780 植物遗传资源学报 15 卷 2000 多年的栽培历史, 并早已遍及全国由于豌豆对土壤的适应能力较强, 生育期较短, 粮菜兼用, 种植地理环境自然生态条件的差异巨大, 因此, 我国的豌豆种质资源具有丰富的遗传多样性另一方面, 由于豌豆蛋白质含量在 24% 左右, 高于水稻小麦

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穹杏东戚
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1 植物遗传资源学报２０１４１５４７７９７８７ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＤＯＩ１０１３４３０ｊｃｎｋｉｊｐｇｒ２０１４０４０１５豌豆近红外模型建立及区域差异分析王姣姣刘浩任贵兴中国农业科学院作物科学研究所北京１０００８１摘要探讨了傅立叶变换近红外光谱技术ＦＴＮＩＲＳ检测豌豆蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量的可行性用化学方法测定１９０份豌豆种质的蛋白质淀粉脂肪以及总多酚含量采集其子粒与粉末的近红外光谱采用偏最小二乘法ＰＬＳ分别建立两种光谱与成份含量预测模型豌豆粉末模型结果优于子粒模型其中蛋白质和淀粉的粉末模型的预测残差ＲＰＤ为５８８５８２相关系数ｒ２达到０９９０９９具有很好的预测性能对其中产地信息详细明确的１５０份豌豆种质的与产地进行两步聚类分析明确得到３种类型其特点分别为类群１低蛋白质含量类群２高总多酚含量类群３高蛋白质高淀粉和高脂肪含量进一步分析了豌豆随播种期经度纬度海拔高度的变化情况结果表明近红外光谱技术可对豌豆种质资源的部分进行快速筛选鉴定聚类分析结论地理坐标与播期对豌豆种质主要的影响规律都可为收集高豌豆种质资源提供可靠依据关键词豌豆种质资源傅立叶变换近红外光谱聚类分析地理坐标ＵｓｉｎｇＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＮｅａｒＩｎｆｒａｒｅｄＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｔｈｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄＲｅｇｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｅａＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬＷＡＮＧＪｉａｏｊｉａｏＬＩＵＨａｏＲＥＮＧｕｉｘｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ＡｂｓｔｒａｃｔＰｅａＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｄｉｂｌｅｌｅｇｕｍｅＦｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＮｅａｒＩｎｆｒａｒｅｄＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙＦＴＮＩＲＳｏｎｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｉｎｐｅａｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｉｎｃｕｒｒｅｎｔｓｔｕｄｙＡｔｏｔａｌｏｆ１９０ｐｅａａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｒｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｒｃｈｏｉｌａｎｄｔｏｔａｌｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｃｏｎｔｅｎｔｗｅｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｄＡｆｔｅｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｉｎｍｉｌｌｅｄｐｏｗｄｅｒａｎｄｉｎｔａｃｔｓｅｅｄｆｏｒｍｓｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔｓｑｕａｒｅｓＰＬＳｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｗａｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｍｏｄｅｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＭｏｄｅｌｓｏｆｐｏｗｄｅｒｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｌｌｙｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏｍｏｄｅｌｓｉｎｉｎｔａｃｔｓｅｅｄＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｗｅｒｅｐｏｗｄｅｒｂａｓｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｓｔａｒｃｈｗｉｔｈｒｅｓｉｄｕａｌｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｄｅｖｉａｔｉｏｎＲＰＤｏｆ５８８ａｎｄ５８２ａｓｗｅｌｌａｓｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｒ２ｏｆ０９９ａｎｄ０９９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＨｉｇｈｖａｌｕｅｓｏｆｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒ２ｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｍｏｄｅｌｓｈａｄｇｏｏｄｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｃａｐａｃｉｔｉｅｓｆｏｒｒａｐｉｄｇｅｒｍｐｌａｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｅａＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ１５０ｐｅａｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｗｏｓｔｅｐｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓＴｈｒｅｅｄｉｓｔｉｎｃｔｇｒｏｕｐｉｎｇｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｏｂｖｉｏｕｓｆｅａｔｕｒｅｓＧｒｏｕｐ１ｗａｓｉｎｌｏｗｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔＧｒｏｕｐ２ｗａｓｉｎｈｉｇｈｔｏｔａｌｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｃｏｎｔｅｎｔＧｒｏｕｐ３ｗａｓｉｎｈｉｇｈｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｒｃｈａｎｄｏｉｌｃｏｎｔｅｎｔＴｈｅｎｕｔｒｉｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｌｏｎｇｉｔｕｄｅｌａｔｉｔｕｄｅａｎｄａｌｔｉｔｕｄｅｏｆｐｌａｎｔｉｎｇｌｏｃａｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｓｅｅｄｉｎｇｄａｔｅＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｒｅｌｉａｂｌｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｃｅｌｌｅｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｗｉｔｈｇｏｏｄｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓＫｅｙｗｏｒｄｓＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓＦＴＮＩＲＳｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ豌豆ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ２ｎ１４起源于亚洲西部地中海埃塞俄比亚小亚细亚西部和外高加索收稿日期２０１３１２０６修回日期２０１３１１１９地区１属蝶形花亚科一年生或越年生草本植物豌豆是世界第４大食用豆类作物２在我国已有网络出版日期２０１４０６０９ＵＲＬｈｔｔｐｗｗｗｃｎｋｉｎｅｔｋｃｍｓｄｅｔａｉｌ１１４９９６Ｓ２０１４０６０９１４０８００５ｈｔｍｌ基金项目现代农业产业技术体系ｎｙｃｙｔｙ０１８国家农作物种质资源平台中国农业科学院科技创新工程第一作者主要从事食用豆品质评价与研究工作Ｅｍａｉｌｄｏｕｂｌｅｏｋ１２６ｃｏｍ刘浩为共同第一作者通信作者任贵兴Ｅｍａｉｌｒｅｎｇｕｉｘｉｎｇｃａａｓｃｎ

2 780 植物遗传资源学报 15 卷 2000 多年的栽培历史, 并早已遍及全国由于豌豆对土壤的适应能力较强, 生育期较短, 粮菜兼用, 种植地理环境自然生态条件的差异巨大, 因此, 我国的豌豆种质资源具有丰富的遗传多样性另一方面, 由于豌豆蛋白质含量在 24% 左右, 高于水稻小麦玉米, 是人类和畜禽植物蛋白质的重要来源之一 ; 豌豆淀粉含量在 46% 左右, 高于红小豆菜豆饭豆木豆 [3], 历来是传统粉丝糕点淀粉加工制作业的优选原料随着市场多样化需求的不断增加, 豌豆在食品加工业医药业畜牧业等行业越来越显示出其重要作用近红外光谱 ( NIRS,near infrared spectroscopy) 技术是光谱测量与化学计量学有机结合的产物, 按照美国材料测试学会标准 ASTM 规定,NIRS 范围是介于 780 ~ 2526 nm(12820 ~ 3959 / cm) 之间的电磁波 NIRS 是通过利用有机物质 C H O H N H 等化学键在这一光谱区倍频及合频的振动吸收, 并基于不同基团产生的光谱在吸收峰的位置和强度上的差异, 根据 Lambert Beer 定律, 吸收光谱特征随样品成分的组成和结构变化, 从而实现对样品中多种化学成分进行定性定量测定的一项技术由于该技术具有检测速度快可同时对多种化学成分进行检测分析, 以及可对检测样品不破坏, 不使用有机试剂, 不会造成污染测量信息数字化等特点, 近年来广泛应用于农业食品化工医药化工冶金纺织质量监督环境保护等领域 [4 6] 在近红外光谱仪器的发展方面, 也已从 20 世纪年代的光栅色散滤光片发展到 90 年代的傅立叶技术, 该技术以其光通量大和信息多通道传输大大提高了近红外光谱分析的灵敏度和分析的深度 [7] NIRS 技术具有常规分析技术难以比拟的诸多优越性, 在作物种质资源鉴定评价方面已有不少应用, 是推进作物种质资源评价的 [8] 有效鉴定分析工具杨小红等用傅立叶漫反射光谱技术, 结合偏最小二乘法建立了玉米子粒 4 种脂肪酸含量和含油量的光谱校正模型闵顺耕 [9] 等采用傅立叶变换技术测定大麦中蛋白质淀粉 [10] 的含量张环等用近红外光谱技术对大麦子粒 [11] 水分蛋白质淀粉进行评价孙君明等采用傅立叶近红外反射光谱法测定大豆脂肪酸含量朱志 [12] 华等用近红外光栅漫反射技术对 17 种作物 7240 份种质资源的主要营养进行鉴定评价李 [13] 楠等用傅立叶变换近红外技术, 结合偏最小二乘法建立校正模型, 对 167 份大豆种质的 17 种氨基酸含量进行分析等, 都获得了较为满意的结果但到目前为止, 尚未见到有关利用傅立叶变换近红外光谱技术对豌豆种质资源进行研究的报道 [14] 李玲等研究发现, 来自我国各省区豌豆种质资源群体的遗传多样性指数, 变异范围差异明显, 并与资源的地理分布相关联很多研究都表明产地对豆类有一定影响 [15 16] [17] V. Kumar 等的研究表明, 纬度与大豆蛋白质含量具有显著的负相关性, 而与脂肪含量具有显著的正相关性 H. Pizo [18] 等认为种植在海拔 300 m 的蚕豆和羽扇豆的蛋白质含量最高, 而种植在海拔 700 m 的蛋白质含量 [19] 最低 Y. Yao 等研究发现海拔与赤小豆中总多 [20] 酚含量呈显著正相关 R. Bressani 等研究表明海拔 (0 ~ 2256 m) 对菜豆的蛋白质淀粉单宁和儿茶酚含量无显著影响总体上, 海拔和纬度对豆类成分含量的影响要大于经度的影响有关豌豆品质性状与产地的关系研究尚未见报道本研究利用傅立叶变换近红外光谱技术对 190 份豌豆种质资源的蛋白质淀粉脂肪总多酚的含量进行近红外光谱测定, 采用偏最小二乘法 ( PLS, partial least squares) 回归法对预测结果进行研究, 并尝试应用两步聚类分析方法对豌豆种质的主要品质性状与产地之间的关系进行分析, 进一步研究经度纬度海拔高度及播种期的变化对豌豆主要品质性状的影响, 旨在为豌豆种质资源的筛选鉴定及收集利用提供支持 1 材料与方法 1 1 试验材料和样品处理试验所用 190 份豌豆种质来自国家种质资源中期库已知样品的来源地信息见表 1, 材料均为同期入库保存的种子且具有良好的代表性样品于常温条件干燥器中平衡 7 d, 每份材料样品分为 2 份等量试样, 其中 1 份用于子粒近红外光谱扫描, 另 1 份表 1 豌豆种质资源样品来源 Table 1 Origin information of pea ( Pisum sativum L. ) germplasm resources 地区 Region 份数 No. 地区 Region 份数 No. 甘肃 Gansu 22 山西 Shanxi 3 河北 Hebei 12 西藏 Tibet 32 江苏 Jiangsu 4 青海 Qinghai 1 内蒙古 Innermengolia 2 重庆 Chongqing 18 宁夏 Ningxia 21 四川 Sichuan 21 陕西 Shaanxi 14 其他 Others 40

3 4 期王姣姣等 : 豌豆近红外模型建立及区域差异分析 781 经旋风磨研磨成粉, 过 60 目筛后分装于封口塑料袋中, 用于化学分析与粉末近红外光谱扫描 1 2 化学分析方法与主要仪器蛋白质含量采用农业行业标准 NY / T ( 谷类豆类作物种子粗蛋白质测定法半微量凯氏法 ), 蛋白质氮的换算系数为 5 70, 使用 FOSS2300 型全自动定氮仪 ( 丹麦福斯特卡托公司 ) 测定淀粉含量测定采用农业行业标准 NY / T ( 谷物子粒粗淀粉测定法 ), 使用 WZZ 1S 数字式旋光分析仪 ( 上海物理光学仪器厂 ) 测定脂肪含量测定采用国家标准 GB / T ( 粮油检验粮食中粗脂肪含量测定 ) 中索氏抽提法测定 [21] 总多酚含量测定参考 Y. Yao 等没食子酸 (gallic acid) 福林试剂紫外分光光度法进行, 根据实际情况略有改动准确称取没食子酸标准品 mg, 加蒸馏水定容至 100 ml, 配成 116 μg / ml 的备用液, 吸取上述备用液 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 7 ml 8 ml 10 ml 加蒸馏水稀释至 10 ml, 得到每 1mL 分别含 23 2 μg 34 8 μg 46 4 μg 58 0 μg 69 6 μg 81 2 μg 92 8 μg μg 的没食子酸标准品溶液 ; 准确吸取 1 ml 上述标准品溶液, 加 1 ml Folin Ciocalten ( 1 mol / L) 显色剂, 加 Na 2 CO 3 (1 mol / L) 溶液 3 ml, 静置反应 15 min, 反应液用蒸馏水定容至 10 ml, 混匀, 用 1 ml 蒸馏水代替标准品溶液同法操作作为空白, 在 765 nm 波长处测定吸光度值 ; 以吸光度为纵坐标, 浓度 ( μg / ml) 为横坐标, 绘制标准曲线, 回归方程为 y = x ( r 2 = ); 称取 1 g 样品 ( 精确到 0 001g) 置于离心管中, 固液比 1 20 加入 80% 乙醇水溶液,10 ml 6 mol / L HCl,80 mg 抗坏血酸, 溶液 72 水浴振荡提取 2 5 h,5000 r / min 离心 10 min, 取上清液用 80% 乙醇水溶液定容至 30 ml 制得供试液测定方法如标准曲线的制备, 空白为 80% 乙醇水溶液所用没食子酸标准品购于中国药品生物制品检定所, Folin Ciocalten 试剂购于 Sigma 公司, 无水乙醇无水碳酸钠及其他试剂均为分析纯, 购于北京化工厂总多酚的结果以每克干样品中含有的等效没食子酸的毫克数 (mg / g) 表示蛋白质淀粉脂肪化学测定结果均以样品干基百分含量表示 1 3 近红外光谱数据采集及模型建立粉末和子粒样品的光谱数据采集试验采用德国 Bruker 公司的 Matrix I 型傅立叶变换近红外光谱分析仪将 30 g 左右豌豆子粒样品装满于直径 50 mm 的旋转样品池中, 在 4000 ~ / cm(800 ~ 2500 nm) 谱区范围内扫描 64 次, 分辨率设置为 16 / cm, 采集样品的吸收光谱为了克服样品粒度差异造成的光谱漂移, 每个样品重复装样扫描 3 次, 以消除粒度大小均匀性不一致等因素对光谱的影响, 可用 Bruker 公司 OPUS 6 5 近红外处理软件计算平均光谱样品子粒光谱采集方法与粉末光谱采集方法相同近红外模型的建立与优化将样品集 (190 份 ) 按 4 1 的比例分成校正集和检验集采用偏最小二乘法 (PLS) 作为建立模型的化学计量学方法利用 Bruker 公司 OPUS 6 5 定量分析软件对方法中所采集的校正集样品试样光谱与方法 1 2 中化学法检测的相同样品蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量进行关联回归运算, 建立校正模型利用该分析软件对所建校正模型进行近红外光谱预处理谱区选择剔除异样样品以及回归统计分析等优化处理, 向校正模型输入检验集样品光谱进行待测成分含量的预测, 对所得预测值与相同样品通过方法 1 2 测得的化学值进行相关性分析验证, 以检验定标模型的预测能力应用该软件的近红外 OPTI MIZE 自动优化功能优化谱区范围和数据预处理方法组合, 自动剔除建模含量范围中间的异常样品点, 对多种组合进行内部交叉验证和外部验证, 从中选择最佳预处理方法光谱谱区范围和优化维度根据外部验证的相关系数 ( r 2 ) 外部验证决定系数 (R 2 P) 交叉验证决定系数 ( R 2 ) 预测均方根误差 (RMSEP,root mean square error of prediction) 交叉验证均方根误差 (RMSECV,root mean square error of cross validation) 残余预测偏差( RPD,residual pre dictive deviation) 和维度 (rank) 等指标确定最优校正模型再经比较预测值和化学测定值的符合程度最终评价其模型的预测效果 1 4 聚类分析从参试的 190 份豌豆种质中选择具有明确产地信息的样品 150 份, 应用 SPSS 13 0 数据处理系统的两步聚类分析 ( two step cluster analysis) 法, 以对数似然函数测距法 ( log likelihood) 为聚类依据, 以贝叶斯标准 ( BCI,Schwarz s Bayesian Criterion) 为判定聚类数目的准则, 按照豌豆品质特性对其不同产地的材料进行分析, 分析得到每个大类的组成特点

4 782 植物遗传资源学报 15 卷 1 5 豌豆种质的地理坐标与播种期对其的影响豌豆原产地地理坐标来源于金农网全国县区分站 ( http: / / www. agri. com. cn / host / province / china. htm) 的数据, 为了便于统计和作图, 将地理坐标经纬度转化为十进制豌豆的播种期信息由中国农业科学院作物科学研究所提供 1 6 数据处理通过 SPSS 13 0 数据处理系统进行 Pearson 相关性检验 (2 tailed) 采用独立样本均值差异性检验 (t test) 进行播种期差异分析, 学生 t 检验 ( sti duent s t test) 和卡方 (chi square test) 显著性检验用于聚类变量差异分析 2 结果与分析 2 1 蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量及其相关性蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量 190 份豌豆种质的蛋白质淀粉脂肪总多酚含量的化学测定值统计结果见表 2 表 2 豌豆蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量的化学检测统计结果 Table 2 Statistics results of protein,starch,oil,and total polyphenol contents in pea determined by chemical methods 均值 ± 标准差 Mean ± SD 变幅 Range 变异系数 CV 偏度 Skewness 峰度 Kurtosis 蛋白质 (% )Protein ± ~ 淀粉 (% )Starch ± ~ 脂肪 (% )Oil 1 33 ± ~ 总多酚 (mg / g)total polyphenol 1 91 ± ~ 从表 2 可见, 豌豆种质淀粉平均含量 51 31% ± 3 44%, 变幅在 33 13% ~ 57 10% ; 蛋白质平均含量 25 19% ± 2 04%, 变幅在 19 85% ~ 30 25% ; 脂肪平均含量 1 33% ± 0 48%, 变幅在 0 49% ~ 2 62% ; 总多酚平均含量 1 91 ± 0 45 mg / g, 变幅在 0 83 ~ 3 45 mg / g 从豌豆种质主要的变异看, 以脂肪的变异程度最大 ( CV = 0 36), 总多酚次之 (CV = 0 24), 蛋白质和淀粉含量变异较小 (CV 值分别为 0 08 和 0 07) 豌豆种质主要的含量化学测定结果与文献研究报道的蛋白质含量 (20 0% ~ 24 9% ) 淀粉含量(28 70% ~ 58 69% ) 脂肪含量 (1 00% ~ 2 70% ) 总多酚含量(1 83 ~ 4 60 mg / g) 的结果基本一致 [22 27] 就其化学测定结果而言, 目前国内尚未建立统一完善的豌豆种质主要评价标准, 以豌豆 4 项品质含量的平均值及其标准差 (x ± s) 为分类依据, 筛选出蛋白质含量超过 27 23% 的豌豆种质 31 份, 占参试种质的 16 34% ; 筛选出淀粉含量超过 54 8% 的豌豆种质 16 份, 占参试种质的 8 42% ; 筛选出脂肪含量超过 1 81% 的豌豆种质 29 份, 占参试种质的 15 26% ; 筛选出总多酚含量低于 1 46 mg / g 的豌豆种质 39 份, 占参试种质的 20 5% 以豌豆种质蛋白质淀粉脂肪含量较高且总多酚含量较低作为优良豌豆种质的筛选依据, 兼顾高总多酚含量作为抗氧化功能食品开发原料的要求, 筛选出蛋白质淀粉含量较高而总多酚含量较低的种质白豌豆 G ( 蛋白质 28 82% 淀粉 54 87%, 总多酚 1 40 mg / g) 和豌豆 G ( 蛋白质 28 25% 淀粉 54 97% 总多酚 1 28 mg / g), 筛选出蛋白质脂肪含量较高而总多酚含量较低的种质白豌豆 G ( 蛋白质 27 64% 脂肪 2 24% 总多酚 1 37 mg / g), 筛选出蛋白质和总多酚含量较高的种质豌豆 G ( 蛋白质 27 44% 总多酚 2 54 mg / g), 筛选出淀粉和脂肪含量较高且总多酚含量较低的种质豌豆 G ( 淀粉 55 31% 脂肪 1 86% 总多酚 1 02 mg / g), 以及脂肪和总多酚均较高的种质豌豆 G ( 脂肪 2 11% 总多酚 3 45 mg / g), 小麻豌 G005401( 脂肪 2 16% 总多酚 3 19 mg / g) 和白豌豆 G ( 脂肪 1 85% 总多酚 3 15 mg / g) 等蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量间的相关性不同含量的相关性分析结果 ( 表 3) 表明, 蛋白质含量与淀粉含量呈极显著负相关 ( P < 0 01), 淀粉含量与总多酚含量呈极显著负相关 (P < 0 01), 其他间相关性均不显著 ( P > 0 05) 2 2 模型的建立优化及分析从豌豆种质主要含量扫描光谱图 ( 图 1) 可见, 豌豆种质的粉末样品和子粒样品图谱相似, 同时发现两组样品扫描图谱在 4200 / cm 4600 / cm 5200 / cm 5500 / cm 6900 / cm 8300 / cm 波段中均出现 6 个较强的吸收峰

5 4 期王姣姣等 : 豌豆近红外模型建立及区域差异分析 783 表 3 Table 3 豌豆蛋白质淀粉脂肪和总多酚含量间的相关性 Correlation of contents of protein,starch,oil,and total polyphenol in pea 蛋白质 Protein 淀粉 Starch 脂肪 Oil 淀粉 Starch 脂肪 Oil 总多酚 Total polyphenol : 在 0 05 水平上有显著相关性 ; : 在 0 01 水平上有显著相关性下同 :Correlation is significant at the 0 05 level(2 tailed), :Correlation is significant at the 0 01 level(2 tailed). The same as below 近红外光谱通过自动剔除异常点参数值, 最终获得了用于建立模型的定标集和检验集样品豌豆种质粉末和子粒样品主要定标集和检验集的基础统计参数见表 4 定标集和检验集数据组成可见, 豌豆种质主要含量的变幅涵盖范围较大, 含量分布较均匀, 具有较好的代表性, 符合近红外光谱建模的要求本研究将化学方法测定值与获得的光谱数据, 导入 OPUS 6 5, 通过自动优化给出的不同 Fig 1 图 1 豌豆样品粉末和子粒近红外光谱图 Typical NIR spectra obtained from 190 pea in powder samples and intact seeds 表 4 Table 4 样品形式豌豆蛋白质淀粉脂肪和总多酚近红外 PLS 模型的参数 Sample status Parameters of NIR PLS model of protein,starch,oil,and total polyphenol in pea 样品数量 Sample size 平均值 ± 标准差 Mean ± SD 变幅 Range Cal Val Cal Val Cal Val 粉末蛋白质 (% )Protein ± ± ~ ~ Milling powder 淀粉 (% )Starch ± ± ~ ~ 脂肪 (% )Oil ± ± ~ ~ 2 24 总多酚 (mg / g)total polyphenol ± ± ~ ~ 2 66 完整子粒蛋白质 (% )Protein ± ± ~ ~ Intact seed 淀粉 (% )Starch ± ± ~ ~ 脂肪 (% )Oil ± ± ~ ~ 2 17 总多酚 (mg / g)total polyphenol ± ± ~ ~ 2 57 Cal: 定标集 ;Val: 检验集 Cal:Calibration set,val:validation set 含量在使用不同的预处理方法下的 R 2 P 与 RMSEP 值的大小选择模型, 得到建立近红外模型的最佳条件 ( 表 5) 豌豆的优化 PLS 回归模型的内部交叉验证和外部验证的检验统计量结果见表 6 总体上豌豆粉末最优,NIRS 回归模型优于子粒模型, 豌豆 4 项模型的相关系数 r 2 均在 0 94 以上, 内部交叉检验和外部检验的决定系数 R 2 C 和 R 2 P 均在 0 86 以上,RMSCV 和 RMSEP 达到最小值, 其中粉末蛋白质和淀粉模型的相关系数 ( r 2 = 0 99,r 2 = 0 99) 和决定系数 (R 2 P = 0 97,R 2 P = 0 97) 最高, 其次是子粒蛋白质 (r 2 = 0 97,R 2 P = 0 94) 和淀粉 (r 2 = 0 95,R 2 P = 0 89), 豌豆总多酚的粉末 ( r 2 = 0 95,R 2 P = 0 90) 和子粒 (r 2 = 0 94,R 2 P = 0 88) 模型接近, 脂肪模型的相关系数 ( r 2 = 0 94,r 2 = 0 94) 和决定系数 (R 2 P = 0 87,R 2 P = 0 86) 最低豌豆粉末蛋白质和淀粉模型内部交叉验证和外部验证的 RPD 值都接近 6, 表明该模型具有非常优良的预测性和检测准确度, 子粒蛋白质和淀粉模型以及粉末总多酚模型的内部交叉验证和外部验证的 RPD 值在 3 0 ~ 4 0 之间, 也说明这些模型具有一定的预测能力, 子粒总多酚粉末脂肪和子粒脂肪的 RPD 值在 2 5 ~ 3 0 之间, 说明这些模型的预测能力比较有限

6 784 植物遗传资源学报 15 卷表 5 Table 5 样品形式 Sample status 豌豆近红外模型建立的优化条件 Optimal conditions of NIR PLS models of pea varieties 优化光谱范围 ( / cm) Wavenumber region 优化光谱前处理 Data pre processing 粉末蛋白质 (% )Protein 6102 ~ 线性补偿差减法 Constant offset elimination Milling powder 淀粉 (% )Starch 7506 ~ 矢量归一法 Multiplicative Scattering Correction 脂肪 (% )Oil 6804 ~ ;454 ~ 最小最大归一法 Min Max normalization 总多酚 (mg / g)total polyphenol 7722 ~ 二阶导数法 Second derivative(17ps) 完整子粒 Intact seed 蛋白质 (% )Protein ~ ; ~ 一阶导数 + 乘法散射矫正法 First derivative + MSC(17ps) 淀粉 (% )Starch ~ ;6102 ~ 线性补偿差减法 Constant offset elimination 脂肪 (% )Oil ~ ; ~ 一阶导数 + 矢量归一法 First derivative + SNV(17ps) 总多酚 (mg / g)total polyphenol ~ ;6102 ~ 线性补偿差减法 Constant offset elimination MSC: 乘法散射矫正 ;SNV: 矢量归一法 MSC:Multiplicative scattering correction,snv:vector normalization 表 6 豌豆粉末和子粒优化 PLS 回归模型的内部交叉验证和外部验证统计量 Table 6 Statistics of PLS regression in cross validation and test set validation for quality traits by OPUS 6 5 样品形式 Sample status 相关系数 r 2 维度 Rank 内部交叉验证 Cross validation 外部验证 Test set validation R 2 C RMSCV RPD R 2 P RMSEP RPD 粉末蛋白质 Protein Milling powder 淀粉 Starch 脂肪 Oil 总多酚 Total polyphenol 完整子粒蛋白质 Protein Intact seed 淀粉 Starch 脂肪 Oil 总多酚 Total polyphenol r 2 : 外部验证相关系数 ;R 2 C: 交叉验证决定系数 ;R 2 P: 外部验证决定系数 ;RMSCV: 交叉验证均方根误差 ;RMSEP: 预测均方根误差 ;RPD: 残余预测偏差 r 2 :Coefficient of correlation in test set validation,r 2 C:Coefficient of determination of cross validation,r 2 P:Coefficient of determination of test set validation, RMSCV:Root mean square error of cross validation,rpd:residual predictive deviation,rmsep:root mean square error of prediction 图 2 图 3 分别给出了豌豆种质粉末和子粒近红外 PLS 回归模型的外部验证曲线粉末样品蛋白质淀粉脂肪总多酚含量的决定系数 R 2 P 值分别为 , 脂肪总多酚含量决定系数明显低于蛋白质淀粉含量豌豆种质子粒样品蛋白质淀粉脂肪总多酚含量的决定系数 R 2 P 值分别为 , 结合表 6 模型处理获得的预测值和化学值间相关性及外部验证拟合曲线结果, 豌豆子粒样品的近红外模型预测能力未达到预测要求, 有关豌豆种质子粒样品的近红外预测模型的优化还有待进一步研究 Fig. 2 图 2 豌豆粉末近红外 PLS 优化模型外部验证回归线 Optimized regression line in test set validation of PLS models for the quality traits of milling powder obtained by FT NIRS

7 4 期王姣姣等 : 豌豆近红外模型建立及区域差异分析 785 Fig. 3 图 3 豌豆子粒近红外 PLS 优化模型外部验证回归线 Optimized regression line in test set validation of PLS models for the quality traits of intact seeds obtained by FT NIRS 2 3 主要的两步聚类分析以豌豆种质主要的均值为变量进行两步聚类分析, 获得聚类特征 ( 表 7), 结果表明, 不同产地的豌豆种质大致可以聚类划分为 3 类其中, 分布在类群 1 中的有 56 份, 所占比例为 37 3% ; 分布在类群 2 中的有 55 份, 所占比例为 36 7% ; 分布在类群 3 中的有 39 份, 占 26 0% 两步聚类分析区别于其他常规聚类分析法的一表 7 两步聚类分析中豌豆的聚类特征 Table 7 Features of three groups of quality traits in pea varieties by two step cluster analysis 样品数量蛋白质 (% ) 淀粉 (% ) 脂肪 (% ) 总多酚 (mg / g) Sample size Protein Starch Oil Total polyphenol 类群 1 Group ± ± ± ± 0 52 类群 2 Group ± ± ± ± 0 46 类群 3 Group ± ± ± ± 0 37 合计 Total ± ± ± ± 0 47 个特点是可以在丰富的数据资料中发现不明显的聚类组的特性, 根据 SPSS 统计结果, 对于每个类群, 通过对各项变量 ( 蛋白质淀粉脂肪总多酚 ) 均值和标准偏差的分析结果表明, 类群 1 中豌豆种质的蛋白质含量脂肪含量低 (24 52% ± 1 46%,1 34% ± 0 49% ), 豌豆种质来自河北内蒙古江苏宁夏陕西山西类群 2 中豌豆种质淀粉含量脂肪含量低 (50 20% ± 2 72%,1 34% ± 0 52% ) 总多酚含量高 (1 93 ± 0 46 mg / g), 豌豆种质来自西藏青海甘肃类群 3 中豌豆种质的蛋白质含量淀粉含量脂肪含量高 ( 26 81% ± 1 50%, 52 82% ± 2 04%,1 51% ± 0 29% ) 总多酚含量低 ( 1 74 ± 0 37 mg / g ), 豌豆种质来自重庆四川图 4 显示了 3 组类群之间差异的显著性 ( P = 0 05), 其差异显著性由高至低依次为类群 3 类群 2 图 4 类群 1 2 和 3 中特征重要性和三类群间的显著性差异 Fig. 4 Significance of principal constituents in Group 1,Group 2,and Group 3 as well as significant difference existed among three groupings by two step cluster analysis

8 786 植物遗传资源学报 15 卷类群 1 图 4 还分别给出了 3 个类群中的蛋白质脂肪淀粉和总多酚的重要性, 横坐标为检验的学生统计量 t(α = 0 05), 其中 t 统计量正值表示该含量大于平均值, 负值则小于平均值, 当统计量的绝对值超过虚线则该含量具有显著影响, 图内纵向虚线表示各个变量对本类群具有的决定性临界值 (α = 0 05) 类群 1 中蛋白质具有显著影响性, 淀粉脂肪总多酚的影响性不显著, 淀粉高于平均值, 脂肪总多酚均低于平均值 ; 类群 2 中淀粉有显著影响性, 蛋白质脂肪总多酚影响不显著, 蛋白质脂肪低于平均值, 总多酚高于平均值 ; 类群 3 中蛋白质淀粉和脂肪有显著影响性, 总多酚低于平均值不同豌豆种质主要在不同类群中的影响显著性结果与表 7 类群特征结果吻合 2 4 播种期和地理坐标对豌豆的影响播种期对豌豆的影响参试的 150 份豌豆种质包括春播豌豆种质 110 份, 秋播豌豆种质 40 份不同播种期 ( 春播秋播 ) 豌豆种质变化结果见表 8 表 8 豌豆种质资源的春秋播均值 Table 8 Mean content of protein,starch,oil,and total poly phenol of spring and winter seeded pea 春播秋播 Spring sowing date Winter sowing date 蛋白质 (% )Protein ± ± 1 51 淀粉 (% )Starch ± ± 2 02 脂肪 (% )Oil 1 34 ± ± 0 29 总多酚 (mg / g)total polyphenol 1 89 ± ± 0 36 由表 8 可见, 不同播种期对豌豆种质主要品质的含量有影响其中春播豌豆蛋白质平均含量为 24 91% ± 1 83%, 秋播豌豆种质蛋白质平均含量为 26 77% ± 1 51%, 秋播豌豆种质蛋白质含量极显著高于春播蛋白质含量 ( F = 3 380,P < 0 01); 春播豌豆种质淀粉平均含量为 51 44% ± 2 92%, 秋播豌豆种质淀粉平均含量为 52 81% ± 2 02%, 秋播豌豆种质淀粉含量极显著高于春播淀粉含量 ( F = 8 785,P < 0 01); 秋播豌豆种质脂肪平均含量为 1 51% ± 0 29%, 春播豌豆种质脂肪平均含量为 1 34% ± 0 50%, 秋播豌豆种质脂肪含量显著高于春播脂肪含量 (F = ,P < 0 05); 春播总多酚平均含量为 1 89 ± 0 49 mg / g, 秋播总多酚平均含量为 1 73 ± 0 36 mg / g, 春播豌豆种质总多酚含量显著高于秋播总多酚含量 (F = 4 273,P < 0 05) 地理坐标与豌豆种质的相关性豌豆种质与产地地理坐标的统计结果见表 9 结果表明, 不同的地理坐标的经度纬度和海拔因素对豌豆种质的主要均有影响其中, 蛋白质含量与纬度呈极显著负相关 (P < 0 01), 即随着纬度的升高, 蛋白质含量递减 ; 淀粉含量与经度呈极显著的正相关 (P < 0 01), 与海拔呈极显著的负相关 (P < 0 01), 即随着经度增加海拔降低, 淀粉含量呈上升的趋势 ; 总多酚含量与海拔呈极显著正相关 (P < 0 01), 即随着海拔高度上升, 总多酚含量有增加的趋势 ; 未发现脂肪含量与其地理坐标的显著相关性从地理坐标对豌豆种质的影响看, 海拔的影响比经度纬度的影响更广泛表 9 豌豆与产地地理坐标的相关系数 Table 9 Coefficients of correlation ( r 2 ) between quality traits and geographic coordinates of pea varieties 地理坐标蛋白质淀粉脂肪总多酚 Geographic Protein Starch Oil Total polyphenol coordinates 经度 Longitude 纬度 Latitude 海拔 Elevation 讨论近红外光谱分析是复杂重叠光谱分析, 测定样品不经预处理, 故样品的状态测定方式以及测定的条件都会影响测定结果 [28] 因此得到的光谱模型是由样品待测成分样品背景成分测量条件测定环境等信息变量的复杂参数构成 [29] 本研究为了使模型达到理想的分析效果, 在试验材料的选择上注意了种质产地来源的代表性, 在主要的含量上关注到样品含量的涵盖幅度, 同时注意不同子粒大小不同子粒饱满度不同颜色子粒等样品的采用比例, 以提高模型的稳健性, 拓宽模型的适用范围为了减少试验误差, 采用了平均化学值平均光谱为基础参数的方法, 在进行建模软件的优化对异常值剔除等选用了合适的预处理方法以尽量扣除干扰信息建立的豌豆种质粉末模型的决定系数 (R 2 ) 在 86% ~ 97% 之间, 获得了比较理想的预测效果由于近红外光谱中信息强度低, 因此组分吸收较弱 [28] 本试验中蛋白质淀粉预测模型的决定系数明显高于脂肪总多酚的预测模型此外, 豌豆子粒模型比其粉末模型的预测性差, 究其原因, 与豌豆

9 4 期王姣姣等 : 豌豆近红外模型建立及区域差异分析 787 子粒大小表面光滑度粗糙和褶皱等有直接关系, 这些因素对样品的装样状态装样条件等造成的影响, 导致测定条件不完全一致, 造成了光谱的不确定性因此, 样品外观和内部的差异性, 包括子粒大小表面光滑度水分含量和样品内部各成份之间的相互作用等, 都会带来近红外光谱吸收的波动变化, 影响模型的预测准确性 [30 31] 有关如何提高豌豆子粒模型方案仍有待进一步研究 [32 33] 宗绪晓等的研究表明豌豆核心种质组群分布与豌豆种植区域分布有一定关系特别是中国栽培豌豆多在边远山区种植, 地理交通闭塞, 气候差异大, 由此形成的长期相互隔离的农业生态系统有可能对中国地方品种的基因库形成产生影响本研究用两步聚类分析的结果将品种产地关系大致分为 3 个区, 即东部中部区西部区和西南部区, 从品质性状的测定结果看, 不同区域来源的品种其品质特征不同, 如四川和重庆地理环境特殊, 传统种植区域封闭, 种质的表现独特 ; 西藏青海和甘肃地理海拔高气候环境相似, 种质的表现相似 ; 中部和东部地区种植区域相对开放, 种质的品质性状表现具有一致性, 可能与其基因特殊性和种植环境均有关豆类营养成份的含量会受产地地理坐标 ( 经度纬度和海拔高度 ) 的影响, 但不同豆类受影响的方式可能不同由于海拔增高常常相应地增加紫外线 UV 辐射强度, 细胞脂类会因 UV 辐射强度增加促进过氧化而具有抗氧化性的总多酚含量增加可能有防止细胞脂类过氧化, 保护细胞组织正常运行的作用有研究发现, 与酚类代谢有关的途径, 有脯氨酸的磷酸戊糖途径 ( PPP,pentose phosphate path way) 模型很可能与应激 UV 辐射的保护性抗氧化代谢有关 [34 35] 纬度对蛋白质含量影响显著, 经度和海拔高度对淀粉含量影响显著, 海拔高度对总多酚含量影响显著, 但这些影响产生的原因尚有待进一步的研究探讨 4 结论以不同样品状态的豌豆种质资源为材料, 建立基于傅立叶变换近红外光谱的模型, 并对不同产地豌豆种质主要进行分析结果表明, 利用近红外光谱技术对豌豆种质资源的主要进行鉴定评价可以获得理想的预测结果, 该技术是有效简便环保实用的快速种质资源鉴定方法 ; 对豌豆种质资源主要及其不同产地的影响进行分析, 为豌豆优良品质资源的选择收集提供了可能的途径参考文献 [1] 贺晨帮, 宗绪晓. 豌豆种质资源形态标记遗传多样性分析 [J]. 植物遗传资源学报,2011,12(1):42 48 [2] 宗绪晓,Ford R,Redden R R, 等. 豌豆属 ( Pisum) SSR 标记遗传多样性结构鉴别与分析 [ J]. 中国农业科学,2009,42(1): [3] 朱志华, 李为喜, 张晓芳, 等. 食用豆类种质资源粗蛋白及淀粉含量的评价 [J]. 植物遗传资源学报,2005,6(4): [4] Liu D,Zeng X A,Sun D W. NIR Spectroscopy and imaging tech niques for evaluation of fish quality a review[ J]. Appl Spectrosc Rev,2013,48(8): [5] Tsuchikawa S,Schwanninger M. A review of recent near infrared research for wood and paper( part 2) [ J]. Appl Spectrosc Rev, 2013,48(7): [6] Vahrmeijer A L,Hutteman M,Van der Vorst J R,et al. Image guided cancer surgery using near infrared fluorescence [ J]. Nat Rev Clin Oncol,2013,10(9): [7] 陈文杰, 谭小力, 王竹云, 等. 用傅立叶变换近红外光谱仪测定油菜种子品质指标的研究 [ J]. 陕西农业科学,2002 (8): 6 9 [8] 杨小红, 郭玉秋, 傅旸, 等. 利用近红外光谱分析玉米籽粒脂肪酸含量的研究 [J]. 光谱学与光谱分析,2009(1): [9] 闵顺耕, 覃方丽, 李宁, 等. 傅里叶变换近红外光谱法测定大麦种蛋白质淀粉和赖氨酸含量 [ J]. 分析化学,2003 (7 ): [10] 张环, 车宗贤, 李玉芳. 用近红外光谱法测定大麦品质的研究 [J]. 甘肃农业科技,2009(3):6 9 [11] 孙君明, 韩粉霞, 闫淑荣, 等. 傅里叶近红外反射光谱法快速测定大豆脂肪酸含量 [ J]. 光谱学与光谱分析,2008 ( 6 ): [12] 朱志华, 王文真, 刘三才, 等. 近红外漫反射光谱分析技术在作物种质资源鉴定中的应用 [ J]. 现代科学仪器, 2006(1):63 66 [13] 李楠, 许韵华, 宋雯雯, 等. 利用近红外光谱技术快速检测大豆氨基酸含量 [ J]. 植物遗传资源学报, 2012, 13 ( 6 ): [14] 李玲. 国内豌豆种质资源形态性状多样性分析 [ D]. 北京 : 中国农业科学院,2009 [15] Nikolopoulou D, Grigorakis K, Stasini M, et al. Differences in chemical composition of field pea ( Pisum sativum ) cultivars: Effects of cultivation area and year [ J]. Food Chem,2007,103 (3): [16] Wang N,Hatcher D W,Warkentin T D,et al. Effect of cultivar and environment on physicochemical and cooking characteristics of field pea( Pisum sativum) [ J]. Food Chem,2010,118 ( 1 ): [17] Kumar V,Rani A,Solanki S,et al. Influence of growing environ ment on the biochemical composition and physical characteristics of soybean seed[ J]. J Food Compos Anal,2006,19: [18] Pizo H,Bobrecka Jamro D,Rzasa B. Nutrient contents in horse bean and lupin seeds grown in the foothill areas of southeastern Poland[ J]. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej im Hugona Ko atajaw Krakowie,Sesja Naukowa,1992,32(260): [19] Yao Y,Cheng X Z,Wang S H,et al. Influence of altitudinal varia tion on the antioxidant and antidiabetic potential of adzuki bean ( Vigna angularis)[ J]. Int J Food Sci Nutr,2012,63: [20] Bressani R,Chon C. Effects of altitude above sea level on the cooking time and nutritional value of common beans [ J]. Plant Food Hum Nutr,1996,49:53 61 ( 下转 801 页 )

39 7 : ASDFieldSpec?3 2) (350~2500 : nm) 50 W, 25, 15, (root mean square error of 40cm 15cm 10,cross-validation,RMSECV) (R 2 cv) ; (350~399nm

39 7 : ASDFieldSpec?3 2) (350~2500 : nm) 50 W, 25, 15, (root mean square error of 40cm 15cm 10,cross-validation,RMSECV) (R 2 cv) ; (350~399nm 39 7 20147 GeomaticsandInformationScienceofWuhanUniversity Vol.39No.7 July2014 DOI:10.13203/j.whugis20130202 :1671-8860(2014)07-0862-05 1 2 3 1,,430079 2,,518060 3,,430079 : 基于江苏省宜兴市 100 个土样的可见光 - 近红外高光谱反射率