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罐翟
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1 中国农学通报 011,7():14-18 Chinese Agricultural Science Bulletin 莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用蔡元保 1 杨祥燕 1 黄明忠曾黎明 1 崔明勇 1 陈显国 1 林玉虹 1 1 广西亚热带作物研究所南宁中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南儋州摘要以莲雾 DNA 为模板应用正交设计法对 SRAP 反应体系中的各个主要影响因素进行了优化筛选结果表明 0 μl 反应体系中各组分的最适浓度或用量分别为 1 Buffer 3.0 mmol/l Mg mmol/l dntps 0.4 μmol/l 引物 0.5 U Taq DNA 聚合酶和 40 ng 模板 DNA 利用该优化体系通过 64 对 SRAP 引物组合对 7 份莲雾进行了 SRAP-PCR 扩增证实了该体系具有稳定可靠重复性好多态性较强等特点关键词莲雾 SRAP 正交设计体系优化中图分类号 Q945.1 文献标志码 A 论文编号 Optimization of SRAP-PCR System and its Application in Wax Apple (Syzygium samarangens) Cai Yuanbao1, Yang Xiangyan1, Huang Mingzhong, Zeng Liming1, Cui Mingyong1, Chen Xianguo1, Lin Yuhong1 (1Guangxi Sub-tropical Crops Research Institute, Nanning ; Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou Hainan ) Abstract: The main influential factors of SRAP reaction system were optimized for genomic DNA in wax apple (Syzygium samarangens) by orthogonal design. The results showed that the optimum concentration was 1 Buffer, Mg mmol/l, dntps 0.3 mmol/l, primer 0.4 μmol/l, Taq DNA polymerase 0.5 U, 40 ng template DNA with a total volume of 0 μl reaction solution. The molecular identification of 7 varieties of wax apple were achieved by 64 SRAP primer combinations with this optimum system which could provide clear, reliable and repeatable abundant polymorphisms molecular markers. Key words: wax apple (Syzygium samarangens); SRAP; orthogonal design; optimization 0 引言的收集与利用带来了极大的不便至今从分子水平莲雾 Syzygium samarangense Merr. et Perry 又上对莲雾种质的研究甚少在国内只报道用同工酶技名洋蒲桃爪哇蒲桃等为桃金娘科 Myrtaceae 蒲桃术[1]和 ISSR 分子标记[]对部分莲雾种质资源的遗传多属植物其果实色泽艳丽果形独特风味清香是著名样性作了初步评价这些从分子水平上为莲雾种质资的热带亚热带水果之一莲雾在中国海南广东广源的收集与利用提供了一些参考依据西福建台湾等省区有广泛分布种质资源丰富有必相关序列扩增多态性 sequence-related amplified 要加强对其资源的收集鉴定与评价工作以发掘利用 polymorphism, SRAP 又称为基于序列扩增多态性这一资源但目前多以莲雾果实的色泽进行命名极 sequence-based amplified polymorphism, SBAP [3] 是有可能造成同名异物和同物异名这对莲雾种质资源由 Li 和 Quiros[4] 在 001 年创建的一种 DNA 分子标记基金项目广西壮族自治区直属公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(桂热研 0110) 第一作者简介蔡元保男 1981 年出生福建莆田人硕士主要从事植物生理与分子生物学研究通信地址广西壮族自治区南宁市邕武路号广西亚热带作物研究所 Tel caiyuanbao05@163.com 通讯作者杨祥燕女 1984 年出生云南大理人硕士主要从事果树栽培学研究通信地址广西壮族自治区南宁市邕武路号广西亚热带作物研究所 Tel yangxiangyan8441@16.com 收稿日期修回日期

2 15 蔡元保等莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用技术该标记具有简便高效稳定产率高便于克隆 1.. SPRA-PCR 反应体系的优化及检测针对 0 μl 目标片段等特点已被广泛应用于植物遗传图谱构反应体系中的 5 个因素 Mg+ dntps 引物 Taq DNA 建比较基因组学遗传多样性分析基因连锁标记的聚合酶和模板 DNA 设定 4 个水平采用 L16(45)正交试寻找与基因定位等多个研究领域目前 SRAP 标记验设计进行筛选方案如表 1 其中 MgCl dntps 和 [5] [6] [7] [8] 已成功应用于石榴柿香蕉桃 [9-11] [1] 苹果等果树遗传多样性遗传图谱等多领域的研究但在国内尚未见 SRAP 标记在莲雾上有研究报道本文以莲雾长青为试材建立并优化了适合莲雾 SRAP 分析的反应体系旨在为 SRAP 标记在研究莲雾的遗传多样性和亲缘关系等奠定基础 1 材料和方法 1.1 试验材料参试莲雾材料共 7 份分别是文昌青皮水晶青皮蝶形南洋长红长青和黑珍珠除长红长青和黑珍珠取自海南大学儋州校区的农学院基地外其他材料均取自广西亚热带作物研究所水果基地选取无病虫害幼叶洗净后于-70 保存备用 1. 方法 1..1 DNA 提取及检测莲雾 DNA 提取参照 Doyle 等[13] 的方法并加以改良所提取的基因组 DNA 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量用 Biophotometre 型核酸蛋白仪检测其浓度稀释至 0 mg/l 置于-0 保存备用 Taq DNA 聚合酶均购自大连宝生物公司正反向引物采用 Li 和 Quiros[4] Ferriol 等 [14] 及 Vandemark 等 [15] 发表的引物序列由上海生工公司合成如表所示随机选用其中的引物 me5+em1 组合对莲雾长青材料进行体系优化试验重复次 PCR 扩增程序参考 Li 和 Quiros[4] 的方法即 94 预变性 5 min 94 变性 1 min 35 复性 1 min 7 延伸 90 s 5 个循环 94 变性 1 min 50 复性 1 min 7 延伸 90 s 35 个循环最后 7 延伸 10 min 4 保存 PCR 产物在含有核酸染料的 1.8% 琼脂糖凝胶中电泳电极缓冲液为 0.5 TBE 电泳结束后于凝胶成像系统上检测并拍照 1..3 SPRA-PCR 优化体系的确立和验证根据上述试验结果确定的 SRAP-PCR 最佳反应体系分别选取 8 条正反向引物表合成 64 个 SRAP 引物组合以莲雾长青材料的 DNA 为模板进行 PCR 扩增以验证该最佳反应体系在不同引物组合下的稳定性和可靠性同样在该最佳反应体系下随机选用引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材料进行 PCR 扩增从而进一步验证表 1 SRAP-PCR L16(45)正交试验设计处理号因素和水平 Mg /(mmol/l) dntps/(mmol/l) 模板 DNA/(mg/L) 引物/(μmol/L) Taq DNA 聚合酶/(U/0μL)

3 16 中国农学通报表 SRAP 所用引物序列编号正向引物(5' 3') 编号反向引物(5' 3') me1 5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3' em1 5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3' me 5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3' em 5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3' me3 5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3' em3 5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3' me4 5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3' em4 5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3' me5 5'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3' em5 5'-GACTGCGTACGAATTAAC-3' ME6 5'-TGAGTCCTTTCCGGTAA-3' R8 5'-GACACCGTACGAATTGAC-3' ME7 5'-TGAGTCCTTTCCGGTCC-3' R9 5'-GACACCGTACGAATTTGA-3' F7 5'-GTAGCACAAGCCGGAGC-3' R15 5'-CGCACGTCCGTAATTCCA-3' 最佳的莲雾 SPRA-PCR 扩增体系因组 DNA 质量和浓度都较好满足本试验的要求结果与分析. 正交试验设计结果分析.1 莲雾基因组 DNA 的检测结果莲雾正交试验 16 个组合表 1 的 SRAP 扩增效果用改良 CTAB 法提取的 7 份莲雾材料 DNA 经电如图所示在 16 个组合中 Mg+ dntps 模板 DNA 泳后条带清晰无拖尾现象图 1 经分光光度计测引物和 Taq DNA 聚合酶 5 个因素浓度的组成不同其定 OD60/A80 值为 1.7~1.9 结果表明参试材料的基扩增结果表现出显著差异从次的重复结果来看 l 8 l0 1 号组合基本上扩增不出谱带号处理的扩增结果相对较好得到的谱带清晰亮度和重复性好其中以 4 号组合的带型最为丰富因此确定第 4 组合为莲雾 SRAP-PCR 的最佳反应体系即 0 μl 反应体系中中含有 3.0 mmol/l Mg+ 0.3 mmol/l dntps 0.4 μmol/l 引物 0.5 U Taq DNA 聚合酶和 1 7 分别是文昌青皮水晶青皮蝶形南洋长红长青.3 莲雾 SRAP-PCR 反应体系的稳定性检测和黑珍珠莲雾材料图 1 莲雾基因组 DNA 的电泳检测图ｂｐＭ 40 ng 模板 DNA 根据上述所确立的优化条件选用 64 个 SRAP 引１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６２０００１０００７５０５００２５０１００ M: DNA Marker DL 处理编号同表图正交设计 SRAP-PCR 反应体系扩增结果物组合表对莲雾长青材料进行扩增以验证该体增出清晰多态性好的谱带说明所确立的体系具有系在不同引物组合下的稳定性和可靠性由图 3 可稳定可靠重复性好多态性较强等特点适于进行莲见绝大部分引物组合均能扩增出清晰重复性好的谱雾的 SRAP 分析带同样随机选用引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材 3 结论料进行 PCR 扩增结果表明图 4 7 份莲雾材料均能扩本试验应用正交设计法对影响莲雾 SRAP 反应体

4 蔡元保等 : 莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用 : 部分引物组合编号图 3 部分 SRAP 引物组合对莲雾长青材料的扩增结果 1 7 分别是文昌青皮水晶青皮蝶形南洋长红长青和黑珍珠莲雾材料图 4 引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材料的扩增结果系的 Mg + dntps 引物 Taq DNA 聚合酶和模板 DNA 浓度等进行了优化, 建立了适用于莲雾的最佳 SRAP 反应体系, 即 0 μl 反应体系中包含 3.0 mmol/l Mg +, 0.3 mmol/l dntps,0.4 μmol/l 引物,0.5 U Taq DNA 聚合酶和 40 ng 模板 DNA 利用此优化体系进行莲雾 SRAP-PCR 扩增, 证实了该体系具有稳定可靠重复性好多态性较强等特点 4 讨论 SRAP 标记是基于 PCR 的技术, 具有很多优点, 但其扩增结果受反应条件和扩增程序以及不同物种的影响其中,SRAP-PCR 扩增程序一般都参考 Li 和 Quiros [4] 的固定扩增程序因此,SRAP 标记应用到不同物种上时需要优化反应体系和条件从本试验结果来看, 不同组合的反应体系对 SRAP-PCR 扩增结果影响很大可见, 对莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应条件进行优化是非常必要的目前, 莲雾的遗传多样性分析和品种测试中尚未看到 SRAP 标记应用的报道, 寻求和优化适合该物种的最佳 SRAP-PCR 反应体系也是深入开展该相关研究的基本条件有关 PCR 反应体系优化的报道大多采用单因子设计, 但该方法费时费工, 且不能兼顾到各因素间的交互作用正交试验设计不仅具有均衡分散综合可比伸缩灵活及效应明确的特点, 还可以顾及各因素间的交换效应本试验采用正交试验设计对影响 SRAP-PCR 反应的主要因素进行筛选, 能较快的找到合适的反应参数, 即避免了单因子实验结果的不足, 又减少了工作量目前, 正交试验设计已成功应用于枣 [16] [17] [18] 假俭草花生等其他植物 SRAP-PCR 反应体系优化, 但在莲雾上还未曾报道本试验采用正交试验设计从最经济的角度, 在对扩增结果图谱进行直观分析的基础上, 最终确定了莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应的最佳反应体系在莲雾 SRAP 体系优化的过程中, 发现 Mg + dntps Taq DNA 聚合酶和引物浓度等均会显著影响 SRAP 扩增效果,4 个因素浓度过低均会造成谱带缺失现象, 但模板 DNA 浓度对扩增无明显影响 (0~40 ng 之

5 18 中国农学通报间均有稳定的扩增 ), 这与其他学者的研究结果相 [19-1] 似 SRAP 一般用 PAGE 电泳检测 PCR 产物, 但本试验用琼脂糖凝胶电泳检测也能获得得较丰富的多态性, 而且稳定可靠重复性好此外, 相对其他分子标记而言,SRAP 由于其特殊的引物设计, 能更好地反映 [4] 物种的遗传多样性和亲缘关系由此可见,SRAP 标记适用于莲雾亲缘关系鉴定和遗传多样性分析等研究本试验优化的 SRAP-PCR 反应体系稳定可靠重复性好多态性较强, 不仅适用于莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应, 也为今后 SRAP 标记在莲雾种质鉴定遗传多样性分析和优良性状标记等方面的广泛应用奠定了良好基础参考文献 [1] 王家保, 姜成东, 李金成, 等. 11 份莲雾资源的同工酶评价 [J]. 热带作物学报, 004, 5(): [] 何桥, 梁国鲁, 谢江辉, 等. 莲雾种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 [J]. 园艺学报, 006, 33(): [3] Ferriol M, Picó B, Nuez F. Genetic diversity of some accessions of Cucurbita maxima from Spain using RAPD and SBAP markers [J]. Genet Resour Crop Evol, 003, 50: [4] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 001, 103: [5] Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I, et al. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers [J]. Theor Appl Genet, 004, 108: [6] 张四普, 汪良驹, 曹尚银, 等. 3 个石榴基因型遗传多样性的 SRAP 分析 [J]. 果树学报,008,5(5): [7] Guo D L, Luo Z R. Genetic relationships of some PCNA persimmons (Diospyros kaki Thunb.) from China and Japan revealed by SRAP analysis [J]. Genet Resour Crop Evol, 006, 53: [8] Phothipan S, Silayoi B,Wanichkul K, et al. Genetic relationship among bananas in AA, AAB and BB groups using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and sequence related amplified polymorphism (SRAP) techniques [J]. Kasetsart Journal, 005, 39(4): [9] Ahmad R, Potter D, Southwick S M. Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers [J]. J Amer Soc Hort Sci, 004, 19: [10] Peace C P, Crisosto C H, Gradziel T M, et al. The use of molecular genetics to improve peach and nectarine post-storage quality [J]. Acta. Hort, 005, 8(1): [11] 沈志军, 马瑞娟, 俞明亮, 等. 油蟠桃组合遗传连锁图谱构建及糖酸性状 QTL 分析 [J]. 园艺学报, 010, 37(11): [1] 张春雨, 陈学森, 林群, 等. 新疆野苹果群体遗传结构和遗传多样性的 SRAP 分析 [J]. 园艺学报, 009, 36(1): [13] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 1987, 19: [14] Ferriol M, Picó B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers [J]. Theor Appl Gent, 003, 107: [15] Vandemark G J, Ariss J J, Bauchan G A, et al. Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms [J]. Euphytica, 006, 15: [16] 李莉, 彭建营, 郑宝强. 枣 SRAP-PCR 体系的正交优化 [J]. 农业生物技术学报, 008, 16(): [17] 郑轶琦, 王志勇, 郭海林, 等. 正交设计优化假俭草 SRAP-PCR 反应体系及引物筛选 [J]. 草业学报, 008, 17(4): [18] 邹小云, 邹晓芬, 陈伦林, 等. 花生 SRAP-PCR 反应体系的正交设计优化 [J]. 分子植物育种, 010, 8(4): [19] 郭凌飞, 邹明宏, 杜丽清, 等. 均匀设计优化澳洲坚果 SRAP 反应体系 [J]. 果树学报, 008, 5(): [0] 路娟, 张绍铃, 刘庆忠, 等. 樱桃 SRAP-PCR 体系优化及其遗传多样性分析 [J]. 果树学报, 009, 6(): [1] 乔燕春, 林顺权, 刘成明, 等. SRAP 分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用 [J]. 果树学报, 008, 5(3):

Microsoft Word - 车卓.doc

Microsoft Word - 车卓.doc 作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(10): 1936 1941 http://www.chinacrops.org/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01936 应用 SRAP 标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性