Appendices

Transcription

1 Lung epithelial cell differentiation in human and mouse Song, Juan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Song, J. (2016). Lung epithelial cell differentiation in human and mouse: Environment, epigenetics and epigenetic editing [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Appendices

3

4 Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Inleiding Ondanks vele aanwijzingen dat roken tijdens de zwangerschap schadelijk is voor de groei en ontwikkeling van het ongeboren kind, de foetus, blijft 30% van de vrouwen roken tijdens de zwangerschap. Bevolkingsonderzoek laat zien dat blootstelling aan rook tijdens de zwangerschap het risico verhoogt op ontwikkeling van astma op de kinderleeftijd. Daarnaast lijkt roken tijdens de zwangerschap een risicofactor te zijn voor ontwikkeling van de chronische rook-gerelateerde ziekte COPD later in het leven. Dit suggereert dat de kiem voor het ontstaan van COPD op volwassen leeftijd al gelegd wordt tijdens de ontwikkeling in de baarmoeder. Risicofactoren op een bepaalde ziekte kunnen erfelijk zijn en liggen dan vast in ons erfelijk materiaal, ons DNA. Daarnaast kunnen tijdens het leven veranderingen optreden in het gebruik van het DNA, zogenaamde epigenetische veranderingen. Epigenetische mechanismen zoals veranderingen in DNA methylatie en modificaties van het DNA-bindende eiwit histon zouden daaraan ten grondslag kunnen liggen. Meer kennis over de epigenetische mechanismen bij COPD zou nieuwe targets kunnen opleveren voor de ontwikkeling van epigenetisch gebaseerde medicijnen. Doel van het onderzoek Het algemene doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was 1) het in kaart brengen van de moleculaire effecten van roken van de moeder tijdens de zwangerschap op de (rook-geïnduceerde) longschade in het nageslacht in een experimenteel muismodel, 2) onderzoek doen naar epigenetische mechanismen die verband houden met de verhoogde ontwikkeling van slijm producerende cellen en slijmproductie in de long bij personen met COPD, en 3) het testen van herschrijven van epigenetische veranderingen ( epigenetische editing ) als een instrument om de slijmproductie te verminderen. 163

5 Appendices Epigenetica Epigenetica verwijst naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan een "stabiel overerfbaar fenotype als gevolg van veranderingen in een chromosoom, zonder veranderingen in de DNA-sequentie (volgorde van de baseparen, ook wel genotype genoemd)". De term "epigenetics werd oorspronkelijk bedacht door C. H. Waddington. Hiermee verklaarde hij de observatie dat een stamcel met behoud van zijn genotype, kan uitgroeien (differentiëren) tot verschillende celtypen met een verschillende functie (fenotype). Als zodanig is de epigenetica belangrijk voor het handhaven van genexpressie patronen (fenotype) tijdens celdelingen gedurende de levensduur van de cel, en zelfs gedurende meerdere generaties van organismen. Epigenetische processen spelen dus een belangrijke rol in genregulatie, en recente studies hebben de relevantie van epigenetische disregulatie aangetoond als onderliggend voor diverse ziekten waaronder astma en COPD. In de kern van een cel wordt het chromatine compact gehouden doordat DNA strak gewikkeld is rond histoneiwitten. Wijzigingen in aanwezigheid van epigenetische markeringen zoals methylgroepen rond het DNA, kunnen de expressie van genen beïnvloeden. Wanneer een gen op bepaalde posities veel methyl groepen heeft zal dit gen niet functioneel zijn (er wordt geen eiwit gevormd). Roken tijdens de zwangerschap Bevolkingsonderzoek laat zien dat nakomelingen van moeders (maar ook vaders) die rookten tijdens de zwangerschap een grotere kans hebben op het krijgen van infecties in de long, benauwdheid en astma. Onderliggend hieraan is dat blootstelling aan sigarettenrook tijdens de zwangerschap de longontwikkeling van de ongeboren vrucht verstoort waardoor deze kinderen met een slechtere longfunctie geboren worden. Een slechte longfunctie is een risico factor voor het krijgen van astma en COPD later in het leven. Daarnaast is in proefdiermodellen aangetoond dat blootstelling 164

6 Nederlandse samenvatting aan sigarettenrook tijdens de zwangerschap effect heeft op de expressie van genen die belangrijk zijn voor een juiste ontwikkeling van de long. Dit zijn grotendeels dezelfde genen die belangrijk zijn bij longweefselherstel later in het leven. Vroege blootstelling vóór de geboorte heeft dus hiermee potentiële gevolgen op lange termijn die van invloed kunnen zijn voor de ontstaansmechanismen van een longziekte op de volwassen leeftijd. Het risico op COPD wordt nog verder verhoogd als vroeg blootgestelde personen zelf ook gaan roken of blootgesteld worden aan omgevingsrook of andere luchtvervuiling. Hoofdstuk 2 beschrijft een experimentele studie in muizen waarbij het effect van blootstelling aan sigarettenrook tijdens de zwangerschap op de ontwikkeling van het luchtwegepitheel, de laag cellen die de bekleding vormt van de luchtwegen, wordt onderzocht in nakomelingen. Deze studie liet een verstoorde epitheelcel ontwikkeling zien in pasgeboren nakomelingen van moeders die blootgesteld waren aan rook tijdens de zwangerschap. Deze pups hadden minder trilhaardragende cellen in de luchtwegen en het lagere aantal cellen ging gepaard met een lagere genexpressie van het gen Foxj1 dat belangrijk is voor de aanmaak van trilharen. Trilhaardragende cellen helpen de long schoon te houden aangezien ze met hun trilharen slijm, stof, microben en andere schadelijke stoffen naar de mond helpen te transporteren. Wanneer slijm aanwezig blijft vormt het een risico voor het ontstaan van infecties. Onze bevinding ondersteunt hiermee de observatie van het vaker voorkomen van luchtweg infecties bij jonge kinderen van een rokende moeders. Bovendien hadden rook-blootgestelde pups een hogere expressie van de genen Spdef en Foxm1, genen die betrokken zijn bij de aanleg en ontwikkeling van de slijm producerende cel, ook wel slijmbekercel genoemd. Hoewel er nog geen slijmbekercellen aanwezig waren in de longen van de pasgeboren muizen kan deze bevinding wel de verhoogde gevoeligheid voor het ontstaan van deze slijmbekercellen verklaren op latere leeftijd. In hoofdstuk 3 werden de studies in dit muismodel voortgezet met aanvullende rook blootstellingen aan volwassen nakomelingen van 165

7 Appendices moeders die blootgesteld waren aan sigarettenrook tijdens de zwangerschap. Hierbij was de vraag of vroeg blootgestelde nakomelingen extra gevoelig waren voor ontsteking en weefselverlittekening, ook wel remodelering genoemd, in de longen nadat ze zelf ook gedurende 3 maanden aan rook waren blootgesteld op volwassen leeftijd. Veranderingen in de long werden gekoppeld aan expressie van genen die belangrijk zijn bij ontsteking, het antioxidant systeem, longweefselherstel, veroudering en genen die gerelateerd zijn aan het onschadelijk maken van schadelijke stoffen (sigarettenrook) in het lichaam. Uit deze studie bleek dat volwassen nakomelingen van rokende moeders, ongeacht of ze zelf ook aan rook waren blootgesteld of niet, een lagere expressie hadden van genen die beschermend zijn met betrekking tot het ontwikkelen van ontsteking, oxidatieve stress en veroudering, en een hogere expressie van genen die belangrijk zijn voor longweefselherstel. Rookblootstelling van de nakomelingen zelf bevorderde weefselremodelering (meer verdikking van gladde spieren en hogere expressie van het slijm-gerelateerde gen Muc5ac), ontsteking (verhoogd aantal macrofagen, dit is een bepaald type witte bloedcellen belangrijk voor opruimen van rookdeeltjes) en hogere genexpressie van genen die belangrijk zijn bij weefselherstel en het onschadelijk maken van schadelijke stoffen. Vroege blootstelling aan rook tijdens de zwangerschap verergerde deze effecten in de meeste gevallen niet. Chronische slijmoverproductie en COPD COPD is een ongeneeslijke, progressieve longziekte die zich manifesteert in de grote (chronische bronchitis) en kleine luchtwegen en de longblaasjes (emfyseem). Blootstelling aan sigarettenrook is de belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van COPD. Chronische bronchitis gaat gepaard met chronische aanwezigheid van ontstekingscellen en overproductie van slijm in de luchtwegen. Bij rokers en veel personen met COPD is deze overproductie van slijm een belangrijke oorzaak van klachten zoals hoesten 166

8 Nederlandse samenvatting en benauwdheid. Het slijm wordt geproduceerd door slijmbekercellen in de grote luchtwegen. Slijmbekercellen ontstaan vanuit de normale luchtwegepitheelcellen na langdurige blootstelling aan sigarettenrook. In de epitheelcel zijn verschillende signaleringsroutes beschreven die de verandering naar een slijmbekercel en slijmproductie bevorderen. Gronings onderzoek in rokers zonder een longaandoening en personen met COPD heeft aangetoond dat een aantal verschillende genen verhoogd tot expressie komen in epitheel van rokers en personen met COPD die hoesten en te veel slijm produceren. Een van de gevonden genen, het gen SPDEF heeft hierbij een centrale rol en stuurt een heel netwerk van genen aan. SPDEF bevordert hiermee de ontwikkeling van slijmbekercellen, als ook slijmproductie. De productie van eiwitten zoals SPDEF wordt gereguleerd door epigenetische mechanismen waarbij een gen aan of uit gezet kan worden. In hoofdstuk 4 waren we geïnteresseerd of I) slijmbekercel uitgroei (differentiatie) gepaard gaat met een verandering in DNA methylatie van SPDEF en II) of deze epigenetische regulatie van SPDEF anders is in luchtwegepitheelcellen van personen met COPD dan bij controle personen. Hiertoe zijn ongedifferentieerde luchtwegepitheelcellen van personen met COPD en controles gedurende vier weken gekweekt tot de cellen waren uitgegroeid tot slijmbekercellen en trilhaardragende epitheelcellen. Deze uitgroei werd gevolgd door wekelijks een monster te nemen dat werd onderzocht op genexpressie en DNA methylatie. In deze studie hebben we aangetoond dat epitheelcel differentiatie onder invloed van toevoeging van de signaalstof interleukine 13 (IL-13), ter bevordering van slijmbekercel differentiatie, gepaard gaat met een toename van expressie van genen die betrokken zijn bij slijm productie zoals MUC5AC en SPDEF. Het gen FOXA2 dat SPDEF expressie remt kwam lager tot expressie. Interessant was dat slijmbekerceldifferentiatie en toename van SPDEF genexpressie was geassocieerd met een verandering van de DNA methylering binnen het SPDEF gen. Dit was, waarschijnlijk door de toevoeging van IL-13 aan het kweeksysteem, niet verschillend voor COPD in vergelijking met de controle 167

9 Appendices cellen. Interessant genoeg werden er wel verschillen gevonden wanneer het experiment herhaald werd zonder de toevoeging van IL-13 in het kweeksysteem. Cellen van personen met COPD hadden na 14 dagen gekweekt te zijn een hogere expressie van SPDEF en MUC5AC en dit ging gepaard met een lagere methylatie van SPDEF. Deze studie laat daarmee zien dat de epigenetische mechanismen met betrekking tot SPDEF verstoord zijn in COPD en daarmee belangrijk en verklarend kunnen zijn bij de ontwikkeling van slijmbekercellen en slijmproductie. In hoofdstuk 5 beschrijven we een mogelijke vorm van therapie gebaseerd op onze bevindingen in de eerdere hoofdstukken. Het doel was DNA methylering van het SPDEF gen te verhogen en zodoende slijmproductie te verminderen. Dit is gelukt in de humane longcellijn A549 die net als primaire cellen van controles en personen met COPD de genen SPDEF en MUC5AC tot expressie brengt en slijm produceert. In deze studie kon SPDEF transcriptie negatief gereguleerd kunnen worden in de endogene situatie met behulp van DNA bindende domeinen (zinkvingers), die gemaakt waren om aan het SPDEF gen te binden, en vervolgens gefuseerd waren aan transcriptieregulerende eiwitten. Deze bevindingen openen mogelijkheden voor het epigenetisch, en dus mogelijk blijvend, veranderen van het SPDEF gen als nieuwe therapeutische strategie voor het remmen van slijmproductie. Algemene conclusies van dit proefschrift De studies die beschreven staan in dit proefschrift laten zien dat vroege blootstelling aan sigarettenrook tijdens de zwangerschap trilhaarcelontwikkeling remt en expressie van het slijmbekercel gerelateerde gen Spdef verhoogt in de longen van pasgeboren muizen. Echter, in volwassen muizen had vroege blootstelling aan rook tijdens de zwangerschap effect op genen met een andere functie zoals betrokkenheid bij oxidatieve stress, veroudering en longweefsel herstel. Rookblootstelling 168

10 Nederlandse samenvatting van de nakomelingen zelf had daarentegen effect op ontsteking, remodelering, veroudering en genen die betrokken zijn bij het onschadelijk maken van toxische stoffen. Dit effect werd niet verder verstrekt door vroege blootstelling tijdens de zwangerschap. Met behulp van celkweken van longcellen van personen met COPD werd vastgesteld dat het gen SPDEF een belangrijke rol speelt bij het ziektemechanisme en dus een goede target voor therapie zou kunnen zijn. SPDEF DNA methylering bleek verstoord te zijn en was hiermee een goede kandidaat voor epigenetische benadering met behulp van epigenetische editing. In een eerste studie in een cellijn bleek inderdaad dat gerichte verhoging van methylatie van het SPDEF gen leidde tot een remming van SPDEF transcriptie en slijmproductie. Dit veelbelovende resultaat is een eerste stap en opent perspectieven voor het moduleren van expressie van ieder gewenst gen voor de toekomst. Verder onderzoek moet echter eerst de specificiteit en de duurzaamheid van de epigenetische modulatie vaststellen, met het uiteindelijke doel om blijvende herprogrammering (bijvoorbeeld slijmreductie) in het organisme te bewerkstelligen. 169

11

12 Chinese summary 中文摘要 前言尽管有许多研究表明, 怀孕期间吸烟有害于胎儿的生长发育, 但仍有 30% 的女性在怀孕期间吸烟 目前已有流行病学研究表明, 孕妇在怀孕期间吸烟会增加儿童患哮喘的风险 此外, 产前的吸烟暴露可能会成为日后生活中胎儿患慢性堵塞性肺疾病 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 的危险因素 这表明, 在成年期发展为 COPD 的危险可能起始于胎儿在子宫的发育过程 此外, 已有研究表明 : 特定疾病的危险因素是可以遗传的, 可以存在于我们的遗传物质 DNA 中 而且随着我们的生长发育, 我们的 DNA 修饰也可以随之发生变化, 即所谓的表观遗传变化 表观遗传学机制, 比如 DNA 甲基化的变化和 DNA 结合蛋白 ( 组蛋白 ) 修饰的改变, 可能用于解释患 COPD 这种疾病的危险因素的遗传性 综上所述, 针对 COPD 的表观遗传学机制的研究可为对基于表观遗传学的 COPD 治疗的药物研发提供新的靶标 研究目的本论文的研究总体目标主要包括以下几方面 :1) 利用小鼠抽烟实验模型, 研究母鼠孕期吸烟对子代肺损伤在分子学水平的影响 ;2) 研究与 COPD 患者肺组织中粘液细胞数量增加和粘液过度分泌相关的表观遗传学变化 ;3) 通过改变病人的表观遗传学特征 ( 表观遗传学编辑 ), 以减少 COPD 患者肺组织中粘液的产生与分泌 表观遗传学表观遗传学是指在基因的核苷酸序列 ( 碱基对的序列, 也叫基因型 ) 不发生改变的情况下, 研究基因表达 ( 表型 ) 发生的可遗传性变化的分子学机制 表观遗传学 这一概念最初是由 CH 沃丁顿提出 他利用这个机制来解释干细胞在保持其基因型的同时, 可成长分化成具有 171

13 Appendices 不同功能 ( 表型 ) 的不同类型细胞的现象 同理, 表观遗传学机制对于在生物体一生中细胞分裂前后, 甚至于几代生物体之间细胞保持其表型 ( 基因表达 ) 很关键 因此, 表观遗传学在基因调控中起着极其重要的作用 近期的研究结果也表明, 表观遗传学机制失调与多种疾病包括哮喘和 COPD 等的发生具有相关性 在细胞核中,DNA 紧紧缠绕在组蛋白上, 形成一种称为染色质的紧凑结构 表观遗传学 标签 ( 例如 DNA 甲基化和组蛋白修饰 ) 的变化, 可以影响基因的表达 基因在其某特定位置的甲基化改变可以阻止或促进其翻译表达过程 怀孕期间吸烟流行病学的调查结果显示, 在怀孕期间吸烟的母亲 ( 或父亲 ) 的子代患肺部感染, 呼吸急促和哮喘的机率更大 其潜在的机制是, 在怀孕期间, 香烟烟雾暴露会影响胎儿的肺发育, 使得这些儿童在出生时具有较差的肺功能 ; 而较差的肺功能是日后生活中发展为 COPD 和哮喘的危险因素 此外, 动物实验模型的研究结果表明, 在怀孕期间暴露于香烟烟雾, 会影响那些与肺的正常发育密切相关的基因的表达 同时, 大多数的这些基因在以后的生活中对肺组织损伤的修复也起着十分重要的作用 所以, 怀孕期间 ( 香烟 ) 烟雾暴露具有潜在的长期后果, 可能会影响子代成年后肺部疾病的发生 并且值得注意的是, 对于早期 ( 香烟烟雾 ) 暴露的个体, 在日后生活中存在的本身暴露于香烟或环境烟雾或其他的空气污染会进一步增加其罹患 COPD 的风险 第 2 章着重阐述了在小鼠的抽烟模型中妊娠期间香烟烟雾暴露对于气道上皮的发育分化的影响 我们发现, 在怀孕期间吸烟的母鼠的新生子代小鼠的气道上皮细胞的分化发育受到了影响, 这些幼仔在呼吸道中具有较少的纤毛细胞 已有研究证实,Foxj1 基因对纤毛的生长有重要的调控作用 ; 而且我们的研究结果也表明, 纤毛细胞的数量减少和 Foxj1 基因表达水平的降低相关 此外, 纤毛细胞有助于保护肺部, 由于纤毛的规律性振动有助于运送肺中存在的粘液 灰尘 微生物等有害物质到口中 当粘液滞留在气道中时, 会增加感染的发生风险 因 172

14 Chinese summary 此, 我们的研究结果也与吸烟母亲的年幼孩子具有较高的感染发病率这一现象一致 此外, 我们还发现, 在烟雾暴露幼仔中与粘液细胞 ( 也被称为杯状细胞 ) 分化和与粘液分泌相关的 SPDEF 和 Foxm1 基因的表达量较高 虽然在新生小鼠的肺中没有杯状细胞的存在, 但这一发现可以用于解释之后的较高的杯状细胞发生易感性 第 3 章的研究延续第 2 章的研究内容, 在相同的小鼠抽烟模型中, 给予怀孕期间接受香烟烟雾暴露的母鼠的成年后代以烟雾暴露处理 本章旨在探究早期烟雾暴露的后代是否在面对成年期烟雾暴露 (3 个月 ) 时其肺组织对炎症和组织修复 ( 重塑 ) 表现得更为敏感 本章中发现的肺组织中发生的变化, 和多个信号通路中的基因表达有关, 例如一些在炎症 抗氧化系统 肺组织修复和老化过程中起着重要作用的基因, 以及将体内的有害物质 ( 香烟烟雾 ) 无害化的相关基因 在本章的研究中, 我们发现来自于吸烟母鼠的成年子代, 无论它们本身在成年后是否接受烟雾暴露, 其体内对炎症 氧化应激和老化的发展有保护作用的相关基因的表达水平都较低, 并且与肺组织修复有关的重要基因都有较高的表达水平 子代自身抽烟会引发组织的重塑 ( 包括平滑肌的增厚更显著, 与粘液有关的基因 MUC5AC 的表达水平增加 ) 和炎症 ( 包括对去除烟雾颗粒有重要作用的一种特定类型的白细胞 巨噬细胞的数量增加 ) 此外, 子代成年后接受的烟雾暴露处理也会提高对组织修复和有害物质的解毒起着重要作用的基因的表达水平 值得注意的是, 大多数情况下, 怀孕期间的早期烟雾暴露并不能引发这些生理学变化 慢性粘液分泌过剩和慢性阻塞性肺疾病 COPD 是一种无法治愈的 渐进性的肺部疾病, 这表现在大气道 ( 慢性气管炎 ), 小气道和肺泡 ( 肺气肿 ) 暴露于香烟烟雾是罹患 COPD 的主要危险因素 慢性支气管炎与慢性炎性细胞浸润以及过度的气道粘液分泌有关 对于吸烟者和 COPD 患者而言, 这种过剩的粘液分泌是产生咳嗽和呼吸困难等症状的重要原因 粘液由在大气道中的杯状细胞 173

15 Appendices 产生, 而长期暴露于香烟烟雾会导致杯状细胞数量增加, 粘液分泌增多 在上皮细胞中存在若干信号通路与促进杯状细胞分化及粘液产生有关 格罗宁根哮喘和 COPD 研究中心对吸烟者的研究表明, 无肺部疾病的吸烟者及患有 COPD 同时伴有咳嗽和过多粘液分泌症状的吸烟者体内, 多种基因在其上皮细胞中具有较高的表达水平 其中一个很重要的基因是 SPDEF, 该基因是这整个调控网络中的关键基因 已有研究结果表明, SPDEF 可以促进杯状细胞的分化以及粘液的产生 SPDEF 蛋白的表达可以被表观遗传学机制调控, 开启 或 关闭 该基因的表达 在第 4 章中, 我们着重针对以下几个问题展开研究 :(1) 杯状细胞的生长 ( 分化 ) 是否伴随着 SPDEF 基因的 DNA 甲基化的变化 ;(2) 比较研究在 COPD 患者和对照组的气道中 SPDEF 基因的表观遗传调控的变化 为此, 我们从 COPD 患者和对照组的气道中分别分离原代上皮细胞, 连续培养四个星期至分化出杯状细胞和纤毛上皮细胞, 并且在这个过程中监测基因的表达和 DNA 的甲基化 在这项研究中, 我们发现, 为促进杯状细胞分化添加信号物质白介素 13(IL-13) 后, 在对照组上皮细胞的分化过程中伴随着与黏液产生相关的基因如 MUC5AC 和 SPDEF 表达的增加, 以及与抑制黏液产生有关的基因 FOXA2 的表达水平的降低 很吸引人的一个实验结果是, 该分化过程中 SPDEF 基因表达的增加与 SPDEF 的 DNA 甲基化的改变之间存在正相关关系 该变化也同样发生在来自于 COPD 个体的上皮细胞分化过程中 此外, 在没有加入 IL-13 的培养系统中, 我们比较分析了来源于 COPD 个体和对照组个体的上皮细胞分化至第 14 天时相关基因的表达水平和甲基化水平 有趣的是, 我们发现, 来自 COPD 个体的上皮细胞中 SPDEF 和 MUC5AC 基因具有较高的表达水平, 这与 SPDEF 基因的较低的 DNA 甲基化水平有关 由此可知, 在 COPD 患者体内 SPDEF 基因的表观遗传学机制受到干扰, 这也可能是 COPD 患者体内杯状细胞产生和粘液分泌增多的重要原因 第 5 章主要的研究目的是验证通过改善在前面的章节中发现的表观遗传学变化对 COPD 治疗具有的潜在意义 我们主要想通过增加 SPDEF 基因的 DNA 甲基化, 从而降低气道中上皮细胞的粘液产生 由于, 人肺 174

16 Chinese summary 细胞系 A549 具有和 COPD 原代细胞类似的 SPDEF 和 MUC5AC 基因的表达增加和产生黏液等特征, 因此在本章中我们选择此细胞系开展相关的研究工作 在本章的研究中, 在融合有可与 SPDEF 基因特异性结合的 DNA 的结构域 ( 锌指结构 ) 以及 DNA/ 组蛋白甲基化转移酶的酶活性域的协同作用下, 可实现对 SPDEF 基因表达的负调节 ; 同时,SPDEF 基因涉及的下游通路中和粘液有关的基因 MUC5AC 和 AGR2 也被负调控 综上所述, 以上研究结果开辟了利用表观遗传学机制 ( 从而可能永久性 ) 地改变 SPDEF 基因表达的可能性, 这也是一种抑制粘液产生的新的治疗策略 本文的一般结论本论文的研究表明, 早期 ( 孕期 ) 暴露于香烟烟雾可抑制新生子代小鼠肺中的纤毛细胞的产生, 并且可增加与杯状细胞有关的基因 Spdef 的表达 在成年小鼠中, 早期 ( 孕期 ) 暴露于香烟烟雾对具有不同生理学功能的基因的表达水平有影响, 例如可影响与氧化应激, 衰老和肺组织修复有关的一些基因的表达 而且, 子代在成年期存在的自身的烟雾暴露, 对于与炎症, 组织重塑, 老化以及有毒物质的解毒等过程相关基因的表达有影响 然而这种影响并没有由于孕期的烟雾暴露得到进一步增强 此外, 通过对来源于 COPD 患者的气道上皮细胞的研究, 我们推测 SPDEF 基因可能在 COPD 的发病机制中起着十分重要的作用, 因此该基因可能是一个未来用于治疗 COPD 的良好靶标 由于我们发现在来自 COPD 个体的气道上皮细胞中,SPDEF 基因的 DNA 甲基化似乎被干扰, 可成为表观遗传学编辑的一个很好的靶标 而且细胞系的初步研究结果也表明, 有针对性的增加 SPDEF 基因的甲基化确实可抑制 SPDEF 基因的表达和粘液的产生 这些极具发展前景的研究成果是通过改变表观遗传学实现 COPD 治疗迈开的第一步, 为调节任意靶基因的表达开辟了广阔的前景 但是值得注意的是, 进一步的深入研究必须先验证表观遗传学编辑的特异性和长久性, 从而最终可实现对机体生理学表现方面的持久的改善 ( 例如抑制粘液分泌 ) 175

17

18 Acknowledgements Acknowledgements Life is a series of destinations, and now that I have reached one of them, I am truly excited. Now is also the time to look back on my PhD journey, a valuable path in which I received an enormous amount of help, encouragement and support from a number of people. I would like to take this opportunity to express my sincere gratitude to all of you, my tutors, friends, and also my family. First and foremost, I would like to thank my promoter Prof. Dr. Marianne G. Rots and co-promoter Dr. Machteld N. Hylkema for their supervision and help in performing this research and completing this dissertation. Dear Marianne, thank you for giving me the opportunity to study in this excellent research group of yours, the epigenetic editing group. You opened a novel perspective for me and guided me through this amazing field. You have influenced me a lot with your professional insights, your passion for science, your logic and fine organization. I also really appreciated your warm hospitality during the parties at your house, which helped me to become one of the group and get to know everyone better, and which were also great opportunities to enjoy delicious foods from different countries. Dear Machteld, thank you for giving me the great opportunity to work on this amazing project. I am such a lucky girl to have you as my supervisor. You always try your best to support me and back me up, from obtaining additional grants supporting the project, the help in preparing my oral presentations and the writing from scratch, to all the help in experiments and trouble shooting. You always made time for me and helped me out. You taught me to be more positive and look at life from the pink sight. Thank you for all your consideration and encouragement over the years. Marianne and Machteld, I also would like to express my special appreciation for your care to my 177

19 Appendices career. You even set a special meeting for me to discuss whether I should do a postdoctoral after my PhD, and thanks for your recommendations for the postdoctoral positions that I applied for. I hope in the future we will get the chance to further collaborate. My sincere gratitude also goes to Prof. Dr. Dirkje.S. Postma, Prof. Dr. Gerard. H. Koppelman and Prof. Dr. Christian. Taube. Thank you for the acceptance to be the members of the reading committee, all your time and efforts on reading my thesis, and the approval of my thesis. Dear Dirkje, I very much enjoyed the symposium that was organized upon the occasion of your retirement on April 1 st You are such a nice person and the best model for me as you have become worldwide one of the greatest scientists in the field of asthma and COPD.. Dear Gerard, your valuable comments and suggestions for my thesis were much appreciated. I also would like to express my appreciation to Prof. Dr. Jie Yang, my dearest promoter for my study in a Combined Master s and Ph.D. Program of Tianjin Medical University, China. Dear Prof. Yang, thank you for guiding me into the field of molecular biology, and the training for me to become a molecular biologist. Your deep passion and sacrifice for scientific research really urge me to move forward. Besides that, thank you for all your efforts to make our P100 group as a home, and all the fun, dinner and travel together. In addition, many thanks to you for the recommendation of me to Dr. Machteld Hylkema. My stay in Groningen opened a new world for me which allows access to the whole world now. I owe you the termination of my PhD in Tianjin Medical University as well. I promise it will happen in Next, I would like to express my appreciation to Dr. Loes E.M. Kistemaker, Prof. Dr. Reinoud Gosens and Prof. Dr. Pieter Hiemstra 178

20 Acknowledgements for setting up of the ALI culture model of human bronchial epithelia cells and also for the valuable suggestions and comments for my conference abstract and the manuscript. Dear Loes, thanks for all your help and patience to teach me hand by hand to start the ALI culture model, and sharing the human bronchial tissue from donors with me. I also appreciated the help from Prof. Dr. Irene H. Heijink and Jacobien Noordhoek. Dear Irene and Jacobien, thank you for our fruitful collaboration and for sharing the precious ALI samples from subjects with COPD and controls, providing the H292 cell line, and your valuable comments for Chapters 4 and 5.. Besides that, I really appreciated your instructions for the isolation and culture of the mouse trachea epithelial cells, even though the results did not make it to my final thesis. My sincere gratitude also goes to Prof. Dr. Wim Timens and Dr. Corry-Anke Brandsma. Dear Wim, thank you for the help with the bronchial tissue of the transplant lung of the patients with COPD. I am deeply impressed by your quick mind, your expertise as a pathologist, and your rigorous but also valuable comments and suggestions for my manuscript, as well as for my presentations during the weekly lab meetings. Dear Corry-Anke, thank you for the efforts and comments on my manuscript of Chapter 4. I really enjoyed the time when we were office mates. I would like to thank all the people in our pulmonary research group. Dear Marjan, I am grateful for your support and help with all the different experiments (staining of sections, the mouse experiments, scanning, harvest of bronchial tissue from human transplanted lungs and so on) in the past three years. You are so kind and really help me out a lot. Thanks also for your kindness to be my paranymph. Dear Wierd, thank you for all the help with PCR, RNA/DNA extraction, cdna synthesis, LDM and western blot. I wish you all the best with 179

21 Appendices your marriage life. Dr. Patricia, thanks for your kind suggestions on how to start the research project at the beginning of my PhD. You are such a nice person and I did enjoy the time with you in the office. I wish you enjoy and success in your new job at the Hanzehogeschool Groningen. Dear Junjun, you are the first person I met in Groningen when you picked me up from the train station. With you in the same office and research group, I didn t feel alone even at the fresh beginning. You guided me to get used to the new environment gradually. Thank you for all your help and companionship. I enjoyed the time we did the QT-PCR and cell culture together, and also having lunch together in the coffee room. Lucky me! Now we are defending our thesis at the same day, who would have thought about that. Wish you all the best with both your life and your career! Dear Karolin, you were the first colleague I met when I stepped into the office. I really appreciated that you took the time to guide me through the pathology department and the route from office to entrance of the building twice that day. Thank you also for teaching me the pyrosequencing technique and the collaboration in the mouse smoke experiments. I wish you good luck with finishing your thesis. Dear Jennie, you are such a sweet girl. I enjoyed the Pancakes we baked together in 2015, which was the first time I learned how the make Dutch Pancakes. I really appreciate all your help and support and also your willingness to be my paranymph. Wish you all the best in your life and your research project! Dear Hataitip, I really appreciate your company in the office. Thanks for your Tai foods during your house warming. I really liked the desserts you made. Wish you success with your projects! Dear Maaike, I am really grateful for your encouragements and supports. Although we applied for the same postdoc position in Munich, I felt lucky to have your 180

22 Acknowledgements company as you put me at ease for my first job interview. Good luck with your Veni application and your next postdoctoral position. I would like to thank all the people in our EGE research group. Dear Melanie, thank you for your hard work on the lentiviral vector construction. You made many things much easier for me. You are such a smart and talented colleague. Good luck with your project and I am expecting your thesis in near future. Dear Rutger, I really appreciate your help with all the protocols and troubleshooting related to lentiviral transduction, QT-PCR and barcode sequencing. You are so talented and hard working. Good luck with finishing your PhD and your defense! Success with your new projects in Berlin! Dear David, I am so grateful to have you in the same research group. You taught me so much from the zinc finger design, lentiviral transduction, ChIP, to small guide RNA design. I am really impressed by your laugh and gentleness. Success with finishing up your projects! Dear Monique, thank you for all the help and supports. You are such a creative, independent and enthusiastic scientist. I am always inspired by your passion in science. I am expecting your thesis soon. No doubt you will success in your position application. Wish you all the best with your future career! Dear Pytrick and Jelleke, I quite appreciated all your help and support in the past three years. You keep the lab and our EGE groups well organized and always help me out. Without you, I could not have started my real experiments at all. Wish you all the best and smile every day! Dear Julio, I really miss your red beard and your greetings. You are such a nice and optimistic man. Good luck with your thesis writing and defense. Dear Desiree, you are such a highly motivated colleague. Thank you for your company during my last experiments. Good luck with your PhD project and your future business. 181

23 Appendices I would also like to express my appreciation to Josee Plantinga, as well as Dr. Annemieke, Smit-van Oosten, Dr. Andre Zandvoort and Michel Weij from the Animal Facility Groningen for their great help with the mouse smoke experiments. I am also grateful to all the secretaries, Ellen, Harriet, Ingrid, Jenny, Marijke and Annet. You are always so nice and helpful for me. Thank special to Jenny for bringing me with your car in the lab day. Many thanks to my other friends in our department for your supports and encouragement. Dear Reeny and Mina, you are so sweet and I enjoyed a lot the time with you. Good luck with finishing your projects. Almost there! I wish you success with your future defense. Dear Nato, thank you for being my officemate for the past year. I like your attitude to life very much. Your persistence and hardworking paid off. Wish you all the best with your life and new project in New York! Dear Agnieska, Mathilde, Ali, Ahmad, Jan, Rik and Siobhan, I wish you good luck with your projects and success with your career. I would like to express my gratefulness to people who I know in our department, pathologist Dr. Lydia Visser, Prof. Dr. Anke and Dr. Joost Kluiver. Thank you for your kindness, greetings, and concerns. I would like to thank all the members of O&O lab and DNA lab. Dear Hans, Bea, Mirjam, Lorian, Marian, Jasper and Debora, thanks for all your support and help during the past three years. You are so nice and always helped me out when I faced some experimental difficulties. Many thanks to Rianne van der Wiel, Anniek Koers, Senna Horsten, Meike Ploeg and Tessa ter Beest, who were students in our group during my project. Thank you for your efforts and hardworking! My big and warmest thanks also go to my Chinese friends in Groningen: Rae Wu, Ye Yuan, Weijie Du, Fubiao Niu, Chengcheng 182

24 Acknowledgements Ren, Huifang Yin, Jun Li, Xiang Zen, Xueting Bai, Ranran Li, Ee Soo Lee, Yuan He, Liwen Zhang, Zhuoran Yin, Cheng Chen, Benhui Li, Rong Wang, and Jin Han. Dear Rae, thank you for your company for this year. I already miss you a lot. I will never forget your good cooking, and the time we were together. You are such a charming girl and you can easily make friends with different people, which will bring you to anywhere you like. I wish you all the best for your future life and projects in Pennsylvania. Dear Chengcheng, my dearest paranymph, thank you for your friendship and company. I also really appreciated to your commens on my Chinese summary. You are such a talented and hardworking girl. No worries! More relaxes. I wish you all the best with your projects and future defense. Dear Jun, many thanks to you for the company when I needed to go the Media Markt and the Outlet stores. Good luck with your manuscript writing and thesis defense. Dear Xiang, thanks for the good time with you in the ERS conference, Amsterdam, I am also grateful for your help with all my post. You made my life much easier. I wish you good luck with your thesis writing and your future defense. Dear Ye and Weijie, I very much enjoyed to have you around. Thank you for the dinner party in your home during the Spring Festival Your PhD defenses are not far away either. No worries! Success with your projects and future defenses. Dear Fubiao, It was always a good time talking with you. Thanks for the delicious foods especially the Hongshao Pork in your dinner party. Good luck with all your experiments. I am expecting the good news from Dandan and you in September. Dear Huifang, it was such a good time we were together for the last year. You learnt me to how to enjoy the life. I really appreciated it. Dear Xueting, thanks for your hospitality when Rae and I were in Milan. I wish you success with your finishing of thesis writing and your future defense. Dear Liwen, thank you for your 183

25 Appendices company in last years. We had many good times together. I really enjoyed the time we traveled together in Palma and learnt the Tango dance together. I also appreciated the delicious foods in your apartment when your parents were in Groningen. Good luck in finishing your thesis writing and success in your coming defense. Dear Cheng Chen, thank you for your company of the one and half years and also the helps to my experiments. You are such a positive and nice person. I was also very grateful to your invitation for dinners. I wish you happiness and success with your career. Dear Rong, you are like a sister to me. I knew you as a teacher from my bachelor study. How lucky me! I also met and stay with you in Groningen. I would like to express my special thanks to you for the good time we were in North Europe and the apartment I took over from you. I wish you all the best with your life and career. Dear Jin, I miss you so much. Thank you for being officemate for my first half a year in Groningen. You and Junjun made me adapt to the life of abroad much easier. Wish you all the best in Shanghai. The last but not the least, I would like to express my gratitude to my dearest families from the bottom of my heart. Thank you for your love, understanding, respect, and continuous support and encouragement. 亲爱的爸爸, 妈妈, 哥哥和妹妹, 感谢你们一直以来的支持和鼓励 一路前行, 感谢你们对我的理解和尊重 祝愿你们永远健康快乐 愿我亲爱的小侄女桐桐健康快乐地成长 我永远爱你们! 184

26 Biography Biography Juan Song was born on July 29 th, 1986 in Anyang, Henan Province, China. From 2005 to 2010, she completed an undergraduate program major in Medical Laboratory Science and minor in law at Tianjin Medical University. In 2010, she was awarded the Bachelor s Degree in Medicine and Law. Subsequently, she started the Combined Master s and Ph.D. Program in the department of Medical Cell biology of Tianjin Medical University, and investigated the role of SND1 in stress granules aggregation and in cell differentiation and proliferation under the supervision of Prof. Jie Yang. In 2013, she was recommended to start her PhD study in the department of Pathology and Medical Biology, University Medical Center Groningen, The Netherlands. Her research project combined both pulmonary pathology (supervised by Dr. M.N. Hylkema) and innovative epigenome editing strategies (in the epigenetic editing group of Prof. Dr. M.G. Rots), which was presented in this thesis entitled Lung epithelial cell differentiation in human and mouse: environment, epigenetics and epigenetic editing. After her defense of her PhD thesis in May 2016, she intends to continue her academic journey in the field of epigenetics and/or pulmonary disease. 185

27 Appendices List of publication Yin J, Ding J, Huang L, Tian X, Shi X, Zhi L, Song J, Zhang Y, Gao X, Yao Z, Jing X and Yang J. SND1 affects proliferation of hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 by regulating IGFBP3 expression. Anat.Rec.(Hoboken) 296: 10: , Gao X, Fu X, Song J, Zhang Y, Cui X, Su C, Ge L, Shao J, Xin L, Saarikettu J, Mei M, Yang X, Wei M, Silvennoinen O, Yao Z, He J and Yang J. Poly(A)(+) mrnabinding protein Tudor-SN regulates stress granules aggregation dynamics. FEBS J. 282: 5: , Su C, Zhang C, Tecle A, Fu X, He J, Song J, Zhang W, Sun X, Ren Y, Silvennoinen O, Yao Z, Yang X, Wei M and Yang J. Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN), a novel regulator facilitating G1/S phase transition, acting as a co-activator of E2F-1 in cell cycle regulation. J.Biol.Chem. 290: 11: , Song J, Meyer K, Kistemaker LEM, Gosens R, Hiemstra PS, Rots MG, and Hylkema MN. Targeted silencing of master transcription factor SPDEF to reduce mucus production in airway diseases by epigenetic editing. European Respiratory Journal, 2015: 46 (suppl 59) Song J, Winkle M, Gjaltema RAF, Cano Rodriguez D, Heijink IH, Rots MG, and Hylkema MN. Targeted epigenetic editing of SPDEF reduces mucus production in human airway epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2016; in revision Song J, Heijink IH, Kistemaker LEM, Reinders-Luinge M, Kooistra W, Noordhoek J, Gosens R, Brandsma CA, Timens W, Hiemstra PS, Rots MG, and Hylkema MN. Aberrant DNA methylation and expression of SPDEF and FOXA2 in airway epithelium of patients with COPD. Submitted Cao J, Song J, Reinders-Luinge M, Kooistra W, Van der Sloot K, Huo X, Timens W, Krauss-Etschmann S, and Hylkema MN. Smoking during pregnancy inhibits ciliated cell differentiation and up regulates secretory cell related genes in neonatal offspring. Submitted 186