JAB_2016_No02

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1 Online system: 农业生物技术学报 01, (): ~ DOI:./j.issn 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 1, 王斌 1,* 昝林森 1 余横伟 刘红 1 殷林 胡晓一 刘大清 1 西北农林科技大学动物科技学院, 杨凌 10; 汉中职业技术学院农林系, 汉中 000; 国家肉牛改良中心, 杨凌 10; 镇巴县 畜牧兽医工作站, 镇巴 00 * 通讯作者,zanlinsen@1.com 摘要为分析秦巴山区西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个黄牛 (Bos taurus) 品种的遗传多样性, 本研究 以蜀宣花牛和郏县红牛作对照, 利用 1 对微卫星引物对 个黄牛品种的 头黄牛个体进行了遗传多样性 检测, 统计了各品种的等位基因及频率 有效等位基因数 遗传杂合度 多态信息含量及各群体间遗传距离, 并对其进行聚类分析 结果表明, 个黄牛品种在 1 个微卫星位点共发现 1 个等位基因, 等位基因频率 为 ~0.1, 总群体各位点平均有效等位基因数为. ~.1 ; 各位点多态信息含量为 0.1 ~ 0. ; 平均杂合度为 0. ~0. 1 群体间发现特有等位基因 11 个, 基因频率为 ~0.1 ; 优势 等位基因 (P>0.)1 个, 基因频率为 0.0 ~0.0 0; 共有等位基因 1 个, 占全部等位基因的.%, 仅有 1 个共有等位基因为优势等位基因 (P>0.), 占.1% 群体间 i's 遗传一致度为 0. ~0.0, 标准遗 传距离 (Ds) 为 0.1 ~0. 聚类分析结果显示, 个黄牛品种聚为 类, 陨巴牛与宣汉牛首先聚在一起, 然后同西镇牛聚在一类 ; 赤崖牛与郏县红牛聚为一类 ; 蜀宣花牛自成一类 研究结果表明,1 对微卫星标 记可用于秦巴山区黄牛遗传多样性的分析, 秦巴山区各黄牛品种遗传多样性丰富, 选育程度不同, 个黄牛 品种虽然地理分布格局相近, 自然环境相似, 但亲缘关系并非相近, 应为来源不同的品种 因此, 西镇牛 赤 崖牛 陨巴牛和宣汉牛不宜合并为 1 个品种 本研究所揭示的秦巴山区黄牛品种的遗传分化特点及亲缘关 系, 为研究品种的遗传共适应特点, 预测杂交优势, 制定育种战略等提供了科学依据 关键词 秦巴山区黄牛, 微卫星 DNA, 遗传多样性 中图分类号 S.+ 文献标识码 A Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area WANG Bin 1, ZAN Lin-Sen 1,* YU eng-wei 1 LIU ong YIN Lin 1 U Xiao-Yi LIU Da-Qing 1 College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 10, China; A&F Department, anzhong Vocation and Technology College, anzhong 000, China; tional Beef Cattle Improvement Center in China, Yangling 10, China; Animal usbandry and Veterinary Station of Zhenba County, Zhenba 00, China * Corresponding author, zanlinsen@1.com Abstract To analyze the genetic diversity of cattle (Bos taurus) species respectively including Xizhen cattle, Chiya cattle, Yunba cattle and Xuanhan cattle in Qinling- Bashan Mountain area, the research chose Shuxuan breed cattle and local varieties of Jiaxian Red Cattle as the control, studied the genetic diversity of cattle individuals from cattle species by using 1 pairs of micro satellite primers to detect the genetic diversity, and analyze the allele and their frequency, the number of effective alleles, genetic heterozygosity, 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 ( 计划 )(No. 01AA0 和 No. 011AA00-0) 国家现代农业产业技术体系 (No. CARS-) 陕西省科技统筹创新工程计划 (No. 01KTZB0-0) 和陕西省科学技术研究发展计划项目 (No. 01NY-1) 收稿日期 :01-0- 接受日期 :01--

2 农业生物技术学报 polymorphism information content and genetic distance among populations, and conducting cluster analysis. The results showed that 1 alleles were found at 1 microsatellite loci in cattle breeds. The allele frequencies ranged from to 0.1 and the average number of alleles per locus ranged from.1 to.. The polymorphism information content of each point ranged from 0.1 to 0.. The average heterozygosity was from 0. to Eleven unique alleles were found among the populations and the gene frequency was from to 0.1. The dominant allele was 1(P>0.) and the gene frequency was from 0.0 to There were 1 common alleles, accounting for.% of all alleles, and only 1 alleles were dominant (P>0.), accounting for.1% of all alleles. Among populations the genetic identity of i's was 0. to 0.0 and the standard genetic distance (Ds) was from 0.1 to 0.. Cluster analysis showed that cattle breeds were clustered into three categories. Yunba cattle and Xuanhan cattle first got together, at the same time with the xizhen cattle gathered in a same class. xt Chiya cattle and Jiaxian Red cattle gathered for second class. At last, Shuxuan cattle was a category alone. The results of research showed that 1 pairs of microsatellite markers could be used for the analysis of genetic diversity of cattle in the Qin-Ba mountain area. The genetic diversity of cattle breeds in the Qin-Ba mountain area was rich, and the degree of breeding was also different. Although the geographical distribution pattern and the natural environment of cattle breeds were similar, their genetic relationship was not close. It was confirmed that cattle breeds were different varieties from different sources. This study provides the scientific basis for researching on the characteristics of genetic co adaptation, predicting heterosis, and formulating breeding strategies. Keywords The cattle in Qinling-Bashan Mountain area, Microsatellite DNA, Genetic diversity 秦巴山区位于陕南 川北 鄂西北三省连界地区, 畜禽地方品种 饲草植被等生物资源从地理位置上看有南北过渡性质, 其种类繁多是一个天然的 基因库 ( 邓银才等, 10) 中国牛(Bos taurus) 品种志编委会 (1) 认为产于四川宣汉 达县等地的宣汉牛, 产于湖北竹山 竹溪等地的陨巴牛, 产于陕西西乡 镇巴 平利 旬阳及商洛等地的西镇牛 平利牛 赤崖牛和岭南牛, 都处于秦巴山区, 其分布区域的生态条件 牛的来源及其外貌特征和特性等相似, 各地方品种应属于同一品种, 统一定名为巴山牛 陈幼春 (1) 认为, 如果仅仅有感观评定, 而没有其他依据支持将陕 鄂 川三省交界处的牛种定为一个品种, 以粗糙型 结实型 细致型等分类, 则理由不太充分 耿社民等 (1) 对 个血液蛋白位点 个毛色位点和 项形态特征进行研究分析, 认为西镇牛含有我国南方黄牛与中原黄牛的血统, 属一个典型的中间类型 耿社民和武彬 (11) 用血液蛋白位点中血红蛋白 (hemoglobin, b) 和白蛋白 (albumin, Alb) 研究西镇牛等品种遗传特性, 结果表明西镇牛与秦川牛之间遗传距离极短, 而与平利牛差异甚大 耿社民和常洪 (1) 根据八项体尺指标的主成分分析及聚类分析表明, 陕西 个黄牛 群体中, 秦川牛属于中型体格, 平利牛 西镇牛和陕西北部黄牛都属于小型体格, 但体格的大小分类与群体起源无关 即证明了秦巴山区黄牛分布地理位置相近 形态外貌特征相似, 但亲缘关系并非相近 微卫星 DNA (microsatellite DNA) 是以 1~ 个单核苷酸为重复单位, 串联而成的核苷酸数目达几 个的重复序列, 如 (TG)n (AAT)n (GATA)n 等 (Parker et al., 1) 微卫星在真核生物的基因组分布广泛而均匀, 具有数量大 并显性遗传 多样性丰富 同时, 分析方法简便 快捷 重复性好等诸多优势 当前, 已在动物 植物的群体遗传变异 起源 QTL 定位等研究中广泛应用 (Aarker et al., 1; Parker et al., 1; Goudariz et al., 1) ( 张自富等, 00) 采用 1 对微卫星 DNA 引物对 1 个中外黄牛品种进行了遗传多样性分析, 表明西镇牛和郏县红牛遗传距离较近却同陨巴牛较远 ; 湖北的恩施牛与湖南的湘西牛之间的亲缘关系也并非相近, 即研究结果同 中国牛品种志 将西镇牛 陨巴牛等合并为巴山牛 ; 恩施牛 湘西牛等合并为巫陵牛的结论不一致 再次印证了亲缘关系并非同分布区域位置关系完全一致 目前, 对于秦巴山区黄牛遗传多样性研究甚少, 且仅对其中少数个别品

3 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area 种研究, 尚未见从分子水平上对秦巴山区各黄牛品种放在一起同时进行遗传多样性研究的相关报道, 各品种间的遗传分化特点尚不清楚 研究明确各品种遗传分化特点及亲缘关系, 对于分析群体的遗传共适应特点, 预测杂交优势 制订育种战略等意义重大 ( 常洪, 1) 1 材料与方法 1.1 材料本研究以主要分布于秦巴山区的培育品种蜀宣花牛与分布于河南中部的地方品种郏县红牛为对照品种, 分析分布于秦巴山区的西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个黄牛 (Bos taurus) 品种遗传多样性 血样的采集地及采集数量见表 1, 要求采样个体品种特征明显 与其他品种没有杂交的本地品种, 并且各个体间为 代以内没有血缘关系 本研究血样采样采集 体尺测定等调查于 01-1~01-0 在各品种中心产区进行, 室内实验于 01-0~01-0 在国家肉牛改良中心实验室进行 颈静脉采血 ( ml/ 头 ),ACD 抗凝 (V ACD V 血液 =1 ), 轻晃摇匀, 用采样箱带回实验室,-0 冰箱保存 1. 主要试剂 血液基因组 DNA 提取试剂盒 (DP1-0) 和 PCR-Mix 购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ;DNA Marker 购自北京鼎国工程公司 ; 分子量参照标记物 pbr/mspⅠ 购自北京华美公司 1. 提取基因组 DNA 按照血液基因组 DNA 提取试剂盒操作说明步骤 用缓冲液 TB 溶解洗脱 DNA, 然后用 1 g/l 琼脂糖凝胶电泳检测, 并用酶标仪测定其浓度, 在 - 0 冰箱冷冻保存 1. PCR 扩增从联合国粮农组织 (The Food and Agriculture Organization of the United tions, FAO) 和国际动物遗传学会 (The International Society for Animal Genetics, ISAG) 推荐的黄牛微卫星遗传多样性研究引物中, 选择了 1 对实验用引物 ( 引物信息见表 ), 引物由南京金思特工程技术公司合成 PCR 反应体系为 1 μl:mix. μl,taq DNA 聚合酶 ( U/μL ) 0.1 μl, 上游和下游引物 ( pmol/μl) 各 0. μl, 样品 DNA (0 ng/μl) 1.0 μl, 超纯水. μl PCR 扩增程序 : 预变性 min; 变性 0 s,~. ( 退火温度见表 1) 退火 0 s, 延伸 0 s, 循环 0 次 ; 延伸 表 1 个黄牛品种名称和采样情况 Table 1 mes, locations and numbers of cattle breeds 编号 品种名称 采集地 样本数 公牛数 Number Breed Place for gathering Amount Ox number 1 西镇牛 陕西省西乡县古城镇 镇巴县三元镇和泾洋镇 1 Xizhen(XZ) Gucheng Town of Xixiang County, Sanyuan and Jingyang Town of Zhenba County of Shaanxi Province 赤崖牛 陕西省旬阳县吕河镇 段家坝镇 赵湾镇 石门镇 1 Chiya(CY) Lvhe, Duanjiaba, Zhaowan and Shimen Town of Xunyang County of Shaanxi Province 陨巴牛 湖北省竹山县深河乡 得胜镇 官渡镇 0 1 Yunba(YB) Shenhe, Desheng and Guandu Town of Zhushan County of ubei Province 宣汉牛 四川省宣汉县清溪镇 开江县新街乡 0 Xuanhan(X) Qingxi Town of Xuanhan County and Xinjie Town of Kaijiang County of Sichuan Province 蜀宣花牛 四川省宣汉县大成镇 Shuxuanhua(SX) Dacheng Town of Xuanhan County of Sichuan Province 郏县红牛 河南省郏县红牛良种繁育中心 0 Jiaxian(JX) Jiaxian red bull breeding center of enan Province

4 农业生物技术学报 min, 保存 1. PCR 产物检测与基因型判定用 0 g/l 的琼脂糖凝胶检测扩增产物, 将阳性产物采用 % 非变性聚丙烯酰胺凝胶 (native page polyacrylamide gel electroph, tive-page) 在 V 电压下经 ~ h 电泳, 染色后用凝胶成像系统拍照 以 pbr/mspⅠ 为判型标准, 采用 Gel-Pro Analyzer.1 分析软件确定各样本基因型 1. 数据统计分析等位基因频率 (allele frequency) 有效等位基因数 (effective number of alleles, ) 遗传杂合度 (heterozygosity, ) 奈氏标准遗传距离 (standard genetic distance, Ds) 计算与聚类分析采用 Popgen 软件分析 ; 多态信息含量 (polymorphism information content, ) 用 分析软件计算 结果与分析.1 基因组 DNA 的检测用 TB 缓冲液将 DNA 溶解过夜后, 采用 1.% 琼脂糖凝胶电泳 0 min 显示, 条带整齐, 没有拖尾, 并且清晰明亮, 可进行下一步实验. 微卫星位点等位基因变异微卫星位点上的等位基因类型和各等位基因频率的高低, 可以反映家畜品种类和品种间的差 异, 从而区分品种的类型 其中 1 头西镇牛个体微卫星 DAVG 位点 PCR 扩增非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳图谱如图 1 所示 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛 宣汉牛 蜀宣花牛及郏县红牛 个黄牛品种在 1 个微卫星位点共发现 1 个等位基因,ET 位点的等位基因数最多, 为 1 个 ;IDVGA 位点只有 个等位基因, 数量最少 ; 其余位点的等位基因数在 ~1 个之间, 各位点平均等位基因数的均值为.0, 等位基因频率为 ~0.1 ( 表 ). 群体内遗传变异..1 特有等位基因及频率特有等位基因是指在几个品种中, 某个品种特有而其他品种没有的等位基因 共发现 11 个特有等位基因 ( 表 ) 仅有两个特有等位基因其频率大于 0.1, 分别位于蜀宣花牛 ET 位点和郏县红 ET 位点, 其频率分别为 表明蜀宣花牛同其余 个品种在 ET 位点上遗传基础可能存在很大的差异 这与蜀宣花牛培育过程中, 引入西门塔尔牛 荷斯坦奶牛有关 郏县红牛特有的等位基因 0 bp, 其频率为 0.1, 也相对较高, 可能同其余 个品种所处的自然环境 生态条件差异较大有关 另外, 个特有等位基因频率都非常小, 介于 ~0.00 0, 是在进化过程中插入或缺失等频率较低的突变机制造成的.. 优势等位等位基因和频率优势等位基因是指某一基因位点上相对集 表 1 对微卫星引物的 PCR 条件 Table PCR reaction conditions of 1 microsatellite primer pairs 位点 染色体位置 引物序列 ('~') Tm/ Locus Chr. position Primer sequence IDVGA BM11 DVGA ET EL BM10 ILSTS00 ILST0 IDVGA BM1 ET DAVG F:GTAGACAAGGAAGCCGCTGAGG F:GCTGCCTTCTACCAAATACCC F:GTGACTGTATTTGTGAACACCTA F:GATCACCTTGCCACTATTTCCT F:CCCATTCAGTCTTCAGAGGT F:GTCCATGGGTTCACAAAGAG F:GGAAGCAATGAAATCTATAGCC F:TGAAATATACCTGAGTAGCAGC F:GGTCAGTCACAGAGAAGCACAG F:GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA F:GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA F:GGGAGAATGGATGGAACCAAAT R:GAGAAAAGCCAAGAGCCAGACC R:CTTCCTGAGAGAAGCAACACC R:TCTAAAACGGAGGCAGAGATG R:ACATGACAGCCAGCTGCTACT R:CACATCCATGTTCTCACCAC R:ACGCCTGCTGATGCTGTAG R:TGTTCTGTGAGTTTGTAAGC R:TTGTTTTAACTCCCCACCCC R:GAAAGCCTGGTACTCATGGAATA R:ATCTTCACATGATATTACAGCAGA R:CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC R:TTCGAAGACGGGCAGACAGG

5 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area 中 频率较高的的等位基因 表 列出了本研究频 红牛群体在 1 个位点的 值为 0.1 ~0. 率大于 0. 的等位基因 频率最高的等位基因是 平均为 0. 均为高度多态 说明 1 个微卫星 最原始与最保守的 其他的频率相对较低的等位 位点可以用于秦巴山区黄牛遗传多样性分析 个 基因是进化过程中由优势等位基因突变而成的 品种的 均值介于 0.1 ~0. 1 表明秦巴山 1 个微卫星座位中 除 ET 之外其余位点最少 区各黄牛品种遗传多样性丰富 有 1 个优势等位基因 其余 11 个微卫星座位共有.. 1 个优势等位基因 ET 位点上优势等位基因 反映等位基因之间的相互影响 有效等位 基因数越接近等位基因的绝对数 表明人工选择压 力就越大 川东白山羊两数值相差. 波尔山羊 最多为 个 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个群体的优势等位基因数分别为 和 对照 品种蜀宣花牛和郏县红牛均为 个 无明显差异 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个品种共有的 优势等位基因仅有 1 个 是 DVGA 位点上的等位 基因 bp 其频率介于 0.~0. 表明各品种 最原始 最保守的等位基因差异较大 有可能各品 表 等位基因数和有效等位基因数() 1 个微卫星位点在 个牛品种中的片段范围 等位基 因数与多态信息含量 Table Allele range and allele numbers at 1 microsatel lite locus of cattle breeds 位点名称 片段范围/bp 等位基因数 多态信息含量 种来源不同 Locus Allele range Allele numbers.. IDVGA ~ 0. BM11 1~ DVGA 00~0 0.1 ET ~ EL ~ ~1 0. 1~ ILST0 ~1 0. IDVGA 1~1 0.1 BM1 1~ ET 0~ 0. DAVG 1~ 0.1 共有等位基因和频率 共有等位基因是该物种基因组中最古老 最保守 的 个品种在 1 个微卫星位点上包含 1 个共有等 位基因, 占等位基因总数的.% (表) 仅有1个 共有等位基因为优势等位基因(P 0.) 占.1% BM10 表明最为古老 保守的等位基因所占比例较低 秦巴 ILSTS00 山区黄牛各品种遗传基础存在较大的差异.. 多态信息含量() 多态信息含量()通常用来表示该微卫星位 点的杂合程度 由表 可知 秦巴山区黄牛及郏县 bp 0 1 M 图 1 1 头西镇牛个体 DAVG 位点 PCR 产物非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳 Figure 1 The nondenaturing PAGE image of PCR products at DAVG locus of 1 Xizhen cattles M Marker pbr/mspⅠ 1~1 1 个西镇牛个体 1~ 和 1~1 DD 基因型 CD 基因型 和 DE 基因型 11 BE 基因型 M: Marker pbr/msp Ⅰ; 1~1: 1 Xizhen cattle individuals; 1~,,,, and 1~1: DD genotype; : CD genotype; and : DE genotype; 11: BE genotype

6 农业生物技术学报 仅相差 0. 由表 可知, 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛 宣汉牛 蜀宣花牛和郏县红牛 个黄牛品种 1 个位点的有效等位基因数和等位基因数的均值, 计算得出 个黄牛品种有效等位基因数和等位基因数之间的差值分别为 和. 表明各品种选育程度不同 蜀宣花牛选育程度最高, 其次是宣汉牛, 赤崖牛同郏县红牛基本一致相对较低, 陨巴牛和西镇牛基本一 致, 选育程度最低.. 遗传杂合度遗传杂合度 (heterozygosity, ) 反映某位点上遗传变异量大小 由表 可知, 个黄牛品种在各位点的遗传杂合度分别为 :0.0 ± ± ± ± ± ±0.01, 均表现出丰富的遗传多样性 表 个黄牛群体在 1 个微卫星位点特有等位基因及频率 Table Specific allele frequency at 1 microsatellite locus of cattle breeds 位点 Locus IDVGA ET EL ILSTS00 BM1 ET DAVG 西镇 (XZ) (0.001) 赤崖 (CY) 陨巴 (YB) 1(0.0) 1(0.0) 1(0.0) 宣汉 (X) (0.01) (0.01) (0.01) 蜀宣 (SX) 1(0.01) (0.1) 郏县 (JX) (0.0) 0(0.1) 品种代号同表 1 Breed codes are the same as in Table 1 表 个黄牛群体在 1 个微卫星位点优势等位基因及频率 Table Dominant allele frequency at 1 microsatellite locus of cattle breeds 位点 Locus IDVGA BM11 DVGA EL BM10 ILSTS00 ILST0 IDVGA BM1 ET DAVG 等位基因 Allele 西镇 (XZ) 赤崖 (CY) 陨巴 (YB) 宣汉 (X) 蜀宣 (SX) 郏县 (JX) 品种代号同表 1 Breed codes are the same as in Table 1

7 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area. 群体间的遗传变异..1 群体间的遗传距离遗传距离是一个用来表示群体间遗传结构差异或分化的一个重要指标 基因之间的差异程度同基因起源于共同祖先的时间成正比 本研究应用奈氏标准遗传距离 (Ds) 分析群体间的遗传距离 应用 GENEPOP 软件计算 i's 标准遗传距离 (Ds) 与 i's 遗传一致度, 结果见表 以郏县红牛为对照, 宣汉牛 赤崖牛 陨巴牛 西镇牛同郏县红牛之间的遗传距离分别为 和 0.1, 即秦巴山区各黄牛品种同对照品种郏县红牛之间的遗传距离存在明显差异.. 聚类分析采用 POPGENE 软件, 根据遗传资料计算西镇牛 赤崖牛 陨巴牛 宣汉牛 蜀宣花牛和郏县黄牛 个品种在 1 个微卫星位点的 i's 标准遗传距离 (Ds) 为基础, 构建 UPGMA 聚类图, 其结果见图 结果显示, 个黄牛品种聚为 类 : 湖北省陨巴牛 (YB) 与四川省宣汉牛 (X) 首先聚在一起, 然后同陕西省西镇牛 (XZ) 聚在一类 ; 陕西省的赤崖牛 (CY) 与河南郏县红牛 (JX) 聚为一类 ; 四川省蜀宣花牛 (SX) 自成一类 表明同处于秦巴山区的黄牛, 分布的地理位置较近, 生态环境条件相似, 亲缘关系并非相近 特别是赤崖牛同分布的地理位置较远, 生态环境条件差异较大的对照品种郏县红牛亲缘关系最近, 其次是西镇牛同对照品种郏县红牛亲缘关系相对较近 讨论.1 微卫星位点与样本量微卫星位点数和样本量是研究结果可靠性的根本保证 关于研究中微卫星位点的多少,Barker (1) 张继全等 (1) 认为, 样本数量为, 微卫星位点应不少于 个, 但 Fiona 等 (1) 在每个品 种只有 1~1 个样本, 应用 11 个微卫星位点对 个品种进行研究 ;Arranz 等 (1) Dietz 等 (1) Glowatzki 等 (1) 每群体为 1~ 个样本, 曾用 ~ 个微卫星位点分析, 都得出了可靠的结论 陈宏 (00) 认为, 如果每个位点有 个以上的等位基因, 组合 个位点估计个体的遗传变异特性的准确率就可以达到 % 应用 个这样的位点, 可达到.% 的准确率 李杰等 (01) 对甘肃高山细毛羊进行亲子鉴定的研究中, 表明 11 个高度多态的微卫星位点可以使父权排除率达到.%,1 个位点可达.1% 本研究采用的 1 个位点均为高度多态分布于 条染色体上, 有效等位基因数均大于 IDVGA 位点等位基因数为,DAVGA 位点等位基因数为, 其他 个位点的等位基因数均大于 也就是说有 11 个位点完全符合 全球家畜品种之间遗传距离测定草案 (Barker, 1) 的要求 本研究中每个品种采集样本最少为 头, 多者为 头, 能够保证研究结果的可靠性, 对于发现特有等位基因特别有利. 群体遗传多样性分析 Botstein 等 (10) 提出了多态信息含量 () 指标, 反映基因变异程度的高低 当 >0. 时, 表明某位点是高度多态位点 ; 其值介于 0.~0. 之间时, 则是中度多态位点 ; 若值小于 0. 时, 即是低度多态位点 本研究 个品种的 均值介于 0.1 ~0. 1 表明, 秦巴山区各品种黄牛多样性丰富, 各位点相关性状均未受到强大选择压力的影响, 且选择方向一致, 选择潜力较大 个微卫星位点在部分群体中表现为中度多态性 低度多态性 DVGA 位点在宣汉牛 蜀宣花牛 郏县红牛 个品种中表现为中度多态 ;DAVG 位点在西镇牛 赤崖牛和陨巴牛 个品种中表现为中度多态 ;IDVGA 位点在西镇牛 赤崖牛 宣汉牛 蜀宣花牛 个品种中表现为中度多态 在郏县红牛品种 表 个黄牛群体在 1 个微卫星位点共有等位基因及频率 Table Common allele frequency at 1 microsatellite locus of cattle breeds IDVGA BM11 DVGA ET EL BM10 ILSTS00 ILST0 IDVGA BM1 ET DAVG

8 农业生物技术学报 位点 Locus IDVGA BM11 DVGA ET EL BM10 ILSTS00 ILST0 IDVGA BM1 ET DAVG 均值 Mean 参数 Index of genetics 西镇 (XZ) 赤崖 (CY) 陨巴 (YB) 宣汉 (X) 蜀宣 (SX) 郏县 (JX) 均值 Mean 表 个黄牛群体在 1 个微卫星位点的遗传变异参数 Table Estimators of genetic variability of cattle breeds at 1 microsatellite loci 0

9 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area 1 中表现为低度多态 表明各微卫星位点在各品种之间遗传变异存在明显的差异, 或者是经受过不同程度人工选择 张自富等 (00) 利用 1 对微卫星 DNA 标记对 1 个中外牛品种进行了遗传多样性分析其 为 0.0 ±0.0 李荣岭等(00) 采用 1 个微卫星位点对 个中国地方黄牛品种和 个外来牛品种的遗传多样性分析其 为 0.1 0±0.00 王洪程等(011) 采用 个微卫星引物对秦川牛微卫星基因位点遗传多样性分析, 其 为 0.1 0±0.0 表明本研究中秦巴山区黄牛同我国大多数黄牛多态信息含量水平基本一致, 明显低于秦川牛 说明秦巴山区各黄牛变异程度同我国大多数黄牛变异程度基本一致, 但明显低于主产于毗邻地区的秦川牛, 表明秦巴山区各黄牛品种选择潜力巨大 张自富等 (00) 报道, 西镇牛 陨巴牛 郏县红牛平均杂合度依次为 0.1 ± ± 0.00 和 0. ±0.01, 本研究结果与其基本一致, 各个位点的遗传杂合度都大于 0., 再次表明秦巴山区的各黄牛品种具有较高的变异程度, 近交程度较小, 具有比较丰富的遗传多样性 杂合度均一致表明秦巴山区各品种黄牛遗传多样性丰 XZ 1 YB X CY JX SX 图 个黄牛群体间的 UPGMA 亲缘关系 Figure UPGMA dendrogram among cattle breeds 富, 具有很好的本品种选育基础. 群体间遗传变异分析刘丽等 (01) 对早胜牛及其杂交群体 mtdna D-loop 区序列进行分析, 发现早胜牛庆阳 平凉 固原 个地方类群的共享单倍型数和特有单倍型数均以庆阳类群最高, 平凉类群其次, 固原类群最低, 即庆阳 平凉 固原 个类群依次降低 个杂交群体也有类似的规律 认为平凉和固原早胜牛相继从庆阳迁徙而来 本研究共有等位基因 1 个, 占全部等位基因的.%, 仅有 1 个共有等位基因为优势等位基因 (P>0.), 占.1% 表明各品种间遗传基础差异较大 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个群体拥有 个优势等位基因, 其分布同品种间无早胜牛各类群间类似的迁徙规律 本研究 个群体共有的优势等位基因仅有 1 个, 个群体共有的优势等位基因仅有 个 表明各品种最原始 最保守的等位基因差异较大, 有可能各品种来源不同 特有等位基因的频率非常低, 对于确定品种之间的遗传关系意义不大 张继全等 (1) 认为, 品种间遗传关系的确立, 稀有等位基因的贡献极小 对此, 由特有等位基因并不能反映出西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛品种的遗传差异关系 荣敏等 (00) 研究中, 比较分析了几种不同的聚类方法, 认为最稳健的是 UPGMA 罗永发等 (00) 报道延边牛 沿江牛 长白地方牛 蒙古牛等 个中国北方黄牛品种间的遗传距离介于 ~ 0. 0, 即延边牛 沿江牛 长白地方牛之间遗传距离较小, 同 中国牛品种志 将延边牛 沿江牛 长白地方牛合并为延边牛的结论一致 王均辉等 (00) 报道吉安黄牛 徐闻牛 隆林黄牛 皖南牛等 个中国南方黄牛品种间的遗传距离介于 0.0 ~ 表 个黄牛群体间的奈氏标准遗传距离 Table i's standard genetic distance of cattle breeds 群体 Groups 西镇 (XZ) 赤崖 (CY) 陨巴 (YB) 宣汉 (X) 蜀宣 (SX) 郏县 (JX) XZ **** CY 0. **** YB **** X **** SX **** 0.1 JX **** 右上为 i's 遗传一致度 ; 左下为 i's 标准遗传距离 (Ds) i's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

10 农业生物技术学报 0., 相互之间遗传距离也相对较小, 由此表明南方黄牛和北方黄牛的亲缘关系同其地理分布格局相一致 本研究表明, 个黄牛群体的遗传距离介于 0.1 ~0., 即相互间亲缘关系较远 秦巴山区西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛 个地方品种之间的遗传距离介于 0.1 ~0.11 王斌等 (0) 研究表明, 个陕南水牛群体的遗传距离为 0.0 ~0.11, 表明本研究的 个群体间遗传距离大于品种内的差异 秦巴山区黄牛地方品种之间的遗传距离相对较大, 明显大于 个中国北方黄牛品种间和 个中国南方黄牛品种间的遗传距离 从聚类结果来看, 对照品种蜀宣花牛为杂交培育品种自成一类, 符合其遗传背景特征 对照品种郏县红牛却未自成一类, 而是同赤崖牛首先聚为一类 本研究聚类结果同张自富等 (00) 报道的对照品种河南郏县红牛首先同西镇牛 ( 秦巴牛 ) 聚为一类不完全一样, 而是同赤崖牛首先聚为一类, 再同西镇牛 ( 秦巴牛 ) 聚为一类, 但反映的本质一致 也就是说, 该聚类结果也表明了赤崖牛 西镇牛都有可能含有中原牛的血统, 只是本研究中的赤崖牛与郏县红牛的遗传距离较西镇牛 ( 秦巴牛 ) 与郏县红牛之间遗传距离更近 这个结论与耿社民等 (1) 认为西镇牛含有我国南方黄牛与中原黄牛的血统, 属一个典型的中间类型的结论一致 由此表明, 赤崖牛和西镇牛应为不同的品种 陈宏等 (1) 对黄牛 Y 染色体多态性研究表明, 中国黄牛起源具有多元性, 中国黄牛在形成过程中, 北方黄牛受普通牛的影响较大, 南方黄牛受瘤牛的影响较大, 而中原地区黄牛既受到瘤牛的影响, 又受到了普通牛的影响 西镇牛比同处于秦巴山区的岭南牛及毗邻地区的秦川牛受瘤牛的影响大 聚类结果显示郧巴黄牛同宣汉牛之间遗传距离最近为 0.1, 但仍大于罗永发等 (00) 报道的 个中国北方黄牛品种间的遗传距离 (0.01 0~ 0. 0) 西镇牛与郧巴牛 宣汉牛之间的遗传距离分别为 和 0. 对此, 西镇牛 郧巴黄牛和宣汉应为不同来源的品种 张自富等 (00) 报道西镇牛与郏县红牛亲缘关系较近, 却与郧巴黄牛较远 张润锋等 (01) 研究表明陨巴黄牛的普通牛 Y 单倍型率为 0.%, 瘤牛 Y 单倍型率为.%, 即陨巴黄牛父系起源方面受普通牛影响大, 同西镇牛相反 再次印证了郧巴黄牛和西镇牛应为不同品种 房兴堂等 (00) 研究表明西镇牛 宣 汉牛 郏县红牛均有普通牛和瘤牛 mtdna 单倍型 蔡欣等 (00) 研究表明西镇牛 宣汉牛 郏县红牛品种的瘤牛单倍型比率分别为 0%.%.% 由此认为母系起源方面, 西镇牛 郏县红牛受瘤牛影响大, 宣汉牛受普通牛影响大, 再次证明了西镇牛与宣汉牛品种来源不同, 同本研究聚类结果一致 对此, 认为秦巴山区黄牛父系和母系起源, 均同时受瘤牛和普通牛的影响, 但不同品种间的影响程度存在差异 常洪等 (1) 陈幼春和曹红鹤 (001) 报道对秦岭两侧在汉江上 中游和渭河流域的平利牛 西镇牛和秦川牛 个血液蛋白型 (b, Alb, Pa, Tf, Ptf, Akp) 位点为主, 结合毛色和形态特征作比较, 研究表明秦岭是南方瘤牛与北方普通牛的分界线, 大巴山区域的平利牛和西镇牛具有南麓宣汉牛及峨边牛的血液蛋白型特点, 同时与秦川牛在这 个血液蛋白型位点上呈连续变异 蔡欣等 (00) 也证明, 瘤牛与黄牛 mtdna 基因在中国地理区域分布的流动模式 : 即瘤牛 mtdna 基因频率自南向北呈现出逐渐降低的趋势 细胞水平和分子水平研究均表明, 秦巴山区地理位置特殊, 处于南方瘤牛与北方普通牛的分界线, 黄牛的起源比较复杂 秦巴山区的各黄牛品种虽同处于秦巴山区, 分布格局相近 自然环境相似, 但品种形成过程中会因受南方黄牛和北方各黄牛品种的影响程度不同, 使各品种来源不同 结论 1 对微卫星标记可用于秦巴山区黄牛群体遗传多样性的分析, 秦巴山区各黄牛品种遗传多样性丰富, 选育程度不同, 品种来源不同 西镇牛 赤崖牛 陨巴牛和宣汉牛应为来源不同的品种, 不宜合并为 1 个品种将其分为 种类型 本研究明确了秦巴山区黄牛品种的遗传分化特点及亲缘关系, 对于分析品种的遗传共适应特点, 预测杂交优势, 制定育种战略等提供了科学依据 参考文献蔡欣, 陈宏, 雷初朝, 等. 00. 中国 1 个黄牛品种 mtdna 变异特征与多态性分析 [J]. 中国生物化学与分子生物学报, (): -. (Cai X, Chen, Lei C Z, et al. 00. Features of variation and genetic polymorphisms in mtdna of seventeen Chinese cattle breeds [J]. Chi-

11 秦巴山区黄牛群体的微卫星 DNA 遗传多样性 Genetic Diversity of Microsatellite DNA Among the Cattle (Bos taurus) Population in the Qinling-Bashan Mountain Area nese Joumal of Biochemistry and Molecular Biology, (): -.) 常洪. 1. 家畜遗传资源学纲要 [M]. 中国农业出版社. 北京. pp. -1. (Chang. 1. Compendium of Animal Genetic Resources[M]. China Agriculture Press. Beijing, pp. -1.) 常洪, 耿社民, 武彬. 1. 秦岭两侧黄牛群体遗传检测报告 [J]. 畜牧兽医学报, (): (Chang, Geng S M, Wu B. 1. A report on the genetic investigation of native yellow cattle populations on both sides of Qinling mountain range[j]. Acta Veterinaria et Zootechnica sinica, (): 11-1.) 陈宏, 邱怀, 詹铁生, 等. 1. 中国四品种黄牛性染色体多态性的研究 [J]. 遗传, 1(): 1-1.(Chen, Qiu, Zhan T S, et al. 1. Studies on sex chromosome polymorphism of four local cattle (Bos taurus) breeds in China[J]. ereditas, 1(): 1-1.) 陈宏, 易自立, 张金文. 00. 基因工程原理与应用 [M]. 中国农业科技出版社, 北京, pp. 0-. (Chen, Yi Z L, Zhang J W. 00. Genetic Engineering Principle and Application[M]. China Agricultural Science and Technology Press, Beijing, pp. 0-.) 陈幼春. 1. 关于中国牛种分类标准的商榷 [J]. 中国黄牛, (): -1. (Chen Y C. 1. Discussion about classification criteria of China cattle [J]. Chinese Yellow Cattle, (): -1.) 陈幼春, 曹红鹤 中国黄牛品种多样性及其保护 [J]. 生物多样性, (): -. (Chen Y C, Cao Diversity of Chinese yellow cattle breeds and their conservation[j]. Biodiversity Science, (): -.) 邓银才, 李锡章, 禚振宇. 10. 秦巴山区家畜家禽及经济动物品种志 [M]. 中国农业科技出版社北京. pp. 1. (Deng Y C, Li X Z, Xiang Z Y. 10. Poulty and Lvestock and Economic Animal Species of Qin- ba Mountain Areas [M]. China Agriculture Science and Technology Press, Beijing, pp.1.) 房兴堂, 周艳, 陈宏, 等. 00. 中国黄牛 mtdna D-loopp 遗传多样性及起源 [J]. 动物学报, (): -. (Fang X T, Zhou Y, Chen, et al. 00. Genetic diversity of mtdna D- LOOP and origin of the Chinese cattle [J]. Acta Zoologica Sinica, (): -.) 耿社民, 常洪, 武彬, 等. 1. 西镇黄牛遗传检测的研究 [J]. 西北农业大学学报, 1(): -. (Geng S M, Chang, Wu B, et al. 1. Studies on genetic investigation in xizhen yellow cattle[j]. Journal of Northwest Sci- Tech University of Agriculture and Forestry(tural Science Edition), 1(): -.) 耿社民, 常洪. 1. 陕西黄牛群体遗传多态性及其系统地位研究简报 [J]. 黄牛杂志, (): - 0. (Geng S M, Chang. 1. Shaanxi cattle population genetic polymorphism and its system status of briefing[j]. Journal of Yellow Cattle Science, (): -0.) 耿社民, 武彬. 11. 西镇牛与其黄牛品种间亲缘关系剖析 [J]. 畜牧兽医杂志, (): -. (Geng S M, Wu B. 11. Analysis of genetic relationship between Xizhen cattle and other cattle breeds[j]. Journal of Animal usbandry and Veterinary, (): -.) 李杰, 罗玉柱, 李少斌, 等.01. 甘肃高山细毛羊微卫星遗传多样性及亲子鉴定研究 [J]. 农业生物技术学报, 1 (): 1-0. (Li J, Luo Y Z, Li S B, et al. 01.The microsatellite genetic diversity and paternity testing of Gansu Alpine Merino sheep (Ovis aries) [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 1(): 1-0.) 李荣岭, 张桂香, 王志刚, 等. 00. 微卫星标记对 1 个中外牛品种群体遗传结构的研究 [J]. 遗传, (1): 1-. (Li R L, Zhan G X, Wang Z G, et al. 00. Analysis of the genetic structure of 1 Chinese and foreign attle reeds using DNA microsatellite markers[j]. ereditas, (1): 1-.) 刘丽, 赵生国, 蔡原, 等. 01. 早胜牛及其杂交群体遗传多样性研究 [J]. 农业生物技术学报, ():1-. (Liu L, Zhao S G, Cai Y, et al. 01. The genetic diversity of Zaosheng tive cattle(bos taurus) and associated crossbred population [J]., (): 1-.) 罗永发, 王志刚, 李加琪, 等. 00. 采用微卫星标记分析 1 个中外牛品种的遗传变异和品种间的遗传关系 [J]. 生物多样性, 1(): -0. (Luo Y F, Wang Z G, Li J Q, et al. 00. Genetic variation and genetic relationship among 1 Chinese and introduced cattle breeds using microsatellite DNA markers[j]. Biodiversity Science, 1 (): -0.) 荣敏, 杨福合, 邢秀梅, 等. 00. 利用微卫星分析中国家兔的遗传多样性 [J]. 中国畜牧杂志, ():1-.( Rong M, Yang F, Xing X M, et al. 00. The genetic diversity of Chinese rabbit by using microsatellite DNA markers [J]. Chinese Journal of Animal Science, (): 1-.) 王斌, 昝林森, 杨彦杰, 等.0. 陕南水牛微卫星 DNA 遗传多样性研究 [J]. 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 ), (): 1-. (Wang B, Zan L S, Yang Y J, et al. 0. Sudy on genetic diversity of microsatellite DNA in shaannan buffalo[j]. Journal of Northwest A&F University(t. Sci. Ed. ), (): 1-.) 王洪程, 昝林森, 宋付标, 等 秦川牛微卫星基因位点

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