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豹孙荣
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1 第 34 卷第 23 期 2014 年 12 月生态学报 ACTA ECOLOGICA SINICA Vol.34,No.23 Dec.,2014 DOI: / stxb 刘连为, 陈新军, 许强华, 李伟文. 北太平洋柔鱼微卫星标记的筛选及遗传多样性. 生态学报,2014,34(23):6847 鄄 Liu L W, Chen X J, Xu Q H, Li W W.Isolation and genetic diversity of microsatellite DNA of Ommastrephes bartramii in the North Pcific Ocean.Acta Ecologica Sinica,2014,34(23):6847 鄄北太平洋柔鱼微卫星标记的筛选及遗传多样性刘连为 1, 陈新军 1,2,3,*, 许强华 1,2,3 1, 李伟文 (1. 上海海洋大学海洋科学学院, 上海摇 ; 2. 国家远洋渔业工程技术研究中心, 上海摇 ; 3. 上海海洋大学大洋渔业资源可持续开发省部共建教育部重点实验室, 上海摇 ) 摘要 : 采用 (AC) 12 (AG) 12 两种生物素探针, 通过磁珠富集法构建了柔鱼部分基因组微卫星富集文库 68 个阳性克隆中有 60 个含有微卫星序列, 重复次数在 10 次以上的占 86.84%, 最高重复次数为 33 次其中, 完美型微卫星占 60.53%, 非完美型微卫星占 36.84%, 混合型微卫星占 2.63% 除探针使用的 AC / TG AG / TC 重复外, 还得到 ACAG AGAC 重复序列利用筛选出的 8 个微卫星位点对北太平洋柔鱼 6 个群体的遗传多样性及遗传结构进行分析结果表明,8 个微卫星位点均为高度多态性位点 (PIC = ), 位点 Bo103 与位点 Bo105 极显著偏离 Hardy 鄄 Weinberg 平衡 ( P<0.01) 6 个地理位置的柔鱼群体显示出较高的遗传多样性水平 (H o = ,H e = 郾 851) 两两群体间的 F st 值以及 AMOVA 分析结果均表明, 群体间遗传分化不显著 (F st = 0 郾 00559,P>0 郾 05), 遗传差异主要来自于个体间基于 Nei 忆 s 遗传距离的 UPGMA 聚类树显示, 北太平洋东北部 2 个柔鱼群体 (NE1 NE3) 聚为一类, 西北部 3 个群体 ( NW1 NW2 NW3) 与东北部 1 个群体 ( NE2) 另聚为一类, 且群体 NW1 与群体 NE2 亲缘关系最近, 遗传距离与地理距离线性相关分析没有呈现出正相关性 ( R = 0 郾 175,P>0 郾 05) 遗传结构分析结果推断北太平洋柔鱼存在 1 个理论群柔鱼个体具有较强的游泳能力, 在海流的作用下, 群体之间存在较强的基因交流建议今后在柔鱼资源开发利用过程中将北太平洋柔鱼看作 1 个管理单元关键词 : 柔鱼 ; 微卫星标记 ; 遗传多样性 ; 遗传结构 Isolation and genetic diversity of microsatellite DNA of Ommastrephes bartramii in the North Pcific Ocean LIU Lianwei 1, CHEN Xinjun 1,2,3,*, XU Qianghua 1,2,3, LI Weiwen 1 1 College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai , China 2 National Distant-water Fisheries Engineering Research Center, Shanghai Ocean University, Shanghai , China 3 Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai , China Abstract: The neon flying squid Ommastrephes bartramii is found circumglobally in subtropical and temperate waters in the world and supports important fisheries in the North Pacific Ocean. The population of the North Pacific O. bartramii comprises a fall spawning cohort and a winter 鄄 spring spawning cohort. Most of the fall cohort occurs east of 170 毅 E, whereas the winter 鄄 spring cohort is widely distributed across the North Pacific Ocean. Two spawning cohorts can be further subdivided into four stocks: a central and an eastern stock of the fall cohort separated near 160 毅 W, and a western and a central 鄄 eastern stock of the winter 鄄 spring cohort separated near 170 毅 E in which the fall cohort was the target of a driftnet fishery before 1993 while the west stock of winter 鄄 spring cohort became main fishing target of an international jigging fishery. Being a short 鄄 lived ecological opportunist, neon flying squid exhibits large fluctuations in stock abundance and distribution 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 国家 863 计划 ( 2012AA092303); 国家发改委产业化专项 ( ); 上海市科技创新行动计划 ( ) 收稿日期 :2013 鄄 03 鄄 03; 摇摇网络出版日期 :2014 鄄 03 鄄 18 * 通讯作者 Corresponding author.e 鄄 mail: xjchen@ shou.edu.cn

2 6848 摇生摇态摇学摇报摇摇摇 34 卷摇 on the feeding grounds and large fluctuating recruitment on the spawning grounds in response to environmental variability. In order to improve our understanding of population structure, the genetic diversity of O. bartramii populations in the North Pacific Ocean was examined using microsatellite markers. Two types of biotin 鄄 labeled oligos[( AC) 12 and ( AG) 12 ] were employed and part of microsatellite 鄄 enhanced genomic library of O. bartramii was constructed by the method of streptavidin magnetic beads. Sixty of 68 positive clones comprised microsatellite sequences and repeat number of more than 10 accounted for 86.84% with the largest one of 33. Of these were 60.53% perfect, 36.84% were imperfect, and the rest were compound type (2. 63%). Repeats including ( ACAG) n and ( AGAC) n were also detected except that of AC / TG and AG / TC. Microsatellite markers were isolated and screened, and 8 of them were then used for the analysis of genetic diversity and genetic structure of six populations of O. bartramii in the North Pcific Ocean. Results showed that all the 8 loci were highly polymorphic (PIC = ), and locus Bo103 and locus Bo105 were extremely significant deviated from Hardy 鄄 Weinberg equilibrium ( P < 0. 01). All of the 6 different geographic populations showed high genetic diversities ( H o = 0 郾 , H e = ). Pairwise F test and AMOVA analysis detected no significant genetic differentiations among populations, and genetic differences mainly came from individuals. UPGMA clustering tree based on Nei 忆 s genetic distance demonstrated that two stocks ( NE1 and NE3) in the northeast of the North Pcific Ocean clustered together, while the three stocks ( NW1, NW2 and NW3) in the western part as well as one stock ( NE2) in the eastern part clustered together, and the genetic distance between NW1 and NE2 was closer. Relations between genetic distance and geographic distance did not show positive correlation ( R = 0.175, P>0.05), indicating that different populations of O. Bartramii could mingle together. Genetic structure simulation analyses suggested that there was only one logic population of all individuals, and extensive gene exchange might occur among the populations, which could be attributed to the influence of ocean currents and swimming ability of O. bartramii individuals. The North Pacific O. bartramii should be considered as a single stock in their assessment and management. Key Words: Ommastrephes bartramii; microsatellite marker; genetic diversity; genetic structure 摇摇柔鱼 ( Ommastrephes bartramii) 广泛分布于全球温带副热带海域, 目前被规模性开发利用的海域主要在北太平洋 [1 鄄 2] 根据不同的产卵季节与地理位置, 北太平洋柔鱼被划分为冬春生西部群体冬春生中东部群体秋生中部群体与秋生东部群体 [3] 其中, 冬春生西部群体为我国大陆鱿钓船的传统捕捞对象, 而秋生群体主要为原流刺网作业海域捕捞对象柔鱼资源量丰富, 且在海洋生态系统中占据重要的地位, 被认为是最重要的大洋性柔鱼类之一 [4] [5 鄄国内外学者对柔鱼渔业生物学 6] [7 鄄 8] 资源评估等方面进行深入的研究, 有关其群体遗传学的研究体现在不同的研究方法上 Katugin [9] 运用蛋白质电泳技术检测出北太平洋柔鱼东西部群体由于等位基因 [10] 频率不连续分布产生的遗传差异而刘连为等基于线粒体 DNA 标记研究了北太平洋柔鱼种群遗传结构, 认为柔鱼冬春生群体与秋生群体以及不同的地理群体之间不存在显著的遗传分化作为渔业管理的基本单元, 柔鱼各群体间是否存在显著的遗传变异有待进一步研究微卫星 DNA 是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状重复序列, 又称简单序列重复 ( simple sequence repeat,ssr) SSR 标记具有高度多态性共显性实验操作相对简单等优点, 使得它在群体遗传学分析基因克隆育种改良以及连锁图谱构建等领域得到广泛的应用 [11] 目前, 头足类很多种类的微卫星标记已被分离筛选, 并应用到群体遗传多样 [12 鄄性与种群遗传结构研究中 13] 而柔鱼微卫星 DNA 的分离在国内外尚未见报道, 本研究采用磁珠富集法筛选柔鱼微卫星标记, 并应用于群体遗传多样性检测, 以期为柔鱼资源的可持续利用和科学管理提供理论基础 1 摇材料与方法 1.1 摇实验材料柔鱼样本按照地理位置划分为西北群体和东北群体, 存放于船舱冷库中并运回至实验室取套膜

3 摇 23 期摇摇摇刘连为摇等 : 北太平洋柔鱼微卫星标记的筛选及遗传多样性摇 6849 肌肉组织, 置于 95% 乙醇中, 保存于 -20 益冰箱内西北群体和东北群体分别由 3 个部分组成, 命名为西北群体 1(northwest population 1,NW1) 西北群体 2 ( northwest population 2, NW2 ) 西北群体 3 ( northwest population 3, NW3 ) 与东北群体 1 (northeast population 1,NE1) 东北群体 2( northeast population 2,NE2) 东北群体 3( northeast population 3,NE3) 利用耳石微结构获得的日龄数据并结合捕捞日期推算孵化时间, 划分出冬春生群体 ( NW1 NW2 NE1) 和秋生群体 ( NW3 NE2 NE3) ( 表 1) 限制性内切酶 Sau3AI T4 DNA 连接酶 pmd19 鄄 T 载体大肠杆菌 DH5 琢购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 Biospin Gel Extraction Kit 购自杭州博日科技有限公司, Dynabeads M 鄄 280 Streptavidin 为 Invitrogen Dynal AS 产品探针 ( AG) 12 ( AC) 12 接头引物及微卫星引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成群体 Population 采样地点 Sampling locations 经度 Longitude 纬度 Latitude Table 1 摇表 1 摇柔鱼样本采集信息 Sampling information of Ommastrephes bartramii 产卵群体 Spawning cohort 采样时间 Sampling date 平均胴长 / cm Mean mantle length 平均体质量 / g Mean body weight NW1 149 毅 29 忆 E 40 毅 41 忆 N 冬春生群体 2010 鄄 11 鄄依依 NW2 159 毅 05 忆 E 39 毅 17 忆 N 冬春生群体 2011 鄄 07 鄄依依 NW3 166 毅 32 忆 E 39 毅 25 忆 N 秋生群体 2011 鄄 06 鄄依依 NE1 174 毅 53 忆 E 40 毅 04 忆 N 冬春生群体 2012 鄄 07 鄄依依 NE2 178 毅 02 忆 W 38 毅 52 忆 N 秋生群体 2011 鄄 06 鄄依依 NE3 172 毅 21 忆 W 39 毅 41 忆 N 秋生群体 2012 鄄 06 鄄依依摇摇 NW1; 西北群体 1,NW2; 西北群体 2,NW3; 西北群体 3,NE1; 东北群体 1,NE2; 东北群体,NE3: 东北群体 3 样本数量 No. of samples 1.2 摇基因组 DNA 的提取采用组织 / 细胞基因组 DNA 快速提取试剂盒 ( 北京艾德莱生物科技有限公司 ) 提取 DNA, 洗脱缓冲液 EB 溶解,-20 益保存备用用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量, 紫外分光光度计检测 DNA 浓度 1.3 摇微卫星富集文库的构建及微卫星标记的筛选 [14] 微卫星富集文库的构建主要参考孙效文等方法限制性内切酶 Sau3AI 对基因组 DNA 进行酶切,Biospin Gel Extraction Kit 回收 bp 大小片段基因组 DNA 片段与 Brown 接头连接 : A:5 忆鄄 GATCGTCGACGGTACCGAATTCT B:5 忆鄄 GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC 最后将富集的微卫星 DNA 片段经 pmd19 鄄 T 载体连接并转化到大肠杆菌 DH5 琢中, 从而建立柔鱼部分基因组文库挑选含有微卫星片段的阳性克隆进行测序, 根据其核心序列两端保守的侧翼序列, 用 Primer Premier 5.0 软件进行引物设计 PCR 扩增筛选具有较高特异性与多态性的微卫星标记 1.4 摇微卫星 PCR 扩增 PCR 反应总体积为 25 滋 L, 其中 10 伊 PCR Buffer 2.5 滋 L Taq DNA polymerase(5 U / 滋 L)0.2 滋 L dntp ( 各 2.5 mmol / L) 2 滋 L 上下游引物(10 滋 mol / L) 各 0 郾 6 滋 L DNA 模板 20 ng ddh 2 O 补足体积 PCR 扩增反应程序为 :94 益预变性 2 min;94 益变性 30 s, 退火 30 s,72 益延伸 45 s,35 个循环 ;72 益最后延伸 2 min PCR 产物经过 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分离 Biospin Gel Extraction Kit 纯化后, 送至上海迈浦生物科技有限公司, 通过 ABI3730XL 全自动 DNA 测序仪分析, 以 ROX 鄄 500 为分子量内标, 通过 Genemapper Version 3. 5 软件读取微卫星扩增产物的分子量数据 1.5 摇数据统计与分析根据分子量数据确定个体各位点基因型, 利用 POPGEN 3.2 [15] 进行群体遗传学分析, 计算等位基因数 (N a ), 有效等位基因数 (N e ), 观测杂合度 (H o ), 期望杂合度 ( H e ) 与 Shannon 多样性指数 ( Shannon 忆 s information index, I ) 多态信息含量 ( PIC ) 由 CERVUS 3. 0 [16] 软件计算, 并采用马尔科夫链 (Markov Chain) 方法进行 Hardy 鄄 Weinberg 平衡检验利用 ARLEQUIN 3.5 [17] 计算群体遗传分化的 F 鄄统计量 (F 鄄 statistics,f st ) 及分子方差分析 ( AMOVA) 利用 POPGEN 3.2 计算群体间的 Nei 忆 s 遗传距离, 并基于该遗传距离用 MEGA 5.0 [18] 构建 UPGMA 系统发

4 6850 摇生摇态摇学摇报摇摇摇 34 卷摇生树根据遗传距离及地理距离数据在 Excel 中作线性相关图, 其中两地理坐标间直线距离计算方法 [19] 参照韩忠民的方法利用 STRUCTURE 2.3 [20] 进行群体遗传结构分析, 分析最佳 K 值, 即群体遗传结构的理论群体数 2 摇结果 2.1 摇微卫星序列特征随机挑取 800 个菌落, 经菌落 PCR 检测后, 共有 68 个阳性克隆, 阳性克隆率为 8.5% 对所有的阳性克隆进行测序, 有 60 个 (88.24%) 克隆含有微卫星序列 ( 部分微卫星序列已提交到 Genbank,Genbank 登录号为 :KC KC855255) 重复次数在次间的 34 个 (44.74%), 重复 20 次以上的微卫星 32 个 (42.10%), 最高重复次数为 33 次其中, 完美型微卫星 46 个 ( %), 非完美型微卫星 28 个 (36.84%), 混合型微卫星 2 个 (2.63%) ( 表 2) 除探针使用的 AC / TG AG / TC 重复外, 还得到 ACAG AGAC 重复序列 Table 2 摇表 2 摇柔鱼微卫星不同类型重复序列所占比例 Percentage of different repeat sequence type of microsatellite in Ommastrephes bartramii 微卫星数量及百分比 Number and percentage of SSR 完美型 Perfect repeats 非完美型 Imperfect repeats 混合型 Compound repeats 重复数 Repeat number 数量 Number 百分比 Percentage / % 摇摇 SSR: simple sequence repeat 2.2 摇微卫星位点的多态性及群体的遗传多样性选择合成的 20 对微卫星引物对柔鱼 30 个个体进行 PCR 扩增, 结果有 12 对能扩增出特异条带, 其中 8 对具有多态性, 并应用于 6 个不同地理位置的柔鱼群体遗传学分析, 引物的核心序列产物大小及退火温度等情况如表 3 所示各位点在所有群体中的扩增结果见表 4, 等位基因数 ( N a ) 为个, 有效等位基因数 ( N e ) 介于 4 郾郾 15 之间 ; 观测杂合度 ( H o ) 介于 0 郾郾 840 之间, 期望杂合度 (H e ) 介于 0 郾郾 969 之间 ; 多态信息含量 ( PIC) 介于 0 郾郾 987 之间, 均为高度多态性位点 (PIC >0 郾 5),Shannon 多样性指数 ( I) 介于 1 郾郾 638 之间位点 Bo103 与位点 Bo105 极显著偏离 Hardy 鄄 Weinberg 平衡 (P<0 郾 01) 6 个不同地理位置的柔鱼群体遗传多样性如表 5 所示 NW1 群体的平均等位基因数最多 ( N a = 25 郾 13),NW3 群体最少 (N a = 15 郾 00);NW2 群体的平均有效等位基因数最多 ( N e = 9 郾 91),NW3 群体最少 (N e = 7 郾 96);NE2 群体的平均观测杂合度最高 (H o = 0 郾 761),NW3 群体最低 (H o = 0 郾 672);NW1 群体的平均期望杂合度最高 ( H e = 0 郾 851), NE1 群体最低 (H e = 0 郾 808);NW1 群体的多态性息含量最高 (PIC = 0 郾 918),NE3 群体最低 (PIC = 0 郾 779) NW1 群体的 Shannon 多样性指数最高 (I = 2 郾 571),NW3 群体最少 (I = 2 郾 215) 总体上,6 个不同地理位置的柔鱼群体均具有较高的遗传多样性位点 Locus 核心重复序列 Repeat motif Table 3 摇表 3 摇柔鱼 8 对微卫星引物特征 Characteristics of 8 pairs of microsatellite primers from Ommastrephes bartramii 引物序列 (5 忆鄄 3 忆 ) Primer sequence(5 忆鄄 3 忆 ) Bo101 (AG) 8 (G) 4 (AG) 21 F:GACACTACGTCGTTCAATGCGC R:GCTGAAGCATCATATGGTGGGC Bo102 (AG) 27 CG(AG) 3 F:GCCATTACAAGGAAGGAGGTG R:CTTTGTCTCTGCCTCTGTCTC Bo103 (CT) (AC) 15 F:CTCCCCACGATACAGCGATA R:CCAATGCACAAATGCTTGCAC Bo104 (AC) 8 (AG) 2 (AC) 19 F:TGGCTCAATCTTGGTAGGGTCA R:AGTTGGAGTTGGGGTTGGGT 产物大小 (bp) Size range 复性温度 / 益 Znnealing temperature

5 摇 23 期摇摇摇刘连为摇等 : 北太平洋柔鱼微卫星标记的筛选及遗传多样性摇 6851 续表位点 Locus 核心重复序列 Repeat motif 引物序列 (5 忆鄄 3 忆 ) Primer sequence(5 忆鄄 3 忆 ) Bo105 (AC) 6 (AC) 12 TC(AC) 3 F:ATTGACCGGGCTTGACGTTG R:CCAAACCCTATAAAAAGCGCCG Bo106 (AC) 24 F:CAATTTAGTTTCACCCGAC R:GACGGTCAAGAACTTGAAATC Bo107 (AC) 15 F:GTGAACGAGCGACTATGATA R:GCATTAGTTTAGGCTTCTGG Bo108 (AG) 30 F:ATCATCTGACAAGATAGGG R:CACACGAGGGTAGTTACACG 产物大小 (bp) Size range 复性温度 / 益 Znnealing temperature 表 4 摇柔鱼 8 个微卫星位点多态性 Table 4 摇 Polymorphism of eight microsatellite loci from Ommastrephes bartramii 位点 Locus N a N e H o H e PIC I Bo Bo Bo ** Bo Bo ** Bo Bo Bo 均值 Average 摇摇 ** 表示极显著偏离 Hardy 鄄 Weinberg 平衡 (P<0.01); N a : 等位基因数 Number of alleles,n e : 有效等位基因数 Number of effective alleles,h o : 观测杂合度 Observed heterozygosity,h e : 期望杂合度 Expected heterozygosity,pic: 多态信息含量 Polymorphism information content,i: Shannon 多样性指数 Shannon 忆 s information index 群体 Population Table 5 摇表 5 摇 6 个不同地理位置的柔鱼群体遗传多样性 Genetic diversity in 6 different fishing areas of Ommastrephes bartramii populations 指数 Index N a N e H o H e PIC I NW NW NW NE NE NE 摇摇 NW1 为西北群体 1,NW2 为西北群体 2,NW3 为西北群体 3,NE1 为东北群体 1,NE2 为东北群体,NE3 为东北群体 3 N a 为等位基因数 (number of alleles),n e 为有效等位基因数 ( number of effective alleles),h o 为观测杂合度 ( observed heterozygosity),h e 为期望杂合度 ( expected heterozygosity),pic 为多态信息含量 (polymorphism information content),i 为 Shannon 多样性指数 (Shannon 忆 s information index) 2.3 摇群体遗传分化与遗传结构分析 AMOVA 分析显示群体间遗传差异主要来自于个体间, 仅有 0.56% 的遗传差异来自于群体间, 遗传变异不显著 ( 表 6) NW1 群体与 NE2 群体间遗传分化系数 F st 为负值, 说明两群体间无遗传分化其余群体间遗传分化系数介于之间, 属于轻微程度的分化 ( F st <0.05), 且统计检验不显著, 进一步表明群体间不存在显著的遗传差异基于 Nei 忆 s 遗传距离 ( 表 7) 的 UPGMA 聚类树显示, NE1 群体与 NE3 群体聚为一族群, 其余 4 个群体聚为一族群, 且 NW1 群体与 NE2 群体首先聚在一起 ( 图 1) 群体间的遗传距离与地理距离相关性分析结果如图 2 所示, 二者没有呈现出正相关性 ( R = 0 郾 175,P > 0. 05) STRUCTURE 2. 3 软件执行 2 6 的假设 K 值, 重复次数为 10 次, 根据 K 值对应参数的趋势分析, 推断本研究所有参试个体最佳分组为

6 6852 摇生摇态摇学摇报摇摇摇 34 卷摇 1 个理论群 Table 6 摇表 6 摇柔鱼群体分子方差分析 AMOVA analysis among Ommastrephes bartramii populations 变异来源 Source of variation 自由度 df 平方和 Sum of squares 变异组分 Variance components 变异百分数 Percentage of variation F st 群体间 Among populations Va (P>0.05) 群体内个体间 Among individuals within populations Vb 个体间 Within individuals Vc 总计 Total 表 7 摇柔鱼群体间 Nei 忆 s 遗传距离 (D A, 对角线以下 ) 及 F 统计值 (F st, 对角线以上 ) Table 7 摇 Nei 忆 s genetic distance ( D A, below diagonal ) and pairwise F st estimates ( F st, above diagonal ) among Ommastrephes bartramii populations 群体 Population NW1 NW2 NW3 NE1 NE2 NE3 NW NW NW NE NE NE 摇摇 NW1: 西北群体 1,NW2: 西北群体 2,NW3: 西北群体 3,NE1: 东北群体 1,NE2: 东北群体,NE3: 东北群体 3 3 摇讨论与分析图 1 摇基于 Nei 忆 s 遗传距离的 UPGMA 聚类树 Fig.1 摇 UPGMA clustering tree based on Nei 忆 s genetic distance 图 2 摇群体间 Nei 忆 s 遗传距离和地理距离的散点图 Fig.2 摇 Plot of Nei 忆 s genetic distance and geographic distance between populations of Ommastrephes bartramii 本文以北太平洋传统作业渔场柔鱼为样本对分离的微卫星位点进行多态性检测, 筛选出 8 个多态性位点 (H o = 0.754), 所有样本均扩增出条带应用这些微卫星位点对北太平洋 6 个不同地理位置的柔鱼群体进行遗传多样性分析, 平均每个微卫星位点获得 50.5 个等位基因与个有效等位基因, 多态性信息含量均较高 (PIC>0.5), 适用于柔鱼群体遗传学分析位点 Bo103 与位点 Bo105 对 NE1 群体及 NE3 群体扩增时, 部分样本未扩增出条带, 个别样本仅显现小片段等位基因的条带, 造成该位点纯合体个体过剩 Hardy 鄄 Weinberg 平衡检验结果显示这 2 个位点极显著偏离 Hardy 鄄 Weinberg 平衡, 因此,2 个位点很可能存在无效等位基因无效等位基因产生的原因主要为微卫星侧翼序列变异, 从而导致该位点无法正常扩增 [21] 而大片段等位基因丢失也会造成无效等位基因, 这些在实验结果中均体现出 [22] 无效等位基因会对遗传学相关研究结果造成显著影响, 在以后的实验中可通过重新设计微卫星引物或者估算无效等位基因频率进行群体遗传学

7 摇 23 期摇摇摇刘连为摇等 : 北太平洋柔鱼微卫星标记的筛选及遗传多样性摇 6853 研究 6 个不同地理位置的柔鱼群体平均观察杂合度介于 0 郾郾 761, 平均期望杂合度介于 0 郾郾 851, 与太平洋褶柔鱼 ( Todarodes pacificus) 和阿根廷滑柔鱼 ( Illex argentinus) 的杂合度相近, 分别为 H o : 0 郾郾 950, H e : 0 郾郾 950; H o : 0 郾 59 0 郾 93,H e :0 郾 62 0 郾 96 [23 鄄 24] 因此, 各群体显示出较高的杂合性 Katugin [9] 利用 18 个蛋白酶位点检测北太平洋柔鱼东西部 2 个群体的遗传变异水平, 只有 1 个蛋白酶位点显示出明显的遗传差异及较高的杂合度 (H o = 0 郾 294,H e = 0 郾 322) 东西部群体平均观察杂合度分别为 : 0 郾 060 依 0 郾 021 与 0 郾 043 依 0 郾 022, 平均期望杂合度分别为 0 郾 056 依 0 郾 020 与 0 郾 043 依 0 郾 022, 远远低于微卫星位点检测的杂合度水平蛋白质标记为基因表达的产物, 所检测到的遗传差异水平很容易受到周围环境的影响刘连为 [10] 等利用线粒体标记检测出北太平洋柔鱼 2 个产卵季节群体具有较低的核苷酸多样性水平由此可见, 微卫星标记应用于物种群体遗传变异水平研究较其它分子遗传标记有一定的优越性本研究所取样本为东西部 2 个不同产卵群体, 其中 NW1 NW2 NE1 群体为冬春生群体, NW3 NE2 NE3 群体为秋生群体两两群体间的 F st 值与 AMOVA 分析结果显示, 群体间的遗传分化程度较低, 未达到显著性水平, 遗传差异主要存在于个体间 6 个群体 UPGMA 聚类分析显示,NE1 群体和 NE3 群体亲缘关系最近, 聚为一类, 而地理位置相距较远的 NW1 群体与 NE2 群体亲缘关系最近, 另聚为一类, 而且它们属于不同的产卵季节群体群体间的遗传距离与地理距离相关性结果进一步说明了不同地理群体间的亲缘关系远近与地理距离不成正相关性北太平洋海域缺乏显著的地理障碍, 而且柔鱼个体具有较强的游泳能力, 在海流的作用下, 群体之间存在较强的基因交流 [25] [26] Chen 等基于胴长与耳石轮纹半径的线性关系在东北太平洋和西北太平洋柔鱼群体间的差异, 推测两部分大型雌性群体 ( 胴长 > 350 mm) 可能来自于同一群体, 这与利用 STRUCTURE 2 郾 3 软件推断的北太平洋柔鱼存在 1 个理论群相一致柔鱼资源量丰富, 已有研究认为传统作业渔场最大可持续产量为 8 伊伊 10 4 t [7], 而原流刺网作业海域柔鱼资源量则超过 30 伊 10 4 t [8] 但作为短生命周期种类, 柔鱼种群资源量的大小很容易受到环境变化的影响而发生波动 [27] 2009 年 8 10 月旺汛期间由于水温变动, 传统作业渔场柔鱼产量出现大幅度下降, 其日产量仅为正常年份的一半 [28] 年本课题组对原流刺网作业海域柔鱼资源量进行探捕调查, 取得了较高的产量因此, 在对北太平洋柔鱼资源进行评估与管理时, 为了更加合理地开发利用与保护该渔业资源, 建议将不同的产卵季节地理群体看作 1 个管理单元 References: [ 1 ] 摇 Murata M. Oceanic resources of squids. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology, 1990, 18(1): 19 鄄 71. [ 2 ] 摇 Araya H. Fishery, biology and stock assessment of Ommastrephes bartramii in the North Pacific Ocean. Memoirs of the National Museum Victoria, 1983, 44: 269 鄄 283. [ 3 ] 摇 Yatsu A, Midorikawa S, Shimada T, Uozumi Y. Age and growth of the neon flying squid, Ommastrephes bartramii, in the North Pacific Ocean. Fisheries Research, 1997, 29(3): 257 鄄 270. [ 4 ] 摇 Coll M, Navarro J, Olson R J, Christensen V. Assessing the trophic position and ecological role of squids in marine ecosystems by means of food 鄄 web models. Deep 鄄 Sea Research II, Topical Studies in Oceanography, (2012 鄄 08 鄄 23) [2013 鄄 03 鄄 01]. http: / / dx.doi.org / / j.dsr [ 5 ] 摇 Ma J, Chen X J, Liu B L, Tian S Q, Cao J. Review of fisheries biology of neon flying squid Ommastrephes bartramii in the North Pacific Ocean. Journal of Shanghai Ocean University, 2011, 20 (4): 563 鄄 567. [ 6 ] 摇 Chen X J, Tian S Q, Chen Y. Fisheries Biology of the Neon Flying Squid, Ommastrephes Bartramii in the North Pacific Ocean. Beijing: Science Press, 2011: 1 鄄 3. [ 7 ] 摇 Chen X J, Chen Y, Tian S Q, Liu B L, Qian W G. An assessment of the west winter 鄄 spring cohort of neon flying squid ( Ommastrephes bartramii ) in the Northwest Pacific Ocean. Fisheries Research, 2008, 92(2 / 3): 221 鄄 230. [ 8 ] 摇 Ichii T, Mahapatra K, Okamura H. Stock assessment of the autumn cohort of neon flying squid ( Ommastrephes bartramii) in the North Pacific based on past large 鄄 scale high seas driftnet fishery data. Fisheries Research, 2006, 78(2 / 3): 286 鄄 297. [ 9 ] 摇 Katugin O N. Patterns of genetic variability and population structure in the North Pacific squids Ommastrephes bartramii, Todarodes pacificus, and Berryteuthis magister. Bulletin of Marine Science, 2002, 71(1): 383 鄄 420. [10] 摇 Liu L W, Xu Q H, Chen X J. Population genetic structure of Ommastrephes bartramii in the North Pacific Ocean based on the COI and Cytb gene sequences analysis. Journal of Fisheries of

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AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L

AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L 2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis