来, 在改性剂浓度较低的情况下尤其如此 应注意等待足够长的时间, 使添加剂浓度达到平衡 32

48 55 添加剂从流动相中除去后不一定能够淋洗下来 使用添加剂会永久性 至少暂时性改变色谱柱特性 事实往往是, 即便从流动相中除去添加剂后, 在一定时间内峰形仍然可得到改善, 但其性能可能逐渐下降至不含添加剂时观察到的初始结果 此类明显不可重现但可预测的行为会使筛选复杂化, 或需要使用多组相同的色谱柱, 例如, 一组色谱柱配合酸性添加剂使用, 而另一组色谱柱则配合碱性添加剂使用 应避免在酸性与碱性添加剂之间来回切换而不进行中间清洗 色谱柱在使用添加剂 ( 特别是胺类 ) 后必须经过仔细清洗才可进行储存 在作者的实验室中, 使用碱性添加剂后, 会依次用大约 1 倍色谱柱体积含 4% 甲醇的 CO 2 含 4%( 甲醇 +.2% 乙酸 ) 的 CO 2 以及含 4% 甲醇的 CO 2 对色谱柱依次进行淋洗 乙酸作为一种相对较弱的酸可置换或中和固定相表面上吸附的碱性添加剂, 而其自身通常用 CO 2/ 甲醇即可淋洗下来, 得到不含吸附态极性添加剂的 几乎裸态的固定相 其他添加剂有时可以用纯有机溶剂进行脱附 在极端情况下, 可依次使用异丙醇 异丙醇 - 水混合物 异丙醇, 以去除极性添加剂 色谱柱在储存之前应当至少用 3 倍至 1 倍色谱柱体积的 含 4% 改性剂的 CO 2 进行淋洗 清洗之后, 将色谱柱以润湿或干燥状态进行储存 在作者的实验室中, 会将色谱柱减压至大气压, 即色谱柱不再填充以液体溶剂 然后, 将色谱柱从系统中取下后, 储存时无需在色谱柱两端插入堵头 近年来, 人们致力于开发不需要在流动相中加入添加剂的固定相 这些固定相将在第 3 章 固定相 中予以更详细的讨论 添加剂会干扰质谱 (MS) 检测, 当其具有弱挥发性时尤其如此 使用质谱仪进行检测时, 选择挥发性较强的添加剂 ( 如乙酸铵或甲酸铵, 甚至氢氧化铵 ) 很重要 33

49 2.5 添加水以扩展溶质极性 正相 HPLC 不适用于水样, 当流动相为非极性时尤其如此 少量水 ( 来自改性剂中的痕量水或水性样品 ) 往往优先吸附到极性固定相上 再平衡过程往往很慢, 以前有些报告指出需要使用最高 1 倍色谱柱体积才能实现再平衡 因此, 通常应避免分析水性样品 SFC 则不存在这些问题, 与己烷或庚烷相比弱极性的 CO 2 能够与极性更强的溶剂混溶 这些极性更强的改性剂有助于对少量水的溶剂化 水在纯 CO 2 中的溶解度仅可达到 1% 的十分之几 然而, 当甲醇与 CO 2 混合时, 可添加至少 1% 的水至甲醇中, 不会显著影响强极性化合物的色谱峰 此时仍然可加入添加剂 添加乙酸铵和甲酸到含 1% 水的甲 56 醇溶液, 可在氨基柱上快速分离核酸与核苷 平衡时间很短 与单纯使用甲醇相比, 水的加入能够分离极性更强的溶质 另外, 水性样品可采用甲醇按 3:1 或 4:1 的比例进行稀释并直接进样, 而不会影响保留时间或峰面积重现性 34

50 固定相 材料 绝大多数 SFC 应用使用的是全多孔 纯度极高的未键合硅胶或键合到同样全多孔硅胶上的固定相 不存在颗粒强度的问题, 因为颗粒不会经受超高压或高压降 仅有几篇报告使用了其他材料, 例如多孔薄壳整体式色谱柱或氧化锆基颗粒 如今, 全多孔颗粒几乎都是直径为 1.7 至 5 µm 之间的球形颗粒 颗粒越大则用得越少, 即使半制备型规模最多也只采用内径为 5 cm 的色谱柱 可提供最佳保留值和峰形 ( 至少对于极性溶质 ) 的颗粒通常为全多孔 孔径较小 表面积较大的颗粒, 其孔径介于 6 和 12 埃之间, 且表面积大于 35 m 2 /g 3.2 非手性键合相 非极性固定相 许多早期的 SFC 成果采用较非极性的溶质, 能够在非极性色谱柱 ( 例如 C18) 上实现最佳分离 少数研究人员将该成果视作反相 SFC, 采用 C18 或类似固定相以及中等极性的改性剂进行分离时尤其如此 然而, 流动相通常主要包含 CO 2 和溶剂强度类似于庚烷的高度非极性溶剂, 并混合以极性较强的改性剂 改性剂浓度几乎总是按程序逐渐提高 因此, 流动相按由低到高的极性程序变化, 按定义并非为反相 反相 HPLC 很明显是得到无数人采用的最主要的色谱技术之一, 最常与 C18 配合使用 因此, 市场上提供有许多此类高质量色谱柱 这些色谱柱也可用于 SFC C18 固定相很适合分离甘油三酯 表面活性剂 硅油 类胡萝卜素 其他萜类及许多具有长脂肪链的化合物 极性溶质一般很少得到保留且峰形通常很差 35

51 3.2.2 极性固定相 SFC 一般按照正相技术进行操作, 其中使用极性固定相, 且流动相按极性由低到高的梯度进行改变 尽管 HPLC 最初也是一种正相技术, 但在手性分离和旧版药典方法以外的几乎每个应用领域中, 其早已被反相技术所取代 后来, 直到最近, 色谱柱制造商已经很少致力于开发更新的极性固定相 传统的极性正相固定相包括未键合硅胶 氰基 氨基和经典的二醇基等多种形式 咖啡因 茶碱和可可碱混合物的色谱图展示了 C18 氰基 未键合硅胶 氨基和二醇基固定相的选择性差异, 如图 3.1 所示 这些具有中等极性的化合物在非极性 C18 柱上几乎不发生保留, 即使在较低的甲醇浓度 (8%) 下也是如此 相比之下, 它们在相同条件下的氰基柱上可得到良好的保留和分离 未键合硅胶柱的保留性能更强, 需要使用较高的改性剂浓度 (18%) 才可获得相近的保留时间 选择性与氰基柱类似 氨基柱实际上形成了相反的洗脱顺序 ( 按 而非 的顺序洗脱 ), 但化合物 2 与 3 之间的分离度仍然不够理想 二醇基固定相的保留性能略强于氨基固定相, 色谱峰洗脱顺序并未逆反, 但由于选择性不同, 色谱峰的分离度稍好 这些色谱图表明仅仅键合相的成分不同即可导致相对保留值发生显著变化 此处展示的色谱图是在多年前采集得到的, 使用了相同的高纯度硅胶基材料 然而, 尽管现代二醇基柱更类似于未键合硅胶柱, 这些结果同样能够代表现代的结果 36

52 1, 2, 3 C 18 8 % 氰基 8 % 硅胶 18 % 氨基 2 % 二醇 2 % = 咖啡因 2 = 茶碱 3 = 可可碱 图 3.1 咖啡因 (1) 茶碱 (2) 和可可碱 (3) 在各种固定相上的保留时间和选择性 SFC 和相互作用的亲水性液相色谱 (HILIC) 重新引起了色谱柱制造商开发新型极性固定相的兴趣 HILIC 色谱柱看起来类似于未键合硅胶柱, 但有时称作二醇基柱 大多数创新都来自试图满足 SFC 用户特有需求的小色谱柱制造商 如第 2 章 流动相 中所述, 通常有必要向流动相中加入添加剂, 对于脂肪胺溶质而言尤其如此 许多乙基吡啶固定相专为分离胺类而开发出来, 其通常能够最大程度减少或消除添加剂的使用 制造商还针对在不用添加剂的情况下分离酸类开发出了其他专利固定相, 这些新型固定相往往比经典的极性固定相具有更强的保留性能, 需要更高的改性剂浓度, 这使它们不太令人满意 较常用的固定相的部分列表如表 3.1 所示 37

53 安捷伦 RX-SIL(5,3.5,1.8 µm) SB-CN(5,3.5,1.8 µm) 己苯基 (5,3.5,1.8 µm) HILIC(5,3.5,1.8 µm) SB-C18(5,3.5,1.8 µm) Eclipse C18(5,3.5,1.8 µm) XDB C18(5,3.5,1.8 µm) 氨基 (5 µm) 其他供应商乙基吡啶 (5,3,1.7 µm) Premier(5,3 µm) 二醇 (5,3,1.7 µm) 许多其他产品 表 3.1 常用固定相 值得一提的是, 这些极性固定相中有一些种类较难获得具有更小粒径的型号 这些固定相包括二醇和氨基固定相 然而,HILIC 未键合硅胶 氰基 己苯基和 C18 均可轻松得到 1.8 µm 及其他亚 2 µm 粒径 固定相过多? 在 SFC 中, 我们提供了各种具有不同选择性的优质固定相以试图分离复杂的峰对, 尽管通常并不需要如此 如图 3.2 所示, 将固定相与溶质匹配起来是相当简单的 通常有若干不同的固定相都可用于任何特定的分离, 可选择其中的任何一种, 多半都能得到可行的分离结果 38

54 烃类蜡质酯类 / 醚类脂肪酸萜类酮类 / 醛类 酰胺类类固醇氮杂环醇类糖类苯胺 苯甲酸羟基酸多元酸脂肪胺 两性离子多肽 蛋白质 DNA/RNA 无机离子 极性增加 流动相 CO 2 乙酸乙酯 / 丙酮 / 乙腈 /CO 2 异丙醇 /CO 2 乙醇 /CO 2 甲醇 /CO 2 甲醇 / 水 添加剂 固定相 C18,C4,C1 己苯基 氰基 硅胶二醇氨基乙基吡啶 图 3.2 与溶质系列相匹配的特定流动相和固定相 随着溶质的极性逐渐提高, 流动相和固定相的极性也需要逐渐提高 对于极性溶质, 几乎任何极性固定相都适用 通过改变流动相组成 温度和压力通常可以对方法进行优化, 如第 4 章 流动相变量对保留值和选择性的影响 中所概述 唯一需要改变固定相的情况是在改变流动相参数仍无法获得足够选择性的时候 39

55 3.3 固定相比较 Lesellier 57 基于溶剂化参数模型开发出了可形象展现色谱柱选择性差异的方法, 其大致类似于 Snyder 的溶剂三角形, 不同之处仅在于它应用于固定相而非流动相 在这种情况下, 他使用五个参数生成蛛网图, 在此对色谱柱进行评估和比较 简化结果如图 3.3 所示 从中可以看到, 所有经典的极性固定相 ( 如未键合硅胶 氰基 氨基和二醇聚类 ) 在质子供体轴上相当接近 二醇基固定相也比其他固定相更易于作为质子受体, 而氰基和氨基固定相则倾向于具有偶极子极化率的特性 相对较新的五氟苯基 (PFP) 固定相在 SFC 中尚未得到广泛应用 在该模型中, 表明偶极子极化率在一定程度上类似于 Snyder 三角形中的一些氯代溶剂 过量摩尔分数极化性 C8 C18 McGowan 特性体积 C4 OPHE PFP 偶极性 / 极化性 二醇 硅胶 氰基乙基吡啶氨基 质子受体 质子供体 图 3.3 使用 Lesellier 的溶剂化参数模型得到的色谱柱选择性 OPHE:SynergiPolar RP( 苯丙基 ) Phenomenix,EP:2- 乙基 - 乙基吡啶,PFP: 五氟苯基 - 丙基 (Supelco) 4

56 烃类 C8 和 C18 聚集成簇, 如所预期的, 或多或少会与经典极性固定相截然相反 ( 反相对正相 ) 相对较新的苯丙基固定相呈相对中性, 将其置于图中心附近, 位于非极性脂肪烃 (C8,C18) 和极性经典色谱柱 ( 未键合硅胶 氰基 氨基或二醇 ) 之间 C4 远离其他脂肪烃 同样地, 如果一种固定相的分离效果较差, 则多半需要切换至其他固定相组 3.4 填料粒径与色谱柱尺寸之间的关系 以前的 SFC 应用大多使用填充 5 µm 全多孔颗粒的 mm 色谱柱 数十年来, 市面上已出现能够充分发挥 3 或 3.5 µm 颗粒填充的色谱柱效的仪器, 但此类颗粒并不常用于 SFC 中 甚至在 1 年前, 大部分 SFC 非手性应用均采用 4.6 (5 ~ 15) mm 色谱柱进行快速筛查, 但大多数色谱柱仍填充以 5 µm 颗粒 亚 2 µm 颗粒已经出现了十多年, 但大多以 C18 形式使用于 UHPLC 中 在相同柱效下且以最佳速度操作时, 与 3 µm 颗粒相比此类颗粒的分析速度提高了三至四倍, 与 5 µm 色谱柱相比提高了大约 9 倍 粒径的减小会通过两种方式缩短分析时间 最佳流速和柱效均与 d p 成反比 粒径减小一倍时需要将流速提高两倍, 在相同柱长下可获得两倍的柱效 将柱长减半可以获得如同用较大的颗粒的柱效, 但分析时间仅为原来的四分之一 由于 van Deemter 方程中的 C 项相当平稳, 早期很多 UHPLC 文献强调使用更短的 ( 甚至 3 至 5 mm) 色谱柱在大大高于最优速度的条件下操作, 以进一步加快分析速度 目前并没有理由显示为何此类颗粒不可用于 SFC, 只要采用适当的流动相且仪器具有适当较低的扩散性即可 尽管亚 2 µm 颗粒在 UHPLC 中已经使用了十几年, 但最近几年才开始应用于 SFC 58 最初仅有未键合硅胶可用 然而, 近年来多种经典的极性固定相和 2- 乙基吡啶基固定相均已有该规格出售 色谱柱内径和粒径 (d p) 均已迅速减小, 采用 3 mm 内径和 1 mm 柱长并填充以亚 2 µm 颗粒的色谱柱逐渐成为实际上的标准配置 41

57 3.4.1 压降 温度梯度和柱效损失 2 柱效不变时, 色谱柱的压降是 d p 的函数 因此, 在柱效不变且各自均采用最佳速度时, 使用 1.8 µm 颗粒得到的压降比使用 5 µm 颗粒得到的压降高出大约 7.7 倍 在两倍于最佳速度的速度下操作将进一步增加 ΔP 达 15 倍以上 在如此高的压力下, 许多泵系统都需要重新设计才可实现 UHPLC 分析 UHPLC 中的热梯度 在最早期的 HPLC 应用中, 预计高压降会引起轴向和径向的温度梯度, 62 在极端条件下使用亚 2 µm 填料时会出现问题 流动相在膨胀过程中会变热, 色谱柱出口的温度可能显著高于柱温箱的设置温度 人们不认为沿轴向的梯度会出现问题 然而, 如果从流动相到柱温箱之间存在显著的热传递, 则沿色谱柱会形成径向温度梯度 此类径向梯度会导致色谱柱轴处的粘度较低且速度较高, 而柱壁附近的粘度较高且流动相速度较低 因此, 同一色谱峰的不同部分可能以不同的速度流出色谱柱, 导致色谱峰展宽并引起柱效下降 此类径向梯度的存在是使用 2.1 mm 内径 ( 甚至 1 mm 内径 ) 色谱柱的主要原因, 因为色谱柱轴与柱壁之间更短的距离会减小径向温度梯度的幅度 这些因素对仪器具有重要影响, 并且关于该主题产生了大量争论 其他人使用填充以亚 2 µm 颗粒的 4.6 mm 色谱柱在高达 6 bar 下操作时并未发生显著的柱效损失 这可能是由于柱温的控制方法不同 流动相可在进入色谱柱之前被加热至工作温度, 将色谱柱置于不流动的空气浴柱箱中并与热交换器隔绝 这样能够最大程度减少柱外和沿色谱柱的热交换, 因为不锈钢硬件和不流动的空气都是不良的导热体 在此条件下, 色谱柱在很大程度上处于绝热状态 这样能形成不重要的轴向梯度, 但会最大程度减小任何有问题的径向梯度 42

58 SFC 中的热梯度 63, 65 在 SFC 领域中也出现了关于由温度梯度引起柱效损失的类似争论 如果将色谱柱置于水浴中, 则整个不锈钢硬件都可维持在同一温度下 色谱柱中将形成轴向梯度, 但此时由于膨胀所引起的柱轴与柱壁之间的温差将生成径向梯度, 并且经证实会发生严重的柱效损失 因此, 与 UHPLC 类似, 通常建议使用内径 2.1 mm( 甚至 1 mm) 的色谱柱 然而, 大多数相关实验均采用的是纯 CO 2 或含 5% 甲醇的 CO 2 在那种条件下, 流动相在膨胀时将显著冷却 与 UHPLC 不同, 在 SFC 中由 Joule- Thomson (J-T) 膨胀引起的温度梯度高度依赖于流动相的组成 对于纯 CO 2 而言, 如那些报告中所述, 由 6 bar 膨胀至 1 bar 将导致温度沿色谱柱长度方向下降 16 度 在 5% 甲醇下, 最大温差仍有大约 1 度 然而在 1% 甲醇时, 在降低 5 度前流体的温度首先升高 2 至 3 度 在大约 18% 以上, 流体实际上将被缓慢加热, 而在 5% 甲醇条件下, 流体不会发生冷却, 其温度反而会升高 1 度 甲醇浓度 [%] Tout [ C] DT 表 3.2 沿色谱柱的理论绝热温降, 假定进样口处于 6 bar,5 C, 出口处于 15 bar 的条件 43

59 切记 SFC 中的压降只有 UHPLC 中的三分之一到五分之一 尽管某些仪器能够在 6 bar 条件下操作, 但实际上几乎从不需要如此高的压力 更典型的操作是采用 15 bar 的出口压力和介于 2 到 35 bar 之间的进样口压力 在这些条件下, 轴向梯度不会超过几度 安捷伦恒温柱箱为静态空气柱温箱, 其中使用热交换器在流动相进入色谱柱之前对其进行预热, 并且色谱柱不难与热交换器隔绝 因此, 在实际条件下, 几乎不会形成径向梯度以及由于该现象引起的柱效损失 这使得 SFC 中几乎不需要使用内径 2.1 mm 或 1 mm 的色谱柱, 尽管有时在 UHPLC 和 SFC 中推荐使用此类色谱柱 基于柱外谱带展宽的问题, 使用 2.1 mm 甚至 1 mm 内径且填充以亚 2 µm 颗粒的色谱柱将严重限制色谱仪的设计 例如, 填充以亚 2 µm 颗粒的 2.1 mm 色谱柱需要使用体积小于 1 µl 的检测器流通池, 以及内径 125 µm 甚至 1 µm 的短 ( 小于 6 cm) 接头管路 当前市售的仪器无法在标准配置下使填充以亚 2 µm 颗粒的 mm 色谱柱的柱效大于理论柱效的大约一半 使用此类色谱柱需要对全部现有的 SFC 系统进行较大幅度的重新设计和 / 或重新布管 然而, 使用较大内径的色谱柱既可行也可取, 它能够降低柱外谱带展宽要求, 只需经过适当修改, 即可利用现有硬件充分发挥亚 2 µm 颗粒的柱效 在另一个方向, 几乎也不需要使用填充以亚 2 µm 颗粒的 4.6 mm 内径色谱柱, 因为在 SFC 中 4.6 mm 色谱柱的最佳流速接近 5 ml/min 这是安捷伦分析型 SFC 系统的最大流速 某些其他 SFC 系统采用较低的最大流速 ( 特别是在柱头压力较高的情况下 ), 大部分时间需要在次优的条件下操作 因此, 使用显著小于 4.6 mm 的色谱柱内径是可取的, 并且有必要在高于亚 2 µm 颗粒的最优线速度或流速下进行操作 由于 2.1 mm 和 4.6 mm 内径色谱柱存在柱外谱带展宽或流速限制的问题, 合理的折衷选择是使用内径 3 mm 的色谱柱尺寸 采用填充以 1.8 µm 颗粒的 3 1 mm 色谱柱, 安捷伦分析型 SFC 系统可轻松进行重新配置以达到色谱柱理论柱效的大约 9%( 或大于等于 96%), 如第 节 高速分析工作 中所述 44

60 3.5 推荐的色谱柱尺寸 日常工作 对于新方法而言, 在 SFC 中使用全多孔 5 µm 颗粒进行分析已不存在任何明显的优势, 它在分析速度 分离度或灵敏度等方面均逊色于在较短 较快的色谱柱中使用较小颗粒 目前市面上很容易获得具有同等性能的仪器和小粒径颗粒的色谱柱, 且分析速度更快且灵敏度可能也更高 对于经过验证的方法, 将继续使用填充以 5 µm 颗粒的 25 mm 色谱柱 内径为 4.6 mm 填充以 3 或 3.5 µm 颗粒的色谱柱可兼容较大的 UV 检测器流通池, 例如广泛应用于安捷伦多波长和二极管阵列检测器的流通池, 具有 1 mm 光程和 13 µl 流通池体积 UV 检测器流通池的长光程能够保持或改善 5 µm 颗粒得到的灵敏度, 因为采用较小的颗粒和使用更高的流速, 因此色谱峰的保留时间更窄且峰更高 连接进样阀与色谱柱以及色谱柱与检测器的管路总长度为 1 m( 内径为 175 µm) 采用此类系统, 可达到几乎 1% 的色谱柱理论柱效 175 µm 管路可最大程度减小整个系统的柱外压降 在日常工作中, 推荐使用填充以 3 或 3.5 µm 颗粒的 mm 色谱柱 采用此类色谱柱开发的方法稳定可靠, 并可获得与 HPLC 最佳结果相近的效果 保留时间重现性应远小于 1.% RSD (n=1), 除最极端的情况以外通常可获得小于或等于.1% 的 RSD 峰面积重现性取决于信噪比 对于信噪比高于大约 1 的色谱峰, 峰面积 RSD 应小于 1% 对于很大的色谱峰,RSD 应远低于 1%, 有时会接近.1% 校准曲线的线性一般超过.999, 如后续章节所示 ( 例如, 参见第 8 章 SFC 定量分析 ) 45

61 3.5.2 高速分析 对于高速分析工作, 可使用亚 2 µm 颗粒 安捷伦的亚 2 µm 填料为 1.8 µm 如上文所述, 以 1.8 µm 颗粒填充的 4.6 mm 内径色谱柱, 其最佳流速为大约 5 ml/min, 这是安捷伦分析型 SFC 系统的最大流速, 调节的余地很小甚至没有调节余地 将色谱柱内径降低至 3 mm 时, 最佳流速将降至大约 1.7 至 2 ml/min, 具有较大的最优流速空间 这一较低的流速 ( 与使用 4.6 mm 内径色谱柱相比 ) 会显著降低系统柱外组件 ( 例如, 连接管路 ) 的压降 然而, 同时使用较小的颗粒和较小的内径需要显著减小柱外扩散 必须将安捷伦分析型 SFC 系统中的许多标准 175 µm 内径连接管路替换为尽可能短的 125 µm 内径管路 此外, 必须用新型 3 mm 2 µl 高压流通池替换标准的 1 mm 13 µl 流通池 通过这些相当简单的更换, 即可获得大约 9% 的色谱柱理论柱效, 甚至在 k 约等于 2 至 3 时也是如此 填充以 1.8 µm RX-SIL 的 3 1 mm 色谱柱在三倍的分析速度下, 得到的柱效是填充以 3.5 µm RX-SIL 的 mm 色谱柱的 12%, 如图 3.4 所示 柱效,N 分配比,k 3. 1 mm,1.8 µm 色谱柱 ;3 mm 光程,2 µl 流通池 ; 37.5 cm 的.7 英寸管线 mm,3.5 µm 色谱柱 ;13 µl 流通池 ;1.175 cm 的.7 英寸管线 图 3.4 测得的色谱柱柱效 上部曲线使用 3 1 mm 1.8 µm 色谱柱并在 3 mm 光程 2 µl 流通池 37.5 cm 的.7 英寸管路 ( 标准热交换器 ) 和 8 cm 的.5 英寸连接管路条件下获得 下部曲线使用 mm 3.5 µm 色谱柱在 13 µl 流通池和 m 的.7 英寸管路条件下获得 尽管较小的色谱柱得到的峰形较差, 但它能够在不到三分之一的时间内获得高出大约 2% 的绝对柱效 46

62 3.5.3 应用较少的色谱柱 66, 68 多孔外壳颗粒尚未广泛应用于 SFC, 但已发表有几篇报告 经证实, 某些较大的表面多孔颗粒能够在更高的速度下得到比相同内径全多孔颗 66 粒明显更高的柱效 这些较大的颗粒在柱效和分析速度方面可媲美亚 2 µm 全多孔颗粒, 但压降则小得多 研究表明, 此类色谱柱在 HPLC 中用于 4 至 6 bar 的色谱仪时能够得到类似于亚 2 µm 的性能 这在 HPLC 中非常引人关注, 但对于 SFC 则不重要, 因为全多孔亚 2 µm 颗粒的压降已经相当低了 66 对于多孔外壳颗粒, 样品容量需要作进一步的研究 在一项研究中, 研究人员使用各种极性溶质和极性流动相将塔板高度降低至大约 1.6 d p, 而进样量仅不到.5 µl 且适用 4.6 mm 内径色谱柱 样品溶剂为甲醇 67 在另一篇报告中, 研究人员使用 C18 固定相和非极性溶质, 曾用较高的进样量 ( 最高 3 µl,4.6 mm 色谱柱 ) 而不会导致柱效发生显著损失 在这种情况下, 样品溶剂为甲醇 / 二氯甲烷, 但溶质则为高度非极性物质 68 由同一作者撰写的另一篇论文表明使用 C18 多孔外壳色谱柱时, 增加进样量时会导致柱效不断降低 这些异常现象似乎与强溶剂效应有关, 其中样品溶剂的强度高于流动相 已知注射较大体积的此类强溶剂会使早先的洗脱峰变形, 对于表面积较小的色谱柱而言尤其如此 已发表的论文中, 使用这些颗粒得到类似结果的 SFC 论文相对较少 无法对进样量与色谱柱内径 改性剂浓度或样品溶剂之间的关系进行有效的概括 然而, 我们很容易发现问题, 并且通过使用极性较低的样品溶剂有助于纠正这一问题 任何形式的无溶剂进样 ( 移去样品溶剂, 然后将溶质复溶于流动相中 ) 都可避免这一问题 47

63 3.6 用于手性分离的色谱柱 几乎所有类型的手性固定相都可有效用于 SFC,Pirkle 型 环糊精型和氨基酸型固定相已得到相当普遍的应用 然而, 目前基本上最通用的固定相是采用衍生化粗晶纤维素或直链淀粉涂覆到硅胶上制成 这些极其成功的固定相的多项专利已经过期, 现在有多家制造商都在生产这些产品 这一状况促使人们去开发能够运用各种改性剂的键合相 由于涂覆相为粗晶, 因此通常将其涂布到孔径较大 (15 埃或更大 ) 的 颗粒上 这样会形成较低的表面积和相对较差的样品容量 某些其他类 型 ( 例如 Pirkle 型固定相 ) 可键合到孔径较小的硅胶上, 明显得到更高 的表面积和样品容量 这对于以通量为最高优先的半制备工作而言至关 重要 分析型 SFC 担负着 1 到 15 年前开始由标准 1 µm 颗粒向普遍使用 5 µm 颗粒的转移 过去几年中,3 µm 颗粒已变得很普遍, 因此, 色谱柱柱长 65, 67 和 ( 在某些程度上 ) 内径都在减小 仅有几篇报告使用亚 2 µm 颗粒 在 UHPLC 中进行手性分离, 关于 SFC 的应用则没有报道 这一状况将来 可能会发生改变 至于非手性分析,SFC 的发展趋势是快速筛查, 为实现分析速度的提升而 牺牲柱效 当前的趋势是使用以 3 µm 颗粒填充的 5 至 1 mm 色谱柱 填充以 3 至 5 µm 填料 柱长 15 至 25 mm 的色谱柱更多用于痕量分 析 ( 对映体过量率 EE 测定 ) 有关更深入的讨论, 请参阅第 7 章 手性 分离 48

64 流动相变量对保留值和选择性的影响 4 SFC 软件为分析人员提供了 4 种流动相控制变量 : 1. 改性剂浓度 2. 温度 3. 压力 4. 流速每个变量都在不同程度上影响着保留值和选择性 4.1 改性剂浓度 在这些流动相控制变量中, 调节改性剂浓度是对保留值最有力的控制, 但却不太能影响选择性 根据经验法则, 改性剂浓度加倍会使保留值减半 文献中的两个例子 69 7 是针对极性较大的混合物系列, 即羟基类固醇和三环类抗抑郁药的洗脱, 如图 4.1 中的图 A 和 B 所示 正如第 2 章 流动相 中溶剂致变色染料的研究所预测的那样, 最初加入的少量改性剂对保留值就有很大影响 在第一个例子中,5% 以上的甲醇使羟基类固醇的保留值改变得很小, 如图 4.1 的图 A 所示 但在 1% 到 2% 的前十分之几这个区间, 分配比 k 从大约 4 降到 5 以下 k 的对数值对改性剂百分比作图所得的曲线是非线性的 改性剂浓度微小变化即引起保留值这样大的改变, 这种现象会导致在不同时间和不同实验室之间难以实现重现性 因此, 应避免使用这种条件 不过, 这个例子也证明了改变改性剂浓度的作用 49

65 分配比, k 改性剂 [%] 雄甾酮可的松 A 保留时间 [min] B 甲醇浓度 [%] 图 4.1 A: 可的松和雄甾酮的保留值随改性剂的浓度而变化, 显示在低浓度下, 浓度的微小改变即可带来很大变化 B:5 种三环类抗抑郁药的保留值在较高改性剂浓度下随改性剂浓度的改变而变化更典型的例子见图 4.1 的 B 图中三环类抗抑郁药的分离 在这个例子中, 在改性剂 5% 到 2% 之间, 所有 5 种化合物的保留值有明显变化 在最极端的情况下,k 从 5% 时改变了 14, 到 2% 时仅改变为 2 在改性剂浓度相当宽的范围内, 所有曲线几乎是平行的 这些曲线不会交叉, 说明不存在色谱峰位置的颠倒, 因此, 改变改性剂浓度对保留值有很大影响, 但对选择性的影响很小 4.2 温度 相比改性剂的浓度, 温度改变对保留值的影响要小, 但有时会引起选择性的明显改变 改变改性剂浓度使得所有溶质都进入合理的短保留窗口后, 再通过改变温度来改变选择性 71 所有其它变量都保持恒定时, 在不同温度下两个磺胺类药物的色谱图显示为,28 C 时以 1 2 的洗脱顺序达到基线分离, 但在 4 C 时保留值减少, 两个峰共洗脱, 而在 6 C 以上, 保留值和分离度都增加了, 但洗脱顺序却变成了 2 1, 如图 4.2 所示 5

66 吸光度 [mau] C C..5 2, C..5 1, C C 时间 [min] 图 4.2 温度的微小变化引起两个磺胺类药物的峰位置颠倒 7, 72, 73 图 4.3 给出了三个其它图例 在图 A 显示的第一个例子中, 用固定的流速 流动相组成和色谱柱出口压力下对几种兴奋剂进行分离, 温度从 3 到 9 C 变化 当温度升高时, 某些化合物的保留值增加, 有的减少, 有的几乎保持不变 交叉的曲线表明色谱峰位置发生了颠倒 但请注意, 保留时间的总体变化不大, 特别是相对于改性剂浓度对保留的影响来说 51

67 同样, 在相同条件但不同温度下进行 1 种抗抑郁药的分离 (B 图 ) 再一次看到, 某些化合物的保留值增加了, 某些有所减少, 而其它化合物在 3 到 6 C 之间几乎没有什么变化 曲线几乎水平, 说明保留只有很小的变化, 但几个交叉表明出现了色谱峰前后颠倒的现象 在图 C 显示的第三个例子中, 抗精神病药物的分离显示了与上述其它两个系列化合物类似的现象 这里有个明显的细节 35 C 下, 在 6 分钟左右, 三个溶质峰共洗脱, 形成单一的对称峰 其它两个峰也在 7 分钟附近共洗脱 但是, 在 4 C 时, 也就是说只升高了 5 度,6 分钟附近的三个共洗脱峰和 7 分钟左右的两个峰都完全得到了基线分离! 这些化合物都具有相同的中心三环结构, 区别仅在于环上的几个取代基 遗憾的是, 在 4 C 时,3 分钟和 8.5 分钟附近的峰存在共洗脱 进一步将温度提高到 45 C, 前面的三峰和双峰都得到了基线分离 实际上, 在 45 C 时, 几乎所有溶质都得到了几乎等间距的完全分离, 除了第二个和第三个最小保留的峰, 这些峰在 4 C 时合并, 在 45 C 以上仍然共洗脱 在类似这样的条件下, 进行温度编程可以分离所有化合物 52

68 保留时间 [min] A 保留时间 [min] B 温度 [ C] 温度 [ C] 保留时间 [min] C 温度 [ C] 图 4.3 温度对保留和选择性的影响 某些化合物增加了保留值, 而其它化合物则减少了保 留值, 从而使选择性发生了很大变化 A: 兴奋剂 ;B: 抗抑郁药 ;C: 抗精神病药 4.3 压力 使用纯 CO 2 时, 压力是首要控制参数 然而, 对于含改性剂的流体, 压力对保留或选择性的影响要小得多, 尤其是含高浓度的较强极性改性剂 7, 73, 74 时 同样, 对三个不同系列的化合物, 包括苯脲农药 三环类抗抑郁药和兴奋剂, 使用不同的色谱柱出口压力但其余条件不变的情况下进行分离 图 4.4 中的图 A B 和 C 所示出的各条曲线, 除了兴奋剂外, 每个系列的各组分几乎都是平行并相当平坦的 有几个曲线存在交叉, 但这与改变温度所发生的交叉不同 53

69 保留时间 [min] A 保留时间 [min] B 出口压力 [bar] 出口压力 [bar] 保留时间 [min] 出口压力 [bar] C 图 4.4 色谱柱出口压力对保留值和选择性的影响 A: 苯脲农药, 注意, 峰 8 和 9 之间发 生了颠倒 ;B: 三环抗抑郁药 ;C: 兴奋剂 将 5 µm 柱上的方法转移到亚 2 µm 柱上, 使用更小粒径填料时, 柱头压 力明显提高 压降与粒径平方的倒数成正比 因此, 在柱效相同 ( 减少 柱长 ) 的情况下,1.8 µm 粒径的色谱柱的压降是 5 µm 粒径的 7.7 倍 这 意味着两根柱子上的平均压力和流动相密度明显不同 如上所述, 这在 保留值和选择性上有着微妙的影响 这在低改性剂浓度, 尤其是低色谱 柱出口压力 ( 低于 12 bar) 和低温 ( 低于 5 C) 时最为明显, 如前面 图 2.1 中纯 CO 2 的密度和图 2.3 中的 CO 2 和甲醇的密度所示 密度对压 力的曲线斜率在高压下往往不是很陡, 最大限度地减小了这种影响 54

70 两种色谱柱平均密度的差异近来引发了新的争论, 而这一概念已经被充分了解了几十年 如果原来在大粒径填料色谱柱上是在高于 1 bar( 即 15 到 2 bar) 时进行分析, 那么降低小粒径填料色谱柱的出口压力可以让两根柱子上的平均压力 ( 和密度 ) 相同或至少相似 如果从大粒径色谱柱向小粒径色谱柱转移方法时出现问题, 可以取小粒径色谱柱压降的二分之一, 以得到平均压降 提高大粒径色谱柱的出口压力, 直到平均压力与小粒径色谱柱的平均压力相同 密度效应是非线性的, 要得到相似的选择性, 可能只需要稍微改变色谱柱的出口压力 或者, 可以简单地升高大粒径色谱柱的出口压力, 使该效应归一化或最小化 平均色谱柱密度 很难计算出二元流体在色谱柱中的 平均密度 记住, 几乎没有一个系统可以大致了解或计算出二元流体的密度 最好的例子是甲醇 /CO 2 有 适用于窄范围条件的数据库和状态方程 虽然缺乏数据的状况在未来有可能改观, 但过去的经验表明, 在目前缺乏 SFC 基础研究经费的情况下, 产生和收集这些数据是不太可能的 4.4 流速 在 HPLC 中, 流速的变化往往对选择性的影响很小, 倘如分离度与速度相折衷的话可以缩短分析时间 而 SFC 则有点儿复杂, 因为提高了流速即增加了色谱柱和连接管线的压降 由于反压调节器保持着系统出口压力的恒定, 压降增大的结果导致了泵压力升高 高压导致相应的密度增加和保留值降低 ( 较低的 k), 超出了如前所述单纯因高流速而引起的预期变化 流速对咖啡因 茶碱 可可碱和尿嘧啶保留值的影响如图 4.5 所示 压降从 2 ml/min 时的 33 bar 增加到 5 ml/min 时的 147 bar, 当流速增加同样的数量时, 保留值缩短了 2.5 倍 因为保留值的变化与流速的变化成正比, 因此该结果表明, 压降的效应是最小的 然而, 将保留时间归一 55

71 化到 2 ml/min 时的数值 ( 实际 k) 时, 得到的数值见图 4.6 保留时间 (k) 缩短了 13% 虽然效果不是特别大, 但还是应该意识到这种形式的 作用 保留时间 [min] 咖啡因 流速 [ml/min] 茶碱 可可碱 尿嘧啶 图 4.5 流速对咖啡因 茶碱 可可碱和尿嘧啶保留值的影响 由于高流速下柱压降增加引起了流动相密度变化, 因此曲线是非线性的 压降从 33 增大到 147 bar(188 到 297 bar 入口压力 ) 条件为 15% 甲醇,5 C,15 bar 出口压力 色谱柱 :4.6 x 15 mm,3.5 µm RX-SIL 柱 归一化保留时间 [min] 咖啡因 流速 [ml/min] 茶碱 可可碱 尿嘧啶 图 4.6 对图 4.2 的保留时间归一化显示, 当流速从 2 增大到 5 ml/min 时, 由于通过色谱柱流动相的密度增加, 保留值缩短了 13% 压降从 33 增大到 147 bar(188 到 297 bar 入口压力 ) 其它条件保持不变,15% 甲醇,5 C 和 15 bar 出口压力 色谱柱 :4.6 x 15 mm, 3.5 µm,rx-sil 柱 56

72 该数据采自 4.6 x 15 mm 色谱柱, 填充 3.5 µm RX-SIL 填料 (P in = 188 至 297 bar) 由于压降的变化, 填充亚 2 µm 填料的色谱柱可能会有更大的偏离 但是, 在最佳流速左右, 色谱柱压降很少超过 25 bar( 小于 4 bar 出口压力 ), 在合适的改性剂浓度下,ΔP 值常在 5 到 1 bar 左右, 与图 4.4 的范围相似 4.5 可控变量对保留值和选择性的影响概述 要想不更换色谱柱而大幅度改变峰保留值, 改性剂浓度是最有效的途径 改性剂浓度加倍, 则保留值大约可以减半 改性剂浓度应该是用来移动 色谱峰进入相应保留窗的首要变量 如果色谱峰没有完全分开, 微调温度常常可以改善具体色谱峰对的分离度 改变 ±1 度通常可以看出选择性是否有改善 如果有改善, 尝试向最好的方向以 5 到 1 度为单位递增进行优化 压力应作为第二控制变量, 但大幅度的压力变化 ( 即 25 到 5 bar) 可能会导致保留时间或选择性或两者都产生微小变化 流速应设置在接近最佳流速, 直到可以优化或最大化所有溶质的分离度 然后可以增加流速, 直到分离度刚好可以接受 57

73 5 方法开发 第 1 章 超临界流体色谱介绍 对超临界流体色谱是给读者下了一个广义的定义, 什么是 SFC, 什么不是 SFC 第 2 章 流动相 是让读者熟悉流动相各方面的特性, 比如纯的 CO 2 是低极性 加入极性改性剂对溶剂强度有很大的影响, 溶剂强度如何与浓度呈非线性关系, 有多少溶质需要在流动相中加入强极性添加剂才能洗脱 第 3 章 固定相 解释了适用的柱硬件的尺寸和形状, 以及对实际可用固定相的相对极性和相互作用的评价 第 4 章 流动相变量对保留值和选择性的影响 描述了各种流动相变量对保留值和选择性的影响, 说明了到目前为止与其它仪器流动相设置点相比, 改性剂浓度对保留值有最大的影响, 但对选择性的影响较小 温度对保留时间的影响小得多, 但对选择性有令人惊讶的效应 压力仅仅是第二控制变量, 对保留值和选择性的影响都较小 流速对选择性的影响更小, 只是通过改变色谱柱的压降而实现 现在是时候将所有这些背景信息都融合成进行方法开发的一个合理途径 5.1 溶质与固定相的极性匹配 老话说相似相溶, 意思是与溶质具有相似官能团的溶剂很可能就是良好溶剂, 而具有不同化学特性的溶剂很可能是不良溶剂 例如, 盐和水相溶, 而盐和庚烷就不相溶 这种说法可以扩展到色谱中, 选择与目标溶质具有类似化学特性的固定相和流动相 在分离极性较强的溶质时, CO 2 在某种程度上可以被看成是相对惰性的稀释剂 改性剂的极性和化学官能团主要支配流动相的特性 特别是需要溶质和固定相之间 溶质和改性剂之间发生强相互作用 这种强竞争性相互作用会产生快速平衡 而弱相互作用则不明显, 因此, 导致长平衡时间和保留时间重现性差 58

74 各种溶质官能团列于图 3.2 的顶部 溶质下面是几种流动相和固定相, 箭头指示着每个相所相称的极性范围 这些都是近似值, 但提供了很好的起点 找到合适的溶质系列, 然后划一条垂直线, 显示流动相和固定相的几种可能性组合, 以获得多半可行的分离 酸和碱需要极性固定相和流动相, 如未改性的硅胶 二醇或氨基 能提供强氢键的溶质应该用氢键固定相和流动相进行分离 在水相介质中会根据 ph 环境进行离子化的溶质, 可能需要极性改性剂, 甚至极性更高的添加剂 应选择抑制其潜在离子化的添加剂 而另一个极端, 具有最低极性官能团或长烃链或两者兼有的溶质最好用非极性固定相 ( 如 C18) 和较非极性的改性剂进行分离 对于这种分离, 不太可能需要添加剂 添加剂 为了选择添加剂, 另一个可能有帮助的类比是酸碱摇出实验 在水相的 ph 环境中允许碱发生离子化的条件下, 与不溶性有机溶剂接触时, 碱就分配到水相介质中 但是, 在水相 ph 环境抑制离子化时, 同样的碱很可能从水相中出来进入有机相 将固定相想做水相, 流动相看作有机相 添加剂应该能够抑制碱性溶质的离子化, 使其不被吸附在固定相上 真正优化时可能需要尝试几种不同的添加剂 但大多数类似添加剂都起到相似的作用, 通常不值得付出更多努力, 除非在没办法的极端情况下 59

75 需要添加剂的最明显例子涉及了脂肪伯胺和脂肪仲胺 在这个案例中, 可能值得从乙基吡啶柱开始尝试, 以避免使用碱性添加剂, 特别是在使用质谱作为检测器的时候 但乙基吡啶柱比经典固定相 ( 氰基 硅胶 二醇和氨基 ) 的保留能力更强, 因此常常需要比较高的改性剂浓度 因而降低了溶质的扩散系数 减慢了优化的线性速度 增加了粘度和压降 另一种方法是, 将一种强碱, 例如三乙胺向改性剂中加入.1%, 很可能改善整个柱效, 并且只需要非常低的改性剂浓度 ( 具有更高的速度和效率 ) 两性化合物一般最好使用甲酸铵或乙酸铵作为添加剂, 通常补充更强的酸或碱 这些添加剂可以抑制这类溶质的酸性和碱性离子化, 或形成中性离子对 5.2 极性窗口 流动相可能形成包括溶质在内的极性窗 如果样品包含了范围广泛的极性 尺寸和官能团, 则流动相的极性差异应更宽, 形成宽的极性窗, 可以通过对较大范围内的组分进行编程使窗口变窄 如果样品含有极性相近的一组同类化合物, 流动相应当收拢范围, 且与溶质类似 5.3 入门指南 在一开始就确定分离目标非常重要 可以采取不同途径进行优化, 比如一个目的是让峰之间具有最小分离度以实现最快分离, 而另一个目的则是痕量分析 我们的目标应该始终是建立一个尽快完成分析的方法 为此, 常常是从最高浓度的相应标准品开始尝试, 使用强洗脱条件, 尽量避免不确定性 如果需要特异性检测器, 如蒸发光散射 (ELS) 检测器, 需要分别开发分离方法和优化检测器 通常是在溶质具有弱发色团时使用 ELS 检测器 使用的溶质尽可能接近目标溶质, 但一定要有发色团 然后可以使用 UV 检测器, 用带有发色团的溶质帮助优化 ELS 检测器, 以此得到几乎适合目标溶质的操作条件 6

76 5.4 极性溶质 下一节将介绍开发优化方法的一步步过程 图 5.1 显示了极性溶质遵循 该指南的决策树 初始条件 添加剂酸用于酸类化合物碱用于碱类化合物两性化合物离子对改变固定相改性剂中加 1% 的水降低表面积 否 出峰? 是 保留? 是 否 减少改性剂浓度降低梯度坡度降低改性剂极性 ( 例如, 将甲醇换成异丙醇 ) 降低压力升高温度改变固定相 增加改性剂浓度提高梯度坡度加大改性剂极性提高压力降低压力改变固定相 否 分析时间短? 是 选择性是否足够? 否 温度改变 1 度压力升高 5 bar 改变改性剂类型改变固定相 是 长柱减小粒径减少改性剂浓度 否 分离度是否足够? 是 最终方法 图 5.1 使用极性溶质的方法开发决策树 61

77 高极性溶质, 如多元酸或脂肪胺可以在图 3.2 的右上方找到 向下划垂 线显示可以使用的极性固定相 这条线还提示可能需要甲醇和适当的添 加剂 需要添加剂吗? 极性溶质需要解决的第一个问题是流动相是否需要添加剂 选择极性固定相, 如未改性的硅胶 使用含 4% 甲醇的 CO 2,5 C,1.5 倍最佳流速, 出口压力为 15 bar 在这样强的条件下, 大多数溶质应在几分钟内洗脱 第一次进样后, 是否得到了对称的高效峰? 出峰? 未出峰? 如果峰形合适, 没有拖尾, 则不需要添加剂, 可以优化改性剂浓度 如果成分没有洗脱下来, 或者峰严重拖尾, 则需要添加剂 通常向改性剂中加入.1% 至.2% 足矣 如果溶质是碱, 则添加强碱, 如氨或三乙胺 如果溶质是酸, 则添加强酸, 如三氟乙酸 许多溶质都具有多官能团 对于这种溶质, 两性添加剂, 如甲酸铵或乙酸铵可能比较合适 在包含添加剂的第二次进样中, 是否得到了对称 高效的色谱峰? 出峰! 在 9% 以上的例子中, 添加剂的加入都得到了峰形合适的峰 如果加入添加剂后色谱峰良好, 则继续优化改性剂浓度, 与不使用添加剂时的方法完全一样 只需进行几次快速等度运行来回答关于极性溶质的一个重要问题 还是未出峰? 如果没有出现峰, 或者峰形很差, 可尝试使用离子对 ( 碱性溶质用酸性添加剂, 反之亦然 ) 如果还是没有出峰或者峰形差, 分离的成功与否将取决于是否能找到合适的添加剂或添加剂组合 最后尝试在甲醇和添加剂中加入 1% 的水 另一个办法是更换新的固定相, 如用乙基吡啶柱分离碱, 或用 Premier 分离酸 这些固定相可以使溶质洗脱, 而不用添加剂 62

78 5.4.2 优化改性剂浓度 甲醇 甲醇是与 CO 2 完全混溶的一种最强溶剂 其本身对许多溶质来说是一种过强的溶剂, 使其在 4% 甲醇下在色谱柱死时间附近被共洗脱 利用经验法则, 改性剂浓度减半, 大致可以使保留时间加倍, 以 2 为分母逐渐减少改性剂的浓度 ( 到 2%, 然后 1%, 再到 5%), 观察所有峰的保留时间 通过缓慢改变改性剂的浓度, 可以很清楚地了解峰的洗脱顺序是否颠倒 另一方面, 只要进行几次等度运行, 就可以表明什么是必要的后续步骤 如果溶质显示出宽范围的保留值, 下一步将是组成梯度 如果大部分峰都被保留, 却以相似的保留时间聚在一起, 接下来可能需要等度方法 开发任何一个方法然后运行一段较短的合理时间, 不要期望只用一种改性剂浓度就能分离出所有峰 当改性剂组成接近最佳时, 所有峰至少部分分离, 然后继续通过柱温来调节选择性 甲醇极性仍然太强 如果使用 5% 甲醇时, 某些峰还是接近不保留, 没有足够的分离度, 则改用较弱的溶剂, 如乙醇或异丙醇 在大多数情况下, 其中一种醇将实现可行的分离 在极端情况下, 可能需要改用不同的溶剂系列 如果醇类不合适, 对样品的最初判断可能是错误的 用温度改变选择性 如第 4 章 流动相变量对保留和选择性的影响 所述, 温度对保留值是有限的影响, 而对选择性可能有明显影响 一旦优化了改性剂浓度得到合理的短分析时间, 以 ±5 到 1 度改变温度, 常常可以改变难分离峰对的相对保留值 如果这种温度变化改善了难分离峰对的分离度, 可以尝试沿同样方向进行较大的温度改变 压力 对于极性溶质, 压力是次要控制变量, 很可能不能明显改变保留值或选择性, 特别是在高改性剂浓度下 但如果分离没有实现优化, 还是值得以 25 或 5 bar 的增量改变压力 这种尝试很简单, 只需要一点时间, 实际上可能很有用 改变出口压力便可改变流体的密度, 可能起到某些令人满意的效果 在高压下 UV 检测器的噪音更低 因此, 在高压下进行痕量分析通常是明智的 63

79 5.5 低极性溶质 许多低极性溶质都适合 SFC 许多是复杂的天然产物或同系物 图 3.2 的左上方列出了一些典型的低极性溶质系列 选择一种类型的溶质, 划一条垂直线找到合适的固定相 对于带长烃链的化合物, 最合适的固定相可能是 C18, 但其它固定相比如 C8 苯基和氰基可能也适用 极性固定相很可能没有保留值和出现变形峰, 因为极性固定相与非极性溶质之间相互作用较弱 在低温低压下, 使用纯 CO 2 很可能不会得到好的峰形 为非极性但重溶质开发耐用方法的最可靠方式是使用改性流体, 可以等度洗脱, 也可以是组成编程洗脱 梯度还是按从低到高的改性剂浓度进行编程 以较低极性的改性剂, 如异丙醇作为起点是一个不错的选择 因为低极性溶质一般没有氢键, 非醇性改性剂可能更好 与高极性溶质相比, 更常用的是低极性溶质乙腈 尽量避免使用氯代溶剂, 虽然也可以使用 对于这种溶质, 不太可能需要添加剂 优化改性剂浓度 对于复杂样品, 可能需要梯度洗脱 但最好尝试在高改性剂浓度的等度条件下进行快速分析, 确保所有组分均洗脱, 这样可以最大限度地减少迷惑 对于极性溶质, 洗脱条件从 4% 改性剂,5 C 和 15 bar 开始 极有可能所有组分都被快速洗脱 将改性剂浓度减半会使保留时间加倍 如果 5% 异丙醇仍然是过强的溶剂, 可以在庚烷中加入 1% 异丙醇, 然后将混合物作为改性剂 64

80 5.5.2 温度和压力 对于极性溶质, 稍微改变温度可以显著影响溶质与固定相之间的极性相互作用, 导致选择性的改变 对于极性很小的溶质, 相互作用以范德华力为主, 温度对选择性的影响很小 温度和压力的最大影响可能都是通过改变流动相密度来实现的 在高温和低压 ( 降低密度 ) 下可能会使保留值增加 保留值也可能是密度的函数, 特别是使用低浓度的低极性改性剂时 5.6 多变量方法 上述途径开发的方法可能比较老式, 因为是遵循单变量的方法 下一步, 你需要作出一些近乎实时的决策, 否则会浪费时间和原料 正如后面的章节中将介绍的优化分离, 对许多分离来说, 多因素分析方法很难找到最佳条件 与更细致的单变量方法开发优化相比, 这种多变量方法不太可能得到优化分离, 温度改变的确常常导致峰的顺序颠倒 但 SFC 的高速度使其可以快速开发这样的方法, 比 HPLC 所用时间要短得多 65

81 6 非手性分离 在本章中, 我们展示了关于如何开发特殊方法的几个案例研究 所选择案例研究都是相当困难的, 随流动相参数的变化, 发生不同寻常的峰顺序颠倒和响应 希望按照本书前面章节中的建议对这些难分离混合物的分离, 能够帮助您开发自己的方法 必须强调, 这些例子并不典型, 不代表常态 大多数分离很容易根据具体的分析要求进行优化 还要记住, 什么才是优化的分离并没有一个统一的标准 所有分离都要在速度 分离度和灵敏度这三者之间达到平衡 在下列例子中, 所有这些问题都得以解决 6.1 案例研究 1 典型的低极性样品 第一个例子是过去 2 年来常用 SFC 分离的典型样品类型 但这种应用在早期 SFC 中更为常见 这个应用提示, 这项技术在药物研究以外的其他领域还有很大潜力 78 辣椒红素的分离是非极性系列化合物分离的良好例子 该产品是辣椒胡椒的提取物, 近年来用以替代加工食品中的大多数人造红色染料, 具有重要的经济价值 目前只存在两种主要色素 : 辣椒黄素和辣椒红素 每个都带有两个羟基, 分别位于萜类链两端的环上, 如图 6.1 所示 这些羟基与一系列脂肪酸形成了大量单酯和双酯 样品中含有大约 7 种化合物, 大多数是双酯 这些酯类不会明显改变母体化合物的颜色, 却有助于增强稳定性 66

82 辣椒红 OH HO O 辣椒红素 OH O O OH 图 6.1 红辣椒中的红色来源于辣椒黄素和辣椒红素这两种化合物 它们的大多数是与各种 脂肪酸形成单酯和双酯的形式存在 胡椒中仅存在相对较少的高极性单醇和二醇 由于脂肪酸上有长烃链, 所以这些酯类都是非极性的 可以在图 6.2 的顶端的左侧找到酯类 垂直的大箭头指示出相应的流动相和固定相 根据溶质的结构选择使用相似的长烃链固定相, 如 C18 固定相, 以及在 CO 2 中加入相对非极性的改性剂, 如异丙醇 使用三根选择性略有不同的 C18 柱 ( 安捷伦出品 ), 每根都是 1.8 µm 粒径 67

83 烃类蜡质酯类 / 醚类脂肪酸萜类酮类 / 醛类 酰胺甾体环氮醇类糖类苯胺类 苯甲酸羟基酸多元酸脂肪胺 两性离子肽 蛋白质 DNA/RNA 无机离子 极性增加 流动相 CO 2 乙酸乙酯 / 丙酮 / 乙腈 /CO 2 异丙醇 /CO 2 乙醇 /CO 2 甲醇 /CO 2 甲醇 / 水 添加剂 固定相 C18,C4,C1 己苯基 氰基 硅胶二醇氨基乙基吡啶 图 6.2 辣椒油中含有大量辣椒黄素和辣椒红素的单酯和双酯 箭头指示了这些酯类的固定相和流动相 在 CO 2 中用 5% 到 2% 异丙醇的相同梯度, 在三根不同的 C18 柱上分离相同样品, 得到分离度稍有细微差异的 不同的色谱图, 如图 6.3 所示 色谱峰均被良好保留, 间隔合理 相反, 相同样品在极性较大的固定相上分离时, 虽然也使用相同的梯度和条件, 但大多数峰形都很差, 保留值也位移到更短的时间, 如图 6.4 所示 显然, 溶质与这些极性较大的固定相之间的相互作用比它与 C18 固定相之间的相互作用更弱 68

84 吸光度 [mau] 保留时间 [min] 图 6.3 在三种不同 C18 柱上分离辣椒油, 色谱柱均为 3 x 1 mm,1.8 µm( 均来自安捷伦 ), 6.5 分钟内用 5% 到 2% IPA 梯度洗脱 69

85 吸光度 [mau] SB-C SB-CN RX-Sil Epic Diol HILIC 保留时间 [min] 图 6.4 在极性柱上使用相同的洗脱条件分离相同的辣椒油, 与顶端的 SB-C18 柱进行比较 所有色谱柱均为 3 x 1 mm,1.8 µm 非极性分析物的保留都很差, 尤其是在未改性的硅胶和二醇固定相上在同样的梯度和条件下用 ZORBAX SB-C18 柱分离, 使用其他改性剂取代异丙醇, 如图 6.5 所示 乙腈和丙酮的极性较强, 而醋酸乙酯的极性与异丙醇相当, 根据表 2.1 所列的 Snyder P 等级, 所有三种溶剂都使样品的保留时间更短 观察到的保留顺序为 : 乙腈 (6.2) 醋酸乙酯 (4.3) 丙酮 (5.4) 异丙醇 (4.3) 括号中的数字为表中每个溶剂的 P 溶剂强度值 显然,P 值不能正确预测这种类型样品的保留顺序 使用 Hildebrand 等级得出的保留顺序甚至更糟 : 乙腈 (.5) 醋酸乙酯 (.38.48) 丙酮 (.47.53) 异丙醇 (.62) 7

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