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匆谢
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1 复旦学报医学版溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 1 1 及其受体 131 表达的作用何爱明林董林世明福建师范大学福清分校生物与化学工程系福清福建省福清卫生学校药理教研组福清摘要目的探讨溃结灵对溃疡性结肠炎 # # 大鼠结肠黏膜的中性粒细胞趋化因子 & #& #!$$ '# ##& -. & 及其受体 2 趋化因子受体 2$ '!# 2 表达的作用方法只雄性, 大鼠随机分为正常组模型组艾迪莎组溃结灵高剂量组溃结灵中剂量组和溃结灵低剂量组共组每组只用 0 & 三硝基苯璜酸 &##( 6 +./ 灌肠建立大鼠溃疡性结肠炎模型造模成功后除正常组外各组分别给予生理盐水 ' 艾迪莎 "" 溃结灵高 "" 中 "" 低 "" 剂量处理后处死动物肉眼观察结合显微镜观察对结肠组织形态学评分运用荧光定量法及免疫组化染色法分别检测各组大鼠 -. & 及 2'.) 及其蛋白表达结果溃结灵具有明确改善大鼠的效应与艾迪莎组相比溃结灵高剂量组的疗效差异无统计学意义中低剂量组的疗效差异有统计学意义与正常组相比模型组 -. & 及 2'.) 及蛋白质表达呈明显上升趋势与炎症呈正相关经过溃结灵和艾迪莎干预后随着炎症改善 -. & 及 2'.) 及其蛋白表达呈下降趋势结论溃结灵可能通过干预 -. & 及 2 的表达来抑制中性粒细胞趋化从而达到缓解./ 诱导溃疡性结肠炎的效应关键词溃结灵溃疡性结肠炎中性粒细胞趋化因子 & 2 趋化因子受体中图分类号文献标志码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

2 何爱明等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 -. & 及其受体 2 表达的作用 '## #$#7, $4# * ## #' # +##$ #'+ 4$ $4! ( $ ( "#$*! + -. & 2$(#"+ ##+!'!$#!$ +' & 7 " # # ##& #!$$ '# ##& 2$ '!# 溃疡性结肠炎 # # 又称为非特异性溃疡性结肠炎是一类慢性反复发作的肠道非特异性炎症病理组织学改变以大量炎性细胞包括中性粒细胞淋巴细胞浸润隐窝结构扭曲隐窝脓肿为特点有研究报道中性粒细胞!'!$ #!$. 通过微血管循环进入结肠黏膜内并持续存在于活动性的全过程固有膜中的. 被认为是病理学炎症反应的可靠的标志性物质中性粒细胞趋化因子 & #& #!$$ '# ##& -. & 及其受体 2 趋化因子受体 2$ '!# 2 的表达在中性粒细胞向炎症区域的趋化过程中起着关键的作用若能干预上述相应趋化因子及其受体的表达从而影响中性粒细胞向炎症区域的趋化无疑对的炎症消除和疾病愈合是非常有利的中药复方溃结灵主要由水蛭救必应白芍炙甘草等组成以清热健脾活血为治则临床和实验研究发现溃结灵对有较好的治疗效果对于溃结灵治疗的作用机制广州中医药大学脾胃研究所等研究单位已经开展了一系列研究工作并取得一定的进展但目前仍然未彻底揭示其作用的机理本研究通过运用荧光定量法免疫组化染色检测大鼠 -. & 及 2'.) 及其蛋白的表达观察溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠的治疗效应及对上述指标的影响以进一步揭示溃结灵的治疗机制和的发病机制材料和方法实验动物, 大鼠只级雄性体重 " 由福建医科大学实验动物中心提供合格证号闽实动质准第号试剂与仪器溃结灵药材采芝林连锁药店经广州中医药大学中药学院中药标本中心张秋镇老师鉴定药材均符合中华人民共和国药典标准按组方比例称取药材常规方法制备水煎液低中高剂量按成人用量的倍给药即 ""./ "' 公司艾迪莎美沙拉秦缓释颗粒剂批号 1 博福益普生天津制药有限公司 -. & 抗大鼠抗体美国, 公司 2 抗大鼠抗体武汉博士德生物工程有限公司大鼠 -. & 2 ),1 基因引物上海生工生物技术有限公司 / 试剂盒广州达晖生物公司其余试剂均为分析纯造模方法动物适应性饲养一周后按体重随机分为组每组只动物禁食不禁水 $ 留取正常组只其余只给予 0 乌拉坦 '" 腹腔麻醉参照文献报道的./ 造模最佳剂量 '" " 计算用 ' 注射器抽吸./ 原液 '" 与 0 乙醇 ' 混合后用聚丙烯管插入肛门上段 ' 处注入混合试剂 $ 后观察造模动物约 0 出现稀便和血便后随机处死只动物距肛门约 ' 处肉眼可见大小约 ' ' 的溃疡面表明造模成功将其余只大鼠随机分成模型组艾迪莎组溃结灵低中高剂量组个组别其中模型组只其余各组均只给药及标本处理造模成功后正常组模型组给予 ' 生理盐水灌胃艾迪莎组给予艾迪莎 "" 灌胃溃结灵低中高剂量组分别按设计剂量给药每天次均连续给药各组治疗结束后禁食 $ 处死动物迅速剖取距肛门 ' 处的长度为 ' 结肠组织块分别置于 0 中性甲醛液和液氮中备用组织形态学评分标准及方法取全段结肠剪开生理盐水洗净平铺于白板上置于放大镜下肉眼观察结肠大体形态结肠黏膜损伤情况表将固定的结肠组织进行常规石蜡包埋切片苏木精伊红染色显微镜下观察结肠组织形态学变化表表肉眼观察结肠形态和黏膜损伤评分标准 "#'!&"! '$%' '!#%'* ' '! %'&#!/! #& #!&*%"#'! )$ -+ ''#!$ " #+ *4#$# 4#$#$!'#$(4 4#$+ ''# #$#4 4#$+ ''# #$#4 4#$#$ ' # + + ''# ' $ ' # ++ ''#' #$ (

3 复旦学报医学版年月表光镜下观察组织学损伤评分标准 "#'!&"! '$ #&"' ' #%#!/!#"#%'&%'*#%'& "#'! 1# " ''' /" '' -+ ''# ' # -!#$ (' ' # ( 结肠黏膜 1 1 及 131 表达检测采用链酶亲合素生物素复合物 #!#&(# '!* )/ 法加微波修复具体步骤按试剂盒说明进行操作用已知阳性标本作阳性对照以 / 代替一抗作阴性对照在光镜下观察免疫组织化学染色结果染色阳性表达为胞质或胞膜呈棕褐色颗粒每张切片随机选取个高倍视野计数个细胞计算阳性细胞百分比 1 1 及 131 的表达检测采用荧光定量法检测 # -. & 引物序列上游引物 :& )))) ))))&: 下游引物 :&))) )) )) ) ))) &: # 2 引物序列上游引物 :&) )& ))&: 下游引物 :& & )&: # ),1 上游引物 :&))) ) & ) )) ) ))) &: 下游引物 :&& ) ) )))&: 组织总.) 提取后做逆转录然后用 #' & 反应体系扩增采用相对定量比较管家基因 "$&&!$!$# $ " ),1 与目的基因的 # 值得出所测标本目的基因的相对表达量相对 '.) 表达 # 0# 值靶基因 # 值 ),1 # 值结果由仪配套的软件自动计算统计学分析实验数据应用统计软件进行处理计量资料采用表示组间差异采用单因素方差分析 &4 ). 8) 方差齐时用 $ + 法方差不齐时用 ' &14 法时认为差异有统计学意义时认为差异有显著统计学意义结果肉眼及光镜观察结肠黏膜损伤情况和损伤评分表 2 模型组黏膜糜烂重溃疡多而大黏膜严重充血水肿艾迪莎组黏膜糜烂程度减轻溃疡数量少黏膜充血水肿程度较模型组轻浅溃结灵高剂量组黏膜糜烂不严重溃疡小黏膜充血水肿程度轻溃结灵低剂量组黏膜糜烂较严重溃疡较明显黏膜充血水肿程度无明显减轻溃结灵中剂量组的组织损伤介于高剂量组和低剂量组之间正常组大鼠未见及黏膜充血水肿和糜烂黏膜光滑平整表 2 大鼠结肠黏膜损伤评分 2, #! "#'!$'%' '!#% %' &!'$ "! " ""$# '!!.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! & # # 1 1 及 131 蛋白表达免疫组化图像分析结果表与正常组相比模型组 -. & 及 2 蛋白表达呈明显上升趋势经过溃结灵和艾迪莎干预后随着炎症改善 -. & 及 2 蛋白呈下降趋势表 1 1 及 131 蛋白表达阳性总面积和阳性表达所占比值 &"$'*'&#"#"'"! *%!" "#''$*'"#!)*&#'!#!1 1! 131! #+ -. & ' #+ -. & 0 #+ 2 ' #+ 2 0.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! &' "! &' "!

4 何爱明等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 -. & 及其受体 2 表达的作用 1 1 及 131 定量检测分析结果表 5 与正常组相比模型组 -. & 及 2 '.) 表达呈明显上升趋势经过溃结灵和艾迪莎干预后随着炎症改善 -. & 及 2'.) 表达呈下降趋势表基因相对表达量 5&"$' "#)*&#'!#!"!'$ 1 1! 131 0! -. & 2.' 7,"" 7, "" 7, "" %# # &'"! &'"! &' "! &' "! 讨论溃疡性结肠炎是炎症性肠病 + ''# (4-/, 的一种 -/, 已被公认为是胃肠道中除恶变外最严重的疾病之一的病因和发病机制目前尚不明确流行病学实验表明结肠癌的发生发展与结肠炎症的反复发作密切相关从中医的角度看属泄泻痢疾便血肠风等范畴多因素体脾胃虚弱饮食不节忧思恼怒等致脾胃损伤湿热内生蕴结于肠腑而致反复发作其病位在脾肾大肠病初多为湿热内蕴肠道气机阻滞病久入络入脏而出现脾肾阳虚挟瘀及寒热虚实挟杂之证以清热健脾活血为治则的溃结灵由救必应白术白芍水蛭炙甘草组成临床治疗有较好的疗效且无明显不良反应本研究的实验结果显示中高剂量的溃结灵能明显减轻大鼠的组织损害改善病理损伤表明溃结灵对实验鼠有明显的治疗作用初步验证了该药的临床治疗效果随着免疫学分子生物学等学科的迅速发展以及动物模型制作方法的日趋成熟的发病机制正逐步得以揭示近来研究集中在样受体 &!# 核转录因子 &/ #!# + #&/.&/ 通路上尤其是.&/ 认为它调控着细胞因子和黏附分子的释放从而参与了肠道的炎症和免疫反应研究指出溃结灵使./ 法诱导的大鼠模型结肠黏膜 -/& 蛋白阳性细胞率明显降低和蛋白表达水平明显下降.& /! 蛋白表达及血清.& 降低说明溃结灵可能通过调控.&/ 通路的细胞因子和蛋白表达而发挥抗炎症的作用这也验证了.&/ 通路在发病机制中发挥一定的作用 - & 和.& 被公认为是介导的细胞因子.&/ 的激活有待于依赖性细胞因子 - & - &.& 的产生 - &.& 在发病机制中的重要性已被确认 - & 是一种很强的中性粒细胞趋化因子它能促进中性粒细胞的溶酶及超氧阴离子白三烯及 & 羟色胺的释放.& - &- & 等诱发的肠道炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以 - & 为代表的趋化因子所介导的因此 - & 在炎症反应的持续与放大中起重要作用 -' 等研究发现患者 - & 表达水平明显高于正常对照组 - &'.) 阳性细胞与正常对照组相比有明显增高且 - &'.) 阳性细胞主要位于勃膜层隐窝脓肿等区域的巨噬细胞内上述研究均表明 - & 与发病有密切的联系中性粒细胞趋化因子 -. & 是一种和人 - & 很相似的鼠源性趋化性细胞因子被看作是 - & 家族的一员对嗜中性粒细胞有很强的趋化作用趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的蛋白偶联的跨膜受体!#!!# 通常表达于免疫细胞内皮细胞上皮细胞等细胞膜上按趋化因子分类将与类趋化因子结合的受体称为类受体同 2 类趋化因子结合的受体称为 2 类受体 2 本研究发现在炎症诱导下活动性结肠组织中 -. & 蛋白及 '.) 增高结肠浸润的中性粒细胞及肠上皮细胞膜上 2 的表达明显增高 -. & 通过与中性粒细胞膜上相应的 2 结合激活胞膜上的钙泵细胞向前方伸出片足使细胞移向产生趋化因子的部位定向迁移进入结肠组织间隙在细胞因子及某些因素作用下活化释放胞质内的颗粒对局部组织产生破坏作用本研究亦发现在不同剂量的溃结灵治疗下结肠组织的 -. & 及其受体 2 的水平随炎症缓解而下降的趋势这与 -. & 及其受体 2 的水平与肠道炎症程度呈正相关的报道相一致本研究证实溃结灵具有明确改善大鼠溃疡性结肠炎的效应其高剂量组与艾迪莎组的疗效差异无统计学意义而中低剂量组与艾迪莎组的疗效差异有显著统计学意义我们推测溃结灵可能通过抑制 -. & 及其受体 2 的表达从而影响中性粒细胞向炎症区域的趋化达到缓解./ 诱导大鼠溃疡性结肠炎的效应综上所述溃结灵治疗的机制通过两种途径来实现

5 复旦学报医学版年月调控.&/ 通路细胞因子的水平调节 -. & 及其受体 2 表达的水平两途径均与 - & 有关联对于两调节途径之间的相互联系及作用方式有待进一步研究参考文献 '! ( ' ))' 7 %!$ " # ## " #$ '!$ + # # 黄志新劳绍贤崔琦珍等溃结灵颗粒治疗活动性溃疡性结肠炎的临床和实验研究中西医结合消化杂志杜群李红王建华溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠治疗作用的病理学观察中药新药与临床药理杜群李红王建华等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜.&/! 蛋白表达及血清.& 含量的影响广州中医药大学学报李红杜群王文君等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜样受体基因表达的影响中药材李红杜群王汝俊等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜.&/& 蛋白表达的作用辽宁中医杂志 / 1 " 1!# & '+ $ + ''# ##$ # 王皓欧阳钦胡仁伟三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立胃肠病学 /#6, ' / /# # '#$! #' # '! *! ' # # #$ # 欧阳钦我国炎性病研究的概况及展望中华消化杂志杜群王汝俊李燕舞等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜蛋白水平的作用世界华人消化杂志 7 ''# " $ -77.&!! / # '## +"!' # 0 & " + & -' )88 "' 8 #! # #&! #"'# '! 4#$ +''# (4 / ( -')-7 $'#! " #+ &"4#$&# "! #&!$!# #$ ' ++ ''# (4 '+$( $-+ ''# (4 4 "$# # '$' + + ''# " #'6!! $ # " #$!," 7 )/ 4 ).&!!/ ##! '.)"&!#!+ ''# # $ ' *# +# '&# # " " '+" '#$,/$#.!!# (#! " # $ ' $ '!# *!!' '#!$ /(! "! " $#!$ 7 1' $ ' " # + '!#$ " ''! ' 收稿日期编辑段佳

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (

何爱明 等 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的 -. & 及其受体 2 表达的作用 '## #$#7, $4# * ## #' # +##$ #'+ 4$ $4! ( $ ( "#$*! + -. & 2$(#"+ ##+!'!$#!$ +' & 7 " # # ##& #!$$ '# ##& 2$

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