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授石
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1 211 年第 69 卷化学学报 Vol. 69, 211 第 2 期, 247~251 ACTA CHIMICA SINICA No. 2, 247~251 研究简报原小檗碱类生物碱与抗凋亡蛋白 Bcl-2 相互作用的光谱法研究张艳霞 a,b 张秀凤 a 唐亚林 *,a 向俊锋 ( a 中国科学院化学研究所分子动态与稳态国家重点实验室北京 119) ( b 中国科学院研究生院北京 149) ( c 北京师范大学生命科学学院北京 1875) a 田明月 a,c 摘要应用荧光光谱法研究三种原小檗碱类生物碱 : 盐酸小檗碱 (Berberine hydrochloride) 药根碱(Jatrorrhizine) 和盐酸巴马汀 (Palmatine hydrochloride) 与抗凋亡蛋白 Bcl-2 之间的相互作用, 探讨了这三种生物碱对 Bcl-2 蛋白的荧光淬灭机理, 分别测定其结合常数和结合位点数. 实验结果表明, 盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀等三种原小檗碱类生物碱都能够使 Bcl-2 蛋白的内源性荧光发生淬灭, 其荧光淬灭过程是静态淬灭过程. 通过比较三种生物碱与 Bcl-2 蛋白的相互作用, 发现随着分子柔性增强, 其与 Bcl-2 蛋白的结合能力增强. 因此, 增强生物碱的分子柔性有可能增强其靶向 Bcl-2 蛋白的能力. 关键词盐酸小檗碱 ; 药根碱 ; 盐酸巴马汀 ; Bcl-2; 荧光光谱 Studies of the Interactions between Three Protoberberine Alkaloids and Bcl-2 by Fluorescence Spectroscopy Zhang, Yanxia a,b Zhang, Xiufeng a Tang, Yalin*,a Xiang, Junfeng a Tian, Mingyue a,c ( a State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 119) ( b Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 149) ( c College of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 1875) Abstract The interactions between Bcl-2 and three protoberberine alkaloids: berberine hydrochloride, jatrorrhizine and palmatine hydrochloride were studied by fluorescence spectroscopy. The binding constants and the number of binding sites were measured, respectively, and the quenching mechanism was proposed. The results indicated that the protoberberine alkaloids could decrease the intrinsic fluorescence of Bcl-2 mainly through static quenching. By comparing the structures of the three alkaloids, it was found that the binding affinity to Bcl-2 protein increased with molecular flexibility of the alkaloids. Keywords berberine hydrochloride; jatrorrhizine; palmatine hydrochloride; Bcl-2; fluorescence spectroscopy 传统治疗肿瘤的主要手段是利用化疗药物杀死肿瘤细胞, 但是这些药物存在毒副作用大易产生耐药性等缺点, 在临床上的应用受到很大限制. 近些年来的研究表明, 细胞凋亡与肿瘤发生发展与消退具有密切关系, 细胞凋亡已经成为肿瘤治疗的新靶点. Bcl-2 蛋白是 Bcl-2 家族中的抗凋亡蛋白, 其过度表达可阻止细胞正常的生理凋亡, 是肿瘤发生和产生耐药性的重要原因之一. 临床上, Bcl-2 蛋白在很多肿瘤细胞中的表达高于在正常细胞中的表达, 包括直肠癌骨髓癌胃癌肺癌等, 表明这些肿瘤与 Bcl-2 基因异常表达有关 [1]. 以 Bcl-2 为靶点的药物对正常细胞产生的影响比较小, 这种基于肿瘤发病机制的新型治疗方案相比于传统的细 * tangyl@iccas.ac.cn Received June 2, 21; revised August 18, 21; accepted September 27, 21.

2 248 化学学报 Vol. 69, 211 胞毒性疗法, 具有选择性好安全性高等优点 [2]. 目前, 国内外已经报道多个活性良好的以 Bcl-2 为靶点的小分子, 它们作为先导化合物为靶向 Bcl-2 抗肿瘤药物的研发打下基础. 天然产物的抗肿瘤作用已经被人们所熟知, 一些天然产物也被发现可能是 Bcl-2 蛋白的抑制剂, 如抗霉素 A 3 白屈菜红碱等. 本文中所研究的三种生物碱已被证实具有一定的抗肿瘤活性, 但其作用机理和作用靶点尚无定论. 盐酸小檗碱 (Berberine hydrochloride, Ber) 药根碱 (Jatrorrhizine, Jat) 和盐酸巴马汀 (Palmatine hydrochloride, Pal) 均为原小檗碱类生物碱 ( 结构见图式 1), 是黄连的主要成分. 原小檗碱类生物碱是自然界中广泛存在的一类生物碱, 结构多样, 具有广泛的生理活性, 如抗菌抗肿瘤镇痛抗心率失常抗血小板聚集降压调节免疫等功能 [3]. 相互作用时, 利用荧光光谱法计算了环丙沙星与不同构象 HSA 的结合常数, 并讨论了环丙沙星对 HSA 结构的 [18] 影响. Cui 等利用荧光光谱法研究 BCPT 与 HSA 和 BSA 的相互作用, 确定其淬灭机理为静态淬灭, 并分别计算结合常数能量转移间距等参数. 本文利用荧光广谱法研究了三种原小檗碱类生物碱分子与 Bcl-2 蛋白的相互作用, 发现这三种生物碱都能够引起 Bcl-2 蛋白发生荧光淬灭, 并首次测定其结合常数和结合位点数等参数. 这些结果为进一步研究该类生物碱的抗肿瘤机制, 以及开发靶向 Bcl-2 蛋白的抗肿瘤药物具有重要的指导意义. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂荧光光谱在 F45 荧光光谱仪 ( 日本 Hitachi 公司 ) 上采集. Bcl-2 蛋白.6 mg/ml 储备液 ( 上海驷佳生物技术有限公司 ), 保存于 -2 冰箱. 药根碱盐酸小檗碱盐酸巴马汀 ( 深圳美荷生物科技有限公司 ) 溶于乙醇, 配成 1 mmol/l 的储备液. 实验所用缓冲溶液为 PBS (ph 7.4, 每升溶液中含 NaCl 8 g, K 2 HPO g, KH 2 PO g, 二硫苏糖醇 7.7 mg), 所用试剂均为分析纯, 所用水为二次蒸馏水. 1.2 实验方法图式 1 盐酸小檗碱 (1) 药根碱(2) 和盐酸巴马汀 (3) 的分子结构 Scheme 1 Molecular structures of berberine hydrochloride (1), jatrorrhizine (2) and palmatine hydrochloride (3) 盐酸小檗碱俗称盐酸黄连素, 临床上主要用于治疗胃肠道感染细菌性痢疾等. 近年来, 国内外许多报道显示, 小檗碱对多种人及动物肿瘤细胞的生长有明显抑制作用, 并能促进细胞凋亡. 研究表明, 小檗碱的抗肿瘤机制可能有以下几个方面 [4] : (1) 影响肿瘤生长相关酶, 如拓扑异构酶环氧酶 -2(COX-2) 等 ; (2) 诱导肿瘤细胞凋亡 ; (3) 诱导肿瘤细胞分化. 药根碱具有抗菌作用, 对细菌真菌都有抑制作用, 并能够抑制肾上腺素的升压作用. 盐酸巴马汀具有抗细菌感染病毒感染真菌感染的作用. 药根碱和盐酸巴马汀也具有一定的抗肿瘤活性, 药根碱对 P388 白血病细胞系具有细胞毒性, 其 E 5 为 2 µg/ml [5], 巴马汀和药根碱均可强烈抑制小鼠腹水癌细胞对氧的摄取作用 [4]. 荧光光谱法具有灵敏度高选择性好取样量少和重现性好等优点, 广泛应用于蛋白质与各种小分子相互作用的研究 [6~18] [13]. Ahmad 等在研究 HSA 与环丙沙星 Bcl-2 蛋白的终浓度为.5 µmol/l, 三种生物碱的终浓度为.5~6 µmol/l. 将 Bcl-2 蛋白和一定浓度生物碱混合后, 在室温下反应 1 h, 测荧光光谱. 固定激发波长为 27 nm, 扫描 28~5 nm 范围内的发射光谱. 激发发射狭缝为 1 nm 宽. 2 结果与讨论 2.1 盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀对 Bcl-2 蛋白荧光光谱的影响 Bcl-2 蛋白中含有的色氨酸 (Trp) 酪氨酸(Tyr) 苯丙氨酸 (Phe) 残基受激发后能够发射内源荧光, 当这些氨基酸残基本身或周围环境发生变化时, 其荧光会发生相应变化. 按照实验方法, 固定 Bcl-2 的浓度, 在其中加入不同浓度的生物碱溶液. 从图 1 可以看出, Bcl-2 在 338 nm 处有较强荧光, 主要产生于色氨酸残基, 酪氨酸残基由于与色氨酸残基之间存在共振能量转移, 因而观测不到其荧光带. 随着盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀的浓度不断增大, Bcl-2 的荧光强度有规律地降低, 最大发射波长发生不同程度的蓝移, 这说明三种生物碱均与 Bcl-2 发生了相互作用. 当生物碱达到一定浓度后,

3 No. 2 张艳霞等 : 原小檗碱类生物碱与抗凋亡蛋白 Bcl-2 相互作用的光谱法研究 249 Bcl-2 的荧光峰裂分为二重峰, 这可能是由于 Bcl-2 中的酪氨酸残基受生物碱诱导而终止与色氨酸残基间的共振能量转移, 分裂出自身的荧光发射峰 [19]. 其中左侧峰发生蓝移, 表明酪氨酸残基所处微环境的疏水性增强 ; 右侧峰强度逐渐增强, 可能是生物碱与 Bcl-2 反应后形成的荧光复合物产生的荧光发射 [2]. 比较三种生物碱的荧光淬灭谱图 ( 图 1), 发现盐酸小檗碱滴定蛋白至出现双峰时的浓度明显比其他两种生物碱高. 这表明盐酸小檗碱与 Bcl-2 蛋白的反应机理结合位点或结合能力可能与药根碱盐酸巴马汀不同. 2.2 荧光淬灭类型的确定荧光淬灭过程可以分为两种 : 动态淬灭和静态淬灭. 首先假设该过程为动态淬灭, 用 Stern-Volmer 方 [3] 程分析荧光淬灭数据 : F / F=+ 1 K τ =+ 1 K [Q] (1) q sv 其中 F 和 F 分别为生物碱加入前后 Bcl-2 蛋白的荧光强度, [Q] 为生物碱浓度, K sv 是淬灭常数, k q 是淬灭过程的速率常数, τ 是淬灭剂不存在时荧光分子的平均寿命, 生物大分子的平均寿命约为 1-8 s. 根据公式 (1), 以 F /F 对生物碱浓度 [Q] 作图 ( 图 2), 由曲线分别得出三种生物碱对 Bcl-2 的淬灭常数和淬灭速率常数, 见表 1. 研究表明, 各类淬灭剂对生物大分子的最大动态淬灭速率常数约为 L mol -1 s -1, 从表 1 的结果可以看出, 三种生物碱盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀对 Bcl-2 的淬灭速率常数分别为 , 和 L mol -1 s -1, 都远大于 L mol - 1 s - 1. 由此说明, 这三个生物碱对 Bcl-2 的淬灭不属于分子间的碰撞引起的动态淬灭过程, 而可能是由于与 Bcl-2 结合形成了新的复合物而引起的静态淬灭过程. 图 2 盐酸小檗碱 (1) 药根碱(2) 和盐酸巴马汀 (3) 淬灭 Bcl-2 荧光的 Stern-Volmer 曲线 Figure 2 Stern-Volmer plot for the quenching of Bcl-2 fluorescence by Ber (1), Jat (2) and Pal (3) 表 1 盐酸小檗碱药根碱盐酸巴马汀对 Bcl-2 的淬灭常数 (K sv ) 和淬灭速率常数 (k q ) Table 1 Quenching constant (K sv ) and quenching rate constant (k q ) for the binding of Bcl-2 with Ber, Jat and Pal Alkaloid K sv /(L mol -1 ) k q /(L mol -1 s -1 ) r 图 1 盐酸小檗碱 (a) 药根碱(b) 和盐酸巴马汀 (c) 对 Bcl-2 的荧光淬灭光谱图 Figure 1 Fluorescence quenching spectra of Bcl-2 by Ber (a), Jat (b) and Pal (c) Ber Jat Pal

4 25 化学学报 Vol. 69, 三种生物碱与 Bcl-2 结合位点数的确定在静态淬灭中, 假设一个 Bcl-2 分子有 n 个相同且独立的结合位点可以结合生物碱小分子, 则两者之前发生的反应可以用下式表示 [21] : P+nQ= PQ n (2) 其中 P 为 Bcl-2, Q 为淬灭剂即生物碱分子, PQ n 为蛋白与生物碱形成的复合物, 用 K 表示复合物的生成常数, 则有 : [PQ n ] K= (3) n [P][Q] 如果 Bcl-2 总体浓度为 [P], 且 [P] =[PQ n ] + [P], [P] 为 Bcl-2 游离浓度, 则有 : [PQ ] [P] n = - [P] (4) 在静态淬灭过程中, 荧光体的荧光强度与其游离浓度成正比 : [P]/[P] = F/ F (5) 将式 (4), (5) 代入式 (3), 可以导出下式 [6] : ( F ) lg - F = lg K + nlg[q] (6) F lg[(f -F)/F] 对 lg[q] 作图 ( 图 3), 可求得盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀对 Bcl-2 的结合位点数分别为 1.5, 1. 和.85. 由此可以推测, 这三种生物碱与 Bcl-2 都以 1 1 相结合. 的结合常数可以由它们之间的缔合公式求得 : P Q A + K K PQ (7) 解离常数可以表示为 : [P][Q] [P] [Q]( FF / ) [Q] K = [PQ] = [P] [1-FF / ] = F/ F-1 从而得到 Lineweaver-Burk 方程 [7] : ) [Q] - (8) ( F-F =F + K F (9) 变形后即为 : F 1 F-F =+K 则结合常数为 : A 1 (1) [Q] K = 1/ K (11) 以 F /(F -F) 对 1/[Q] 作图 ( 如图 4), 可求得三种生物碱与 Bcl-2 相互作用的解离常数和结合常数, 如表 2. 可以看出, 这三个化合物与 Bcl-2 蛋白的结合常数 K A 都较大, 表明这三种生物碱与 Bcl-2 之间有比较强烈的相互作用力. 图 4 盐酸小檗碱 (1) 药根碱(2) 和盐酸巴马汀 (3) 淬灭 Bcl-2 荧光的 Lineweaver-Burk 曲线 Figure 4 Lineweaver-Burk plot for the quenching of Bcl-2 fluorescence by Ber (1), Jat (2) and Pal (3) 图 3 盐酸小檗碱 (1) 药根碱(2) 和盐酸巴马汀 (3) 淬灭 Bcl-2 荧光的双对数曲线 Figure 3 ouble-lg plot for the quenching of Bcl-2 fluorescence by Ber (1), Jat (2) and Pal (3) 2.4 三种生物碱与 Bcl-2 结合常数的确定对于以 1 1 结合的静态淬灭, 三种生物碱与 Bcl-2 表 2 盐酸小檗碱药根碱盐酸巴马汀对 Bcl-2 的结合常数 (K A ) 和解离常数 (K ) Table 2 Binding constant (K A ) and dissociation constant (K ) for the binding of Bcl-2 with Ber, Jat and Pal Alkaloid K A /(L mol -1 ) K /(mol L -1 ) r Ber Jat Pal

5 No. 2 张艳霞等 : 原小檗碱类生物碱与抗凋亡蛋白 Bcl-2 相互作用的光谱法研究讨论从表 1 和表 2 可以发现, 盐酸小檗碱的荧光淬灭常数和结合常数明显低于其他两种生物碱, 且滴定蛋白至出现双峰所需的浓度明显高于其它两种生物碱 ( 图 1), 这表明三种生物碱与 Bcl-2 蛋白的结合能力不同. 由于这三种生物碱同属于原小檗碱类生物碱, 它们的结构非常相似, 很多性质相似, 但结构上的细微差别还是导致三者之间存在一定的差异. 比较三者的结构 ( 图式 1), 其母核结构相同, 只有最左侧的烷氧基数量不同. 盐酸巴马汀含有两个 OCH 3, 药根碱含有一个 OCH 3 和一个 OH, 而盐酸小檗碱含有一个 1,3- 二氧戊杂环, 从分子柔性的角度来看, 盐酸小檗碱是闭环结构, 分子柔性最小, 而药根碱和盐酸巴马汀是开环结构, 分子柔性较大. 上述实验结果表明, 生物碱随着分子柔性增大, 与 Bcl-2 蛋白的结合能力增强. 3 结论本文通过荧光光谱分析法研究了盐酸小檗碱药根碱和盐酸巴马汀三种原小檗碱类生物碱与 Bcl-2 蛋白的相互作用. 实验发现, 这三种生物碱都能够使 Bcl-2 蛋白的荧光发生静态淬灭. 三种生物碱分别与 Bcl-2 蛋白结合, 形成新的复合物, 且复合物能够发射较弱的荧光. 三种生物碱随着分子柔性增大, 与 Bcl-2 蛋白的结合能力增强. 要寻找以 Bcl-2 蛋白为靶点的生物碱配体可以通过对原小檗碱类生物碱进行结构修饰, 增大其分子柔性来实现. 本文得出的结论对于更深入的研究原小檗碱类生物碱与 Bcl-2 蛋白的作用机理改造天然化合物与设计合成新药具有一定的指导意义. References 1 Zheng, Z.-B.; Jiao, K.-F.; Li, S. Chin. J. Med. Chem. 21, 4, 115 (in Chinese). ( 郑志兵, 焦克芳, 李松, 中国药学化学杂志, 21, 4, 115.) 2 Liu, G.; You, Q.-. Prog. Pharm. Sci. 28, 32(6), 246 (in Chinese). ( 刘改, 尤启东, 药学进展, 28, 32(6), 246.) 3 Wu, Q.-H.; Wang,.-Y.; Zhou, X.; Zhang, Z.-H.; Liu, W.-H.; Wang, Z. J. Spectrosc. Spec. Anal. 29, 29(7), 1911 (in Chinese). ( 吴秋华, 王东跃, 周欣, 张志恒, 刘伟华, 王志, 光谱学与光谱分析, 29, 29(7), 1911.) 4 Wang, T.-X.; Li, M.; Lei, K.-J.; Zhao, W. Chin. J. Gerontol. 28, 28(11), 1143 (in Chinese). ( 王天晓, 李明, 雷凯健, 赵玮, 中国老年学杂志, 28, 28(11), 1143.) 5 Zhao, T.-F.; Wang, X.-K.; Rimando, A. M.; Che, C.-T. Planta Med. 1991, 3(3), Kandagal, P. B.; Ashoka, S.; Seetharamappa, J.; Shaikh, S. M. T.; Jadegoud, Y.; Ijare, O. B. J. Pharm. Biomed. Anal. 26, 41, Qu, L.-B.; Wang, L.; Chen, X.-L.; Yuan, J.-W.; Yang, R.; Li, P. Acta Chim. Sinica 27, 65(21), 2417 (in Chinese). ( 屈凌波, 王玲, 陈晓岚, 袁金伟, 杨冉, 李萍, 化学学报, 27, 65(21), 2417.) 8 Sun, Y.-T.; Zhang, Y.-P.; Bi, S.-Y.; Sun, Y.; Liu, H.; Zhai, Y.-J.; Zhang, H.-Q. Chem. J. Chin. Univ. 29, 3(6), 195 (in Chinese). ( 孙艳涛, 张玉璞, 毕淑云, 孙晔, 刘贺, 翟玉娟, 张寒琦, 高等学校化学学报, 29, 3(6), 195.) 9 Bi, S.-Y.; ing, L.; Song,.-Q.; Tian, Y.; Zhang, H.-Q. Acta Chim. Sinica 25, 63, 2169 (in Chinese). ( 毕淑云, 丁兰, 宋大千, 田媛, 张寒琦, 化学学报, 25, 63, 2169.) 1 Li, G.-Z.; Liu, Y.-M.; Guo, X.-Y.; Wang, J.-J. Acta Chim. Sinica 26, 64, 679 (in Chinese). ( 李桂芝, 刘永明, 虢新运, 王进军, 化学学报, 26, 64, 679.) 11 Hu, Y.-J.; Yang, Y.-O.; ai, C.-M.; Liu, Y.; Xiao, X.-H. Biomacromolecules 21, 11, Hu, Y.-J.; Liu, Y.; Xiao, X.-H. Biomacromolecules 29, 1, Ahmad, B.; Parveen, S.; Khan, R. H. Biomacromolecules 26, 7, Lei, G.-H.; Yang, R.; Zeng, X.-L.; Shen, Y. H.; Zheng, X.-H.; Wei, Y.-M. Chromatographia 27, 66, Li, Y.; He, W.-Y.; Liu, J.-Q.; Sheng, F.-L.; Hu, Z.-.; Chen, X.-G. Biochim. Biophys. Acta 25, 1722(1), Wang, Y.-Q.; Zhang, H.-M.; Zhang, G.-C. J. Pharm. Bio- Med. 26, 41, Li, Y.; He, W.-Y.; Tian, J.-N.; Tang, J.-H.; Hu, Z.-.; Chen, X.-G. J. Mol. Struct. 25, 743, Cui, F.-L.; Fan, J.; Li, J.-P.; Hu, Z.-. Bioorg. Med. Chem. 24, 12, Liu, X.-F.; Xia, Y.-M.; Fang, Y.; Liu, L.-L.; Zou, L. Chem. J. Chin. Univ. 24, 25, 299 (in Chinese). ( 刘雪峰, 夏咏梅, 方云, 刘玲玲, 邹鲁, 高等学校化学学报, 24, 25, 299.) 2 Zhao, C.-C.; Zheng, W.-F.; Li, M.-Q. J. Spectrosc. Spec. Anal. 24, 24, 111 (in Chinese). ( 赵长春, 郑维发, 李梦秋, 光谱学与光谱分析, 24, 24, 111.) 21 Zhang, Y.; Zhang, G.-Z.; Wang, Y.-M. J. Anal. Sci. 2, 16, 445 (in Chinese). ( 张勇, 张贵珠, 王月梅, 分析科学学报, 2, 16, 445.) (A1622 Li, L.)

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