384 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No.4 Results TheexpresivevectorpcDNA3.1(-) hhg

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九卉白
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1 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No 人肝细胞生长因子转染 L02 细胞的锌指基因差异表达筛选吴亮张锦前王琦李国力张晨宇王晓春洪源曾辉成军基础论著摘要目的构建人肝细胞生长因子 (hhgf) 真核表达载体, 在 L02 细胞中表达 hhgf 并筛选其中的差异表达基因方法构建 pcdna3.1(-) hhgf 载体, 测序鉴定 ; 其转染 L02 细胞后进行蛋白免疫印迹检测 ; 将 pcdna3.1(-) hhgf 和 pcdna3.1(-) 载体分别转染 L02 细胞后, 提取总 mrna 并逆转录为 cdna, 运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因结果构建的 hhgf 真核表达载体 pcdna3.1(-) hhgf 经酶切和测序鉴定正确 ; 转染 L02 细胞后经蛋白免疫印迹证实 hhgf 存在明确表达 ;pcdna3.1(-) 及 pcdna3.1(-) hhgf 分别转染 L02 细胞后提取总 RNA, 经基因表达谱芯片分析发现, 表达水平显著上调和下调的基因分别有 404 个和 145 个, 在表达显著上调的基因中包含 7 种锌指基因结论筛选出了 hhgf 转染 L02 细胞后的差异表达基因, 为其作用机制及与锌指蛋白相关性的研究提供了重要依据关键词人肝细胞生长因子 ;L02 细胞 ; 锌指基因 ScreeningofzincfingergenesdiferentialyexpresedinL02celstransfectedby humanhepatocytegrowthfactor WULiang,ZHANGJin qian,wangqi,liguo li,zhangchen yu,wangxiao chun,hongyuan,zenghui,chengjun.the 3rdDepartmentServices,BeijingDitanHospital,InstituteofInfectiousDiseasesofCap italmedicaluniversity,beijing100015,china Corespondingauthor:CHENGJun, chengjdt@ cmu.edu.cn Abstract Objective Todetectthehepatocytegrowthfactor(hHGF)ex presionandscreenthediferentialyexpresedgenesinl02celstransfectedbyhh GF.Methods pcdna3.1(-) hhgfexpresivevectorwereconstructedandcon firmedbyrestrictionenzymedigestionanddnasequencing.theexpresionofhhgf proteininl02cellinewastestedbywesternblot.mrnaofl02celstransfectedby pcdna3.1(-) hhgfandpcdna3.1(-)wereisolatedandreversetranscriptedto cdna.diferentialyexpresedgeneswereanalyzedbycdnamicroaraytechnique. DOI: /cma.j.isn 基金项目 : 国家自然科学基金 (No ); 北京市卫生局项目 (2004 局 051) 作者单位 : 北京市, 首都医科大学传染病学研究所北京地坛医院内三科 ( 吴亮 ), 传染病研究所 ( 张锦前王琦李国力张晨宇王晓春洪源曾辉成军 ) 通讯作者 : 成军, chengjdt@ccmu.edu.cn

2 384 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No.4 Results TheexpresivevectorpcDNA3.1(-) hhgfwereconstructedandcon firmedbyrestrictionenzymedigestionanddnasequencing.hhgfproteinexpresion wereconfirmedbywesternblot.highqualitymrnaandcdnawerepreparedfrom L02celstranfcectedbypcDNA3.1(-)andpcDNA3.1(-) hhgf,respectively. Succesfulmicroarayscreeningwereconducted.Fromthescanningresults,404genes wereup regulated(including9zincfingergenes)and145weredown regulatedgenes inl02cellinetransfectedbyhhgf.conclusions cdnamicroaraytechnologywas succesfulyusedtoscreenthegenesdiferentialyexpresedinl02cellinetransfect edbyhhgf,whichbroughtsomenewcluesfortheregulationmechanism studyon hhgfinlivercels. Keywords Humanhepatocytegrowthfactor;L02cel;Zincfingergene 人肝细胞生长因子 (humanhepatocytegrowthfactor,hhgf) 具有多种生物学作用, 是正常胚胎发育多种组织器官 ( 如肝肾肠骨骼神经系统造血系统 ) 发生过程中的一个重要调控因子 [1], 但其作用机制仍不十分明确锌指基因家族是人体中最大的基因家族, 参与细胞分化胚胎发育, 并与许多疾病的发生相关锌指蛋白 (zincfingerprotein) 则是哺乳动物细胞内含量最丰富的蛋白质模体, 是各种特异性 DNA 结合蛋白中最大的一个类别据统计, 约 2% 的人类基因 (700~900 个 ) 编码锌指蛋白, 这些锌指蛋白与真核基因的表达调控密切相关 [2] 本研究应用基因芯片技术, 筛选 hhgf 对 L02 细胞差异表达的基因, 并从中发现了 7 种锌指基因, 为进一步深入研究 hhgf 在肝细胞中的多种作用机制及其与锌指基因调控的相关性提供了一定依据材料和方法一材料真核表达质粒 pcdna3.1(-) 购自 Invitrogen 公司 ;L02 细胞购自协和医院细胞中心 ; 细胞培养相关试剂及总 RNA 提取试剂 Trizol 等均购自 Gibco 公司 ; 限制性内切酶 ApaⅠ BstⅪ 购自 Toyobo 生物科技有限公司 ; 抗 HGF 购自 Simga 公司二方法 1. 构建 hhgf 基因真核表达载体 : 将质粒 pgem ThHGF 转化感受态大肠埃希菌 DH5α 后, 提取该转化菌质粒 pgem ThHGF, 并将该质粒用 ApaⅠ BstⅪ 双酶切鉴定 ; 测序质粒 pgem ThHGF 测定其基因序列约为 2200bp, 结果与目的基因序列 hhgf 对照, 其序列长度一致, 同源性为 99.5% 且氨基酸序列完全一致以 pgem ThHGF 为模板用 ApaⅠ 及 BstⅪ 双酶切, 回收 2.2kb 左右目的片段, 与表达载体 pcdna3.1(-) 连接, 再转化入感受态大肠埃希菌 DH5α 后提取质粒 pcdna3.1(-) hhgf 进行 ApaⅠ 及 BstⅪ 双酶切鉴定 2.L02 细胞的转染和筛选 : 细胞株用 DMEM 培养基 ( 含 100kU/L 氨卞青霉素的 100ml/L 小牛血清 ) 常规培养, 待细胞生长到 50% ~70% 融合时, 采用 Lipo

3 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No fectin 脂质体法 ( 转染程序参照 Manitsans 方法 ) 将 pcdna3.1(-) 及 pcdna3.1 (-) hhgf 质粒转染细胞, 以含 G418 的培养基续培养 48h, 裂解细胞后留取上清, 用于表达产物的 Westernblot 检测 hhgf 蛋白表达的 Westernblot 检测 : 将上清于 SDS PAGE 胶电泳, 转膜后将膜置于 TPBS( 含 30g/L 牛血清白蛋白 ) 封闭液室温封闭 2h, 加入封闭液稀释后的抗体 ( 抗 HGF,1 500 稀释 ),4 孵育 1h,PBS 液漂洗 4~6 次, 每次 5min, 再与封闭液稀释的酶标抗体 ( 抗 IgG HRP, 稀释 ) 于 30 温育 60min,PBS 漂洗 4~5 次后滤纸吸干残余液体, 加入 ECL 化学发光底物, 在 X 光片曝光, 显影定影后观察 3. 总 RNA 提取 : 在 35mm 培养皿中常规培养 L02 细胞, 待细胞生长至对数期时分别将 pcdna3.1(-) 及 pcdna3.1(-) hhgf 转染 L02 细胞 48h 后收获细胞采用 Trizol 试剂一步法提取细胞总 RNA( 对照组和实验组 ), 样品经分光光度计检测吸光度 (A), 并行琼脂糖凝胶电泳进行检测 4.mRNA 纯化 : 探针标记和芯片制备, 以 OligotexmRNAMidikit(Qiagen 公司 ) 分离纯化得到 mrna, 并行电泳检测常规方法逆转录标记 cdna 探针并纯化用 Cy3 dutp 标记对照组细胞 mrna(5μg), 用 Cy5 dutp 标记实验组细胞 mrna (5μg) 乙醇沉淀后溶解于杂交液中芯片包含的个 cdna 由上海国家工程研究中心上海生物芯片有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因免疫调节相关基因细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因信号转导相关基因等以通用引物进行 PCR 扩增,PCR 产物长度为 1000~3000bp 靶基因溶解于 3 SSC 溶液中, 用 Cartesian7500 点样仪 (Cartesian 公司 ) 及硅烷化玻片 (TeleChem 公司 ) 进行点样玻片经水合 (2h) 室温干燥 (0.5h) UV 交联, 再分别用 0.2% SDS 水及 0.2% 的硼氢化钠溶液处理 10min, 晾干备用 5. 杂交及洗涤 : 将基因芯片和杂交探针在 95 水浴变性 5min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于 60 杂交 15~17h 以 SSC 洗涤 10min, 室温晾干 6. 检测与分析 : 用 ScanAray3000(GeneralScanning 公司 ) 扫描芯片用预先选定的内参照基因对 Cy3 和 Cy5 的原始提取信号进行均衡和修正用 ImaGene 3.0 软件分析 Cy3 Cy5 两种荧光信号的强度, 计算 Cy5/Cy3 阳性结果判断 : Cy5/Cy3 >1.8, 红色荧光, 显示表达增强 ;Cy5/Cy3<0.6, 为绿色荧光, 显示表达减弱结一真核表达载体 pcdna3.1(-) hhgf 的酶切鉴定将质粒 pgem ThHGF 转化感受态大肠埃希菌 DH5α 后, 提取菌落质粒并用 ApaⅠ BstⅪ 双酶切鉴定后测序, 结果插入序列约为 2200bp, 与目的基因 hhgf 比对同源性为 99%, 且氨基酸序列一致 ; 以 pgem ThHGF 为模板用 ApaⅠ BstⅪ 双酶切, 回收 2.2kb 左右的目的片段, 与表达载体 pcdna3.1(-) 连接, 再转化入转化感受态大肠埃希菌 DH5α 后提取质粒 pcdna3.1(-) hhgf 进行 ApaⅠ Bst Ⅺ 双酶切鉴定 ( 图 1) 果

4 386 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No.4 图 1 pcdna3.1(-) hhgf 经 ApaⅠ 和 BstⅪ 双酶切鉴定注 :M: 标记物 ;1:ApaⅠ 及 BstⅪ 双酶切鉴定的 pcd NA3.1(-) hhgf;2:apaⅠ 及 BstⅪ 双酶切鉴定的 pcdna3.1(-) 质粒二真核表达载体 pcdna3.1(-) 和 pcdna3.1(-) hhgf 分别转染 L02 细胞后蛋白免疫印迹检测 L02 细胞培养后分别转染 pcdna3.1(-) 及 pcdna3.1(-) hhgf 质粒, 再培养 48h 裂解细胞蛋白 SDS PAGE 胶电泳,Westernblot 检测结果可见 pcdna3.1 (-) 转染组未见蛋白表达, 而 pcdna3.1(-) hhgf 质粒转染组细胞可见 hhgf 大量表达 ( 图 2) 图 2 pcdna3.1(-) 质粒及 pcdna3.1(-) hhgf 质粒转染的 L02 细胞蛋白免疫印迹检测注 :1:pcDNA3.1(-) 质粒转染细胞培养后裂解细胞上清 Westernblot 结果 ;2:pcDNA3.1(-) hhgf 质粒转染细胞培养后裂解细胞上清 Westernblot 结果

5 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No 三总 RNA 提取 L02 细胞分别转染 pcdna3.1(-) 及 pcdna3.1(-) hhgf 质粒, 培养 48h 后提取细胞总 RNA, 琼脂糖凝胶电泳可见 28S 18S 及 8S 条带 ( 图 3) 可见两组细胞中提取 RNA 效果良好图 3 pcdna3.1(-) 质粒及 pcdna3.1(-) hhgf 质粒转染的 L02 细胞总 RNA 电泳注 :1:pcDNA3.1(-) 质粒转染 L02 细胞后提取的总 RNA;2:pcDNA3.1(-) hhgf 质粒转染 L02 细胞后提取的总 RNA 四差异表达基因的分析表达水平显著上调和下调的基因分别有 404 个和 145 个, 显著上调表达的基因中含 7 种锌指基因 ( 表 1) 表 1 表达显著增强的锌指蛋白基因序号 GenBank 编号编码蛋白 Cy5/Cy3 1 NM_ Homosapienszincfingersandhomeoboxes NM_ Homosapienszincfingerprotein NM_ Homosapienszincfingerprotein NM_ HomosapienszincfingerCCCHtypedomaincontaining NM_ HomosapienszincfingerRNAbindingprotein NM_ Homosapienszincfingerprotein NM_ Homosapienszincfinger,MYM domaincontaining 讨 hhgf 具有多种生物学功能, 也可用于多种疾病的治疗如逆转肝纤维化改善肝硬化脂肪肝防止肺纤维化血管性疾病胃溃疡糖尿病等 [3] 近年来, 有关 hhgf 生物学功能机制的研究逐渐深入但尚无定论 hhgf 在肝脏首先与肝论

6 388 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No.4 细胞表面的 c met 结合, 通过后者将信号转导入胞内, 促进肝细胞 DNA 合成后导致肝细胞增殖和有丝分裂, 促进肝细胞及肝脏再生 [4] 而这些过程中相关的信号通路并不明确, 国内外尚未见有关研究报道因此, 为深入研究并明确其在肝细胞中的作用机制, 本实验应用基因芯片技术研究 hhgf 转染 L02 健康人肝细胞后的差异表达基因最终, 从个基因中筛选出 549 个差异表达的基因, 其中表达水平显著上调和下调的基因分别有 404 个和 145 个, 表达显著上调的基因中包括 7 种锌指基因这些基因涉及细胞信号转导细胞凋亡肿瘤发生物质代谢等多个领域, 这与 hhgf 的多样化生物学功能密切相关几乎所有生物过程均涉及生物大分子的特异相互作用, 这些作用有赖于大分子内的结构域近年来又发现一些由较短多肽片段 ( 少于 50 个氨基酸残基长 ) 形成的结构域, 但这些多肽片段不能自身折叠成稳定的结构域锌离子在一定条件下可以不需要任何化学反应就能与这种结构稳定性结合, 故非常适于结合在这种同步短片段多肽形成的结构中以维持其稳定, 发挥其特殊作用人们将这种能够特异与核酸位点结合并调节生理功能的蛋白质片段称为锌指结构 ( 简称锌指 ), 含有锌指结构的蛋白称为锌指蛋白 [5] 锌指蛋白是一种常见的转录因子, 自 1983 年首次在转录因子 ⅢA 中发现锌指结构以来, 现已发现 10 多种不同的锌指家族, 约占人类基因产物的 1% 锌指结构由多个半胱氨酸和 ( 或 ) 组氨酸组成, 通过锌离子来维持结构的稳定性在哺乳动物中, 锌指蛋白在转录因子中占大多数, 与各种基因的调控和细胞发育有关其可在 DNA 进行转录时, 间接或直接结合到 DNA 增强子, 抑制或增强转录此种蛋白质的主要特征是形成像手指的蛋白结合域, 利用这种手指形状的结构结合到 DNA 大沟通常会存在多个锌指以加强作用同时, 特定的蛋白结合域与特定的 DNA 序列结合锌指通过与目的基因的 DNA 或 RNA 结合, 或锌指之间的相互作用来调控基因表达 [6 8] 本研究发现 hhgf 明显上调几种锌指基因的表达, 这可能是 hhgf 发挥其生物学功能的机制之一 [9 12],hHGF 可能通过对某些特定锌指蛋白的调控从而进一步实现其下游的基因表达调控 [13 15] 这就为研究并明确 hhgf 在肝细胞中的作用机制提供了较好的实验基础和研究方向本实验通过筛选 hhgf 转染 L02 细胞的差异表达基因发现, 其对参与多种生物学过程的多种基因都存在明显表达差异, 主要与细胞信号转导细胞增殖与分化物质代谢细胞凋亡和肿瘤发生等密切相关, 且可调控锌指基因本实验结果为研究 hhgf 在肝细胞中相关生物学过程及其信号转导机制, 也为研究 hhgf 与锌指蛋白之间的基因调控相关性提供了坚实的基础参考文献 1 BogatkevichGS,Ludwicka BradleyA,HighlandKB,etal.Down regulationofcolagenandconnectivetisuegrowthfactorex

7 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 )2010 年 1 月第 4 卷第 4 期 ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),November2010,Vol4,No presionwithhepatocytegrowthfactorinlungfibroblastsfrom whitesclerodermapatientsviatwosignalingpathways.arthritis Rheum,2007,56(10): NishidaM,KatoM,KatoY,etal.IdentificationofZNF200asanovelbindingpartnerofhistoneH3methyltransferaseG9a. GenesCels,2007,12(7): BelLN,WardJL,YamauchiMD,etal.AdiposetisueproductionofhepatocytegrowthfactorcontributestoelevatedserumHGF inobesity.amjphysiolendocrinolmetab,2006,291(4):e843 E MaPC,TretiakovaMS,NalasuraV,etal.Downstreamsignalingandspecificinhibitionofc MET/HGFpathwayinsmalcel lungcancer:implicationsfortumourinvasion.brjcancer,2007,97(3): EdelsteinLC,ColinsT.TheSCANdomainfamilyofzincfingertranscriptionfactors.Gene,2005,359(10): SchnablB,HuK,MuhlbauerM,etal.Zincfingerprotein267isup regulatedduringtheactivationprocesofhumanhepatic stelatecelsandfunctionsasanegativetranscriptionalregulatorofmmp 10.BiochemBiophysResCommun,2005,335(1): 张健琦, 李文娟, 王臻臻, 等. 一个 phic31 相互作用的蛋白 : 人锌指蛋白 403 功能分析. 中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(37): 任道龙, 胡兴旺, 徐甜, 等. 人锌指蛋白 ZNF256 基因克隆表达谱分析及其功能研究. 激光生物学报,2009,18(2): 张宝珍, 谷连坤, 邓大君. 锌指蛋白 Kaiso 的甲基化特异性结合功能分析. 中华预防医学杂志,2007,6(41): 马占福, 杨冬, 贺福初, 等.KRAB 型锌指蛋白在高等脊椎动物胚胎发育和肿瘤发生发展中的调控功能. 遗传,2010,32 (5): 吴丽娟, 刘国栋, 陈伟, 等. 锌指蛋白 A20 对人单核细胞 LPS 应答的影响. 第三军医大学学报,2007,29(14): 张晓颖, 阎影, 宋海峰, 等. 锌指蛋白 A20 与树突状细胞. 白血病淋巴瘤,2010,4(19): 胡娟, 王启军. 肝癌患者血清锌指蛋白和 p53 高表达的临床意义. 中华实用诊断与治疗杂志,2009,23(5): 陈颖, 广桥良彦, 林谋斌, 等. 锌指蛋白 KOX12 单克隆抗体的制备及在肿瘤组织中的表达. 放射免疫学杂志,2010,23 (2): 夏伟, 曾甫清, 叶哲伟, 等. 胶质细胞源性神经营养因子对体外培养大鼠精原干细胞 PLZF 和 c Kit 表达的影响. 中华泌尿外科杂志,2010,4(31): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 孙荣华 ) 吴亮, 张锦前, 王琦, 等. 人肝细胞生长因子转染 L02 细胞的锌指基因差异表达筛选 [J/CD]. 中华实验和临床感染病杂志 : 电子版,2010,4(4):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽