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远谈
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1 中国农学通报 202,28(06):59-65 Chinese Agricultural Science Bulletin 稻瘟病菌 NAD(H) 激酶 Mopos5 互作蛋白的筛选陈晓峰, 余杰, 蔡仁丽, 王琴秋, 朱晓寒 2, 鲁国东 ( 福建农林大学生命科学学院, 福州 ; 2 福建农林大学植物保护学院, 福州 ) 摘要 : 为了探索 Mopos5 可能参与的信号网络, 了解其作用的分子机制, 利用酵母双杂交系统筛选了稻瘟病菌 cdna 文库, 获得了 6 个与 Mopos5 互作的蛋白 ; 结合生物信息学预测分析和相关文献报道, 发现这些候选互作蛋白很可能参与调控了细胞骨架建成细胞运动细胞分裂细胞老化与死亡线粒体功能维持胁迫防御反应物质与能量代谢和信号传导等多种多样的生物学进程进一步分析这些互作蛋白的生物学功能及与 Mopos5 的互作机制, 对于了解 Mopos5 可能参与的信号网络及其调控稻瘟病菌在寄主组织内定殖和扩展的分子机制具有重要的意义关键词 : 稻瘟病菌 ;NAD(H) 激酶 Mopos5; 酵母双杂交 ; 互作蛋白中图分类号 :Q7 文献标志码 :A 论文编号 : Screening of Interaction Proteins of NAD(H) Kinase Mopos5 in Magnaporthe oryzae Chen Xiaofeng, Yu Jie, Cai Renli, Wang Qinqiu, Zhu Xiaohan, Lu Guodong 2 ( School of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou ; 2 College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou ) Abstract: In order to explore the signal networks in which Mopos5 might involve and study the molecular mechanism, cdna library was screened by using yeast two-hybrid system, and six interaction proteins were obtained. According to bioinformatics prediction and relevant research papers, these candidate interaction proteins were likely to participate in various biological processes, including cytoskeleton morphogenesis, cell movement, cell division, cell ageing and death, maintenance of mitochondrial function, defense response to environmental stress, material and energy metabolism and signal transduction. Further analysis of the biological functions of these interaction proteins and their interaction mechanisms with Mopos5 would be of great significances to make out the signal networks in which Mopos5 might involve and even its molecular regulation mechanisms of colonization and expansion of M. oryzae in rice tissues. Key words: Magnaporthe oryzae; NAD(H) kinase Mopos5; yeast two-hybrid; interaction proteins 0 引言由稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae) 侵染水稻引起的 [-3] 稻瘟病是中国乃至世界水稻生产上的首要病害, 通过鉴定并系统地分析参与调控稻瘟病菌生长发育及侵染致病过程中的基因及其生物学功能, 从而深入了解该病原菌侵染循环过程的规律, 能为寻找稻瘟病持久有效的防治措施奠定基础尽管对稻瘟病菌的生长发育和侵染致病各阶段已开展了长期较为系统的研究, 并取得了一些重大进展, 但迄今对该病原菌定殖扩展的分子机理仍然未完全弄清楚稻瘟病菌生长发育过程中的细胞分化及致病起始过程需要胞内维持适量的活性氧物质 (reactive oxygen species,ros) [4] ; 而在其侵染植物宿主后, 植物会释放 [5-7] 大量的 ROS 以杀灭病原菌并抵御其进一步扩展基金项目 : 国家自然科学基金 ATP-NAD 激酶调控的稻瘟病菌与水稻 Pib 基因特异互作的研究 (308766) 第一作者简介 : 陈晓峰, 男,984 年出生, 福建泉州人, 博士, 主要从事真菌功能基因组学研究通信地址 : 福建福州金山福建农林大学生命科学学院,Tel: , verry@63.com 通讯作者 : 鲁国东, 男,967 年出生, 福建上杭人, 教授, 博士, 主要从事分子植物病理学研究通信地址 : 福建福州金山福建农林大学植物保护学院,Tel: , guodonglu@yahoo.com 收稿日期 : , 修回日期 :20-2-2

2 60 中国农学通报因此, 为了能维持正常的生长发育及成功地在宿主植物内定殖和扩展, 与其他一些病原菌一样, 稻瘟病菌能产生并分泌一些超氧化物歧化酶过氧化物酶及过氧化氢酶等解毒酶类来及时清除毒性的 ROS [8-], 这些酶类之所以能够发挥功能, 又大都依赖于 NADPH 所提 [2] 供的还原力, 而 NAD(H) 激酶正是通过调节细胞内 NADPH 合成, 在细胞氧胁迫防御系统中起着至关重 [3] 要的作用目前, 对于 NAD(H) 激酶生物学功能的研究主要局限在模式生物酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 以及人类细胞中酿酒酵母的 NAD(H) 激酶在响应氧胁迫维持线粒体功能精 [2,4-5] 氨酸生物合成等方面起关键作用 ; 拟南芥的 NAD (H) 激酶调节并维持着植物体的还原势, 对于叶绿素的合成保护叶绿体抵抗氧胁迫方面也起着重要的作 [6-8] 用 ; 人类细胞中的 NAD(H) 激酶也同样通过维持细胞质 NADPH 的水平来保护细胞免受氧胁迫的危 [9-20] 害但迄今为止, 对于胞内外氧胁迫信号是如何传递至 NAD(H) 激酶的, 以及 NAD(H) 激酶又是通过哪些效应蛋白来调控对胞内外活性氧物质的降解以及其他一些生命活动还知之甚少 ; 此外, 对于病原真菌中 NAD(H) 激酶的功能研究仍十分有限, 也尚无研究报道指出其能通过调节 NAD(H) 与 NADP(H) 之间的动态平衡参与病原真菌响应活性氧胁迫的反应因此, 鉴定稻瘟病菌中 NAD(H) 激酶的互作蛋白是十分必要的, 它将有助于探索病原真菌中 NAD(H) 激酶的生物学功能参与的信号网络作用的分子机制及其与病原菌定殖扩展之间的关系 MGG_05450( 根据基因组数据库中该基因注释将其命名为 Mopos5) 是稻瘟病菌全基因组中注释的一个 NAD(H) 激酶, 本研究利用酵母双杂交系统, 以 Mopos5 为诱饵蛋白筛选稻瘟病菌 cdna 文库, 为进一步探索 Mopos5 可能参与的信号网络奠定基础材料与方法. 材料稻瘟病菌菌株 Guy 由法国 Didier Tharreau 惠赠, 其 cdna 文库为本实验室构建并保存 ExTaq 聚合酶限制性内切酶 T4 DNA 连接酶购自 TAKARA 公司 ;PCR 纯化试剂盒质粒提取试剂盒 DNA Marker 购自天根生物技术有限公司 ; 稻瘟病菌总 RNA 提取使用 Promega 公司的 SV Total RNA Isolation System 试剂盒 ; 单链 cdna 的合成使用 Promega 公司的 ImProm-II. Reverse Transcription System 试剂盒 ; 酵母表达载体 pgbkt7 和 pgadt7, 酵母菌株 Y87 和 AH09 购自 Clontech 公司.2 方法.2. Mopos5 基因诱饵载体的构建参照相关试剂盒操作说明提取稻瘟病菌 Guy 的总 RNA, 并反转录成 cdna 待用以上述 cdna 为模板, 用 Mopos5 开放阅读框内特异引物 Mopos5F(5'-CGGAATTCATGGCGTT ACCCCTGAGGATCC-3') 与 Mopos5R(5'-GCGTCGAC TCAATGCCCCGCTTCTCCGAAC-3') 通过 PCR 扩增获得了 Mopos5 基因的片段,PCR 产物纯化后经 EcoR Ⅰ 和 SalⅠ 双酶切后, 与经同样双酶切的 pgbkt7 载体于 6 连接过夜, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α, 挑取阳性克隆酶切测序鉴定, 构建好诱饵载体 pgbkt7-mopos5.2.2 诱饵载体质粒转化酵母菌株 Y87 及分子验证参照 Clontech 公司 Matchmaker TM Library Constrution & Screening Kits 操作说明转化诱饵载体 pgbkt7-mopos5 至酵母菌株 Y87, 转化产物涂布 SD/-Trp 平板上,30 倒置培养直至克隆子长出, 随机挑取单克隆于 SD/-Trp 液体培养基中 r/min 振荡培养 24 h, 参照试剂盒说明书提取酵母质粒, 用引物 Mopos5F/R 检测 pgbkt7-mopos5 是否转入酵母菌 Y Mopos5 自激活检测将 PCR 验证后的单克隆分别接种于 SD/-Trp/-Ade 和 SD/-Trp/-His 平板上, 检测是否自激活报告基因 ADE2 和 HIS3; 同时也在 SD/-Trp/ X-α-Gal 平板上划线, 检测是否自激活报告基因 MEL 只有在 SD/-Trp/-Ade 和 SD/-Trp/-His 平板上菌落不能生长以及 SD/-Trp/X-α-Gal 平板上菌落为白色的, 才能证明重组质粒自身不能激活报告基因, 方可用于接下来互作蛋白的筛选.2.4 Mopos5 互作蛋白的筛选参照 Clontech 公司 Matchmaker TM Library Constrution & Screening Kits 操作说明, 采用酵母菌株交配法进行 cdna 文库筛选以多次验证为互作阳性的酵母转化子质粒为模板, 用 pgadt7-rec 载体通用引物 ADF(5'-CTATTCGA TGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3') 和 ADR (5'-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT- 3') 对其进行 PCR 扩增, 检测插入的 cdna 片段的大小排除无插入片段插入片段较小 ( <200 bp, pgadt7-rec 空载体 PCR 扩增产物约为 200 bp) 以及多个插入片段的克隆, 保留含有单一较大 cdna 插入片段的克隆作进一步验证.2.5 互作克隆子的回复杂交验证将上述阳性克隆质

3 陈晓峰等 : 稻瘟病菌 NAD(H) 激酶 Mopos5 互作蛋白的筛选 6 粒转化大肠杆菌 DH5α 超级感受态细胞, 以单克隆菌液为模板, 用 pgadt7-rec 载体通用引物 ADF 和 ADR 进行 PCR 扩增, 选取扩增大小与酵母质粒的阳性克隆提取细菌质粒将上述筛选出的互作克隆的细菌质粒分别与诱饵载体 pgbkt7-mopos5 共转化入酵母菌株 AH09, 在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 平板上进行回复验证, 经验证仍可生长且显蓝色的即为最终确定的互作阳性克隆子将最终确定的互作阳性克隆的细菌菌液送华大基因公司测序, 测序结果在稻瘟病菌基因组数据库 (http: // 中用 Blastn 进行比对分析, 获得同源序列及注释信息等 2 结果与分析 2. Mopos5 基因诱饵载体的构建及其酵母转化子的验证以稻瘟病菌 Guy 总 cdna 为模板, 用 Ex Tag 聚合酶扩增获得 Mopos5 基因全长片段, 经 EcoRⅠ 和 Sal Ⅰ 双酶切后纯化回收, 将其亚克隆进 pgbkt7 载体, 用 EcoRⅠ 和 SalⅠ 双酶切鉴定阳性重组质粒, 如图所示, 再经测序验证无误, 表明诱饵载体 pgbkt7-mopos5 构建成功 bp M M:Marker D2000;:Guy 基因组 DNA; 2:pGBKT7 空载转化子 ;3~5: 酵母转化子图 2 酵母转化子质粒 PCR 验证表达产物对酵母菌株 Y87 无毒性进而将上述菌液划线接种于 SD/-Trp/-Ade SD/-Trp/-His 以及 SD/-Trp/X-α-Gal 平板上检测 pgbkt7-mopos5 重组质粒的自激活活性检测结果如图 3 所示, 含有 pgbkt7-mopos5 重组质粒的酵母菌株可在 SD/-Trp 培养基上生长, 而无法在 SD/-Trp/-Ade 和 SD/-Trp/-His 培养基上生长, 且菌落在 SD/-Trp/ X-α-Gal 培养基上也不显蓝色以上结果表明, pgbkt7-mopos5 重组质粒的表达产物无法激活报告基因 ADE2 HIS3 和 MEL 的表达, 即不具有自激活活性, 可用于接下来互作蛋白的筛选 2 3 bp M 2 SD/-Trp SD/-Trp/-Ade SD/-Trp/-His M: DNA Marker II;, 2: Bait vector pgbkt7-mopos5 图诱饵载体 pgbkt7-mopos5 的酶切验证将重组质粒 pgbkt7-mopos5 转化进酵母菌株 Y87, 随机挑取 3 个 SD/-Trp 培养基上的单克隆菌落提取酵母质粒, 用 Mopos5 特异引物 Mopos5F/R 鉴定阳性克隆如图 2 所示, 随机挑取的 3 个单克隆均为阳性克隆 2.2 Mopos5 自激活检测将带有 pgbkt7-mopos5 的阳性克隆子和带有 pgbkt7 空载体的对照克隆子接种至 SD/-Trp 液体培养基中, r/min 振荡培养 24 h 后, 发现含有重组质粒的酵母菌菌液浓度与含有 pgbkt7 空载体的酵母菌差别不明显, 表明 pgbkt7-mopos5 重组质粒的 SD/-Trp/X-α-Gal :pgbkt7;2:pgbkt7-mopos5;3:pgadt7-rect+pgbkt7-53 图 3 pgbkt7-mopos5 重组质粒的自激活检测 2.3 Mopos5 互作蛋白的筛选鉴定与分析经过反复筛选一对一的回复杂交验证及测序排除相同克隆, 最后, 以 Mopos5 为诱饵, 从稻瘟病菌 Guy 菌丝阶段双杂交 cdna 文库中筛选到 6 个不同的阳性克隆子, 图 4 显示的是 6 个互作阳性克隆子在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 平板上进行回复验证的结果将测序获得的 6 个插入 cdna 序列在稻瘟病菌基因组数据库中进行 Blastn 比对, 分析结果如表所示,

4 62 中国农学通报 : 阳性对照 pgadt7-rect + pgbkt7-53;2: 阴性对照 pgadt7-rect+ pgbkt7-lam; 3: 阴性对照 pgadt7 + pgbkt7;4: 阴性对照 pgbkt7-mopos5+ pgadt7; 5:pGBKT7-Mopos5+ MGG_00505 克隆子 ;6: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_00505 克隆子 ; 7:pGBKT7-Mopos5+ MGG_07560 克隆子 ;8: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_07560 克隆子 ; 9:pGBKT7-Mopos5+ MGG_04352 克隆子 ;0: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_04352 克隆子 ; :pgbkt7-mopos5+ MGG_0648 克隆子 ;2: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_0648 克隆子 ; 3:pGBKT7-Mopos5+ MGG_07594 克隆子 ;4: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_07594 克隆子 ; 5:pGBKT7-Mopos5+ MGG_00052 克隆子 ;6: 阴性对照 pgbkt7+ MGG_00052 克隆子图 4 互作阳性克隆子回复杂交验证表稻瘟病菌 Guy 菌丝 cdna 文库中 6 个互作阳性克隆子测序结果克隆编号插入片段长度 /bp 基因号基因注释 ORF 完整性编码性 502 MGG_00505 septation protein SUN MGG_07560 conserved hypothetical protein MGG_04352 actin-related protein 2/3 complex subunit A 不,708/ MGG_0648 peroxisomal hydratase-dehydrogenase-epimerase MGG_07594 ubiquinone/menaquinone biosynthesis methyltransferase MGG_00052 hypothetical protein 不,342/343 可以看出, 所有克隆中所插入的 ORF 片段均不是完整的, 且其中有 2 个克隆的序列与其同源基因不完全 3 结论与讨论 NADPH 除了作为电子传递载体参与生物体新陈代谢之外, 还是生物抗氧化自我保护的核心, 其提供的 [2] 还原力是消除胞内外杀伤性 ROS 所必需的,NAD (H) 激酶则是通过调节 NADPH 代谢调控着胞内外 ROS 的平衡, 对于维持生命体正常的生命活动是至关重要的因此, 为了探索稻瘟病菌 NAD(H) 激酶 Mopos5 可能参与的涉及活性氧代谢的信号网络系统, 本研究以 Mopos5 作为诱饵, 在证实 pgbkt7-mopos5 重组质粒对酵母菌无毒性且不具有自激活活性之后, 利用酵母双杂交系统, 从稻瘟病菌 Guy 菌丝 cdna

5 陈晓峰等 : 稻瘟病菌 NAD(H) 激酶 Mopos5 互作蛋白的筛选 63 文库中筛选获得了 6 个插入片段不同的互作阳性克隆 MGG_00505 编码分隔蛋白 SUN4(septation protein SUN4), 含有 SUN 结构域, 属于 SUN 家族蛋白 SUN 蛋白家族是酵母中的一个蛋白家族, 其成员包括 SIM UTH NCA3 和 SUN4/SCW3, 通常在位于蛋白 C 端处有一由 258 个氨基酸组成的较为保守的 SUN 结构域, 该家族蛋白生物学功能多样, 参与许多生物学进程, 如 DNA 复制胁迫抗性 ( 氧胁迫抗性 ) 细胞老化与死亡线粒体的生物合成与自噬降解细胞壁 [2-22] 形态建成细胞分隔等 MGG_00052 编码的是一个假定蛋白, 通过 Pfam 数据库分析未发现保守结构域, 而氨基酸序列同源比对结果显示, 其与上述酵母菌 SUN 家族蛋白中的 UTH 具有同源性 UTH 通常位于线粒体外膜和细胞壁上, 与细胞壁形态建成线粒体的生物合成和自噬氧胁迫防御反应饥饿耐受性细 [22-24] 胞死亡等有关 MGG_07560 编码一个保守的假定蛋白, 与酿酒酵母 (S. cerevisiae) 中的天冬氨酸蛋白酶 YPS3 同源 YPS3 属于 yapsin 蛋白酶家族, 该家族目前只在真菌中有报道, 是一类通过糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定在细胞膜上的天冬氨酸蛋白酶, 通过维护细胞壁的完整性参 [25-26] 与一些胁迫抗性实际上, 天冬氨酸蛋白酶广泛存在于真菌病毒及动植物中, 因其活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成而得名, 参与机体的新陈代谢及生物调控作用在病原真菌白色念珠菌 (Candida albicans) 中, 分泌型天冬氨酸蛋白酶 (secreted aspartyl proteinase,sap) 是其最重要的毒力因子之一, 除了参与维持细胞表面完整性及细胞分离之外, 还在与宿主互作过程中具有特异的功能, 与其粘附侵染致病及在宿 [27] 主细胞内的定殖扩展密切相关 MGG_04352 编码肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合体亚单位 A(actin-related protein 2/3 complex subunit A), 与肌动蛋白的运动性和完整性有关肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合体 (actin-related protein 2/3,Arp2/3) 由 7 条保守的多肽链 Arp2 Arp3 ARPC ARPC2 ARPC3 [28] ARPC4 和 ARPC5 组成, 其介导的肌动蛋白核化是肌 [29] 动蛋白微丝形成所必需的, 而微丝装配形成后可以介导多种肌动蛋白依赖性的细胞生理功能, 如细胞骨架建成细胞形态的维持细胞运动细胞分裂及胞吞胞吐等此外,MGG_04352 还含有 WD 重复基序, 此类蛋白具有多种多样的生物学功能, 通过协调蛋白复合体的组装参与信号传导转录调控细胞周期调控 [30] 细胞凋亡等 MGG_0648 编码个过氧化物酶体的多功能蛋白, 同时具有水合酶脱氢酶差向异构酶活性 (peroxisomal hydratase-dehydrogenase-epimerase) 该蛋白在酵母中的同源蛋白 FOX2 是过氧化物酶体中脂肪酸 β- 氧化途径中的一个多功能酶类, 同时具有 3- 羟 [3] 烷基辅酶 A 脱氢酶及烯酰辅酶 A 水合酶活性 MGG_07594 编码个泛醌 / 甲萘醌生物合成甲基转移酶 (ubiquinone/menaquinone biosynthesis methyltransferase), 含有个甲基转移酶结构域由甲基转移酶介导的 DNA RNA 蛋白和其他小分子物质的甲基化在基因调控和细胞分化等进程中起着重要作用该蛋白在酵母中的同源蛋白 ERG6 是一个甾醇 C-24 甲基转移酶, 在酵母麦角甾醇生物合成中起着重 [32] 要的调控作用而泛醌( 辅酶 Q) 和甲萘醌是电子传递链中的一个关键组分, 与生物体的生长发育密不可分综上所述, 筛选出的与 Mopos5 互作的蛋白在其他生物中的同源蛋白参与调控了多种多样的生物学进程, 如细胞骨架建成细胞运动细胞分裂细胞老化与死亡线粒体功能维持活性氧代谢脂质代谢和信号传导等据此推测这些互作蛋白在稻瘟病菌中可能也起着类似的作用, 因此, 进一步通过功能基因组学研究手段分析这些互作蛋白在稻瘟病菌中的生物学功能及与 Mopos5 的互作机制, 对于了解 Mopos5 可能参与的信号网络及其调控稻瘟病菌生长发育和致病的分子机制是十分必要的由于异源蛋白在酵母中表达时可能会发生错误折叠或修饰, 利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白时有可能出现假阳性现象, 因此本研究的结果仍有必要进一步通过免疫共沉淀技术加以验证此外, 所有获得的互作阳性克隆中插入的 cdna 序列均是的 ORF 片段, 且还有 2 个的序列与其同源基因不完全匹配, 因此有必要进一步验证全长蛋白能否与 Mopos5 互作, 以确保结果的可靠性酿酒酵母一直被视为真菌功能基因组学研究的重要模式生物之一, 在其基因组数据库中所有蛋白都列举出一些候选的互作蛋白因此, 在鉴定稻瘟病菌 Mopos5 互作蛋白时, 它在酿酒酵母中的同源蛋白 Pos5p 的互作蛋白信息是具有一定的借鉴意义的到目前为止, 在酿酒酵母基因组数据库中,Pos5p 共注释 [33-34] 有 44 个互作蛋白, 通过在稻瘟病菌数据库中一一进行 Blastp 比对分析, 获得相对应的稻瘟病菌中的同源蛋白 38 个 ( 数据未提供, 部分 Pos5p 互作蛋白属于同一蛋白家族, 故其在稻瘟病菌中比对同源性最高的蛋

6 64 中国农学通报白为同一个 ), 而本研究通过酵母双杂交系统所筛选出的 6 个候选互作蛋白并未出现在其中据此推测, 本研究所获得的稻瘟病菌 Mopos5 互作蛋白可能是新发现的可与 NAD(H) 激酶互作的蛋白 ; 但是本研究所获得的互作蛋白数量较为有限, 还有待进一步补充完善首先, 由于一些与 Mopos5 互作的蛋白丰度较低, 在 cdna 文库的构建及后期筛选过程中较易遗漏, 因此可以通过构建与筛选均一化 cdna 文库来加以完善 ; 其次, 由于酵母双杂交系统自身存在的缺陷, 一些膜蛋白胞外分泌蛋白转录因子, 以及一些与 Mopos5 互作较弱的蛋白等也可能被遗漏, 因此可以尝试改用其他改良的酵母双杂交技术, 或是其他在酵母双杂交基础上建立的酵母单杂三杂交及核外双杂交等对 Mopos5 的互作蛋白进行鉴定和筛选, 也还可以利用 Pull-down 技术, 直接使用稻瘟病菌 Mopos5 的纯化蛋白作为诱饵, 在稻瘟病菌蛋白质组中钓出它的互作蛋白参考文献 [] Ou S H. Pathogen variability and host resistance in rice blast disease [J]. Annu Rev Phytopathol,980(8): [2] Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, et al. Signalling in plant-microbe interactions[j]. Science,997(276): [3] Talbot N J. On the trail of a cereal killer: Exploring the Biology of Magnaporthe grisea[j]. Annu. Rev. Microbio,2003(57): [4] Egan M J, Wang Z Y, Jone M A, et al. Generation of reactive oxygen species by fungal NADPH oxidases is required for rice blast disease[j]. PNAS,2007,04(28): [5] Pasechnik T D, Aver yanov A A, Lapikova V P, et al. The involvement of activated oxygen in the expression of the vertical and horizontal resistance of rice to blast disease[j]. Russian J Plant Physiol,998(45): [6] Kato T, Tanabe S, Nishimura M, et al. Differential responses of rice to inoculation with wild-type and non-pathogenic mutants of Magnaporthe oryzae[j]. Plant Mol Biol,2009(70): [7] Chi M H, Park S Y, Kim S, et al. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host[j]. PLoS Path,2009,5(4):e [8] Molina L, Kahmann R. An Ustilago maydis gene involved in H2O2 detoxification is required for virulence[j]. Plant Cell,2007(9): [9] Kawasaki L, Wysong D, Diamond R, et al. Two divergent catalase genes are differentially regulated during Aspergillus nidulans development and oxidative stress[j]. J Bacteriol,997(79): [0] Lanfranco L, Novero M, Bonfante P. The mycorrhizal fungus Gigaspora margarita possesses a CuZn superoxide dismutase that is up-regulated during symbiosis with legume hosts[j]. Plant Physiol, 2005(37): [] Tanabe S, Ishii-Minami N, Saitoh K I, et al. The role of catalase-peroxidase secreted by Magnaporthe oryzae during early infection of rice cells[j]. MPMI,20,24(2):63-7. [2] Outten C E, Culotta V C. A novel NADH kinase is the mitochondrial source of NADPH in Saccharomyces cerevisiae[j]. EMBO J,2003(22): [3] Singh R, Mailloux R J, Puiseux-Dao S, et al. Oxidative stress evokes a metabolic adaptation that favors increased NADPH synthesis and decreased NADH production in Pseudomonas fl uorescens[j]. J Bacteriol,2007,89(8): [4] Strand M K, Stuart G R, Longley M J, et al. POS5 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a mitochondrial NADH kinase required for stability of mitochondrial DNA[J]. Eukaryot Cell, 2003 (2): [5] Hikary M, Shigeyuki K, Kousaku M. Two sources of mitochondrial NADPH in the yeast Saccharomyces cerevisiae[j]. J Biol Chem, 2009(284): [6] Berrin J G, Pierrugues O, Brutesco C, et al. Stress induces the expression of AtNADK-, a gene encoding a NAD(H) kinase in Arabidopsis thaliana[j]. Mol Genet Genomics,2005(273):0-9. [7] Chai M F, Chen Q J, An R, et al. NADK2, an Arabidopsis chloroplastic NAD kinase, plays a vital role in both chlorophyll synthesis and chloroplast protection[j]. Plant Mol Biol,2005(59): [8] Chai M F, Wei P C, Chen Q J, et al. NADK3, a novel cytoplasmic source of NADPH, is required under conditions of oxidative stress and modulates abscisic acid responses in Arabidopsis[J]. Plant J, 2006(47): [9] Lerner F, Niere M, Ludwig A, et al. Structural and functional characterization of human NAD kinase[j]. Biochem Biophys Res Commun,200(288): [20] Pollak N, Niere M, Ziegler M. NAD kinase levels control the NADPH concentration in human cells[j]. J Biol Chem,2007,282 (46): [2] Mouassite M, Camougrand N, Schwob E, et al. The 'SUN' family: yeast SUN4/SCW3 is involved in cell separation [J]. Yeast,2000,6 (0): [22] Camougrand N, Kissová I, Velours G, et al. Uthp: a yeast mitochondrial protein at the crossroads of stress, degradation and cell death[j]. FEMS Yeast Res,2004,5(2): [23] Camougrand N, Mouassite M, Velours G, et al. The SUN family: UTH, an ageing gene, is also involved in the regulation of mitochondria biogenesis in Saccharomyces cerevisiae[j]. Arch Biochem Biophys,2000(375): [24] Kissová I, Deffieu M, Manon S, et al. Uthp is involved in the autophagic degradation of mitochondria[j]. J Biol Chem,2004,279 (37): [25] Krysan D J, Ting E L, Abeijon C, et al. Yapsins are a family of aspartyl proteases required for cell wall integrity in Saccharomyces cerevisiae[j]. Eukaryot cell,2005,4(8): [26] Gagnon A I, Tremblay J, Bourbonnais Y. Fungal yapsins and cell

7 陈晓峰等 : 稻瘟病菌 NAD(H) 激酶 Mopos5 互作蛋白的筛选 65 wall: a unique family of aspartic peptidases for a distinctive cellular function[j]. FEMS Yeast Res,2006(6): [27] Albrecht A, Felk A, Pichova I, et al. Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteinases of Candida albicans target proteins necessary for both cellular processes and host pathogen interactions[j]. J Biol Chem,2006(28): [28] Robinson R C, Turbedsky K, Kaiser D A, et al. Crystal structure of Arp2/3 complex[j]. Science,200(294): [29] Higgs H N, Pollard T D. Regulation of actin filament network formation through ARP2/3 complex: Activation by a diverse arrayof protein[j]. Annu Rev Biochem,200(70): [30] Smith T F, Gaitatzes C, Saxena K, et al. The WD repeat: a common architecture for diverse functions[j]. Trends Biochem Sci,999,24 (5):8-85. [3] Hiltunen J K, Wenzel B, Beyer A, et al. Peroxisomal multifunctional beta-oxidation protein of Saccharomyces cerevisiae. Molecular analysis of the fox2 gene and gene product[j]. J Biol Chem,992,267(0): [32] Hardwick K G, Pelham H R B. SED6 is identical to ERG6, and encodes a putative methyltransferase required for ergosterol synthesis[j]. Yeast,994,0(2): [33] Pan X, Ye P, Yuan D S, et al. A DNA integrity network in the yeast Saccharomyces cerevisiae[j]. Cell,2006,24(5): [34] Szappanos B, Kovacs K, Szamecz B, et al. An integrated approach to characterize genetic interaction networks in yeast metabolism[j]. Nat Genet,20(43):

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