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松丁
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1 第 34 卷第 5 期 2015 年 9 月华中农业大学学报 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Vol.34 No.5 Sep.2015,76~80 鳜属 5 种鱼类微卫星遗传多样性分析赵程梁旭方田昌绪杨敏窦亚琪郭稳杰宋易华中农业大学水产学院 / 农业部淡水生物繁育重点实验室 / 湖北省淡水渔业协同创新中心, 武汉摘要利用 8 对已发表的翘嘴鳜微卫星引物, 对 5 种鳜属鱼类翘嘴鳜大眼鳜斑鳜波纹鳜和暗鳜共 147 个个体进行跨种扩增和遗传多样性的研究. 结果发现,8 个微卫星标记除位点 HW8 在波纹鳜中无多态性外, 其他位点在 5 种鳜属鱼类中都具有较高的多态性. 每个位点等位基因数为 4~8 个不等, 平均等位基因数为 6.13; 在 5 个物种中分析的平均有效等位基因数为 3.58, 平均观测和期望杂合度分别为 0.75 和 0.59, 平均多态性信息含量 0.51, 为高度多态, 表明鳜属鱼类物种的遗传多样性比较丰富. 采用 Nei s 遗传距离和遗传相似性系数分析 5 种鳜属鱼类系统发育关系, 并构建 UPGMA 聚类图, 结果显示翘嘴鳜和大眼鳜斑鳜和波纹鳜分别有较近的亲缘关系, 斑鳜和暗鳜亲缘关系最远. 关键词鳜属 ; 微卫星标记 ; 多态性 ; 遗传多样性 ; 系统发育关系中图分类号 Q 文献标识码 A 文章编号 1000G2421(2015)05G0076G05 鳜属 (Siniperca) 鱼类隶属于鲈形目 (PerciG formes), 鳜亚科 (Siniperinae), 是一类淡水底栖凶猛性鱼类, 包括翘嘴鳜 (S.chuatsi) 大眼鳜 (S.kneG ri) 斑鳜 (S.scherzeri) 波纹鳜 (S.undulata) 和暗鳜 (S.obscura) 等 5 个物种, 主要分布范围有我国东部俄罗斯远东地区朝鲜半岛, 日本和越南等亦有分布 [1]. 鳜类因其肉质纯白细嫩, 厚实无刺, 味道鲜美可口, 营养价值丰富等特点而深受人们的青睐, 其中翘嘴鳜大眼鳜和斑鳜已成为人工养殖的主要名贵经济鱼类. 目前对鳜属鱼类遗传背景的研究主要集中在翘嘴鳜和斑鳜, 且多见于 RAPD 技术, 如杨 [2] 受保等采用 RAPD 技术对长江水系 3 个水域的翘嘴鳜群体的基因组进行了检测和遗传信息的分 [3] 析 ; 方展强等对翘嘴鳜野生群体和养殖群体的遗 [4] 传多样性进行了 RAPD 分析 ; 杨星等对斑鳜翘嘴鳜及其杂交鳜进行 RAPD 鉴定并分析了斑鳜种内遗传多样性. 但 RAPD 技术因其扩增结果重复性差, 无法鉴别纯合子与杂合子等缺点, 导致其不能满足更进一步的研究需要. 近年来, 微卫星标记 (microsatelitemarker) 以其数量多分布广泛且均匀共显性遗传多态性高, 以及引物在种属间具有一定的通用性等特点 [5], 被大量应用于水产动物的群体遗传结构分析遗传多 [6G8] [9] 样性分析等研究. 梅秋兰等利用 20 对微卫星引物对鳜原种群体和养殖群体进行遗传多样性分 [10] 析 ; 朱滔等从翘嘴鳜的 EST 文库中开发并筛选出 22 对具有多态性的微卫星标记对翘嘴鳜 3 个野 [11] 生群体进行了遗传多样性分析 ;Cao 等利用微卫星标记对长江鸭绿江珠江及钱塘江流域的野生斑鳜资源进行了遗传多样性分析. 然而, 在鳜属鱼类的相关研究中, 由于选用的微卫星标记不一样, 且缺乏相同类型的微卫星标记资源, 目前还无法基于微卫星标记对鳜属鱼类进行准确的遗传多样性和系统发育关系分析. 因此, 本研究利用在翘嘴鳜中已发表的微卫星引物, 在 5 种鳜属鱼类中进行 PCR 跨种扩增, 以期得到适用于该属鱼类种群遗传学研究的微卫星标记 ; 利用微卫星标记对 5 种鳜属鱼类的遗传多样性及系统发育关系等进行分析, 以期为进一步鳜类野生资源的多样性检测和评估种群遗传学研究和进化关系分析等提供理论支持, 也为鳜类优良种质资源的合理保护和发掘利用奠定基础. 收稿日期 :2015G02G25 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( , ); 珠江流域高产精养池塘健康养殖技术与示范项目 (2012BAD25B04) 赵程, 硕士研究生. 研究方向 : 鱼类遗传与育种.EGmail:zhaocheng130754@163.com 通信作者 : 梁旭方, 博士, 教授. 研究方向 : 鱼类遗传与育种.EGmail:xufang_liang@hotmail.com

2 第 5 期赵程等 : 鳜属 5 种鱼类微卫星遗传多样性分析 77 1 材料与方法 1.1 样品的采集和 DNA 的提取随机挑选已采集的野生鳜样本 : 翘嘴鳜 30 尾, 来自湖南怀化和常德 ; 斑鳜 30 尾, 来自辽宁凤城和湖北崇阳 ; 大眼鳜 30 尾, 来自湖南怀化和常德 ; 波纹鳜 29 尾, 来自浙江衢州和江西余干 ; 暗鳜 28 尾, 来自湖南怀化. 所有样品剪取胸鳍少许, 于 95% 无水乙醇中固定, 按照 TIANampGenomicDNA 提取试剂盒 ( 北京天根生物科技有限公司 ) 的说明提示获得样品的基因组 DNA.1.2% 的琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白酶标仪检测所提取 DNA 的质量和浓度,-20 下保存备用. 1.2 引物来源随机挑选已在翘嘴鳜群体中成功扩增的微卫星 [12] 序列, 合成相应的微卫星引物, 共 8 对, 名称和退火温度等具体见表 1. 表 1 8 个微卫星标记及等位基因数 Table1 Characterizationofeightmicrosatelitemarkersandtheobservednumberofaleles 名称 Name 登录号 GenBank accessionno. 引物序列 (5 3 ) Primersequence(5 3 ) 长度范围 /bp Sizerange 退火温度 / Annealing temperature 等位基因数 Observed number ofaleles HW1 JQ F:TGTAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC R:AGACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC 121~ HW2 JQ F:TTTCCTCCTCAGTCACAGCAGA R:TGGTTGCTTCAGATCAGTGCCA 156~ HW3 JQ F:GAATAGCAAATGTCCTCGCCG R:GCGGAAAGCCATTCTTCAGGA 181~ HW4 JQ F:GTCTGGTTTCCTGGTCTTGCTT R:GCACCATTCGTTGCTGAGAC 140~ HW5 JQ F:GCTTGAGATGTACGAGAGAGAGA R:AGGATTAGAGGTGTTCAGCC 150~ HW6 JQ F:ATCAGCTCAACCCCTCTGCAT R:GCATGGATGCCAGCGTGAG 130~ HW7 JQ F:GACTGACTGTGCCCTCTGTG R:ATGTGCCAAGCCTCACCAAT 140~ HW8 JQ F:AGCTTGTCTGAATCTGAATCATCCT R:TGCTCTAATGTGGGCAAAAGTCA 183~ PCR 扩增反应的体系和程序 PCR 反应体系的总体积为 12.5μL, 内含 DNA 0.25μL,10 TaqPCRBufer( 含 Mg 2+ )1.25μL, dntps(2.5 mmol/l)0.25 μl, 上下游引物 (10 μmol/l) 各 0.25 μl,5 U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.125μL, 去离子水 μL.PCR 扩增程序为 : 94 预变性 4 min, 然后按 94 变性 30s, 退火 45s,72 延伸 30s 进行 30 个循环, 循环结束后再 72 延伸 10min,4 保存. 1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和基因分型 PCR 产物采用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测,10 V/cm 低电压电泳 2h. 电泳结束后银染法显色. 用 AlphaInnotech 凝胶成像系统扫描记录, 用 Alpha View SA 软件以 DNA Marker(pBR322DNA/MspI) 作为分子质量参照, 确定每个个体的基因型并估计等位基因大小. 1.5 数据处理与分析根据 PCR 扩增片段的变异范围和特征, 对由扩增条带的表现型获得的基因型, 利用 Popgene32 (Version1.31) 和数据转换软件进行统计分析. 统计的指标主要有各位点的等位基因数有效等位基因数观察杂合度期望杂合度多态信息含量标准 Nei s 遗传距离和遗传相似系数等 ; 以及由 PHYLIP Version 3.5 软件中的类平均聚类法 UPGMA 和 MEGA5.1 软件等构建系统发育树. 2 结果与分析 2.1 微卫星 PCR 扩增结果 8 个微卫星位点在 5 种鳜属鱼类即翘嘴鳜斑鳜大眼鳜波纹鳜和暗鳜中进行 PCR 跨种扩增, 均能成功得到目的条带. 除位点 HW8 在波纹鳜中表现为单态外, 其他位点在 5 种鳜类中都表现为多态.

3 78 华中农业大学学报第 34 卷这些位点在 5 种鳜类中共检测出 49 个等位基因, 随引物的不同, 检测到的等位基因数分别为 4~8 个不等, 平均值为引物 HW3 和 HW7 的等位基因数最多, 均为 8 个, 引物 HW6 的等位基因数最少. 其中, 位点 HW1 在暗鳜位点 HW8 在斑鳜和波纹鳜为纯合子, 而在其他鳜类中均为杂合子. 2.2 遗传多样性分析 5 种鳜的平均有效等位基因数为 3.58, 翘嘴鳜最多为 4.75, 大眼鳜波纹鳜和暗鳜最少, 均为 3.00; 观察杂合度为 0.66~0.85 之间, 平均值为 0.75, 期望杂合度为 0.52~0.69, 平均值为 0.59, 其中波纹鳜最低 (0.52), 翘嘴鳜最高 (0.69). 经计算 5 个物种物种 Species 的多态信息含量平均为 0.51, 其中翘嘴鳜最高 (0.63), 波纹鳜和暗鳜最低 (0.45)( 表 2). 2.3 遗传距离和遗传相似性系数不同物种间的遗传相似性系数在到之间, 遗传距离在到之间, 5 个物种间存在一定的遗传变异. 其中, 物种间遗传距离最小而相似性系数最大的是斑鳜和波纹鳜, 分别为和 , 说明这 2 种鱼的亲缘关系较近 ; 斑鳜和暗鳜之间的遗传距离最大 (1.1724), 其遗传相似性系数最小 (0.3096), 说明这 2 个物种间的遗传变异程度最高, 亲缘关系最远 ( 表 3). 表 2 5 种鳜属鱼类群体 8 个微卫星标记基因位点的统计信息 Table2 Thestatisticinformationof8microsatelitemarkerslociinthefivespeciesofSiniperca 有效等位基因数 Efectivenumbers ofalele 平均观测杂合度 Meanvalueof observedheterozygosity 平均期望杂合度 Meanvalueof expectedheterozygosity 平均多态信息含量 Averagepolymorphism informationcontent 翘嘴鳜 S.chuatsi 大眼鳜 S.kneri 斑鳜 S.scherzeri 波纹鳜 S.undulata 暗鳜 S.obscura 表 3 Nei s 遗传距离 ( 左下角 ) 和遗传相似性系数 ( 右上角 ) Table3 Nei sgeneticdistances(abovediagonal)andgeneticidentities(belowdiagonal) 物种 Species 翘嘴鳜 S.chuatsi 斑鳜 S.scherzeri 波纹鳜 S.undulata 暗鳜 S.obscura 大眼鳜 S.kneri 翘嘴鳜 S.chuatsi 斑鳜 S.scherzeri 波纹鳜 S.undulata 暗鳜 S.obscura 大眼鳜 S.kneri 根据以上结果构建 5 种鳜的系统发育树 ( 图 1), 从图 1 中可看出翘嘴鳜和大眼鳜的亲缘关系最近, 并与暗鳜较近, 斑鳜与波纹鳜亲缘关系较近. 列 (corerepeat) 及其两边的侧翼序列 (flankingreg gion), 通常情况下亲缘关系较近的物种间微卫星的侧翼序列具有很高的同源性. 因此, 利用 GenBank 数据库资源和已经被发表的微卫星位点, 通过优化相近物种的微卫星引物 PCR 反应条件, 来获得适用于所研究物种的微卫星标记是一条简捷有效的途 [13] 径. 如用铲鲟 (Scaphirhynchus platorynchus 图 1 5 种鳜属鱼类的 UPGMA 聚类图 Fig.1 UPGMAclusterdendrogramofthefive speciesofsiniperca 3 讨论微卫星 DNA 是由 1~6 个碱基组成的简单串联重复序列, 其组成结构是位于中心的核心重复序 Rafinesque) 微卫星分子标记对中华鲟 (Acipenser [14] sinensis Gray) 进行种间多态性检测获得成功. 本文利用已发表的 8 个翘嘴鳜微卫星标记, 对包括翘嘴鳜在内的鳜属其他鱼类, 即大眼鳜斑鳜波纹鳜和暗鳜共 5 个物种进行 PCR 跨种扩增, 结果获得了单一稳定性良好的目标产物.8 对引物共获得 49 个等位基因, 等位基因数在 4~8 之间, 平均 6.13 个 ; 有效等位基因数在 2.64~6.28 之间, 平均每个

4 第 5 期赵程等 : 鳜属 5 种鱼类微卫星遗传多样性分析 79 位点检测到 3.58 个有效等位基因. 根据以上结果, 笔者认为基于翘嘴鳜转录组获得的这 8 个微卫星标记能较好地用于鳜属其他鱼类的遗传多样性分析研究. 结果也说明鳜属鱼类微卫星侧翼序列在同属内不同种间具有保守性, 再次印证了鱼类的微卫星引物在同属其他鱼类具有一定的通用性. 一般用有效等位基因数杂合度及多态信息含量等指标来衡量遗传标记的多态性程度及其应用价值 [15]. 杂合度是群体在多个基因座上的遗传变异的表现, 被认为是评价群体的遗传变异的一个最适参数 [16]. 本研究中 5 种鳜群体的平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为 0.75 和 0.59, 按照哈代温伯格定理, 杂合度在随机交配群体中不能大于 0.5, 本研究中这 5 种鳜类群体的杂合度均偏高, 表明它们的遗传多样性比较丰富, 在自然环境中发生近交的可能性不大, 含有非常丰富的遗传育种和遗传改良潜力. 多态信息含量 (PIC) 一般用来表示突变位点多态性的高低.PIC<0.25 为低度多态,0.50> PIC>0.25 为中度多态,PIC>0.5 为高度多态 [17]. 本研究发现,5 种鳜的 PIC 值平均为 0.51, 大于 0.5, 仅波纹鳜和暗鳜为 0.45, 说明 5 个物种间遗传变异较大, 信息含量较高, 属于中度及高度多态, 蕴含着较大的物种进化潜力. 理论上来说, 微卫星引物在进化分类系统越接近的物种间的通用性也更高 [18]. 群体间的遗传关系一般以两两群体间基于等位基因频率等指标获得的遗传距离来衡量, 而以微卫星标记得到的群体间遗传距离被认为是比较真实可信的 [19]. 本文采用 Nei s 遗传距离和遗传相似性系数及构建 UPGMA 聚类图分析 5 种鳜的系统发育关系, 结果显示, 翘嘴鳜与大眼鳜亲缘关系较近, 并与暗鳜聚为一支, 斑鳜与波纹鳜亲缘关系较近并聚为另一支, 斑鳜和暗鳜 [20] 亲缘关系最远, 与赵金良等基于线粒体细胞色素 b 基因序列对东亚鳜类系统发育关系的研究结果基本一致. 本研究结果证明, 利用翘嘴鳜微卫星引物对同属其他 4 种鳜进行 PCR 跨种扩增的方法, 来获得适用于该属鱼类种群遗传性研究的微卫星标记是可行的. 同时, 利用微卫星标记对 5 种鳜类进行遗传多样性及系统发育分析的结果也比较可靠, 这些鳜类的遗传多样性程度较高, 种间遗传变异较大, 这可能与它们适应不同的生存环境有关. 由于地域差异比较大, 且在自然条件下近交和外来压力较小,5 种鳜类均蕴涵着比较大的进化潜能和较为丰富的遗传育种和遗传改良潜力. 随着鳜类野生资源保护和可持续开发利用的力度加大, 以微卫星标记手段的不同鳜类的遗传多样性以及系统进化关系研究, 对进一步鳜类野生资源的多样性检测和评估种群遗传学研究和进化关系分析等研究提供了一定的理论支持, 同时对鳜类优良种质资源的合理保护和发掘利用具有重大意义. 参考文献 [1] 李思忠. 鳜亚科鱼类地理分布的研究 [J]. 动物学杂志,1991,26 (4):40G44. [2] 杨受保, 祖国掌, 程久发. 鳜鱼遗传多样性的 RAPD 指纹分析 [J]. 水产养殖,2003,24(4):33G35. [3] 方展强, 陈军, 郑文彪, 等. 鳜野生群体与养殖群体的 RAPD 分析 [J]. 大连水产学院学报,2005,20(1):16G19. [4] 杨星, 杨军峰, 汤明亮, 等. 斑鳜种内遗传多态性以及与翘嘴鳜的分子鉴别 [J]. 水生生物学报,2007,31(6):891G895. [5] 徐莉, 赵桂仿. 微卫星 DNA 标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 [J]. 西北植物学报,2002,22(3):714G722. [6] FERGUSON A.Moleculargeneticsinfisheries:currentandfuG tureperspective[j].reviewsinfishbiologyfisheries,1994, 4:379G383. [7] KOCHERT D,LEE W J,SOBOLEWSKA H,etal.Agenetic linkagemapofacichildfish:thetilapiaorcochromismiloticus [J].Genetics,1998,148(3):1225G1232. [8] DAEMENE.AnalysisofthegeneticsstructureofEuropeaneel usingmicrosatelitednaandmtdna markers[j].marinebig ology,2001,139:755g764. [9] 梅秋兰, 刘臻, 张学文, 等. 鳜原种群体和养殖群体遗传多样性的微卫星分析 [J]. 基因组学与应用生物学,2010,29(2):266G 272. [10] 朱滔, 梁旭方, 彭敏燕, 等. 翘嘴鳜 ESTGSSR 标记的开发及 3 个群体遗传多态性分析 [J]. 暨南大学学报 : 自然科学版,2013,34 (3):347G352. [11]CAOL,LIANG XF,QU C M,etal.GeneticpopulationstrucG tureinsinipercascherzeri (Perciformes:Siniperca)inChina inferredfrom mitochondrialdnasequencesandmicrosatelite loci[j].biochemicalsystematicsand Ecology,2013,51:160G 170. [12]HUANG W,LIANG X F,QU C M,etal.Developmentand characterizationofnovelpolymorphicmicrosatelitelociinsig niperca scherzeri Steindachner and Siniperca chuatsi (Basilewsky)[J].MolecularBiology Reports,2012,40:751G 756. [13] 鲁双庆, 刘臻, 刘红玉, 等. 鲫鱼 4 群体基因组 DNA 遗传多样性及亲缘关系的微卫星分析 [J]. 中国水产科学,2005,12(4): 371G376.

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Microsoft Word - 李学军.doc 41 1 Vol.41, No.1 2010 1 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jan., 2010 (Sarotherodon melanotheron) 5 * 1, 2 1 2 2 (1. 453007; 2. 201306) 5, 6, : (1) 6 5 22 49, 190 204, 190/190 204/204 270/223 270/243; (2)