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1 國立中興大學環境工程學系 碩士學位論文 探討台灣女性乳癌患者之雌性激素代謝活化基因及去氧核醣核酸修復基因之單一核甘酸多型性與去氧核醣核酸損害之相關性 Investigation of the Associations of Single Nucleotide Polymorphisms in Estrogen Bioactivation and DNA Repair Genes with DNA Damage in Taiwanese Women with Breast Cancer 指導教授 : 林伯雄 Po-Hsiung Lin 研究生 : 阮常新 Chang-Hsin Juan 中華民國一零一年七月

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4 誌謝 本論文之完成, 主要感謝林伯雄老師認真指導學生, 讓我在環境工程傳統之空 水 廢 土等領域外發現了全新道路, 雖然一路走來時有挫折, 但都能一一化解並從中體悟 學習 實驗室學長致辰 慶全 弘傑以及冠傑感謝你們在實驗專業上給予我許多幫助及解惑, 讓我對於環醫方面的知識更加豐富, 尤其致辰學長在實驗上容忍我的失誤 ( 永遠記得 XD) 由衷感恩 實驗室同窗兩年的同學茂輝, 我很珍惜與你一起在此實驗室度過的回憶, 感謝你共同互助維持這快樂的實驗室環境 實驗室學長林喆醫師, 感謝你在實驗室最困難時 ( 沒燈等等 ), 出手幫助, 讓我們免於 " 眼殘 ", 也將許多新科技以及醫學專業知識帶入我們實驗室中, 受益良多 系上行政大姐之芃安與海雲姐, 感謝你們協助解決我們實驗室之困境, 銘記在心 實驗室之學弟政佑與國炫, 感謝你們在分擔及協助在實驗室上之工作, 以後就靠你們撐起這一片天 研究所同學們, 感謝你 ( 妳 ) 們讓我研究所生活中多采多姿, 尤其是 RuRu 辦了許多活動以及籌劃生日, 我知道這很辛苦滴 女友盧涵, 感謝妳在常常辛苦奔波台北 - 台中, 陪我度過許多時光, 讓我的生活更加充實 最後一定要感謝我的父母, 感謝你們支持我繼續就讀研究所, 讓我毫無後顧之憂, 能夠順利完成學業 本研究之完成也要感謝許多機構之幫助, 感謝國科會計畫支持, 彰化基督教醫院與大千綜合醫院之研究樣本提供 阮常新僅誌於中興大學環境工程研究所中華民國一零一年七月

5 摘要 本研究主要目的為探討台灣女性乳癌患者之乳癌風險因子, 包括年齡 身體質量指數 (body mass index, BMI) 去氧核醣核酸核酸修復 (DNA repair genes) 及雌性激素代謝基因 (estrogen bioactivation genes) 之多型性與去鹼基核酸背景值 (abasic sites, AP sites) 之相關性 研究結果顯示,67 位乳癌患者 AP sites 背景值為 25.1 ± 16.1/106 核苷酸 ( 平均 ± 標準偏差 ) 乳癌患者之對偶基因變異 (variant alleles) 頻率, 包括雌性激素代謝基因之基因多型性 CYP1A1 T3801C CYP1B1 Leu432Val 與去鹼基核酸內切酵素 (APE1 Asp148Glu) 分別為 29.9% 8.21% 與 46.3% 綜合本實驗室先前所研究之 81 乳癌患者樣本共 148 位發現, 在 BMI < 27 之乳癌患者其 AP sites 背景值較 BMI 27 之患者高約 1.5 倍 (ρ<0.05), 而此趨勢在年齡小於 50 歲且 BMI 小於 27 研究族群內更為明顯 ( 高約三倍,ρ<0.05) 雌性激素代謝基因之基因多型性 (CYP1A1 CYP1B1) 與 AP sites 背景值結果並無明顯之關聯性, 但去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 (AP endonuclease 1, APE1 Asp148Glu) 與 AP sites 背景值則發現 Asp/Glu+Glu/Glu 之變異基因型較 Asp/Asp 基因型高約兩倍 (p<0.05) 利用多元線性迴歸可得知, 當加入乳癌風險因子 BMI 與年齡時,AP sites 之背景值於 APE1 變異基因型之患者較無變異患者高出 1.63 倍 (p<0.05) 綜合上述研究結果可獲得之結論, 乳癌風險因子年齡乳癌患者之 AP sites 背景值呈現負相關 ; 雌性激素代謝基因 (CYP1A1 CYP1B1) 之基因多型性與 AP site 無明顯關聯性 ; 去氧核醣核酸修復基因 (APE1) 之對偶基因變異型 (Asp/Glu + Glu/Glu) 與乳癌患者 AP sites 背景值呈現正相關 i

6 Abstract The objectives of this research were to investigate the associations of the risk factors of breast cancer, including body mass index (BMI), age, polymorphisms of genes involved in DNA repair and estrogen metabolism with the background levels of abasic sites (AP sites) in Taiwanese women with breast cancer. Results indicated that the background levels of AP sites (mean ± SD) in breast cancer patients (n=67) were estimated to be 25.1 ± 16.1 per 10 6 nucleotides. The frequencies of variant alleles of estrogen bio-activation genes, including CYP1A1 T3801C, CYP1B1 Leu 432 Val, and AP endonuclease (APE1 Asp 148 Glu) were estimated to be 29.9%, 8.21%, and 46.3%. We have found total of 148 breast cancer patients that participated in the 81 samples lab study. We noticed that a 1.5-fold increase in the number of AP sites was detected in patients with BMI<27 when compared to those with BMI>27. The tendency was more obvious in subjects with age<50 and BMI<27 (~3 fold). The genotypic polymorphisms of estrogen bioactivation genes (CYP1A1 and CYP1B1) did not correlate with the background levels of AP sites whereas the genotypic polymorphisms of DNA repair gene (APE1) was ~2 fold greater in patients with APE1 (Asp/Glu+Glu/Glu) genotype than in those with Asp/Asp genotype. Results from multiple linear regression indicated that a 1.63-fold increase in the number of AP sites was detected in patients with variant alleles Asp/Glu and Glu/Glu genotypes when compared to those with Asp/Asp genotype. In summary, we concluded that the risk factors of breast cancer, including BMI and age, were negatively correlated with the background levels of AP sites. Additionally, the genotypic polymorphisms of estrogen bio-activation gene (CYP1A1 and CYP1B1) were not correlate with the ii

7 background levels of AP sites whereas the genotypic polymorphisms of DNA repair gene (APE1 Asp/Glu+Glu/Glu) with breast cancer positively correlated with level of AP sites in breast cancer patients of Taiwanese women. iii

8 縮寫表 8-oxo-dG 8-oxo-guanine DNA glycosylase 1 A Adenine Ala AP endonuclease AP site Asn Asp BER BMI BRCA1 BRCA2 BSA C CEs COMT CPDs CT-DNA C.V. Alanine Apurinic/apyrimidinic endonuclease Abasic site or Apurinic/apyrimidinic site Asparagine Aspartic acid Base excision repair Body mass index Breast cancer 1, early onset Breast cancer 2, early onset Albumin from bovine serum Cytosine Catechol estrogens Catechol-O-methyltrasferase Cyclobutane pyrimidine dimers Calf-thymus DNA CYP19 Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1 CYP1A1 Cytochrome P450, family 1,subfamily A, polypeptide 1 CYP1B1 Cytochrome P450, family 1,subfamily B, polypeptide 1 Cys D DNA DSB E E 1 E 2 Cysteine Aspartic acid Deoxyribonucleic acid Double strand breaks Glutamic acid Estrone Estradiol iv

9 E 3 ER EREs ECL FRET G Gly Glu GSH GST Estriol Estrogen receptor Estrogen responsive elements Enhanced-chemiluminescence reagent Fluorescence resonance energy transfer Guanine Glycine Glutamic acid Glutathione Glutathione-S-transferase hogg1 Human oh8gua glycosylase 1 HRP Streptavidin peroxidase label Ile Isoleucine Leu Leucine MDL Method detection limit Met Methionine MMR Mismatch repair NC membrane NER PAHs PBS PCR Polδ RBC RNase A ROS Ser SHBG SNP SSB Nitrocellulose membrane Nucleotide excision repair Polycyclic aromatic hydrocarbons Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction DNA polymerase δ Red blood cell Ribonuclease A Reactive oxygen species Serine Sex hormone-binding globulin Single nucleotide polymorphism Single strand breaks v

10 T TFIIH T-T dimers TEMPO Thr TLS Tween 20 Val WBC XP sndrome Thymine Transcription factor II H Thymine dimers 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yloxy Threonine Translesion DNA synthesis Polyoxyethylenesorbitan monolyaurate Valine White blood cell Xeroderma pigmentosum syndrome XRCC1 X-ray repair cross-complementing protein 1 vi

11 目錄 摘要... i Abstract... ii 縮寫表... iv 目錄... vii 表目錄... ix 圖目錄... x 第一章前言... 1 第二章文獻回顧 乳癌風險 (Breast Cancer Risk) 與乳癌風險因子 (Breast Cancer Risk factors) 年齡 (Age) 種族 (Race) 身體質量指數 (BMI) 家族乳癌病史 (Family History ) 抽菸 雌性激素與其代謝途徑 雌性激素與乳癌風險 氧化 DNA 損害反應 去鹼基核酸 ((Apurinic/Apyrimidinic Sites,AP sites) 去氧核糖核酸之修復 (DNA Repairs) 機制 鹼基切除修復 (Base excision repair,ber): 核苷酸切除修復 (nucleotide excision repair,ner): 基因多型性 (Genetic Polymorphism) CYP1A1 之功能及其基因多型性 CYP1B1 之功能及其基因多型性 APE1 之功能及其基因多型性 XRCC1 之功能及其基因多型性 OGG1 之功能及其基因多型性 第三章實驗架構與設計 實驗架構 實驗設計 第四章實驗材料與方法 實驗設備與材料 研究族群 實驗方法 全血分離 vii

12 4.3.2 核酸萃取 核酸醛基損害分析方法 (Aldehyde Reactive Probe-Slot-Blot assay, ASB assay) Putrescine-cleavage assay 單一核苷酸基因多型性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) CYP1A1 T3801C CYP1B1 Leu 432 Val 與 APE1 Asp 148 Glu 聚合酵素鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 產物之定序確認 數據分析 第五章實驗結果 方法偵測極限 (method detection limit, MDL) 與變異係數 (coefficient of variation, C.V.) Real-Time PCR 與 DNA 之定序結果確認 乳癌患者之 AP site 背景值之分析結果 雌性激素代謝活化之基因多型性 去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 乳癌風險因子 : BMI Age 基因多型性對於 AP site 之結果比較 氧化壓力對於 AP sites 背景值之影響 第六章討論 AP sites 與年齡 AP sites 與 BMI 雌性激素代謝基因之基因多型性 CYP1A1 T3801C CYP1B1 Leu 432 Val 去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 APE1 Asp 148 Glu 統計分析 第七章結論與建議 結論 未來研究方向與建議 參考文獻 viii

13 表目錄 表 2-1 全球婦女癌症發生率及死亡率... 3 表 2-2 在穩定狀態下細胞內生性 DNA 損害數量 表 2-3 細胞及動物實驗之 AP sites 研究 表 2-4 各種 CYP1A1 與 CYP1B1 基因多型性與酵素活性之影響 表 2-5 各種 APE1 基因多型性與癌症風險之相關性 表 2-6 各種 XRCC1 及 hogg1 之基因多型性與癌症風險之相關性 表 位乳癌患者之年齡 BMI 資料 表 4-2 Primers and hybridization probes sequence 表 4-3 Real-Time PCR CYP1A1 T3801C 之反應條件 表 4-4 Real-Time PCR CYP1B1 Leu 432 Val 之反應條件 表 4-5 Real-Time PCR APE1 Asp 148 Glu 之反應條件 表 4-6 PCR 之反應條件 表 5-1 乳癌患者白血球細胞核 AP sites 背景值 表 5-2 CYP1A1 T3801C 之基因多型性分析結果 表 5-3 CYP1B1 Leu 432 Val 之基因多型性分析結果 表 5-4 APE1 Asp 148 Glu 之基因多型性分析結果 表 6-1 乳癌患者之 AP sites 背景值 (n=148) 表 6-2 CYP1A1 T3801C 之基因多型性分析結果 (n=148) 表 6-3 停經後之乳癌患者與健康婦女對照組之勝算比分析 表 6-4 CYP1B1 Leu432Val 之基因多型性分析結果 (n=148) 表 6-5 APE1 Asp 148 Glu 之基因多型性分析結果 (n=148) 表 6-6 乳癌患者與健康婦女對照組之勝算比分析 表 6-7 Ln (AP sites) 背景值與乳癌風險因子之相關性 (n=148) 表 6-8 Ln(AP sites) 之多元線性迴歸分析 ix

14 圖目錄 圖 2-1 台灣各年齡層乳癌發生個案數 ( 國民健康局 2011 統計資料 )... 2 圖 2-2 雌激素之中最主要之雌二醇結構式... 5 圖 2-3 雌性激素之代謝途徑 (Cavalieri et al., 2006)... 7 圖 2-4 常見之氧化傷害 8-Oxo-2'-deoxyguanosine... 9 圖 2-5 DNA 損害反應之信號傳導通路輪廓 (Zhou and Elledge, 2000) 圖 2-6 醛基核酸損害 (Aldehydic DNA Lesions, ADL) 圖 2-7 雌激素醌類代謝物之氧化還原導致 DNA 損傷之各類形成途徑 ( 劉氏 2011) 圖 2-8 鹼基切除修復機制 (BER) 之流程圖 (Sancar et al., 2004) 圖 2-9 核苷酸切除修復 (NER) 之流程圖 (Fuss and Cooper, 2006) 圖 2-10 APE1 切除 5 端磷酸骨幹示意圖 圖 2-11 人類 XRCC1 蛋白質與其 BER 修復蛋白質之相互作用 圖 3-1 實驗設計流程 圖 4-1 全血血液分離流程 圖 4-2 ARP 結構式 圖 5-1 ASB assay 法之最低偵測極限 圖 5-2 Real-Time PCR 分析 APE1 Asp 148 Glu 之基因型結果 圖 5-3 APE1 Asp 148 Glu 單股基因定序結果 圖 5-4 Real-Time PCR 分析 CYP1B1 Leu 432 Val 之基因型結果 圖 5-5 Real-Time PCR 分析 CYP1A1 T3801C 之基因型結果 圖 5-6 乳癌患者之年齡對於 AP site 背景值之影響 圖 5-7 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 圖 5-8 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 ( 年齡分類 ) 圖 5-9 乳癌患者之 CYP1A1 T3801C 對於 AP site 背景值之影響 圖 5-10 乳癌患者之 CYP1B1 Leu 432 Val 對於 AP site 背景值之影響 圖 5-11 乳癌患者之 APE1 Asp 148 Glu 對於 AP site 背景值之影響 圖 6-1 乳癌患者之年齡對於 AP site 背景值之影響 (n=148) 圖 6-2 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 (n=148) 圖 6-3 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 ( 年齡分類, n=148) 58 圖 6-4 乳癌患者之 AP sites 背景值與年齡及 BMI 之影響 圖 6-5 乳癌患者 CYP1A1 T3801C 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 圖 6-6 乳癌患者之 CYP1A1 T3801C 對於 AP site 背景值之影響 圖 6-7 乳癌患者 CYP1B1 Leu432Val 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 圖 6-8 乳癌患者之 CYP1B1 Leu432Val 對於 AP site 背景值之影響 x

15 圖 6-9 乳癌患者 CYP1B1 Leu432Val 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 圖 6-10 乳癌患者之 APE1 Asp 148 Glu 對於 AP site 背景值之影響 圖 6-11 乳癌患者之 APE1 變異對於 AP sites 背景值之影響 圖 7-1 乳癌風險因子與乳癌患者 AP sites 背景值之關係 xi

16 第一章前言 癌症已連續蟬聯 25 年以上頭號死因, 而台灣女性乳癌的罹患人數更是快速的增加且相較於西方國家, 乳癌發生之高峰期有年輕化趨勢, 其中基因突變 飲食習慣與環境污染物等被認為是增加乳癌發生率之風險因子 雖然遺傳性乳癌大多是由於高外顯性基因 (high penetrance gene) 之突變所導致 ( 如 :BRCA1 BRCA2), 但經研究指出, 遺傳性乳癌只佔所有乳癌病例約 5-9%, 故大多數的乳癌形成原因大多為低外顯性基因 (low penetrance gene) 以及環境因素等影響所致 根據研究指出, 癌症的形成原因最主要為 DNA 受到內源性或外源性之物質攻擊, 使 DNA 上的遺傳訊息改變且又未經修復, 就有機率導致細胞脫離正常生長軌道而形成癌症 去鹼基核酸 (AP site) 為最主要之 DNA 損害形式, 由於內源性 ( 例 : 氧化壓力 (ROS) 嘌呤 / 嘧啶內切酶 (AP Endonuclease)) 及外源性 ( 例 : 紫外光 化學物質 ) 皆會造成 DNA 氧化損害, 而使 AP sites 之背景值較高 因此本研究主要目的是探討台灣女性乳癌患者之乳癌風險因子, 包括年齡 BMI 及基因多型性 ( 包括雌性激素主要代謝基因 CYP 1A1 及 CYP 1B1 與鹼基切除修復基因 APE1) 與去鹼基核酸背景值之關係, 希冀能夠篩選出乳癌與乳癌風險因子及 AP sites 之間關聯性 1

17 第二章文獻回顧 2.1 乳癌風險 (Breast Cancer Risk) 與乳癌風險因子 (Breast Cancer Risk factors) 現今癌症已連續蟬聯 25 年以上頭號死因, 而經國民健康局統計台灣乳癌的罹患人數更是快速的增加且有年輕化的趨勢 ( 圖 2-1) 乳癌每年造成全球 46 萬名婦女死亡 ( 表 2-1), 在台灣每天則約有 22 名婦女被診斷罹患乳癌且每天有 5 名婦女死於乳癌 經國民健康局統計可知, 台灣地區女性乳癌發生率在過去 12 年間呈現大幅上揚的趨勢, 由 1995 年的 人增加為 2006 年的 人 ( 每 10 萬女性 ), 增加幅度超過一倍, 而同期間年齡標準化死亡率則僅增加了 0.18 倍, 和發生率相比, 增加幅度相對有限, 且乳癌如第一期就接受治療, 治癒率約有九成, 第二期治癒率就降到七成, 第三期更降到四成, 末期治癒率更低於一成, 故如何快速且精準的提高乳癌早期發現率就成為最主要的研究課題 Cases ~19 20~24 25~29 30~34 35~39 40~44 45~49 50~54 55~59 60~64 65~69 70~74 75~79 80~ Age 圖 2-1 台灣各年齡層乳癌發生個案數 ( 國民健康局 2011 統計資料 ) 2

18 表 2-1 全球婦女癌症發生率及死亡率 癌症別 死亡 發生 人數 年齡標準化死亡率 ( 每 10 萬人 ) 排名 人數 年齡標準化死亡率 ( 每 10 萬人 ) 乳癌 458, ,384, 肺癌 427, , 子宮頸癌 275, , 結腸及直腸癌 288, , 排名 備註 : 1. 資料來源為 Globalcan 2008 預測資料 2. 年齡標準化發生率及死亡率係以 1976 年的世界標準人口做調整後的預測值 乳癌風險因子 (Breast Cancer Risk factors) 年齡 (Age) 乳癌風險因子目前已經發現的有許多, 而其中年齡是一大乳癌風險因子之一, 女性隨著年齡的增長, 罹患乳癌的風險亦隨之而增加 (Ferrer et al., 2005) 有研究指出, 在美國 歲婦女的乳癌年發生率高出 歲婦女達 15 倍之多 (Gail et al., 2007) 亞洲地區之韓國女性乳癌研究則發現, 年齡在 30 歲以上婦女相對於 30 歲以下婦女罹患乳癌之風險也是顯著上升 (Lee et al., 2008) 造成此一原因目前尚無確切根據, 但有研究指出年齡的增加, 造成細胞 RASSF1A 基因甲基化 (Methylation) 也隨之增加, 且與乳癌風險有高度相關 (OR=5.28; P = 0.001) (Euhus et al., 2008) 種族 (Race) 種族因子在乳癌發生的風險上, 具有修飾作用 因此, 即使是相同年齡層的婦女, 不同種族之婦女其乳癌發生率也會因而不同 (Car ey et al., 2006; Vogel, 2008) 如同一種單一鹼基基因多型性 ( 例 :hog g1) 變異, 歐美等白種人研究結果表明此為位置變異有統計上之顯著降低乳癌風險, 但亞洲國家學者研究卻不支持 (Yuan et al., 2010) 3

19 2.1.3 身體質量指數 (BMI) 身體質量指數 (BMI) 常常用於大眾健康研究之統計工具, 因有許多文獻認為肥胖與癌症之間有相關性, 乳癌也是其中一種 在停經後婦女, 若其 BMI 較高, 其乳癌風險也會增加 (Eliassen et al., 2006), 可能原因有 2 種, 一是因體內脂肪組織會將雄性激素 (androgen) 轉換為雌性激素, 而使停經後婦女血清中雌性激素較高 (Key et al., 2003); 另一可能原因是因肥胖會使 SHBG (sex hormone-binding globulin) 含量減少, 而增加血清中游離之雌性激素 (Bernstein and Ross, 1993), 使乳癌風險上升 但也有學者研究發現在女性中 BMI 增加會導致因氧化壓力傷害造成的 8OHdG 減少 (Mizoue et al., 2007), 故有可能影響乳癌之風險 更有文獻認為在停經前的婦女, 高 BMI 會降低乳癌風險 (Friedenreich, 2001; Huang et al., 1997), 根據研究結果顯示, 在年輕時肥胖, 可能會使青春期較晚來, 而減少雌性激素之暴露時間 ; 而另一項可能因素為在停經前婦女 BMI 過高, 會有較多之無排卵週期 (anovulatory cycles) 較低之卵巢荷爾蒙濃度及較低之 (IGF)-I (insulin -like growth factor) (Schernhammer et al., 2007; Tworoger et al., 20 06), 但近期關於 BMI 研究結果顯示,BMI 與乳癌風險無直接關係 (Gi bson et al., 2010), 故 BMI 與乳癌風險相關性或許與人種 生活環境有密切影響 而在 2007 年 Mizoue 等人研究指出, 在亞洲國家發現 B MI 與 DNA 損害有呈現負相關之趨勢, 其認為可能原因為 BMI 較低者, 其基礎代謝率相對較高, 導致粒線體產生較多的 ATP, 而產生 A TP 的過程中因為呼吸作用也會產生較多的活性氧物質而導致氧化壓力上升, 並進一步傷害 DNA (Loft et al., 1992; Mizoue et al., 200 7) 家族乳癌病史 (Family History ) 乳癌家族史是最重要的風險因子, 所有乳癌個案中, 將近 5% 和基因有關, 其中又有 25% 的個案是在 30 歲之前便被診斷出罹患乳癌 (Thull and Vogel, 2004), 且有文獻指出約有 80%~90% 之遺傳性乳癌皆為 BRCA1 以及 BRCA2 所引起 (Thull and Vogel, 2004) 目前已知腫瘤抑制基因 BRCA1 與 BRCA2 如突變將增加乳癌罹患風險 (Antoniou et al., 2008) BRCA1/BRCA2 基因之突變皆為自體顯性遺傳, 在家族性乳癌 / 卵巢癌症族群中, 一旦 BRCA1 或 BRCA2 基因產生突變, 其家 4

20 族子代中 ( 包含男性 ) 皆有 50% 左右之機會帶有此突變基因, 並且這些家族罹患卵巢癌 子宮內膜癌之比例也會相對地提高 (Nelson et al., 2005) 因此有學者研究指出一級親屬有罹患乳癌, 則此家族女性之乳癌風險有顯著增加 (Phipps et al., 2011) 目前, 歐美學都一致認為, 如果在家族中有得到乳癌, 而且有 BRCA1 或 BRCA2 等基因變異, 其一等親之婦女一定要接受有關 BRCA1 或 BRCA2 之基因篩檢 抽菸 一般認為吸菸有害健康導致疾病發生,2011 年最新研究發現, 從不吸菸女性與目前尚有吸菸女性比較發現, 目前吸煙者在乳腺癌增加 16% 風險 (HR,1.16;95%CI, )(Laurie Barclay., 2011) 但也有許多研究持有保留態度, 如日本學者研究指出, 不論主動吸菸, 或被動吸菸 ( 二手煙 ) 皆與乳癌風險無統計上顯著相關 故此一部份或許也因人種, 基因型等不同而有所差異 2.2 雌性激素與其代謝途徑 雌激素是一類主要的女性荷爾蒙, 包括雌酮 雌二醇等 雌二醇是最重要的雌激素, 雌激素主要由卵巢分泌, 少量由肝, 腎上腺皮質, 乳房分泌 懷孕時, 胎盤也可大量分泌 而其結構主要是由一個芳香族 A 環 (aromatic A ring) 在 C-3 位置連接一個氫氧基 (hydroxyl gruop) 及在 C-13 位置上連接一個甲基 (methyl group) 雌性激素主要包括雌素酮 (estrone) 雌素二醇 (estradiol) 及雌素三醇 (estriol) 圖 2-2 雌激素之中最主要之雌二醇結構式 5

21 雌性激素在女性的生殖系統 懷孕期間扮演非常重要之角色, 甚至影響皮膚 骨骼 心血管與免疫系統等之功能與發展, 而雌性激素代謝 ( 如圖 3) 主要是藉由細胞色素 Cytochrome P450 1A1 及 1B1 等酵素催化體內雌性激素芳香族環之氫氧根, 將其水解形成高親電子性 (electrophilicity) 之 16α-OHE1 2-OHE2 及 4-OHE2, 而此三種活性代謝物可與雌性激素受體或 DNA protein 等巨分子進行胼合反應, 形成 DNA 或 protein adducts, 而 2-OHE2 及 4-OHE2 亦可藉由 catechol-o-methyltransferase(comt) 抑制酵素代謝生成較低活性之 2-methoxy estradiol(2-meo-e2) 及 4-methoxy estradiol(4-meo-e2) 二種產物, 這兩種化合物很快就會經由尿液排出 (Wang sl.,2006), 因此 COMT 對人體而言是一個重要的保護性酵素, 但若缺少或沒有足夠之 COMT 時,2-OHE2 及 4-OHE2 則會氧化形成最終產物 E2-2,3-Q 及 E2-3,4-Q, 此時若體內沒有足夠之 GSH-S-transferase quinone reductase 及 CYP reductase, 則會生成大量極具親電性之 E2-2,3-Q 及 E2-3,4-Q, 並與 DNA 或 protein 等巨分子發生胼合反應, 形成 DNA 或 protein adducts, 此胼合物已被證實與人類罹患乳癌 前列腺癌及其它癌症有關 6

22 . OH 2-methoxy estradiol R Fe 2+ R H 2 O 2 HO E 1 : R, =O E 2 : R, -OH R MeO HO HO HO HO COMT 2-OHE 1 (E 2 ) P450 1A/3A P450 1B1 OH 4-OHE 1 (E 2 ) COMT R R R P450 peroxidases or P450 reductase peroxidases or P450 P450reductas HO O HO E 1 (E 2 )- 2,3-SQ Quinone Reductase O E 1 (E 2 )- 3,4-SQ R R SOD O -. O 2 2 peroxidases or P450 P450 reductase O O peroxidases or P450 P450 reductase O 2 O 2 -. SOD O Glutathione conjugates E 1 (E 2 )- 2,3-Q O GSH S-transferase R E 1 (E 2 )-3,4-Q Glutathione conjugates R DNA GSH S-transferase DNA H 2 N HN HO HO N O N N OH NH 2 N OH N N N N NH 2 2-OHE 1 (E 2 )-6-N3Ade N N N R R 4-OHE 1 (E 2 )- 1 N 3 Ade + HO H 2 O 2 OH HO OMe 4-methoxy estradiol. OH Fe 2+ 4-OHE 1 (E 2 )-1-N7Gu Depurinating Adducts 圖 2-3 雌性激素之代謝途徑 (Cavalieri et al., 2006) 7

23 2.3 雌性激素與乳癌風險 雌性激素所誘發之致癌機轉, 是透過雌性激素與其相對應之受體 (estrogen receptor,er) 在細胞內互相鍵結, 進而改變基因轉錄 細胞之生命週期 (cell cycle) 細胞增生 (cell proliferation) 與細胞凋亡 (apotosis) 之失衡 (imbalance) 因此長期暴露於雌性激素, 可能會促進已帶有突變之乳房管道上皮細胞 (initiated cells) 有過度增生之風險, 持續累積之突變將能導致癌症之發生, 因此雌性激素過去被認為在乳癌的致病機轉上扮演促進因子 (promotor) 的角色, 且雌性激素也被 IARC 歸類為人類確定致癌物, 因有許多研究證實, 過量之雌性激素則可能誘發疾病與癌症的產生, 例如乳癌與子宮頸癌等 (Tapiero et al., 2002), 美國國家衛生研究所 (National Institute of Health) 的婦女健康促進計畫 (Women s Health Initiative) 下, 曾針對 歲婦女進行大型隨機試驗, 共計隨機 8,506 名婦女作為實驗組, 進行荷爾蒙替代療法, 服用雌激素 (Estrogen) 與黃體素 (Progestin), 另外 8,102 名婦女作為控制組, 服用安慰劑 追蹤 5.2 年後, 發現實驗組婦女罹患侵入性乳癌的風險為 (Hazard ratio)1.27(95% 信賴區間 )(Rossouw et al., 2002) 因此有許多學者研究中都會將停經前以及停經後分開討論, 就是因為雌性激素的影響甚巨 2.4 氧化 DNA 損害反應 一般而言, 哺乳類動物細胞不斷地曝露於內生性及外來環境之致基因毒性物質而造成各種形式的 DNA 損害, 包括藉由烷化作用 (alkylating agent) 離子輻射 (ionizing radiation) 與氧化過程而形成傷害, 氧化壓力所造成的 DNA 損害包括氧化鹼基損害和醣的磷酸化 (sugar-phosphates), 其中又包含 DNA 單股斷鏈 (single strand breaks,ssb)(caldecott, 2003a) 或導致雙股斷鏈 (double strand breaks)( 鄰近的單股斷鏈可能經由複製過程造成雙股斷鏈 ) DNA 受到的損害可能直接由游離輻射 (Ionizing Radiation) 的照射所造成, 或是經由游離輻射引發自由基產生二次傷害, 而外來物質的干擾也會造成 DNA 損害反應, 例如戴奧辛 (dioxin) 多氯聯苯等物質, 內生性物質如雌性激素醌類代謝物也會與 DNA 鍵結造成傷害, 例如 8-OHdG (8-Oxo-2'-deoxyguanosine) 就是體內自由基攻擊 DNA( 由一個羫基 -OH ( 自由基的一種 ) 接在鳥嘌呤 ( 簡稱 G) 的第 8 個碳上而形成 ( 圖 2-4)) 無論是原核或真核細胞皆會持續的暴露到內因性或者是外因性物質而造成 DNA 損害 這些 DNA 損害經由刺激而快速的被偵測到, 其次活化一種複雜的訊息路徑, 此訊息路徑稱作 DNA 損害反應 (DNA damage response) 而當 DNA 損害反應達到一定程度後會進而活化細胞週期的檢 8

24 查點 (check points) 並啟動合適的 DNA 修復途徑, 或者是使細胞走向程序化死亡 (apoptotic programs) DNA 損害反應是一種分層的程序並經由一連串的步驟而被執行, 首先 DNA 受到損害後經由感應蛋白 (sensor proteins) 而被偵測出來, 此感應蛋白 (sensor proteins) 可偵測出 DNA 本身的損害或染色質改變以反映 DNA 的損害 接著, 傳感器 (transducers) 被帶進反應中以傳達損害訊息到下游的效應器 (effectors), 藉由此分層關係將受損的 DNA 能順利導向修復程序中或其他程序 ( 如圖 2-5)(Bartek and Lukas, 2007; Iliakis et al., 2003; Zhou and Elledge, 2000) 根據研究學者發現白血球內之 DNA 氧化壓力損傷 (8-OHdG) 大約是 (2.4±1.01)/10 6 dg (Nakajima et al., 1996), 白血球主要防禦機制為產生超氧陰離子 ClOH 與過氧化氫等方式氧化外來細菌之細胞膜使其死亡, 但這些物質也是常見之氧化壓力來源, 故白血球細胞內有較高之氧化壓力 (Babior et al., 1973) 圖 2-4 常見之氧化傷害 8-Oxo-2'-deoxyguanosine 9

25 圖 2-5 DNA 損害反應之信號傳導通路輪廓 (Zhou and Elledge, 2000) 2.5 去鹼基核酸 ((Apurinic/Apyrimidinic Sites,AP sites) 去鹼基核酸即為 abasic sites apurinic/apyrimidinic sites 或 AP sites, AP sites 是 DNA 損害中最常見的一種形式 ( 約佔 90%)( 表 2-2) (Swenberg et al., 2011), 其形成原因主要為, 具反應能力之活性氧分子可藉由直接去除 DNA 上五碳醣 (ribose) 上之氫原子 (hydrogen abstraction), 生成 3 - 或 5 - 斷裂之氧化去鹼基核酸 (3 - or 5 -cleaved oxidized AP site), 在各種形式的 DNA 損傷當中, 最後會形成具有醛基 (aldehydic group) 構造者, 則通稱為醛基核酸損害 (Aldehydic DNA Lesions, ADL) ADL 主要有三種形式 : Abasic site (AP site) Aldehydic sugar lesions 與 Aldehydic Base lesions(b reen and Murphy, 1995), 如圖 2-6 所示 Nakamura 等人利用醛基反應探針與開環之 AP site 形成共價鍵結, 進而定量出活體外自發性的 AP site 產生之數量, 根據研究指出, 在氧化壓力環境下內源性的氧化傷害最主要為 AP site (30,000 AP site 細胞 / 天 ) (Swenberg et al., 2011) 而其他內生性核酸損害之數量如表 2-2 所示, 而根據上述 Swenberg 學者研究結果顯示, 去鹼基核酸之每天生成量 (30000/ 天 ) 大約為氧化壓力所生成之 DNA 損害 ( 例 : 8-oxo-dG )(2400/ 天 ) 之 12 倍 世界其他學者對於細胞及動物實驗之 AP s 10

26 ites 研究整理於表 2-3 在雌性激素代謝過程中, 其代謝產物 2-hydroxyestr adiol 4-hydroxyestradiol estradiol-2,3-quinone 及 estradiol-3,4-quinone 都為具親電子性物質, 容易與帶負電的 DNA protein 或脂質等物質鍵結形成胼合物 (adducts), 進而造成細胞損害 其中 estradiol-2,3-quinone 及 estra diol-3,4-quinone 皆會與 DNA 鍵結形成 AP sites (Lin et al., 2003); 醌類代謝物被 P450 reductase 還原的過程稱為氧化還原循環 (redox-cycling), 在此過程中會產生反應性氧物種 (reactive oxygen species, ROS), 而 ROS 之產生會進一步造成脂質過氧化 (lipid peroxidation) 蛋白質過氧化 (protein peroxidation) 及 DNA 損害等氧化傷害, 使 DNA 形成 AP sites 與 8-hydroxy guanine (8-oxo-dG)( 圖 2-7), 最新研究顯示, 當細胞進行複製時,DNA 上即使有 AP sites 之損傷, 複製叉還是能推動過去 (Chastain et al., 2010) 表 2-2 在穩定狀態下細胞內生性 DNA 損害數量 (Swenberg et al., 2011) Endogenous DNA lesions Number per cell Abasic sites 30,000 N7-(2-Hydroxyethyl)guanine (7HEG) 3,000 8-Hydroxyguanine 2,400 7-(2-Oxoethyl)guanine 1,500 Formaldehyde adducts 960 Acrolein-deoxyguanosine 120 Malondialdehyde-deoxyguanosine 60 N 2,3-Ethenoguanine (εg) 36 1,N 2 -Ethenodeoxyguanosine (1,N 2 -εdg) 30 1,N 6 -Ethenodeoxyguanosine (1,N 6 -εda) 12 Total 38,118 11

27 5' O O OH O 3' a. Abasic site HN O H N O - O P O O O O P O OH H O - O O b. Aldehydic sugar lesions N H 2 N NH R R=DNA sugar c. Aldehydic base lesion 圖 2-6 醛基核酸損害 (Aldehydic DNA Lesions, ADL):a. Abasic site (AP site) b. Aldehydic sugar lesions c. Aldehydic base lesions. (Breen and Murphy, 1995) 12

28 表 2-3 細胞及動物實驗之 AP sites 研究 種類 標的器官 AP sites (per 10 6 nucleotides) Reference Lung, Kidney, Liver, Testis 8 ~ 9 Heart ~16 Rat Colon ~18 Nakamura et al., 1999 Brain ~28 Nasal respiratory epithelium ~19 Dog Olfactory bulb, Hippocampus, cerebellum ~4 Garciduenas et al., 2003 Frontal cortex, Left cardiac Ventricle, Lungs 6~7 Avian DT40 cells Cells ~6 Chastain et al.,

29 圖 2-7 雌激素醌類代謝物之氧化還原導致 DNA 損傷之各類形成途徑 ( 劉氏 2011) 14

30 2.6 去氧核糖核酸之修復 (DNA Repairs) 機制 DNA 修復為活細胞中經常運行的一種機制, 使 DNA 維持完整結構並執行其任務 根據研究指出基因體容易受到如輻射線 (X-ray 紫外光 短波長之射線 ) 外生性傷害 (exogenous damage) 內源性物質的傷害攻擊 (endogenous damage), 導致 DNA 受損, 如沒有經過適當的修復機制, 就有可能導致突變進而引發疾病 ( 如 : 癌症 )(Jackson and Bartek, 2009), 因此突變產生的頻率反映了 DNA 損害數量和修復數量之間的平衡 常見的單股 DNA 修復機制主要分為以下幾種 :(1). 直接修復機制 (direct damage reversal) (2). 鹼基切除修復 (Base excision repair,ber) (3). 核苷酸切除修復 (nucleotide excision repair,ner) (4). 錯誤配對修復 (Mismatch repair, MMR) (5). 單股 DNA 斷裂修復 (Single strand break repair, SSBR) 氧化壓力所造成的核酸損害主要的修復機制為 BER 以及 NER 為主, 故以下針對此兩種 DNA 修復機制說明 : 鹼基切除修復 (Base excision repair,ber): BER 主要是針對核酸上較小程度之鹼基受損修復機制 (1-10 nucleotides) ((Sancar et al., 2004)), 其受損之機制主要是由於 ROS 所產生之脫嘌呤 / 脫嘧啶位置 (apurinic/apyrimidinic site,ap site) 氧化核酸鹼基 (Oxidised DNA base) 或游離輻射照射至核酸所引發的核酸損害 (Shikazono et al., 2009) BER 修復過程主要分為以下兩部分 (Sancar et al., 2004)( 圖 2-8): (a) 短片段 : 辨認 (recognition) 與鹼基移除 (base removal): 當 DNA 被專一性的去氧核醣核酸基解酶 (DNA glycosylases) 辨認出受損之鹼基位置時, 其會將鹼基與去氧核醣間的醣苷鍵 (N-glycosidic bond ) 水解, 使鹼基移除而形成 AP sites (1) 切除 (incision): 當形成 AP sites 後, 醣苷酶相關之裂解酶就會將 DNA 的雙股結構打開並將 3 端之磷酸雙酯鍵水解, 此時第一類之脫嘌呤 / 脫嘧啶核酸內切酶 (Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1) 會來將 5 端之磷酸雙酯鍵水解掉而形成一個缺口 (gap), 接著 APE1 會招來 DNA 聚合酶 β(dna polymerase β,polβ) 使 DNA 聚合酶佔據此缺口 (2) 填補 (ligation): 當此缺口被 DNA 聚合酶佔據時,Polβ 會和 XRCC1(X-ray repair cross complementing group 1) 以及 DNA 黏合酶 ( Ligase) Ⅲ 形成複雜的聚合物而後將正確的核苷酸填補此缺口, 最後再由 DNA ligase 黏合兩端 15

31 (b) 長片段 : 剛開始等同短片段, 去氧核醣核酸基解酶先將損壞之鹼基去除形成 AP site, 此時 APE1 會先將 5 端之磷酸雙酯鍵水解掉, 而 DNA 聚合酶 δ(dna polymerase δ,polδ) 會和細胞增生抗源 (Proliferating cell nuclear antigen,pcna) 複製因子 C(Replication factor C,RFC) 及皮瓣結構特異性內切酶 (Flap structure-specific endonuclease 1, FEN1) 等蛋白質形成聚合物, 此種聚合物結構能夠方便其在 DNA 結構上自由移動使其完成修復功能, 最後經 DNA 黏合酶 Ⅰ 將原先 APE1 切除位置黏接上 16

32 圖 2-8 鹼基切除修復機制 (BER) 之流程圖 (Sancar et al., 2004) 17

33 2.6.2 核苷酸切除修復 (nucleotide excision repair,ner): NER 主要是修復暴露輻射線或化學品等對於 DNA 所造成之傷害, 且相較於 BER 而言, 修復的片段也較長 ( 約 30 核苷酸 ), 例如經由紫外光照射而造成 DNA 的損害產物包括環丁烷嘧啶雙體 (cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs) 6-4 嘧啶光產物 (6-4 photoproducts, 6-4PPs) 與胸腺嘧啶二聚物 (thymine dimers, T-T dimers) 核苷酸切除修復之基本步驟是 :(A) 損壞識別,(B) 雙切口包圍病變位置, 形成一個 NT 的聚合物 ( 真核生物 )(C) 釋放切除之聚合物 (D) 修復合成 ( 填補 )(E) 黏合, 如將其細分又可分為兩大類 : (1) 全面基因體修復 (Global genome repair,ggr) (2) 轉錄複合修復 (Transcription couple repair, TCR) 兩者最大差別在於 GGR 為當 DNA 受到輻射線照射產生像胸腺嘧啶二聚物 (T-T dimmers) 時 XPC-hHR23B 聚合體即會鍵結在受損的位置, 並且吸引 TFIIH 聚合體等物來完成後續之修復, 而如果受損區是位於轉綠的那一股, 則 DNA 聚合酶無法通過, 此時 CSA 和 CSB 會和 TFIH 聚合體一起修復, 這個即稱為 TCR(Fuss and Cooper, 2006)( 圖 2-9) 圖 2-9 核苷酸切除修復 (NER) 之流程圖 (Fuss and Cooper, 2006) 18

34 2.7 基因多型性 (Genetic Polymorphism) 人類基因體是由 23 對染色體組成, 其中包括 22 對體染色體 1 條 X 染色體和 1 條 Y 染色體 人類基因組含有約 30 億個 DNA 鹼基對, 鹼基對是以氫鍵相結合的兩個含氮鹼基, 以胸腺嘧啶 (T) 腺嘌呤 (A) 胞嘧啶 (C) 和鳥嘌呤 (G) 四種鹼基排列成鹼基序列, 其中 A 與 T 之間由兩個氫鍵連接,G 與 C 之間由三個氫鍵連接, 其中一部分的鹼基對組成了大約 到 個基因 染色體相同位子的基因稱為對偶基因 (allele), 雖然是控制相同功能的基因, 但是其 DNA 序列組成卻可能有所差異, 這即稱為基因多型性 (Genetic Polymorphism), 而其中最廣泛被人研究之基因多型性為僅有一個鹼基不同之對偶基因, 稱作單一鹼基多型性 (Single Nucleotide Polymorphism,SNP), 雖然此種變異並不會導致極嚴重之影響, 但卻會對該變異基因所影響的表現型有些許差異, 像是有研究指出, 人類眼睛有藍 咖啡 黑等各種顏色, 大部分皆和 OCA2 這組基因上的 SNP 位子有關 ( 如 Arg 305 Trp 等 )(Duffy et al., 2007), 而本研究所研究之 SNP 大多與乳癌密切相關, 如雌性激素之相關代謝 SNP 核酸損害修復之 SNP CYP1A1 之功能及其基因多型性 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1) 是細胞色素 P450 家族其中之一基因, 位於染色體 15q22- Q24, 共有 5987 個鹼基對長和 512 個氨基酸的蛋白質, 文獻指出有 19 個已確定之基因多態性 (Sowers et al., 2006), 而其產生之 CYP1A1 蛋白質主要能將多環芳香烴物質 (PAHs) 和雌性激素轉化為環氧化物而產生最終致癌物且基因表現也會受到 AhR(aryl hydrocarbon receptor) 調控 (Ma and Lu, 2007), 故也能將雌性激素 2 號位子進行氧化 CYP1A1 基因之 SNP 位子皆有許多研究文獻, 如 CYP1A1 第 426 號胺基酸位置由 Ile 變異為 Val 之變異, 就被認為會增加子宮肌瘤之風險 ( 中國婦女 )(Ye et al., 2008) CYP1A1T6235C 此變異位於 3 端之非編碼區, 在核苷酸序列上第 6235 號鹼基由胸腺嘧啶 (thymine) 變異為胞嘧啶 (cytosine) 被認為和乳癌風險增加有關 (Miyoshi and Noguchi, 2003) 本研究所選擇之 SNP 為 CYP1A1 T3801C, 此變異位置雖位於非編碼區, 但根據文獻指出位於非編碼區之序列雖不會直接改變轉譯之胺基酸, 卻會間接藉由改變 mrna 之表現 位置 時間等影響其基因表現 (Tabor et al., 2002), 有文獻指出此變異位置會使酵素之活性增加 (Taioli et al., 1999) 以及停經後婦女隻乳癌風險上升 (Huang et al., 19

35 1999) CYP1B1 之功能及其基因多型性 CYP1B1 為人體內的一種氧化酵素, 是肝臟解毒的工具之一, 它帮助身體代謝可能導致癌症的化學物質, 但也可能活化某些化學物質, 反而使其變成致癌物質之前驅物, 例如 : 多環芳香烴 (PAH) 及雌性激素物質, 在解毒過程中會被 CYP1B1 活化, 產生活性物質或自由基而造成 DNA 之損害 (Shimada et al., 2001) 本研究所選擇之 CYP1B1 之 SNP 位置為 Leu 432 Val( 第 432 個密碼子上由白胺酸 (leucine) 變為纈胺酸 (valine)), 此變異具文獻指出可能會影響 mrna 穩定性或轉錄調控序列之連鎖不平衡 (Cartegni et al., 2002), 此外也有多篇文獻指出此位置變異時, 可能會導致雌性激素代謝之改變 (Aklillu et al., 2002; Hanna et al., 2000; Li et al., 2000; Paracchini et al., 2007), 另有文獻指出此變異會導致乳癌風險上升 ( 白種人且抽菸女性 )(Sillanpaa et al., 2007), 而中國婦女則有 Leu/Leu 基因型在停經後會有較高之乳癌風險, 但此 SNP 無明顯影響日本之婦女 (Zheng et al., 2000), 也有文獻認為 CYP1B1 基因型, 不影響乳癌風險, 但也許對停經後並使用荷爾蒙藥物之女性有影響 (Rylander-Rudqvist et al., 2003) 20

36 表 2-4 各種 CYP1A1 與 CYP1B1 基因多型性與酵素活性之影響修改自 ( 劉., 2011) Gene Mutation Function effect Disease Reference CYP1A1 T3801C in non-coding region Increased activity Breast cancer (Huang et al., 1999; Shin et al., 2007) CYP1B1 (Ile 462 Val) Increased activity/inducibility Lung cancer (Ala 48 Gly) Decreased activeity Breast and endometrial cancer (Leu 432 Val) Increased activity Breast, endometrial cancer (Asn 453 Ser) Increased activity Breast cancer (Sugimura et al., 1998); (Larsen et al., 2005) (Zimarina et al., 2004) (Diergaarde et al., 2008; Mitrunen and Hirvonen, 2003; Zimarina et al., 2004) (Delort et al., 2010) 21

37 2.7.3 APE1 之功能及其基因多型性 脫嘌呤 / 嘧啶核酸內切酶 1 類 (Apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease 1,APE1), 主要功能為當 DNA 醣基化酶將受損之鹼基移除後, APE1 經由一個簡單的親核醯基取代反應 (Nucleophilic acyl substituti on) 將核苷酸上 5 端之磷酸骨幹水解切除, 使其產生一段缺口 ( 圖 2-1 0), 再配合其他蛋白質完成修復工作 ( 圖 2-8) 圖 2-10 APE1 切除 5 端磷酸骨幹示意圖 目前大部分之 AP 內切酶之基因多型性研究主要都集中在 APE1 D 148 E, 此變異為第 148 胺基酸位子由於鹼基從 T 突變為 G, 導致 DN A 轉譯胺基酸從天冬胺酸 (Aspartic acid,d) 轉為谷胺酸 (Glutamic aci 22

38 d,e), 根據研究指出在健康人中此位置變異會導致輻射特定 DNA 修復速率以及 DNA 氧化損傷修復率有顯著下降 (Vodicka et al., 2007), 有文獻發現 APE1 D 148 E 此位置變異會明顯延長細胞 G2 期並且降低 D NA 修復速率 (Hu et al., 2002; Vodicka et al., 2007), 且研究發現乳癌患者 cell-cycle(g2) 期的延遲是一種低外顯性的乳癌風險因子, 而 G 2 期延遲又跟輻射敏感性有關, 故一般認為 APE1 之 DNA 修復速率降低, 應會導致 DNA 較易突變使乳癌風險上生, 但有研究意外發現在某些亞洲國家 ( 泰國 ) 此位置變異反而會導致乳癌風險降低且有保護作用 (Sangrajrang et al., 2008), 而造成此位置變異有保護作用之原因有學者認為 APE1D 148 E 此位置變異時, 已知會阻礙有絲分裂進而導致細胞 G2 期延遲且修復作用效率降低, 這兩種皆容易使細胞啟動凋亡機制而非累積 DNA 傷害造成突變 (Sangrajrang et al., 2008) 但在此位置對於歐美國家之白種人卻有不同之結果, 如 Zhang 於 2006 年所發表之研究結果顯示, 此位置變異對於乳癌風險無明顯差異 (Zhang, 200 6), 但 Smith 於 2008 年研究結果卻顯示, 單一變異 (D/E) 之基因型會有顯著的乳癌風險下降 (Smith et al., 2008) 此位置及其他 APE1 位置之變異對於其他種類之癌症風險影響, 如下表 2-4 所示 23

39 表 2-5 各種 APE1 基因多型性與癌症風險之相關性 Gene Mutation Risk Effect Disease Reference Decreased risk Breast cancer (Sangrajrang et al., 2008; Smith et al., 2008) T2197G Asp 148 Glu (rs ) No significant effect Breast cancer (Zhang, 2006) No significant effect Lung cancer (Li et al., 2011; Lo et al., 2009) APE1 Decreased risk bladder cancer (Mittal et al., 2011) No significant effect Prostate cancer (Mittal et al., 2011) T141G (rs ) Decreased risk Lung cancer (Li et al., 2011; Lo et al., 2009; Lu et al., 2009) Increased risk Renal cell carcinoma (Cao et al., 2011) 24

40 2.7.4 XRCC1 之功能及其基因多型性 XRCC1(X-ray repair cross complementing group 1) 是一種參與鹼基缺失修復的基因, 轉譯出能修復單股螺旋壞損的摺疊蛋白質 (scaffolding protein) 它能與一些 DNA 修復蛋白質作用, 包括二磷酸腺苷核糖聚合酶 (poly(adp-ribose) polymerase) DNA 連接酶 3(DNA ligase 3) 和 DNA 聚合酶 ß(DNA polymerase ß)(Caldecott et al., 1996; Sancar et al., 2004) 目前對 XRCC1 的構造了解其有三個明顯的球狀區域, 其中之一為 N-terminal domain (NTD), 稱為 NMR 且為與 DNA polβ 的接觸位置 ; 而另外兩種為 BRCT domain, 稱為 BRCT1 及 BRCT2, 分別位於中心和 C-terminal 終點 ; 於 DNA 單股斷鏈的修復程序中, BRCT2 會與 Ligase III 鍵結並穩定之, 此過程發生於細胞週期的 G0/G1 期間 ; 而 BRCT1 與 DNA 單股斷鏈 (single strand break, SSB) 的辨認蛋白 PARP-1 鍵結, 並負調控 (down regulate)parp-1 的活性, 此過程發生於細胞週期的 G1 和 S/G2 期間 (Caldecott, 2003b; Mackey et al., 1997; Marintchev et al., 1999; Marintchev et al., 2000; Pleschke et al., 2000; Vidal et al., 2001) XRCC1 最常被研究之單一核苷酸多型性 (single nucleotide polymorphisms, SNP) 位置在 XRCC1 第 之密碼子鹼基變異而導致胺基酸改變 (Arg 194 Trp Arg 280 His Arg 399 Gln) Arg399Gln 多型性位於二磷酸腺苷核糖聚合酶與 BRCT-I 黏合的區域, 所以這個多型性被廣泛的研究在它的功能, 以及它與癌症發生的相關性, 而 Arg194Trp 和 Arg280His 的多型性則是發生在辨識細胞核增殖的抗原黏合區域 目前雖然有文獻發現在亞洲國家 Arg399Gln 位置變異會增加乳癌風險 (Zhang, 2006), 但也有許多不同之結果 (Loizidou et al., 2008; Moullan et al., 2003), 台灣在 2004 年也有學者研究此變異位置, 其結果雖有增加乳癌風險但不具有顯著性 (95%CI: ), 但由於其樣本數相較於歐美等國較少, 故還是可持續追蹤此位置之研究, 並配合核酸損害來篩選出乳癌風險因子 2009 年一篇 review 中整合數十篇全世界研究 XRCC1 三種位置 (Arg194Trp Arg399Gln Arg280His) 之研究報告發現,XRCC1 Arg399Glu 之基因型變異會增加乳癌風險 (OR=1.12; 95%CI = ), 單看亞洲人方面為 (OR=1.25; 95%CI = ), 美國人則為 (OR=1.80 ; 95%CI = ), 但另外兩位置之基因多型性並無發現與乳癌風險有明顯相關 (Huang et al., 2009) 25

41 圖 2-11 人類 XRCC1 蛋白質與其 BER 修復蛋白質之相互作用 NTD: N-terminal domain; NLS: nuclear localisation signal OGG1 之功能及其基因多型性 hogg1 (human 8-Oxoguanine glycosylase) 主要是負責切除因氧化壓力 (ROS) 而產生之 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG)DNA 傷害 (J anssen et al., 2001), 而最常被研究與乳癌有關之單一鹼基基因多型性位置為 hogg1 Ser 326 Cys(rs ), 它是一種胺基酸替代, 位於第 7 個 exon 上 1245 G to C, 導致轉錄的氨基酸在 326 密碼子位置上由第 326 個胺基酸絲氨酸 (Ser) 變異為半胱氨酸 (Cys)(Weiss et al., 2005), 功能研究表明,326Cys 等位基因會降低 DNA 修復活性 (Koh no et al., 1998) 並增加患癌症的風險, 如乳腺癌 (Choi et al., 2003; Sangrajrang et al., 2008), 結腸癌 (Kim et al., 2003) 與肺癌 (Hung, 2 005), 雖然有許多文獻指出, 此位置變異會增加乳癌風險, 但也有許多不同研究結果甚至還有保護作用 (Romanowicz-Makowska et al., 20 08; Synowiec et al., 2008) 2010 年一篇 review 中整合了十篇研究此位置進行討論, 其發現變異型的 326Cys 並無明顯增加乳癌風險 (OR =1.02; 95%CI = ), 如果細分人種, 則發現歐洲人此位置變異會導致乳癌風險下降 (OR=0.71;95%CI = ), 亞洲人則是無明顯差異 (Yuan et al., 2010) 26

42 表 2-6 各種 XRCC1 及 hogg1 之基因多型性與癌症風險之相關性 Gene Mutation Risk Effect Disease Reference Arg194Trp (rs ) No significant effect Breast cancer (Huang et al., 2009) XRCC1 Arg280His No significant effect Breast cancer (Huang et al., 2009) (rs25489) Increased risk Overall cancer risk (Hu et al., 2005) Arg399Gln Increased risk Breast cancer (Zhang, 2006) (rs25487) No significant effect Breast cancer (Loizidou et al., 2008) Increased risk Breast cancer (Choi et al., 2003; Sangrajrang et al., 2008) hogg1 Ser326Cys (rs ) No significant effect Increased risk Breast cancer Lung cancer (Romanowicz-Makowska et al., 2008; Synowiec et al., 2008) (Hung et al., 2005) 27

43 第三章 實驗架構與設計 3-1 實驗架構 本研究主要目的為探討台灣地區女性乳癌患者體內之白血球細胞核中去鹼基核酸背景值與雌性激素代謝活化基因 (CYP1A1 CYP1B1) 去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 (APE1) 之相關性研究, 並在加入 BMI 年齡等乳癌風險因子一同做探討 特定目標一 : 乳癌風險因子之年齡及 BMI 與 AP sites 之相關性研究 28

44 特定目標二 : 乳癌風險因子之基因多型性與 AP sites 之相關性研究 特定目標三 : 氧化壓力對於 AP sites 之影響 29

45 3-2 實驗設計 女性乳癌患者之全血樣本由彰化基督教醫院所提供, 全血經由離心機分離血漿 (plasma) 與血球 (complete blood cell count) 後再利用 ficoll 分離血球中之紅血球與白血球 ( 主要為嗜中性白血球 ), 其後萃取白血球細胞核之 DNA, 並藉由此 DNA 分析樣本之雌性激素代謝活化基因 (CYP1A1 CYP1B1) 與去氧核醣核酸修復基因 (APE1) 之基因多型性及核酸損害之去鹼基核酸 (AP sites) 背景值 圖 3-1 實驗設計流程 30

46 第四章實驗材料與方法 4.1 實驗設備與材料 設備 Minifold II Manifold Slot-Blot (Catalog No ) 即時定量聚合酵素鏈鎖反應器 (Roche LightCycler1.5) 分光光度計 (Cary 100) 滾輪式混合器 (Stovall Rol-115) 迴旋振盪器 (KS) 核酸電泳膠體照像系統 (Gel Doc 2000)(Bio-Rad) 恆溫乾浴器聚合酵素鏈鎖反應器 (GeneAmp PCR system 9700) 真空烘箱超音波震盪器 (Branson 3510) 酸鹼值測定儀 (Suntex SP-701) 微量高速離心機 (Hitachi Mikro 20) 材料 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yloxy (TEMPO)(Aldrich, Catalog No.21400) Albumin from bovine serium (BSA)(Sigma, Catalog No.A7906) Aldehyde reactive probe (ARP)(Dojindo, Lot No.VL609) 31

47 Ammonium acetate (NH 4 OAc)(USB, Lot No ) Calf thymus DNA (Sigma, Catalog No.D1501) Casein (Sigma, Catalog No.C7078) Cell lysis buffer (QIAGEN sciences, Lot No ) Enhancde-chemiluminescence reagent (ECL reagent)(amersham, Lot No. 152) Ethanol absolut (Riedel-de Haën, Lot No.22550) Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma, Catalog No.E5134) Ficoll (Pharmacia ) Gel blot paper (Whatman, Catalog No ) HybProbe mix (Roche) Isopropanol (Sigma, Catalog No.I9516) LightCycler Capillaries (Roche) LightCycler Fast-Start DNA Master HybProbe (Roche, Catalog No ) Nitrocellulose membrane (NC membrane)(whatman, Catalog No ) Polyoxyethylenesorbitan monolyaurate (Tween 20) (Amresco, Catalog No.0777) Primer mix (Roche) Protein precipitation solution (QIAGEN sciences, Lot No ) Putrescine (Sigma, Catalog No.P7630) RNase A (Sigma, Catalog No.R4642) Sodium chloride (NaCl)(Aldrich, Lot No.31434) 32

48 Streptavidin peroxidase label (HRP)(BioGenex Lot No.HK ) Tris (Amresco, Lot No.2098B302KG23, Catalog No.0826) Tris-Base (USB, Catalog No.0826) Tris-HCl (USB, Lot No ) Trisodium citrate (Sigma, Catalog No.S4641) X-ray film (Kodak, Catalog No ) 定影液 (Kodak, Catalog No ) 離心管 (50 ml Falcon 15 ml Corning) 顯影液 (Kodak, Catalog No ) 4.2 研究族群 本實驗所收集之 DNA 樣本由 2009 年五月至 2010 年六月共計 194 位女性乳癌患者, 經過篩選扣除慣性吸菸 喝酒及化療後所得 148 位女性乳癌患者, 先前實驗室已分析 81 位患者, 而本實驗將繼續完成剩餘 67 位女性乳癌患者之樣本, 其年齡介於 歲, 平均年齡為 53 歲, 血液採集及分離由彰化基督教醫院合作協助處哩, 每位受試者皆已簽署受試者同意書, 並經彰基人體試驗委員會審核通過 此次新研究之 SNP 位置 APE1Asp 148 Glu 總共研究人數為 148 位 ( 包含實驗室先前所分析之乳癌患者 ), 詳細 BMI 與年齡資料如表

49 表 位乳癌患者之年齡 BMI 資料 Female breast cancer patients (n=148) Age (years) BMI (kg/m 2 ) Mean Median Range 實驗方法 全血分離 將全血血液以 g (2000rpm) 離心 15 分鐘分離血漿 (plasma) 與血球, 離心後會分上層與下層, 上層為血漿, 下層為血球, 將上層淡黃色血漿取出分裝至 600μl tube 在下層之血球中加入相同體積之 saline (0.9% NaCl), 混合均勻, 並將其沿管壁緩緩地倒入裝有 ficoll 之離心管, 以 g (2000rpm) 離心 20 分鐘分離紅血球與白血球 ( 主要為嗜中性白血球 ), 離心後會分四層, 由上而下分別為 saline buffy coat ficoll 及紅血球, 白血球即存在於 buffy coat 中 將 saline 及 buffy coat 取出, 並放入有 10 ml 1X PBS 的離心管, 吸取時避免吸到 ficoll 吸出的 saline 及 buffy coat 以 g (2000rpm) 離心 5 分鐘, 離心後將上層液倒掉, 再加入 300μl 1X PBS 回溶, 並保存於 -80 冰箱 ( 圖 4-1) 而此全血血液分離步驟由彰化基督教醫院協助處理 34

50 圖 4-1 全血血液分離流程 核酸萃取 此方法參照 Nakamura 等人所提列之方法 (Nakamura et al., 1998), 利用 PureGene DNA extraction kit (Gentra Systems, Inc.) 及抗氧化劑 (TEMPO) 進行白血球細胞核內 DNA 之萃取, 以降低萃取過程中核酸氧化損壞作用之背景值上升 其中 TEMPO 將作為抗氧化劑, 並將樣本於步驟進行時避免光線照射及保持低溫 (4 ) 狀態, 且維持 TEMPO 濃度約在 20 mm, 以達到降低背景值之效果 首先在白血球細胞分別加入核糖核酸酶 (RNase A) 及 lysis buffer ( 內含 20 mm TEMPO) 以打破細胞膜並將 RNA 水解避免干擾 DNA 萃取, 再以 protein precipitation solution 將蛋白質沉澱 以 g 4 之條件離 35

51 心 15 分鐘, 上層液即為含 DNA 之溶液 將此溶液與異丙醇 (isopropanol) 混合均勻, 使 DNA 內水分脫除並沈澱, 將沈澱之 DNA 經 70% 酒精均勻洗過後使其乾操, 最後在將 DNA 溶於含 1 mm TEMPO 之無菌水中, 於 4 避光, 待 DNA 溶解後, 以分光光度計 (Cary 100) 測其 O.D. 値 (260 nm), 定量 DNA 濃度後進行 ASB assay 核酸醛基損害分析方法 (Aldehyde Reactive Probe-Slot- Blot assay, ASB assay) 此方法參照 Nakamura 等人所提列之方法 (Nakamura et al., 1998), 自樣本萃取之 DNA 中取 8 μg 於 37 與醛基反應探針 (aldehyde reactive probe, ARP) 反應 30 分鐘 再利用醇類將 DNA 沈澱後, 重新溶於 TE buffer (10 mm Tris,1 mm EDTA,pH 7.2) DNA 經 100 加熱 10 分鐘將 DNA 變性, 再與等體積 2 M 醋酸銨 (Ammonium acetate, NH4OAc) 溶液混和均勻 將與醋酸銨混合均勻之 DNA 利用 Minifold II Manifold Slot-Blot 真空過濾裝置 (vacuum filter device) 固定於硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, NC membrane) 上, 待溶液抽乾後, 將硝化纖維膜以 5X SSC (0.75 M NaCl,0.075 M trisodium citrate) 溶液於 37 混合 15 分鐘, 其後於 80 之真空烘箱乾燥 1-2 小時 隨後硝化纖維膜以含 BSA 20mM Tris-HCl (ph 7.5),0.1 M NaCl, 1 mm EDTA,0.5% casein,0.25% BSA,0.1% Tween 20) 及 10 mm Tris-NaCl 溶液於室溫預先培養 30 分鐘, 之後添加 streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) 於 BSA 溶液中於室溫下培養 45 分鐘 再經沖洗緩衝液 (0.26 M NaCl,1 mm EDTA, 20 mm Tris-HCl,0.1%Tween 20,pH 7.5) 潤溼硝化纖維膜 15 分鐘, 硝化纖維膜上之酵素活性將以 ECL (Enhancde-chemiluminescence) 試劑呈現 硝化纖維膜以 X 光底片曝光, 再以 Gel Doc 2000 數據影像處理分析系統及 Quantity One 軟體系統分析 X 光底片 最後再與 AP sites 之內標準品 (internal standard) 比較以估計待測物中所含有的 AP sites 數目 36

52 O HN S NH O H H O (CH 2 ) 4 C N N C 圖 4-2 ARP 結構式 H C H O NH Putrescine-cleavage assay 此方法參照 Nakamura 等人所提列之方法 (Nakamura and Swenberg, 1999), 自樣本萃取的 DNA 中取 8 μg, 在 1X PBS 存在之環境下與 100 mm putrescine 於 37 反應 30 分鐘, 反應完成後利用醇類將 DNA 沉澱後, 隨後進行 ASB assay 37

53 4.4 單一核苷酸基因多型性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) CYP1A1 T3801C CYP1B1 Leu 432 Val 與 APE1 Asp 148 Glu CYP1A1 T3801C CYP1B1 Leu432Val 與 APE1 Asp148Glu 之分析方式分別參照 Brüning 等人 Harth 等人與 Popanda 等所提列之方法 (Brüning et al., 1999; Harth et al., 2001; Popanda et al., 2004), 利用 Roche LightCycler1.5 進行即時聚合酵素鏈鎖反應 (Real-Time PCR), 並添加 hybridization probe 與 Light-Cycler DNA master hybridization probes kit Hybridization probe 是由兩個短的且相鄰 oligonucleotides 序列片段 其中一個探針在 5' 端標有 Light-Cycler-red 螢光, 在 3' 端磷酸化 ; 另一探針標有螢光素 當此兩探針接近時, 兩探針之間會產生螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET), 部分產生之能量轉移至 Light-Cycler-red 而放出螢光, 而由即時定量聚合酵素鏈鎖反應器偵測放出之螢光並定量 Real-Time PCR 之引子與探針皆由 TIB MOLBIOL 合成, 其序列如表 4-1, 反應條件如表 4-2 表 4-3 與表

54 4.4.2 聚合酵素鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 產 物之定序確認 首先將 Primer 兩端及 Master Mix(GoTaq Green Master) 及 PCR 等級水依比例加入 Tube 中, 接著利用聚合酵素鏈鎖反應器 (GeneAmp PCR system 9700) 進行 PCR 反應,PCR 之引子序列如表 4-1, 反應條件如表 4-5 PCR 產物委外利用 ABI 3730 全自動基因定序儀 (Applied Biosystems) 進行基因型定序分析,DNA 定序結果將與即時定量聚合酵素鏈鎖反應器偵測之 SNP 結果確認 表 4-2 Primers and hybridization probes sequence Gene Primers sequence Hybridization probes CYP1A1 5'-CCTGAACCCCATTCTGTGTTG-3' 5'-CACCTCCCIGGCTCACACGATT-FL-3' CYP1B1 APE1 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGTG-3' 5'-CAGCTTTGTGCCTGTCACTAT-3' 5'-CTTAGAAAGTTCTTCGCCAATG-3' 5'-TTGATGCCTAATGCCTGAAC-3' 5'-GCCGGTACTCCAGTCTA -3' 5'-LCR-CCACCTCAGCCTCTGAGTAGTTGGG-3' 5'-ATGACCCACTGAAGTGACCTAACCC-FL-3' 5'-LCR-AACTTTGATCCAGCTCGATTCTTGGACAA-3' 3'-CAGCCACAATCACCCGGCCTTCCTGA--FL -5'' 3'-LC-CATGCTCCTCCTCGCCTA-P-5' 註 : 標記之位置為變異偵測位置 39

55 表 4-3 Real-Time PCR CYP1A1 T3801C 之反應條件 Cycles Segment Temperatures Times Acquisition model Hot-start min denaturation sec Amplification 37 annealing sec Single extension sec denaturation sec Melting Curve 1 annealing sec melting 85, slope=0.1 /sec 0 sec continue 40

56 表 4-4 Real-Time PCR CYP1B1 Leu 432 Val 之反應條件 Cycles Segment Temperatures Times Acquisition model Hot-start min denaturation sec Amplification 45 annealing sec Single extension sec denaturation sec Melting Curve 1 annealing sec melting 80, slope=0.2 /sec 0 sec continue 41

57 表 4-5 Real-Time PCR APE1 Asp 148 Glu 之反應條件 Cycles Segment Temperatures Times Acquisition model Hot-start min denaturation sec Amplification 45 annealing sec Single extension sec denaturation sec Melting Curve 1 annealing sec melting 85, slope=0.2 /sec 0 sec continue 42

58 表 4-6 PCR 之反應條件 SNP Cycles Segment Temperatures Times denaturation sec CYP1A1 T3801C 37 annealing sec extension sec denaturation sec CYP1B1 Leu 432 Val 45 annealing sec extension sec APE1 Asp148Glu 45 denaturation sec annealing sec extension sec 43

59 4.5 數據分析 實驗之結果,ASB assay 均是二重複,SNP 以即時定量聚合酵素鏈鎖反應器分析, 由定序確認即時定量聚合酵素鏈鎖反應器之分析結果 統計分析是以 Statistical Package for Social Science (SPSS Advanced Statistics version 18.0.) 統計軟體與 Kyplot 軟體 versions 2.0 beta 並經由數據常態分佈檢定 (Kolmogorov-Smirnov,K-S) One-Way ANOVA 相關性 t-test 及 Dunnett s multiple comparison test 勝算比 (odds ratio) 等分析,(*) (**) (***) 分別表示相較於控制組具有差異顯著 (p < 0.05) (p < 0.01) (p < 0.001) 44

60 第五章 實驗結果 5.1 方法偵測極限 (method detection limit, MDL) 與變異係數 (coeff icient of variation, C.V.) 經加熱 / 酸處理過後之小牛胸腺 DNA(calf-thymus DNA) 大約有 300 AP site/10 6 核苷酸, 經稀釋 4 倍後當作 Primary DNA 使用, 並將 Primary DNA 經等體積但未與 ARP 反應之小牛胸腺 DNA 序列稀釋, 以 X 光底片之壓片結果如圖 5-1 所示 內標準品之 AP site 數量利用 Dr. Kubo 發展之 microtiter plate method 定量 由 ASB assay 分析之最低偵測極限經由核酸電泳膠體照相系統之白光半定量得知為 0.25 AP site/10 6 核苷酸, 方法偵測之變異係數 (coefficient of variation, C.V.) 值以小牛胸腺 DNA 為測試樣本, 其結果為 6.6% (n=5) 0.25 AP site/10 6 核苷酸 圖 5-1 ASB assay 法之最低偵測極限 45

61 5.2 Real-Time PCR 與 DNA 之定序結果確認 將 APE1 Asp 148 Glu 以即時定量聚合酵素鍊鎖反應器 (Real-Time PCR) 分析, 並將其結果與隨機抽取各變異型之樣本做比較確認其準確性 委外廠商 ( 源資生技 ) 利用 ABI 3730 全自動基因定序儀進行基因型定序分析, 其分析結果如圖 5-3 CYP 1A1 T3801C 與 CYP 1B1 Leu 432 Val 已由本實驗室先前定序確認其結果無誤 ( 劉氏 2011) Asp/Glu Glu/Glu Asp/Asp 圖 5-2 Real-Time PCR 分析 APE1 Asp 148 Glu 之基因型結果 由 Real-Time PCR 內即時偵測 melting curve(slope=0.2 /sec) 之螢光值, 並將其結果對溫度積分即可得到 Y 軸之值, 可測得三種不同圖型 ( 如圖 5-2) APE1 Asp 148 Glu (T2197G) 之 Asp/Asp (T/T) 之基因型約在 56 會有 peak; APE1 Asp 148 Glu 之 Asp/Glu (T/G) 基因型約在 56 與 65.5 皆會有 peak; APE1 Asp 148 Glu 之 Glu/Glu (G/G) 基因型約在 65.5 會有 peak 46

62 圖 5-3 APE1 Asp 148 Glu 單股基因定序結果 由左而右分別為 APE1 Asp 148 Glu (T2197G) 之 Asp/Asp (T/T) APE1 Asp 148 Glu 之 Asp/Glu (T/G) 與 APE1 Asp 148 Glu 之 Glu/Glu (G/G) 之基因型定序圖譜結果, 由於定序之位置為下方之單股, 故可得知定序結果為 A A/C 與 C 三種結果可推得另一股基因型為 T T/G 與 G, 與 Real-Time PCR 之分析結果經確認為相符 Val/Val Leu/Val Leu/Leu 圖 5-4 Real-Time PCR 分析 CYP1B1 Leu 432 Val 之基因型結果 47

63 T/T T/C C/C 圖 5-5 Real-Time PCR 分析 CYP1A1 T3801C 之基因型結果 5.3 乳癌患者之 AP site 背景值之分析結果 此實驗結果分析 67 位女性乳癌患者 ( 未進行化療 ) 之 AP sites 背景值 ( 平均 ± 標準偏差 ) 為 (25.1 ± 16.1)/10 6 核苷酸, 中間值為 21.9 /10 6 核苷酸其統計結果如表 5-1 表 5-1 乳癌患者白血球細胞核 AP sites 背景值 Breast cancer patients (n=67) Mean (SD) Median Range 25.1 (16.1) 雌性激素代謝活化之基因多型性 將 67 位乳癌患者 ( 新增之乳癌患者 DNA 樣本 67 位 ) 雌性激素代謝活化基因 CYP1A1 T3801C 與 CYP1B1 Leu 432 Val 之基因型分析結果分別呈現於表 48

64 5-2 與表 5-3 CYP1A1 T3801C 之對偶基因變異頻率 (variant alleles frequency) 為 29.9%,CYP1B1 Leu 432 Val 之對偶基因變異頻率為 8.21% CYP1A1 T3801C 之對偶基因變異頻率計算方式 : ( T / C ) + 2 ( C / C ) 2 ( T / T ) + ( T / C ) + ( C / C ) [ ] CYP1B1 Leu 432 Val 之對偶基因變異頻率計算方式 : ( Leu / Val ) + 2 ( Val / Val ) 2 ( Leu / Leu ) + ( Leu / Val ) + ( Val / Val ) [ ] 表 5-2 CYP1A1 T3801C 之基因多型性分析結果 CYP1A1 T3801C T/T T/C C/C Number Polymorphism(%) Variant alleles frequency (%) 29.9% 表 5-3 CYP1B1 Leu 432 Val 之基因多型性分析結果 CYP1B1 Leu 432 Val Leu / Leu Leu / Val Val / Val Number Polymorphism(%) Variant alleles frequency 8.21% 49

65 5.5 去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 將 148 位乳癌患者 ( 包含先前實驗室所保存之乳癌患者 DNA 樣本 ) 去氧核醣核酸修復基因之 APE1 Asp 148 Glu 基因型分析結果呈現於表 5-4 APE1 Asp 148 Glu 之對偶基因變異頻率 (variant alleles frequency) 為 46% APE1 Asp 148 Glu 之對偶基因變異頻率計算方式 : ( Asp / Glu ) + 2 ( Glu / Glu ) 2 ( Asp / Asp ) + ( Asp / Glu ) + ( Glu / Glu ) [ ] 表 5-4 APE1 Asp 148 Glu 之基因多型性分析結果 APE1 Asp 148 Glu Asp / Asp Asp / Glu Glu / Glu Number Polymorphism(%) Variant alleles frequency 46% 5.6 乳癌風險因子 : BMI Age 基因多型性對於 AP site 之結果比較 80 AP sites / 10 6 Nucleotides < 50 years (n=31) 50 years (n=36) 圖 5-6 乳癌患者之年齡對於 AP site 背景值之影響 50

66 利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 再將乳癌患者以年齡區分為小於 50 歲與大於等於 50 歲兩個研究族群, 比較年齡對 AP sites 背景值之影響 此處為 67 位乳癌患者之比較, 第六章將會彙整 148 位乳癌患者之 APsite 背景值做討論 50 AP sites / 10 6 Nucleotides BMI < 27 (n=49) BMI 27 (n=18) 圖 5-7 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 再將乳癌患者以 BMI 區分為小於 27 與大於等於 27 兩個研究族群, 比較 BMI 對 AP sites 背景值之影響 此處為 67 位乳癌患者之比較, 第六章將會彙整 148 位乳癌患者之 APsite 背景值做討論 51

67 (A) AP sites / 10 6 Nucleotides < 50 years (B) 0 BMI < 27 (n=22) BMI 27 (n=9) years AP sites / 10 6 Nucleotides BMI < 27 (n=27) BMI 27 (n=9) 圖 5-8 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 ( 年齡分類 ) (A) 年齡小於 50 歲並以 BMI 區分為小於 27 與大於等於 27 兩個研究族群 (B) 年齡大於等於 50 歲並以 BMI 區分為小於 27 與大於等於 27 兩個研究族群, 利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 比較年齡及 BMI 對 AP sites 背景值之影響 此處為 67 位乳癌患者之比較, 第六章將會彙整 148 位乳癌患者之 APsite 背景值做討論 52

68 80 AP sites / 10 6 Nucleotides T/T (n=31) T/C (n=32) C/C (n=4) 圖 5-9 乳癌患者之 CYP1A1 T3801C 對於 AP site 背景值之影響利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 再將乳癌患者以 CYP1A1 T3801C 區分為 T/T T/C 與 C/C 基因型, 比較 CYP1A1 T3801C 對 AP sites 背景值之影響 此處為 67 位乳癌患者之比較, 第六章將會彙整 148 位乳癌患者之 APsite 背景值做討論 80 AP sites / 10 6 Nucleotides Leu/Leu (n=57) Leu/Val + Val/Val (n=10) 圖 5-10 乳癌患者之 CYP1B1 Leu 432 Val 對於 AP site 背景值之影響 53

69 利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 再將乳癌患者以 CYP1B1 Leu 432 Val 區分為 Leu/Leu Leu/Val 與 Val/Val 基因型, 比較 CYP1B1 Leu 432 Val 對 AP sites 背景值之影響 此處為 67 位乳癌患者之比較, 第六章將會彙整 148 位乳癌患者之 APsite 背景值做討論 (A) 200 (B) AP sites / 10 6 Nucleotides AP sites / 10 6 Nucleotides Asp/Asp (n=29) Asp/Asp (n=10) * Asp/Glu (n=101) Glu/Glu (n=18) * Asp/Glu + Glu/Glu (n=66) Age<50 圖 5-11 乳癌患者之 APE1 Asp 148 Glu 對於 AP site 背景值之影響利用 ASB assay 分析乳癌患者之 AP sites 背景值, 再將乳癌患者以 APE1 Asp 148 Glu 區分為 Asp/Asp Asp/Glu 與 Glu/Glu 基因型, 比較 APE1 Asp 148 Glu 對 AP sites 背景值之影響 此為 148 位乳癌患者樣本之比較, 第六章將會對其討論 圖中 * 表示相較於 Asp/Asp 之研究族群有差異顯著 (p < 54

70 0.05) 5.7 氧化壓力對於 AP sites 背景值之影響 隨機選取 3 個乳癌患者樣本, 將其 DNA 以 AP sites cleavage assay 分析其 AP sites 背景值 結果顯示, 再經過 putrescine 反應切除 DNA 之 3 端後, 約有 63% 之 AP sites 被移除, 代表氧化壓力所造成 5 端之 DNA 損害佔有約 63% ( 圖 5-12) 100 AP sites / 10 6 Nucleotides /putre (n=3) * +/putre (n=3) 圖 5-12 乳癌患者內白血球 DNA 氧化壓力誘發核酸損害之結果 55

71 第六章討論 6-1 AP sites 與年齡 研究結果發現, 年齡小於 50 歲之乳癌患者 AP sites 背景值較大於等於 50 歲之乳癌患者高約 1.6 倍 (p<0.05) ( 圖 6-1), 推測可能原因為婦女停經後, 血清中之雌性激素濃度會較停經前明顯降低, 使致癌性之雌性激素代謝物濃度降低, 因此在大於等於 50 歲之乳癌患者 AP site 背景值較低 ; 另一可能原因為年輕時身體代謝速率較快, 細胞進行有氧呼吸時因電子轉移而形成一些短暫的自由基 (Free Radical), 如超氧化物 (O3) 帶羥基化合物 (OH-) 和過氧化氫 (H2O2), 這些自由基就有機會攻擊細胞 DNA 使其鹼基受損而形成 AP sites 200 AP sites / 10 6 Nucleotides * 0 < 50 years (n=76) 50 years (n=72) 圖 6-1 乳癌患者之年齡對於 AP site 背景值之影響 (n=148) 56

72 表 6-1 乳癌患者之 AP sites 背景值 (n=148) Breast cancer patients (n=148) Mean (SD) 50.3(59.2) Median 26.5 Range AP sites 與 BMI 研究結果發現,BMI 小於 27 之乳癌患者 AP sites 背景值較 BMI 大於等於 27 之乳癌患者高約 1.5 倍 (p<0.05) ( 圖 6-2) 若將乳癌患者先區分年齡大於等於 50 歲及年齡小於 50 歲兩個年齡再比較其 BMI 對於 AP sites 背景值之影響, 結果顯示, 年齡小於 50 歲且 BMI 小於 27 之族群較年齡大於等於 50 歲且 BMI 大於等於 27 之族群高約 3 倍 (p<0.05) ( 圖 6-3), 而在年齡大於等於 50 歲之族群其 BMI 分類並無明顯之 AP sites 背景值差異, 因此我們認為在年齡小於 50 歲時,BMI 對其 AP sites 背景值影響較大, 推測原因可能為 BMI 較小之女性其身體代謝率相較於 BMI 大之女性相對較高, 而細胞內粒線體進行呼吸作用產生 ATP 也較多, 因此產生較多的活性氧物質導致細胞內氧化壓力增加 (Mizoue et al., 2007), 本實驗室先前研究也證實, 人類白血球 DNA 內之 AP sites 主要為氧化壓力所造成 ( 約 80%) ( 劉氏 2011) ; 另一可能因素為在停經前婦女 BMI 如過高, 則會有較多之無排卵週期 (anovulatory cycles) 較低之卵巢荷爾蒙濃度及較低之類胰島素生長因子 (insulin-like growth factor), 而使雌性激素暴露之含量減少 (Mizoue et al., 2007; Tworoger et al., 2006), 此外年齡大於等於 50 歲之 BMI 分類有發現,BMI 大於等於 27 相較於 BMI 小於 27 有較高之趨勢, 但並無統計上之顯著差異, 我們結論符合目前大多數學者研究發現停經前 BMI 較高之女性, 其乳癌風險較低, 而停經後 BMI 上升會導致乳癌風險增加 (Cleary and Grossmann, 2009; Reeves et al., 2007; Sweeney et al., 2004) 57

73 200 AP sites / 10 6 Nucleotides * 0 BMI < 27 BMI 27 (n=110) (n=38) 圖 6-2 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 (n=148) 240 AP sites / 10 6 Nucleotides * < 50 years AP sites / 10 6 Nucleotides years 0 BMI < 27 (n=60) BMI 27 (n=16) 0 BMI < 27 (n=51) BMI 27 (n=22) 圖 6-3 乳癌患者之 BMI 對於 AP site 背景值之影響 ( 年齡分類, n=148) 58

74 圖 6-4 乳癌患者之 AP sites 背景值與年齡及 BMI 之影響 59

75 6-3 雌性激素代謝基因之基因多型性 雌性激素代謝基因 CYP1A1 與 CYP1B1 已被證實會活化某些化學物質, 使其變成致癌物質之前驅物, 例如 : 多環芳香烴 (PAH) 及雌性激素物質, 其產生之活性物質或自由基將造成 DNA 之損害 (Shimada et al., 2001) (Ma and Lu, 2007) 因此希望藉由研究此兩種基因多型性來探討對於 DNA 損害之情形 CYP1A1 T3801C 本研究發現, 相較於西方歐美國家, 亞洲地區之 CYP1A1 T3801C 變異頻率有明顯較高之趨勢, 而我們研究結果也符合亞洲國家之變異頻率 ( 圖 6-4) 研究結果顯示,CYP1A1 T3801C 位置變異, 並無明顯導致 DNA 損害 (AP sites) 較高 ( 分年齡 BMI 亦無 ), 與研究假設不符, 推測可能原因為此基因型變異雖會導致酵素活性增強, 進而增加活性代謝物之含量, 但由於代謝路徑中尚有許多去活化之酵素 ( 如 :COMT GST), 且其造成 DNA 損害也只占其中一部份, 因此未來應研究更多直接影響 DNA 損害之基因型 ( 如修復基因 :XRCC1 hogg1 等 ) 此外台灣 Huang 等人於 1999 年研究發現, 在停經後婦女其 CYP1A1 T3801C 位置變異將會導致乳癌風險上升 ( OR= % CI= ), 但由於其樣本數偏低, 因此本研究將我們所分析之乳癌患者樣本數大於 50 歲以上挑出, 並加入 Huang 學者之停經後之乳癌患者人數以及健康婦女對照組做勝算比 (OR) 分析如表 6-3, 可發現 C/C 之變異型基因相較於 T/T 之原基因型風險上升 1.99 倍, 但由於並無達到顯著差異推測原因是健康婦女樣本數偏低, 因此未來將分析健康婦女之基因型以增加對照組之樣本數 60

76 (A) (B) Polymorphism percentage (%) Polymorphism percentage (%) Taiwan Taiwan (1999) Japan (2002) China (2005) China (2006) Korea (2007) T/T T/C C/C USA (1998) Canada (2001) USA (2004) Nigeria (2005) Germany (2009) T/T T/C C/C 圖 6-5 乳癌患者 CYP1A1 T3801C 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 61

77 表 6-2 CYP1A1 T3801C 之基因多型性分析結果 (n=148) CYP1A1 T3801C T / T T / C C / C Number Polymorphism (%) Variant alleles frequency 35.5% AP sites / 10 6 Nucleotides T/T T/C C/C (n=59) (n=73) (n=16) 圖 6-6 乳癌患者之 CYP1A1 T3801C 對於 AP site 背景值之影響 表 6-3 停經後之乳癌患者與健康婦女對照組之勝算比分析 SNP NO. Controls* NO. Cases* OR(95%CI) T/T (reference) T/C ( ) C/C ( ) * 本研究之乳癌患者人數與 Huang et al.,1999 之乳癌患者與對照組人數一同比較 62

78 6-3-2 CYP1B1 Leu 432 Val 本研究發現, 相較於西方歐美國家, 亞洲地區之 CYP1B1 Leu 432 Val 變異頻率有明顯較低之趨勢, 而我們研究結果也符合亞洲國家之變異頻率 ( 圖 6-5) 研究結果顯示,CYP1B1 Leu 432 Val 位置變異, 並無明顯導致 DNA 損害 (AP sites) 較高 ( 分年齡 BMI 亦無 ), 與研究假設不符, 如同 CYP1A1 之推測可能原因, 中間變因太多, 無法確切反映 DNA 損害量 由於台灣地區目前並無此 CYP1B1 Leu432Val 位置之研究報告, 因此未來如研究健康婦女對照組, 將會探討台灣女性此位置之變異對於乳癌風險之影響, 如同先前文獻回顧所說, 有文獻指出此變異會導致乳癌風險上升 ( 白種人且抽菸女性 )(Sillanpaa et al., 2007), 而中國婦女則有 Leu/Leu 基因型在停經後會有較高之乳癌風險, 因此後續有研究之必要性 63

79 (A) (B) Polymorphsim percentage (%) Polymorphsim percentage (%) Taiwan China (2005) Korean (2003) Leu/Leu Leu/Val Val/Val Caucasian (2011) African American (2011) Turkish (2002) Finnish (2007) Leu/Leu Leu/Val Val/Val 圖 6-7 乳癌患者 CYP1B1 Leu432Val 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 64

80 表 6-4 CYP1B1 Leu432Val 之基因多型性分析結果 (n=148) CYP1B1 Leu432Val Leu / Leu Leu / Val Val / Val Number Polymorphism(%) Variant alleles frequency 13.5% 200 AP sites / 10 6 Nucleotides Leu/Leu (n=128) Leu/Val (n=16) Val/Val (n=4) 圖 6-8 乳癌患者之 CYP1B1 Leu432Val 對於 AP site 背景值之影響 65

81 6-4 去氧核醣核酸修復基因之基因多型性 研究學者建議, 核酸修復能力為乳癌風險因子之一 (Han et al., 2009), 因為如修復酵素活性改變, 將會改變修復速率導致基因突變機率改變, 進而影響乳癌發生機率, 因此研究與核酸修復機制有關之基因 ( 如 : APE1 XRCC1 hogg1 等 ) 為主要之課題 APE1 Asp 148 Glu 本研究發現, 亞洲與歐美人之 APE1 D 148 E 之基因型變異頻率相差不多, 但此次 148 位乳癌受試者之 APE1 變異頻率與台灣 2004 年黃姓學者研究有所差異, 本研究發現 148 位乳癌患者之 APE1 D 148 E 基因之雜合子 (heterozygous Asp/Glu ) 與野生型 (wild type Asp/Asp) 相比有明顯較高之比例, 而 2004 年黃姓學者研究發現此兩者變異所佔比例相差不多 ( 圖 6-8), 造成此原因或許是由於樣本數不足所導致 研究結果顯示,APE1 D 148 E 位置變異, 將會明顯導致 DNA 損害 (AP sites) 較高, 如以野生型 (Asp/Asp) 與變異型 (Asp/Glu + Glu/Glu) 相比, 變異性之 AP sites 背景值高出野生型約 2 倍, 此結果符合研究假設, 推測原因為此位置變異將會導致 APE1 之修復速率降低 (Hu et al., 2002), 因此導致有較多 DNA 損害殘留而被偵測 此外台灣 Huang 姓學者等人於 2004 年研究結果顯示, 如野生型 (wild type Asp/Asp) 與純合子變異型 (homozygous Glu/Glu) 比較其勝算比發現, 變異型罹患乳癌風險雖下降約 30%, 但並無達到統計上之顯著差異 (OR= %CI = ), 因此本研究將加入我們所分析之 148 位乳癌患者基因型人數資料與其乳癌患者及健康對照組做勝算比分析, 其結果如表 6-6, 其結果顯示純合子變異型 (Glu/Glu) 較野生型 (Asp/Asp) 風險低 18% 但也無達到顯著差異 (OR= % CI = ), 可能其樣本數還是較少因此無法達到統計上之顯著差異 但此結果與其他學者研究有相同之處, 如同之前文獻回顧所提, 有研究顯示在某些亞洲國家 ( 泰國 ) 此位置變異會導致乳癌風險降低且有保護作用 (Sangrajrang et al., 2008), 而造成此位置變異有保護作用, 學者認為 APE1D 148 E 此位置變異時, 已知會阻礙有絲分裂進而導致細胞 G2 期延遲且修復作用效率降低, 這兩種皆容易使細胞啟動凋亡機制而非累積 DNA 傷害造成突變 (Hu et al., 2002; Sangrajrang et al., 2008) 66

82 (A) (B) Polymorphism percentage (%) Polymorphism percentage (%) Taiwan Taiwan (2004) Thailand (2008) China (2005) Asp/Asp Asp/Glu Glu/Glu USA (Caucasian) (2006) USA (Caucasian) (2008) USA (Caucasian) (2009) Spain (Caucasian) (2007) Asp/Asp Asp/Glu Glu/Glu 圖 6-9 乳癌患者 CYP1B1 Leu432Val 對偶基因分佈頻率 (A) 亞洲國家 (B) 歐美國家 67