上海交通大学学报农业科学版第卷起的一种急性高度接触性传染病马牛猪等动物较易感临床上以舌唇口腔黏膜乳头和蹄冠等处上皮发生水泡病变为主要特征在临床症状上很难与口蹄疫猪水疱病猪水疱性疹 " 区别开来据国际兽医局 " 报道南美中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在

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晃添詹
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1 第卷第期年月上海交通大学学报农业科学版 " # $ $" $" %&' %' ' 文章编号 ) ' ' ' ''' 重组水泡性口炎病毒基质蛋白制备及 " 检测方法的建立张世宽陈备娟肖贤孙涛毛慧玲 ' 南昌大学生命科学与食品工程学院南昌 ' 宝山区动物疫病预防控制中心上海 ' 上海市种猪场上海 )' 上海市兽医生物技术重点实验室上海交通大学农业生物学院上海摘要水泡性口炎由水泡性口炎病毒引起基因组编码个结构蛋白其中基质蛋白 *+,9- %,2 是其重要毒力因子可阻遏宿主细胞 * 由胞核向细胞质的转运并抑制感染病毒的细胞产生型干扰素使病毒得以快速繁殖本实验克隆了印第安那型的 9 基因在大肠杆菌表达系统中表达制备重组蛋白以蛋白为抗原建立了检测特异蛋白抗体的间接 " 方法采用建立的 " 方法分析了感染小鼠体内蛋白抗体的变化规律关键词水泡性口炎病毒基质蛋白 " 中图分类号 )' 文献标识码 1* # $"& #+ +' #21# ) # & #$)-, $ #& ## $,' % $ ' ) 9$ * ' /%%&%,, %%3"2,2,2 +2 /+2 2,6 1, 5 +2 /+2 $/,2+ '$ 2 % 2,*+&,1 +1 $%2 %&,24+%1/+2,1, /+2 /+, $/,2+ ' /+2 /+,, + * /+2 /+,)$/,2+ ' /+2 /+,02,,-+&,2+ 5B 5 + /%%&%, 0& ,%&% 5 /+2 /+,,+% %2 2,6 1, 5 /+2 /+,$/,2+ & # # / -+ /% 2%,16 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01 ' 2%* %21,1 1%, & - %,2 2 1'+,9- %,2,1+2,*-% +2 6, 0& 2 + % % /, / +2,2/,, /%1 * +21-% %*20 & 01%0 1,3 % 5 %-&+1*,2/%1 &1' 1 / 10& - %30,%2% 5-,2 %2 5 /%1 &1 +2,2/,, 3/ +16, &, +,, 2 &5,2,2 3 &'2% &% ,2 2)*'4+1 3%2 / %*,2+2 - %,2,23, " &,1/ 3 %3 +2, %35+ +,21,2,2% 0&+ 3 *, ' 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01*+,9- %,2" 水泡性口炎 6 1, 0&+ 1 %*+,,1 是由水泡性口炎病毒 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01 引收稿日期基金项目国家自然科学基金作者简介张世宽 ) 男硕士生研究方向病毒学 " *+,&1/,0+2./+2 %9*+,&' %* 毛慧玲为本文通讯作者女教授研究方向微生物学 " *+,&/0,&,2* ' %* 孙涛 ) 为本文共同通讯作者男博士副研究员研究方向病毒学和免疫学 " *+,& +%'1021 0' 30' 2

2 上海交通大学学报农业科学版第卷起的一种急性高度接触性传染病马牛猪等动物较易感临床上以舌唇口腔黏膜乳头和蹄冠等处上皮发生水泡病变为主要特征在临床症状上很难与口蹄疫猪水疱病猪水疱性疹 " 区别开来据国际兽医局 " 报道南美中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在年暴发了大面积的流行造成严重的经济损失常呈季节性暴发常发生于晚夏零星的流行于热带潮湿地区多在夏秋季 ) 月发生秋末趋于平息节肢动物可能在病毒的传播中起到一定的作用许多病例还表现为地方流行性及易感动物间的直接传播水泡性口炎被 " 列为类疾病在我国其为外来动物传染病还未有大规模爆发的报道国家进出境动物检疫对象中将列为动物二类传染病分为个血清型即印地安那型和新泽西型基因组为线状单股负链全长约从的到端依次排列着个相互不重叠的基因分别编码病毒的核衣壳蛋白磷酸化蛋白基质蛋白囊膜蛋白和病毒复制酶蛋白是一个分子量约 + 的非糖基化的蛋白在细胞内有多重功能包括稳定病毒囊膜上的蛋白三聚体参与病毒体装配抑制病毒合成等更重要的是它可以阻遏宿主细胞 * 1 由胞核向胞外的转运并以此有效地干扰宿主细胞表达抗病毒型干扰素使得病毒得以在宿主内有效复制目前监测感染后动物抗体的方法主要采用中和实验和 " 方法并且主要是对印第安纳型或新泽西型的糖蛋白 &5 %- %,2 的部分表位和核蛋白 20 & %- %,2 的抗体进行检测从而检测分型以及快速检测病毒抗体而对另一重要毒力因子的抗体国内外还无有效的监测方法鉴于蛋白在感染宿主细胞中的重要作用本文利用大肠杆菌表达系统制备了重组蛋白同时以该重组蛋白为抗原建立了检测感染动物体内蛋白抗体的 " 方法以初步研究蛋白抗体在宿主体内的变化规律并为监测动物感染情况等提供技术方法材料与方法材料大肠杆菌菌株 4 " 原核蛋白表达质粒 -" + 克隆全长基因组的质粒 - 和感染小鼠康复血清由上海市兽医生物技术重点实验室制备保存主要试剂分子标准聚合酶连接酶购自美国 * 2 +1 公司 6 0 内切酶购自美国 "4 公司胶回收试剂盒 $ 产物回收试剂盒与质粒提取试剂盒购自 95 2 公司,1 单克隆抗体购自康为世纪公司,1 标签蛋白纯化树脂, 1,2 购自北京鼎国昌盛生物技术公司重组蛋白的原核表达质粒的构建与鉴定据 $4 中收录的印第安纳株基因组序列设计引物将 9 基因克隆至 -" + 原核表达质粒上游引物下游引物下划线为上下游引物设计的 6 与 0 酶切位点将 9 基因连接至 -" + 质粒获得的重组质粒用双酶切鉴定正确后送上海杰李公司测序基因序列正确的表达质粒称为 -" + 33 重组蛋白的诱导表达纯化及鉴定将 -" + 质粒转化 4 " 表达宿主菌以终浓度为 **%& 的诱导重组蛋白的表达超声破碎表达蛋白的宿主菌 *,2 下离心 *,2 对破碎菌体上清及沉淀分别采用? 的 " 检测目的蛋白是否表达以及是否以包涵体形式存在采用, 1,2 纯化该重组蛋白纯化流程按照北京鼎国公司的纯化说明书进行采用? 的 " 胶鉴定纯化产物并用小鼠康复血清及,1 单克隆抗 ) 体按文献所述方法进行 1 2 &%,2 以鉴定蛋白表达正确感染 33 的 54 " 小鼠血液蛋白抗体变化实验小鼠为 4 4 雄性小鼠上海斯莱克实验动物有限公司体重约为 ) 滴鼻接种病毒实验小鼠分组每组只分别用 4 缓冲液病毒空斑形成单位 -&+=0 % *,2 02, 进行接种并检测小鼠体内抗抗体的消长规律及体重变化接种前以及接种后每周取血次连续周采集血清冻存于 A 备用

3 第 #期张世宽#等'重组水泡性口炎病毒基质蛋白制备及 4,1.+ 检测方法的建立?# = Y 蛋白抗体 $R# 3S 检测方法的建立 #?) 参照文献方法 %通过方阵滴定对 4,1.+ 检序列 <?$"%以此我们设计了特异性引物%以克隆 3.31*X全长基因组的质粒 3.30-] 为模板%用测方法条件进行优化%包括重组蛋白最佳包被浓度高保真 ]6) 试剂盒扩增到了目的大小的基因片段% 和一抗稀释度等*纯化的重组 Y 用 $9 $, $@ B % e 包被过夜*用含 c <碳酸缓冲液稀释% /?9 如图#所示* 的脱脂奶粉的 ]R.j$9 $@c 2U "$封闭缓冲液% = e封闭"*待测血清经倍比稀释% = e 孵育 " *二抗为标记的羊抗鼠 % 用封闭缓冲液 /)] 1 N0 稀释为#h@$$$% 做阴性对照%以待测血清 'X 值$阴性对照 'X 值 ]$*"#"9 # 作为阳性标准%以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清的抗体滴度"$)* 图#3.31*X W 基因 ]6) 扩增产物琼脂糖电泳 ## X*+ Y V ' "#扩增 3.3 W 基因?结果与分析 #4 ]6) 3.3 W, ## X*+ Y V ', "# 3.3 W N?= Y 蛋白基因的扩增根据0RV中3.31*X 的基质蛋白基因 W" 经测序的 3.3 W 基因的 X*+ 序列以及对应的氨基酸序列如图"所示* 图"3.3 W 基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列 "* Q QQ QB Q 3.3 W N a a?= 重组 Y 蛋白的表达及鉴定将 3.3 Y 蛋白基因克隆至表达质粒 42"% $, VX左右*电泳结果如图 + 所示%在 # BB 1 ]20 诱导后%相比 42"质粒诱导表达产物 #= 该质粒表达蛋白其 * 末端可偶联分子量约 #=VX VX"% %<VX左右相应的位置%全菌体破碎物有预期的 42" Y 质粒诱导表达产物的新增条带* 的外源蛋白硫氧还蛋白 2 W+"%与 Y 蛋白融合表达后%得到的 2 W+Y 重组蛋白的理论分子量为 %< 为了进一步验证该新增条带为目的蛋白%我们用

4 上海交通大学学报农业科学版"?" 第"卷 "Z 亲和层析纯化对表达产物进行了纯化%得到了 * 预期分子量的目的蛋白%如图 R 所示*纯化的蛋康复血清检测到 Y 蛋白呈阳性%而健康小鼠则反应呈阴性'抗 / N的单克隆抗体检测到的 2 W+Y 白用感染 3.3 小鼠康复血清及抗 / 标签的单克重组蛋白%而 2 W+ 则为 #=VX左右有条带显示% 隆抗体分别进行了 _ N 鉴定实验结果表明该蛋白是正确表达的重组 Y 蛋白% 3.3 小鼠以上结果表明%利用原核表达质粒 42"% 3.3 Y 蛋白得到了正确表达* 图重组 3.3 W 基因在大肠杆菌中表达及纯化产物的.X. ]+04 鉴定 +"##蛋白质分子量 Y V ' "# # Y 未诱导表达' %# Y 诱导表达产物' R"##蛋白 Y V ' "# 42"空质粒表达产物' 42" 42" Y 表达产物纯化* 42".X. ]+04 Q B 3.3 W N?Y A B ' +", ## B V ',"# 42" Q?Y A B '',# Q 42" Y', %# 42" Y Q' R", ## ] 42" Y9 B V ',"# 图%重组 Y 蛋白表达的 _ N鉴定 +"抗 / R"3.3 康复小鼠血清' 6"健康鼠血清*泳道# ## "# Y 未诱导表达' # Y N 抗体' 42"质粒表达产物' 42" 42" 全菌破碎' %# Y 表达产物纯化* 42" %1 Q B Y S_ N +"+ / QS' R"3.3 T ' 6"* o T B 9, ## 42" Q?Y A B ''"# N Q 42" Y'# 42" Y Q'%# 42" 感染小鼠体内 Y 蛋白的抗体变化点阵滴定优化确定蛋白包被浓度为#"%N $B,' /)] 标记的兔抗鼠1 N0 二抗工作浓度确定为内检测不到特异的 Y 攻毒后第#周下降显著%可达 "$c%与之对应的是% 3.3 在宿主中的感染和复制得益于其自身可有效地抑制宿主1型干扰素的表达*0 和 Y 蛋白感染该剂量病毒动物体内 Y 抗体滴度在 3.3 攻毒被认为是导致 3.3 致病性的重要毒力因子"#)%其第#周后变化不明显%但从第 " 周至第 % 周抗体滴中 Y 蛋白参与了对宿主细胞的抗病毒免疫应答抑度稳步上升'而 #$]- 组动物在病毒攻击后的未制作用*报道表明"#"")%野生型的 Y 蛋白可阻遏宿显现出显著下降%而 Y 抗体水平直至接种后第 % 周主细胞 B)*+ 从胞核向胞外的转运%并以此抑制感亦变化不显著*]R. 组动物的体重则稳步上升%体 $#%使得病毒得以在正染细胞产生&型干扰素1 -*/ 如图@所示% #$<]- 剂量组的动物的体重在

5 第 #期张世宽#等'重组水泡性口炎病毒基质蛋白制备及 4,1.+ 检测方法的建立? 接种小鼠 Y 抗体检测 +"及小鼠的体重变化 R" " ' + + Y QS 3.3 QB R RQSU N 3.3 QB S N 常组织细胞中大量繁殖%这被认为是导致 3.3 致鼠产生严重的致病性%表现为体重不像 #$<]- 组病性的重要原因之一*自然情况下%存在一种 3.3 中出现的那样%发生显著的下降%这些结果显示出病突变体%其 Y 位氨基酸甲硫氨酸"突毒抗体的产生与致病性的产生是由关系的*较低剂变为精氨酸%这种突变型 3.3 的致病性减低*这量的 3.3%如#$]-%其不会导致小鼠的致病性% 是因为%突变的 Y 蛋白丧失了阻遏 B)*+ 转运的但也未有效产生抗体%这显示病毒未能有效复制%而能力%感染突变型 3.3 的宿主细胞可恢复产生 & 高剂量时%导致显著的致病性%伴随着抗体也得到有型干扰素%从而抑制病毒的复制的转录*虽然 Y 蛋效地激发*这种现象仍有待回归 3.3 的本体动物白在 3.3 的致病性形成上起了重要作用%但其感如猪&牛等进行进一步验证%并判断是否 Y 抗体能作为感染严重性的一个重要指标* 染动物后% Y 蛋白抗体的变化规律还未深入研究* 为了更好的研究 Y 蛋白的功能以及快速诊断 3.3 综上%通过利用大肠杆菌表达重组 3.3 Y 蛋感染%本文克隆了 3.3 W 基因并尝试多种原核表白%建立了检测 Y 抗体的 4,1.+ 方法%为 3.3 的达载体对其进行表达%最后%发现在 Y 蛋白 * 末端研究奠定了基础* 融合一个外源蛋白 2 W+ 以后%可获得高水平的重组 Y 蛋白表达%该蛋白经小鼠 3.3 康复血清和 / N单克隆抗体鉴定后%证明表达正确* 参考文献 3.3 的天然宿主为猪&牛&马等家畜动物%引起严重的水泡性病变甚至死亡%)* 小鼠虽然不是 #) 郑增忍%王海霞%龚振华%等9水疱性口炎研究进展 3.3 的天然宿主%但实验证明其可被 3.3 感染%高剂量的野生型 3.3 病毒经滴鼻等途径接种小鼠 ")国家质量监督检验检疫总局9中华人民共和国进境动后%可导致其出现神经症状%如后肢麻痹甚至死 $$UUU9 $WWNV5 $A" "$#" #$ #<)9 T9 # a a9 N 亡#<)*因此%本文采用 #$<]- 和 #$]-" 种不 $N $ $"$#"#$$ #A<$ WW "$#"#$#<5"%?=A9 J N 同剂量病毒对小鼠进行滴鼻接种%除了通过小鼠体重变化等指标来研究病毒致病性%也期望利用重组 Y 蛋白建立 4,1.+ 方法%并研究 Y 蛋白抗体变化规律及其与 3.3 致病性的关系*实验表明% 3.3 感染可激发小鼠产生 Y 蛋白抗体%其滴度在接种后第#周变化不明显%而在第"周后开始显著上升%尤其值得注意的是%抗体的产生是与致病性相关的%当 &)9中国兽医杂志% "$$@% %# ="# 物一&二类传染病&寄生虫名录 4R$',)9 #??" $< B9 ) 褚秀玲%成军%周学章%等9水泡性口炎的研究进展 &)9吉林畜牧兽医% "$$% ="#? #"9 %) 殷震%刘景华9动物病毒学Y)9第" 版9北京#科学出版社% #???# %A@ ] &%.Q Y% & J+ B9+ S)*% N B U B T B T Q T U QB 接种剂量为#$<]-%可导致小鼠体重在接种后第 # B T QQ N &)9 # 周即非常显著的下降%而在第"周开始得到恢复%而 #???% = %"# "?"# "?"?9 Q ) * % Y 抗体也是在第 " 周开始有效产生'接种剂量为 #$]- 则未产生高水平的抗体%而病毒也未对小 <)1 2% 6 4% 'VB +% & J+ B9YQ ].+] B Q N

6 上海交通大学学报农业科学版第卷 +,%2% 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01,26, %+23,26,6% ' % 3 )) ' 孙洪正徐自忠周晓黎等 ' 水疱性口炎研究进展 ' 动物医学进展 ) ' )$/%2 %1 B' * %,+,%2% 02,%2+&6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01*+,9- %,2,26,6% ' 3 ' % *+22 0# *' 01,%2 +,6 &5 %- %,2 * 3,+ 1 / 5 % %9,, 5% 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01 *0 +2 1&+,2 /%1 1/0 % +,6, 5' % 3 ) ' B%- 5 5& 1 '/ & %023,2 +,6, 5% / 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 01*+,9- %,2,130 % /,230,%2% &3 + / ' 3 )' 周学章高丰宋德光等 ' 水泡性口炎病毒抗原决定簇单克隆抗体研究 ' 中国预防兽医学报 ' 孙秀萍宋晗星苏高莉等 ' 水泡性口炎病毒双抗体夹心 " 检测方法的建立 ' 中国预防兽医学报 ) ' 周学章高丰贺文琦 ' 水泡性口炎病毒蛋白抗原决定区片段基因在大肠杆菌中的表达 ' 中国兽医学报 ' 曾彩云陈茹谢青梅等 ' 水泡性口炎病毒种血清型核衣壳蛋白的原核表达及生物信息学分析 ' 华南农业大学学报 )' +2+, +&4,+2 0 / *'%2% &%2+& +2, %3, 1 % / - %,2% 6 1, 0&+ 1 %*+,,16, 0123,+2+1 % % ,%2- %30 ' 3 ) ) ' +2 </+2 02 *'"6+&0+,%2% , /*0 + 3% +23- %,21+16+,2 6 % 1'3 "" ' 孙涛陆苹 ' 口蹄疫病毒复制酶基因的克隆表达及纯化 ' 中国兽医学报 ' ) +* %%011 & ' 分子克隆实验指南 ' 第版 ' 北京科学出版社 )' 田丽红华育平 ' 检测种猫科动物猫瘟热病毒抗体 " 方法的建立及初步应用 ' 中国兽医学报 ) ' ' 2+--&, + & * /%3 % *+- -,2 -, %- 1%26, +&- %,2', & "$ '$.# ' 方心葵李京敬王欣等 '+,9 蛋白和蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建及生物学活性观察 ' 畜牧兽医学报 ) ) ' % 3&, / ' 1 +,21, /3 1,2 /, +,&, 5 %1/0 3%2,22+,**02, 5+ -% *, +2, ' 1 " 1 '

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽