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何封
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1 第 17 卷第 3 期生命科学研究灾燥造援员 7 晕燥援 3 圆园 13 年 6 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Jun. 圆园 13 金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达李磊 1, 杨远柱 2, 刘泓 3, 杜长青 1, 林建中 1, 朱咏华 1, 刘选明 1* (1. 湖南大学生物学院, 中国湖南长沙 4182; 2. 湖南亚华种业科学研究院, 中国湖南长沙 411; 3. 福建农林大学资源与环境学院, 中国福建福州 352) 摘要院利用简并引物和 RT 鄄 PCR 方法从金针菇渊 Flammulina velutipes 冤幼嫩子实体中克隆获得 FvGDH 全长 cdna 序列. 构建入门载体 pgwc 鄄 FvGDH, 利用 Gateway 克隆技术的 LR 反应构建原核重组表达载体 pdestl7 鄄 FvGDH, 转化大肠杆菌 BL21 渊 DE3 冤. 通过 IPTG 法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS 鄄 PAGE 蛋白电泳分析表明, 融合蛋白相对分子质量约为 53 kd, 与预测的一致. 最佳表达条件为温度 3 益尧 IPTG 浓度.4 mmol/l 尧诱导 4h. 融合蛋白表达量较高, 实现了 FvGDH 的高效表达, 并利用 Western blotting 对其特异性进行鉴定. FvGDH 基因高效原核表达体系的成功建立, 为进一步研究 FvGDH 的酶促动力学奠定了基础援关键词 : FvGDH; Gateway 克隆 ; 原核表达 ;SDS 鄄 PAGE; Western blotting 中图分类号 : Q786 文献标识码 : A 文章编号 : 17 鄄 7847 渊 213 冤 3 鄄 23 鄄 8 Cloning of aglutamate Dehydrogenase Gene from Flammulina velutipes and Prokaryotic Expression LI Lei 1,YANG Yuan 鄄 zhu 2,LIU Hong 3,DU Chang 鄄 qing 1, LIN Jian 鄄 zhong 1,ZHU Yong 鄄 hua 1,LIU Xuan 鄄 ming 1* (1. College of Biological Sciences, Hunan University, Changsha 4182, Hunan, China; 2. Academy of Seed Industry of Hunan Yahua, Changsha 411, Hunan, China; 3. College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fujian 352, Fuzhou, China) Abstract:The full 鄄 length cdna sequence of FvGDH gene was amplified from young Flammulina velutipes sporocarp by using apair of degenerate primers and RT 鄄 PCR. Then the cdna sequence was introduced into the vector pgwc for constructing entry vector pgwc 鄄 FvGDH. Finally, the prokaryotic expression vector pdestl7 鄄 FvGDH was obtained by the LR reaction of Gateway cloning system and transformed into E.coli BL21 (DE3). The fusion protein expression was induced by IPTG, and the expression conditions were opti 鄄 mized. SDS 鄄 PAGE analysis indicated that the relative molecular mass of recombinant protein was about 53 kd as expected. The optimal condition for prokaryotic expression was performed at 3 益 for 4hwith.4 mmol/l IPTG. The fusion protein displayed ahigh level among the whole bacterial proteins, which demon 鄄 stratedthatefficient expressionof FvGDH wasachieved. Proteinspecificitywas also confirmed by Western blotting. In summary, an efficient prokaryotic expression system of FvGDH has been successfully established, which providesafoundationforfurtherresearchontheenzymekineticsof FvGDH. Key words: FvGDH; Gateway clone; prokaryotic expression; SDS 鄄 PAGE; Western blotting (Life Science Research,213,17(3):23 耀 237) 收稿日期 : 213 鄄 3 鄄 17; 修回日期 : 213 鄄 5 鄄 2 基金项目 : 国家转基因生物新品种培育重大专项项目 (29ZX81 鄄 3B); 国家自然科学基金面上项目 ( ); 湖南省自然科学基金资助项目 (12JJ324); 植物分子遗传国家重点实验室开放课题和中央高校基本科研业务费湖南大学重大前期培育项目和青年教师科技创新扶持项目资助作者简介 : 李磊 (1986 鄄 ), 女, 湖南邵阳人, 硕士研究生, 主要从事生物化学与分子生物学研究 ; * 通讯作者 : 刘选明 (1963 鄄 ), 男, 湖南邵阳人, 湖南大学生物学院教授, 博士, 主要从事分子生物学分子遗传学和生物纳米技术方面的研究,Tel: 731 鄄 , E 鄄 mail: xml5@hnu.edu.cn.

2 第 3 期李磊等 : 金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达 231 谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase, GDH) [1,2] 是生物界中广泛存在的一种多聚酶, 主要催化琢鄄酮戊二酸还原氨基化和谷氨酸的氧化脱氨 [ 琢鄄酮戊二酸 NH 4 NAD (P)HH 圳谷氨酸 H 2 ONAD (P) ]. 在生物体中, 以 NADP 垣为辅酶的 GDH 作用于谷氨酸的合成, 而以 NADPH 为辅酶的 GDH 则作用于谷氨酸的分解代谢. 目前, 已知的 GDH 可分为六聚体和四聚体两大类, 这两类都是同源多聚体. 其中六聚体分布极为广泛, 在细菌真菌高等动植物中均有报道, 而四聚体仅 [3~5] 发现于几种酵母中援有研究表明,GDH 在合成代谢过程中有可能在同化光呼吸产生的 NH 4 或帮助同化过多的外源 NH 4 援植物虽存在 GDH 基因, 但由于植物 GDH 对 NH 4 的亲和力低, 使得 NH 4 利用途径不能有效进行. 目前, 已出现通过转入外源 GDH 到植物中来修饰 NH 4 同化途径, 从而节省能量及提 [6] 高产量. 其中, 真菌 NADPH 依赖型谷氨酸脱氢酶是用于提高植物氮肥利用率的最有前景的外源 [7] 基因, 也是目前研究的热点. 如王芳和田波利用中间脉孢霉 (Neurospora intermedia)nigdh 基因转化烟草, 发现能促进烟草在低氮水平下的生长. [8] Aoki 等将真菌 GDH 基因转入水稻, 在转基因水稻中发现分蘖数和每穗的小穗数明显增加, 生物量和谷物产量也大幅增加, 特别是在低氮条件下更为明显. 该结果也说明了真菌 GDH 基因的过表达增加了水稻的氮素利用效率援金针菇 (Flammulina velutipes) 又称冬菇朴菰构菌毛柄金钱菌冻菌, 属伞菌目, 白蘑科, 金针菇属. 可食用, 肉质细嫩, 软滑, 味鲜宜人, 目前人工栽培较广泛. 子实体含粗蛋白 31.2%, 脂肪 5.8% 及多种维生素和人体必需氨基酸, 具有极高 [9~12] 的经济和医用价值. 为了寻找能够有效提高水稻氮素利用效率的外源 GDH 基因, 本研究应用 RT 鄄 PCR 技术克隆了金针菇的 GDH 基因, 将其命名为 FvGDH 基因, 构建了原核重组表达载体 pdestl7 鄄 FvGDH. 随后在大肠杆菌 BL21(DE3) 中高效表达了 FvGDH, 并对诱导时间和 IPTG 浓度等参数进行了研究和优化, 成功建立了 FvGDH 的高效原核表达体系. FvGDH 的成功克隆和原核表达为下一步进行水稻的转化和其酶促动力学的研究奠定了基础援 1 材料和方法 1.1 材料金针菇 (Flammulina velutipes) 由福建农林大学王宗华博士友情提供 ; 菌株 E.coli DH5 琢和 E.coli BL21(DE3) 为本实验室保存 ; 入门载体 pgwc( 图 1A) 和表达载体 pdestl7( 图 1B) 为本实验室保存援 1.2 方法 FvGDH 的克隆将金针菇接种种菌于马铃薯培养基在 22 耀 23 益暗处培养 7 耀 14 d, 使营养菌丝充分发育, 随后置于容积为 1 ml 的三角瓶进行低温 17 益培养, 微弱散射光线处继续培养 24 d, 培养形成成熟的 [13~15] 子实体援取约.1 g 左右幼嫩金针菇子实体, 液氮中研磨成粉末, 用购买于 Invitrogen 公司的 Trizon 试剂盒提取总 RNA. 然后用购自 TAKARA 的 RT 鄄 PCR 试剂盒逆转录所提取的 RNA 以获得相应的 cdna. 具体方法见相关公司的试剂盒说明书. 通过 GenBank 查询并找到已经测序的 GDH 基因的 Eag 玉 (2764) Ahd 玉 (2758) attl1 Apa 玉 (2649) SP6 M13-47 Afl 域 (2568) rmb T2 rmb T1 Aat 域 (2291) Nhe 玉 (2269) Xba 玉 (2876) pgwc 2978bp ccdb Pst 玉 (214) Ahd 玉 (221) Xba 玉 (227) attl2 Pst 玉 (344) T7 RV-M Bsp HI(415) T7 RBS ATG 6xHis attr1 Cm R ccd 月 attr2 T7 贼藻则皂 pdest TM bp puc origin CmR Sac 域 (1491) 图 1 Fig.1 入门载体 pgwc 渊 A 冤和 pdest17 原核表达载体渊 B 冤的图谱 Map of entry vector pgwc and prokaryotic expression vector pdest17

3 232 生命科学研究圆园 13 年保守区, 然后利用 Primer Premier 5. 软件设计简并性引物扩增 FvGDH 的 CDS 序列. 其简并引物序列为 FvGDH 鄄 F (5 忆鄄 ATGTCCCACCTGCCTTTC 鄄 GARCCNGARTT 鄄 3 忆 ) 和 FvGDH 鄄 R(5 忆鄄 CCCCACC 鄄 AGTCACCCTGGTCRTGCATNGC 鄄 3 忆 ; 下划线为 pgwc 载体所需要增加的碱基 ), 引物由上海生工生物技术有限公司合成.PCR 反应体系为 1 伊 PCR buffer( 含 Mg 2 )5 滋 L, 25 mmol/l dntps 1 滋 L, 引物 GDH 鄄 F 和引物 GDH 鄄 R 分别为 1 滋 L, 5U/ 滋 L Taq 酶.5 滋 L, 模板 2 滋 L, 加去离子水补足 5 滋 L. PCR 程序为 94 益预变性 5min, 94 益变性 3 s, 56 益复性 3 min, 72 益延伸 l.5 min, 共 35 个循环 ;72 益延伸 1 min. 1. % 琼脂糖凝胶电泳检 [16] 测. 然后按照 Chen 等的方法将 FvGDH 克隆进 Gateway 入门载体 pgwc 中, 送上海生工测序鉴定援 FvGDH 蛋白的生物信息学分析利用网络服务器 ExPASy 和 SignalP 4. GENEDOC Cluster X 等生物信息学软件对 FvGDH 蛋白进行生物信息学分析, 推测该蛋白的氨基酸组成相对分子质量大小疏水性和信号肽等信息援 FvGDH 原核表达载体构建 Gateway 技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统, 包含了 BP 和 LR 两个重组反应 ( 具体见 Invitrogen 公司的说明书 ). BP 重组将目的基因转入入门载体中形成入门克隆.LR 重组可以将插入的目的基因很方便地连入目的表达载体. 由于 pgwc 既是 TA 克隆载体, 又是 [17] Gateway 入门载体, 所以入门载体 pgwc 鄄 FvGDH 就可以省去 Gateway 克隆的 BP 重组步骤, 直接进行 LR 重组反应.LR 反应体系为入门载体 pg 原 WC 鄄 FvGDH 质粒 75 ng, 表达载体 25 ng, LR 反应缓冲液 ( 含 LR 酶 ).5 滋 L, 加双蒸水补足 5 滋 L, 25 益过夜. 将 LR 反应产物转化 E.coli DH5 琢, 并涂布培养于含 1 mg/l 氨苄青霉素的 LB 平板培养基,37 益培养过夜. 挑取单克隆, 菌液鉴定阳性克隆, 提取阳性克隆的原核表达载体质粒 pdestl7 鄄 FvGDH 援工程菌的获得将提取的原核表达载体质粒 pdestl7 鄄 FvGDH 转入宿主菌 BL21(DE3) 中, 涂布于含 1 mg/l 氨苄青霉素的 LB 固体平板培养基上,37 益倒置过夜. 随机挑取单菌落, 以引物 FvGDH 鄄 F 和 FvGDH 鄄 R 做菌落 PCR 鉴定. 获得工程菌并命名 BL21(DE3) 鄄 pdestl7 鄄 FvGDH 援重组蛋白的原核表达及诱导表达条件优化接种单克隆阳性工程菌 BL21(DE3) 鄄 pdestl7 鄄 FvGDH 于含氨苄青霉素 (Amp 1 滋 g/ml) 的 LB 液体培养基中培养,37 益振荡培养至 OD 6 值达.4 耀.6 左右. 加入 IPTG 至终浓度为.4 mmol/l 进行诱导表达,3 益下诱导 4h 后收集菌液, 未加 IPTG 诱导的 BL21(DE3) 空菌菌液作为阴性对照. 用 1 r/min 离心 1min 收集菌液, 并用 Binding Buffer 按照 l 颐 1 的比例对离心沉淀进行稀释. 取 5mL 稀释后的菌液进行超声波破碎, 然后以 1 r/min 的转速离心 1 min 分离上清和沉淀. 取 1mL 上清, 在上清和沉淀样品中分别加入 1 滋 L1 伊 SDS 上样缓冲液, 沸水浴 1 min. 取 l 滋 L 上样进行 SDS 鄄 PAGE (5.% 浓缩胶,12. % 分离胶 ) 电泳, 然后分析蛋白表达结果援 1)IPTG 浓度的优化选定诱导时间为 4h; 诱导温度为 3 益. 加入终浓度分别为和 1. mmol/l IPTG 诱导表达,SDS 鄄 PAGE 电泳鉴定表达情况援 2) 诱导时间的优化选定诱导 IPTG 浓度为.4 mmol/l; 诱导温度为 3 益. 诱导和 8h 后, 进行 SDS 鄄 PAGE 电泳鉴定表达情况援重组蛋白的纯化及 Western blot 鉴定根据 Ni 鄄 NTA Agrose ( 购自 Invitrogen) 说明书进行目的蛋白的纯化. 将纯化的目的蛋白经上样处理后进行 SDS 鄄 PAGE 电泳, 利用 Bio 鄄 Rad 半干转膜仪将电泳分离的蛋白胶转到 PVDF 膜上, 5.% 的脱脂奶粉封闭过夜, 用 PBST 洗涤. 加 2 倍稀释的鼠源 His 标签抗体, 孵育 l 耀 2h 后,PBST 洗涤 3 次, 每次 5min. 加入 5 倍稀释的辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠 IgG, 室温杂交 1 耀 2h, PBST 洗涤 3 次, 每次 5min. 然后在 PVDF 膜上加入 Western 发光检测液 A B 各 5 滋 L, 进行显影反应援 2 结果与分析 2.1 FvGDH 的克隆及其生物信息学分析以引物 FvGDH 鄄 F 和 FvGDH 鄄 R 从金针菇的 cdna 中进行 PCR 的特异扩增, 经电泳检测得到大小约为 135 bp 的特异条带图 (2B), 与预期目的片段大小一致. 采用 Gateway 技术将 PCR 产物

4 第 3 期李磊等 : 金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达 233 与 pgwc 载体进行 BP 反应,25 益连接过夜. 次日将连接产物转化大肠杆菌感受态 DH5 琢, 涂布 1 mg/l 氨苄青霉素的 LB 固体平板 37 益过夜培养. 挑取单克隆菌斑做菌落 PCR 鉴定, 得到条带清晰, 大小约为 135 bp 的目的条带 ( 图 2C), 说明已成功构建了入门克隆. 将阳性入门克隆挑选 1 个送上海生工测序进一步验证, 测序结果表明我们获得了正确的 FvGDH 的 cdna 序列援利用生物信息学数据库和互联网软件, 分析 FvGDH 的编码序列. FvGDH 蛋白的理化性质预测显示, 该蛋白含 2 种氨基酸 ( 表 1), 其中亲水性氨基酸占 38.5%, 疏水性氨基酸占 43.7%, 酸性氨基酸占 7.3%, 碱性氨基酸占 12.8%, 且含有 6 个含硫氨基酸 Cys, 说明 FvGDH 蛋白中存在二硫键援疏水性是每种氨基酸所固有的特性, 这种特性和其它的一些因素决定了一个蛋白质最终折叠成的三维构象. 利用 ExPASy 的 ProtScale 程序预测 FvGDH 最大值为 1.878, 最小值为从 ( 图 3A) 可以看出, 该蛋白各肽段平均疏水值都不太高, 没有明显的疏水性. 利用 SignalP 4. Server 蛋白信号肽蛋白预测服务器对 FvGDH 编码蛋白进行分析, 结果 ( 图 3B) 显示该蛋白 N 端不含信号肽序列援利用 Cluster X 软件对 FvGDH 基因大肠杆菌 GDH 基因和水稻 OsGDH 的 cdna 核苷酸序列进行序列比对, 结果显示 FvGDH 基因与大肠杆菌 GDH 基因同源性较高, 水稻 OsGDH 与前两者序列相比同源性较低 ( 图 4). 利用 Genedoc 软件对 FvGDH 大肠杆菌 GDH 和水稻 OsGDH 的氨基酸序列比对分析, 结果表明 FvGDH 与大肠杆菌 GDH 的氨基酸序列相似度较高, 而水稻 OsGDH 与前两者序列相比相似度较低 ( 图 5). 因此可以推知, 真菌 FvGDH 基因与大肠杆菌的 GDH 基因进化关系较近, 与水稻植物 OsGDH 基因进化关系较远援 bp 5 鄄 UTR FvGDH His tag 3 鄄 UTR M C M (C) M 1 2 图 2 FvGDH 基因的克隆及原核表达工程菌的构建渊 A 冤 pdest17 鄄 FvGDH 原核表达重组质粒示意图 ; 渊 B 冤 FvGDH cdna 克隆.M: DNA Marker, 1: FvGDH cdna 的 PCR 产物 ; 渊 C 冤 pdest17 鄄 FvGDH 重组质粒转化大肠杆菌渊 DH5 琢冤菌液 PCR 鉴定.M: DNA Marker, 1 耀 6: 不同的阳性单克隆,C: 阴性对照 ; 渊 D 冤 pdest17 鄄 FvGDH 重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3) 菌液 PCR 鉴定.M: DNA Marker; 1 耀 2: 不同的阳性单克隆援 Fig.2 Cloning of FvGDH gene and construction of prok 鄄 aryotic expressive engineering bacteria 渊 A 冤 Diagram of recombinant expression vector pdest17 鄄 FvGDH; 渊 B 冤 Cloning of FvGDH cdna. M: DNA Marker, 1: PCR product of FvGDH cdna; 渊 C 冤 Bacteria liquid PCR of recombinant vector pdest17 鄄 FvGDH transformed into E.coli DH5 琢.M: DNA Marker, 1~6: Different positive mono 鄄 clones, C: Negative control; 渊 D 冤 Bacteria liquid PCR of recombinant vector pdest17 鄄 FvGDH transformed into BL21 (DE3). M: DNA Marker, 1~2: Different positive mono 鄄 clones. bp bp (D) Table 1 表 1 FvGDH 蛋白的组成 Theaminoacids compositionof FvGDH protein Amino acid Ala Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) Gly(G) Numbers Proportion/(%) Amino acid His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Numbers Proportion/(%) Amino acid Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V) Pyl(O) Sec(U) Numbers Proportion/(%) 工程菌的获得对测序正确的菌株抽提质粒, 得到 pgwc 鄄 FvGDH, 采用 Gateway 技术加入 pdestl7 载体, 以获得带有组氨酸标签的 His6 鄄 FvGDH 融合蛋白 ( 图 2A). 将入门载体 pgwc 鄄 FvGDH 与原核表达载体 pdestl7 进行 LR 反应,25 益过夜. 次日将反应产物转化大肠杆菌感受态 DH5 琢, 涂布 1 mg/l 氨苄青霉素的 LB 固体平板 37 益过夜培养. 菌落 PCR 鉴定阳性克隆, 得到条带清晰, 大小约为 135 bp 的目的条带 ( 图 2C), 说明 FvGDH 已经成功重组到原核表达载体 pdestl7 中. 将阳性克隆的重组质粒 pdestl7 鄄 FvGDH 转化入宿主菌

5 ProtScale output for user sequence Hphob./kyte &Doolittle 生命科学研究圆园 13 年图 3 FvGDH 蛋白生物信息学分析结果疏水性分析 ; N 端信号肽分析. Fig.3 Bioinformaticsanalysis of FvGDH protein Hydrophobic analysis; Signal peptide analysis. SignalP 鄄 4.1 prediction(euk networks):sequence C 鄄 score S 鄄 score Y 鄄 score MSHLPFEPEFEQAYKELVSTLESSTLFEKNPEYRKALEVVSIPERVIQFRVVMEDDSGKCQVNKGYRVQF Position 图 4 Fig.4 FvGDH 基因尧大肠杆菌 GDH 基因和水稻 OsGDH 的核苷酸序列比对 Nucleotide sequence alignment of FvGDH, E.coli GDH and OsGDH

6 第 3 期李磊等 : 金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达 235 图 5 Fig.5 FvGDH 基因尧大肠杆菌 GDH 基因和水稻 OsGDH 的氨基酸序列比对 Amino acidsequence alignment of FvGDH, E.coli GDH and OsGDH BL21(DE3) 中, 随机挑选 4 个菌落, 做菌落 PCR, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析,PCR 产物条带大小均约为 135bp( 图 2D), 说明将重组质粒 pdestl7 鄄 FvGDH 成功转入了原核表达菌株 BL21(DE3) 中, 获得了含有重组质粒 pdestl7 鄄 FvGDH 的工程菌援 2.3 FvGDH 的原核表达及可溶性分析为确定目的蛋白的表达形式, 将 BL21(DE3) 鄄 pdestl7 鄄 FvGDH 工程菌经过 IPTG 诱导后,1 r/min 离心 1min, 收集菌体进行超声破碎细胞, 分别取上清和沉淀进行 SDS 鄄 PAGE. 结果显示, 上清中几乎不含表达蛋白, 诱导表达的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中 ; 与未加 IPTG 的阴性对照相比, 沉淀中在相对分子质量约为 5 kd 的地方出现明显的蛋白富集区, 与预期的理论值相符援 2.4 FvGDH 蛋白原核表达的条件优化为得到大量的重组蛋白, 对重组蛋白的表达条件进行了优化. 初选诱导时间为 4h, 诱导温度为 3 益, 加入不同终浓度的 IPTG 诱导表达. SDS 鄄 PAGE 结果表明,IPTG 的浓度在诱导蛋白表达时有明显差异 ( 图 6A), 于是试验中选用.4 mmol/l 作为 IPTG 诱导浓度. 初选诱导时间定为 4h, IPTG 浓度为.4 mmol/l. 选定 IPTG 浓度为.4 mmol/l, 温度为 3 益, 采用不同的诱导时间. SDS 鄄 PAGE 结果表明, 诱导 2h 后便出现蛋白的富集, 随着时间的延长富集量也有明显增加, 在 4h 蛋白表达量达到最高 ( 图 6B), 6h 以后蛋白的表达量下降, 表达量也保持在相同的程度. 因此确定最佳的诱导表达时间为 4h. 根据以上结果, 确定该重组蛋白的最佳诱导表达条件为 IPTG 终浓度.4 mmol/l 3 益诱导 4h 援 2.5 FvGDH 蛋白的纯化及 Western blot 鉴定根据 Ni 鄄 NTA Agrose( 购自 Invitrogen) 说明书进行目的蛋白的纯化 ( 图 7A), FvGDH 蛋白的相对分子质量是 kd, 在 N 端加入的 6 个组氨酸标签的相对分子质量为 3.71 kd, 因此整个融合蛋白的相对分子质量为 52.7 kd. 为了进一步检测纯化的蛋白是否为目的蛋白, 将纯化的目的蛋白进行 SDS 鄄 PAGE 电泳, 用 HRP 标记的 His 抗体进行 Western 印迹检测. 以空菌 BL21(DE3) 做阴性对照.Western blotting 结果显示, 纯化后的蛋白在相对分子质量 52.7 kd 处均出现特异性反应条带 ( 图 7B), 与预期相符, 而阴性对照则无条带出现. 证实该融合蛋白为 His6 鄄 FvGDH 融合蛋白援 3 讨论 Gateway 克隆技术是一种新发展起来的克隆技术, 是克隆和亚克隆 DNA 序列的一项新颖的通用系统, 它同时具有限制性内切酶和连接酶的作用, 大大精简了克隆的步骤, 便于功能基因的分析和蛋白质的表达. 与传统的克隆技术相比, 其优点是 : 这种重组技术不仅高效并且保持了基因定位和阅读框架 ; 其次它代替了限制性内切酶和连接酶的作用, 大大精简了克隆的步骤, 克隆效率高达 95% 或更高. 当基因在目的表达载体之间快速简便地穿梭时, 还可以保证正确的方向和阅读框. 另外 Gateway 也有助于进行带不同数目

7 236 生命科学研究圆园 13 年 M kd kd h 4h 6h 8h M 图 6 原核表达条件的优化结果浓度的优化.1: 阴性对照 ;2~6:.2 尧.4 尧.6 尧.8 尧 1. mmol/l IPTG 诱导表达产物 ;M: 蛋白相对分子质量 Marker. 时间的优化.M: 蛋白相对分子质量 Marker; 2 尧 4 尧 6 尧 8hIPTG 诱导表达产物. Fig.6 Results of prokaryotic expression optimization Optimization of the concentration. 1: Negative control; 2~6: Expression products with.2,.4,.6,.8, 1. mmol/l IPTG; M: Protein Marker. Optimization of the time. M: Protein marker. 2, 4, 6, 8hexpression products with IPTG kd M C 1 C 图 7 FvGDH 融合蛋白的纯化渊 A 冤及 Western blotting 鉴定渊 B 冤 FvGDH 融合蛋白的纯化.M: 蛋白质相对分子质量 Marker; C 1 和 C 2 为阴性对照 ;1~4 分别经 2 尧 3 尧 4 尧 5 mmol/l 咪唑洗脱纯化的重组蛋白. FvGDH 融合蛋白的 Western blotting 鉴定.1: 空菌总蛋白 ;2: 总蛋白 ;3: 纯化后的 His6 鄄 FvGDH 上清总蛋白. Fig.7 Purification of FvGDH fusion proteinand We 鄄 stern blotting Purificationof FvGDH fusion protein. M: Protein Marker; C1 and C2: Negative control; 1~4: Purified fusion protein by 2, 3, 4, 5 mmol/l imidazole elution. 渊 B 冤 Western blottinganalysisof FvGDHfusionprotein. 1: Emptybacteria protein; 2: Total protein; 3: Purified supernatant total protein of His 6 鄄 FvGDH 纯化和检测标签的表达. 基于以上考虑, 本实验采取了 Gateway 的方法来构建 FvGDH 原核表达 [18~2] 载体援谷氨酸脱氢酶普遍存在于植物体内, 在植物氮代谢中起着重要作用. 然而来自植物体内的 GDH 对 NH 4 具有很高的 Km 值 (1 耀 8 mmol/l), 使得 NH 4 利用途径不能有效进行. 通过转入外源 GDH 到植物中来修饰 NH 4 同化, 提高植物氮肥利用率, 从而节省能量及提高产量, 已经成为一种 [21] 研究趋势. 如 Schmidt 等利用小球藻 gdh 基因转化小麦, 在施用同等数量氮肥条件下经改良的小麦长得更壮大, 增产 3%, 且具有抗除草剂耐盐 [8] 的效果.Aoki 等将真菌 GDH 基因转入水稻, 在转基因水稻中发现分蘖数和每穗的小穗数明显增加, 生物量和谷物产量也大幅增加, 特别是在低氮条件下更为明显. 该结果也说明了真菌 GDH 基因的过表达增加了水稻的氮素利用效率. 由于真菌 GDH 基因可开辟出植物另一条氮素利用途径, 提高氮肥的利用效率, 减少环境污染, 其经济效益十分巨大, 因而成为植物生物工程的研究热点之一. 金针菇 (Flammulina velutipes) 属伞菌目, 白蘑科, 金针菇属, 是一种味美可口用的食用性真菌, 目前人工栽培较广泛. 金针菇氨基酸的含量非常丰富, 高于一般菇类, 具有极高的经济和医用价值. 为了发掘安全和有效的外源 GDH 基因用于提高水稻氮素利用效率, 本研究从金针菇中克隆了谷氨酸脱氢酶基因 FvGDH, 并对其核酸和蛋白序列进行了生物信息学分析. 随后采用

8 第 3 期李磊等 : 金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达 237 Gateway 技术构建了 FvGDH 基因的原核重组表达载体 pdestl7 鄄 FvGDH, 通过优化表达条件在大肠杆菌 BL21(DE3) 中成功原核表达了 FvGDH 蛋白. 但是表达出的 FvGDH 蛋白主要以包涵体的形式存在, 在蛋白纯化前还需将包涵体充分地溶解才能得到纯化目的蛋白. FvGDH 的成功克隆和原核表达为下一步进行水稻的转化和其酶促动力学研究奠定了基础. 目前, FvGDH 基因的水稻转化和其酶促动力学分子正在进行中. 参考文献渊 References 冤 : [1] LAM HM, OLIVEIRA IC, COSCHIGANO KT, et al. The molecular 鄄 genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants[j]. Annual Review of Plant Physiology Plant and Molecular Biology, 1996, 47: 569 鄄 593. [2] 黄国存, 田波. 高等植物中的谷氨酸脱氢酶及其生理作用 [J]. 植物学通报 (HUANG Guo 鄄 cun,tian Bo. The physiological roleofglutamatedehydrogenaseinhigher plants[j].chinese Bul 鄄 letion of Botany), 21, 18(4): 396 鄄 41. [3] LIGHTFOOT DA, BARON AJ, WOOTTON JC. Expression of the Escherichia coli glutamate dehydrogenase gene in the cyanobacterium Synechococcus PCC631 causes ammonium tolerance[j]. Plant Molecular Biology, 1988, 11(3): 335 鄄 344. [4] TEMPLE SJ, KUNJIBETTU S, ROCHE D, et al. Total glu 鄄 tamine synthetase activity during soybean nodule development is controlled at the level of transcription and holoprotein turnover[j]. Plant Physiology, 1996, 112(4): 1723 鄄 [5] LEA PJ, MIFLIN BJ. Alternative route for nitrogen assimila 鄄 tion in higher plants[j]. Nature, 1974, 251(5476): 614 鄄 616. [6] BERNARD P, COUTURIER M. Cell killing by the Fplasmid CcdB protein involves poisoning of DNA 鄄 topoisomerase II com 鄄 plexes[j]. Journal of Molecular Biology,1992, 226(3):735 鄄 745. [7] 王芳, 田波. 中间脉抱霉谷氨酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达 [J]. 科学通报 (WANG Fang, TIAN Bo. Cloning of glutamate dehydrogenase gene from Neurospora in 鄄 termedia and expressed in Escherichiacoli and tobacco[j]. Chi 鄄 nese Science Bulletin), 21, 46(2): 137 鄄 14. [8] ABIKO T, WAKAYAMA M, KAWAKAMI A, et al. Changes in nitrogen assimilation, metabolism, and growth in transgenic rice plants expressing afungal NADP(H) 鄄 dependent glutamate dehydrogenase (gdha)[j]. Planta, 21, 232(2): 299 鄄 311. [9] 申进文, 贾身茂, 吴洁洁, 等. 金针菇营养成分研究 [J]. 中国食用菌 (SHEN Jin 鄄 wen, JIA Shen 鄄 mao, WU Jie 鄄 jie, et al. Study on nutrient content of Flammulina velutipes[j]. Edible Fungi of China), 1997, 16(5): 36 鄄 4. [1] 严茂祥, 陈芝芸, 项柏康, 等. 金针菇多糖对小鼠移植性肿瘤抗瘤效应研究 [J]. 中国中医药科技 (YAN Mao 鄄 xiang, CHEN Zhi 鄄 yun, XIANG Bo 鄄 kang, et al. Laboratory study on the effect of Flammulina velutipes polysaccharide on transplation tumor in mouse[j]. Chinese Journal of Traditional Medical Science and Technology), 1999, 6(6): 379 鄄 38. [11] 吴锦文. 食用菌的医疗保健功能和改善食物结构的作用 [J]. 中国食用菌 (WU Jin 鄄 wen. Functions of edible fungi on health care and food structure improvement[j]. Edible Fungi of China), 23, 22(4): 9 鄄 11. [12] 孙立梅, 金艳梅. 金针菇保健饮料的研制 [J]. 中国食用菌 (SUN Li 鄄 mei, JIN Yan 鄄 mei. Study on health beverage of Flammulina velutipes[j]. Edible Fungi of China), 27, 26(2): 43 鄄 46. [13] 村尾泽夫. 菇类形成的促进物质和诱导物质蛋白酶抑制剂对食用菌类的增产 [J]. 微生物学杂志 (SAWAO M. The pro 鄄 moting substance and inducing substance of mushroom protease inhibitors for yield improvement of edible fungus[j]. Journal of Microbiology), 1986, 6(2): 72 鄄 76. [14] 邢耀国. 金针菇栽培方法 [J]. 特种经济动植物 (XING Yao 鄄 guo. Cultivation methodof Flammulinavelutipes[J].Special Economic Animal and Plant), 212, (9): 4 鄄 41. [15] 熊泽, 邵伟, 李玲, 等. 富硒金针菇菌种的诱变选育 [J]. 三峡大学学报 ( 自然科学版 )(XIONG Ze, SHAO Wei, LI Ling, et al. Mutation breeding of se 鄄 enriched Collybia radicata[j]. Jour 鄄 nal of China Three Gorges University(Natural Sciences)), 24, 26(6): 574 鄄 576. [16] CHEN QJ, ZHOU HM, CHEN J, et al. Using amodified TA cloningmethodtocreateentryclones[j].analyticalbiochemistry, 26, 358 (1): 12 鄄 125. [17] XUAN N, JIN Y, ZHANG HW, et al. Aputative maize zinc 鄄 finger protein gene, ZmAN13, participates in abiotic stress re 鄄 sponse[j].plantcelltissueandorganculture,211,17(1):11 鄄 112. [18] LANDY A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambdasite 鄄 specificrecombination[j].annualreviewofbiochem 鄄 istry, 1989, 58: 913 鄄 941. [19] 张艳霞, 贾海英, 司志飞, 等. 水稻甲基结合蛋白 MBD71 的克隆及原核表达 [J]. 生命科学研究 (ZHANG Yan 鄄 xia, JIA Hai 鄄 ying, SI Zhi 鄄 fei, et al. Cloning of methyl 鄄 binding domain protein gene MBD71 and its prokaryotic expression[j]. Life Science Research), 212, 16(2): 12 鄄 124. [2] 林建中, 杨远柱, 赵小英, 等. 一种优良半矮秆水稻品种的分离与分子鉴定 [J]. 湖南大学学报 ( 自然科学版 )(LIN Jian 鄄 zhong, YANG Yuan 鄄 zhu, ZHAO Xiao 鄄 ying, et al. Isolation and molecular characterization of semi 鄄 dwarf mutations in an elite rice cultivar[j]. Journal of Hunan University(Natural Sciences)), 21, 37(8): 66 鄄 73. [21] SCHMIDT RR, MILLER P, ROBERT R, et al. Polypeptides and polynucleotides relating to the 琢鄄 and 茁鄄 subunits of aglu 鄄 tamate dehydrogenase and method of use[p]. USA, , 1999 鄄 5 鄄 9.

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