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凤施
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1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2016, 41(8) articles 论著 DOI: /j.issn 汉族高血压人群 CAMK4 基因多态性与氨氯地平降压疗效的相关性钟广伟, 陈雨丝, 刘丽华, 刘英哲, 杨柳, 罗燕丽, 姚佳梅 ( 中南大学湘雅医院国际医疗部, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究二氢吡啶类钙通道阻滞药 ( 氨氯地平 ) 的降压疗效与汉族高血压人群钙 / 钙调素依赖性激酶 4 (CAMK4) 单核苷酸多态性间的关联方法 : 对 108 例轻中度汉族原发性高血压患者给予氨氯地平 5 mg/d, 为期 8 周的治疗, 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术对 CAMK4 基因 rs 位点进行分型, 同时分析基因型与氨氯地平降压疗效间的关系结果 :CAMK4 基因频率分布符合 Hardy-Weinberg 平衡分布 C,T 等位基因的频率分别为 88.89% 和 11.11% 患者治疗前各基因型组的收缩压和舒张压比较差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后, 各基因型原发性高血压患者收缩压和舒张压较治疗前下降 (P<0.05) CC 型与 CT 型在降低收缩压幅度方面显著优于 TT 型 (P<0.05),CC 型高血压患者的总有效率明显高于 CT 及 TT 型患者 (P<0.01) 结论: 轻中度汉族原发性高血压患者 CAMK4 基因 rs 位点基因多态性与服用钙通道阻滞药的降压疗效有相关性 [ 关键词 ] 钙 / 钙调素依赖性激酶 4; 原发性高血压 ; 钙通道阻滞药 ; 基因多态性 Association between gene polymorphism of calcium/ calmodulin-dependent kinase 4 and efficacy of amlodipine in the treatment of hypertension in Chinese Han nationality ZHONG Guangwei, CHEN Yusi, LIU Lihua, LIU Yingzhe, YANG Liu, LUO Yanli, YAO Jiamei (Internatioal Medical Center, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To evaluate the association between single nucleotide polymorphisms of calcium/ calmodulin-dependent kinase 4 (CAMK4) and the therapeutic effect of amlodipine in essential hypertensive patients in Chinese Han nationality. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 钟广伟, zgw7512@sina.com 通信作者 (Corresponding author): 姚佳梅, @qq.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( , ); 湖南省中医药科研计划项目 ( ,201245) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( , ) and Chinese Medicine and Pharmacy Planned Project of Hunan Province, P. R. China ( , ).

2 778 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(8) Methods: A total of 108 mild-to-moderate essential hypertension patients in Chinese Han nationality were treated with amlodipine for 8 weeks at a dosage of 5 mg/d. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism was performed to detect the genotypes (rs ). Blood pressure was measured and analyzed. Results: The result of rs polymorphism of CAMK4 was consistent with Hardy-Weinberg equilibrium distribution and the frequencies of C allele and T allele were 88.89% and 11.11%, respectively. The systolic blood pressure and diastolic blood pressure before amlodipine treatment were not statistically different among different genotype carriers (P>0.05). The blood pressure was significantly reduced in all patients after amlodipine treatment (P<0.05). Systolic blood pressure was significantly decreased in patients with rs CC genotype and CT genotype compared with those patients with rs TT genotype. Total effective rates of CT and TT carriers were higher than those of the CC genotype carriers (P<0.01). Conclusion: The CAMK4 gene polymorphism might be associated with the efficacy of calcium channel blocker in treating mild-to-moderate essential hypertension patients. KEY WORDS calcium/calmodulin-dependent kinase 4; essential hypertension; calcium channel blocker; gene polymorphism 二氢吡啶类钙离子通道阻滞药是广泛应用于治疗高血压的一线药物, 目前最常用的代表性药物是氨氯地平 [1] [2-3] 最近多项多中心研究表明 : 原发性高血压患者服用钙通道阻滞药, 血压达标率可达 62%~78%; 但仍有近三分之一患者血压不能达标近年来, 随着药物受体基因研究的发展, 发现个体间遗传背景的差异是这种降压疗效个体间差异的重要原因之一 [4] ; 其作用靶点的基因多态性与降压疗效及不良反应密切相关, 体现出明显的遗传易感性钙 / 钙调素依赖性激酶 4 基因 (calcium/calmodulin dependent kinase 4,CAMK4) 介导的信号通路能够调节细胞内钙离子的浓度 [5], 参与血压的调节, 提示其多态性可能影响 L 型钙离子通道阻滞药的降压疗效本研究旨在分析轻中度汉族高血压人群 CAMK4 基因单核苷酸多态性 (SNPs) 与钙通道阻滞药降压疗效之间的关系 1 对象与方法 1.1 对象选取 2013 年 6 月至 2016 年 2 月在中南大学湘雅医院心内科老年医学科国际医疗部内科住院及门诊原发性高血压患者, 从未服用过降压药物入选标准 : 年龄 40~75 岁, 所选病例均符合 2004 年中 [6] 国高血压防治指南高血压诊断标准并按指南分级 (1 级 2 级及 3 级 ), 未治疗前非同日 3 次测量, 收缩压 140 mmhg(1 mmhg=0.133 kpa) 和 / 或舒张压 90 mmhg 者选择其中 l~2 级无血缘关系的轻中度汉族原发性高血压患者为研究对象其中 1 级为 34 例, 血压为 (155.26±13.07) mmhg;2 级为 74 例, 血压为 (98.52±11.38) mmhg 排除标准: 肾实质病变肾血管病变嗜铬细胞瘤原发性醛固酮增多症甲状腺功能亢进等引起的继发性高血压 ; 严重糖尿病单纯收缩期高血压贫血周围血管疾病心力衰竭卒中心肌梗死病史严重心律失常严重肝肾功能障碍等 ; 顽固性高血压及中途失访等其他不宜参加研究的患者最终确定选取 108 例, 入选年龄 (61.05±6.73) 岁, 其中男 63 例, 女 45 例 ; 本研究得到湘雅医院伦理委员会的批准, 所有患者同意参加本研究并签署知情同意书, 进入试验程序 1.2 方法血压测量与静脉血的抽取患者均给予苯磺酸氨氯地平片 5 mg/d( 商品名 : 络活喜, 大连辉瑞制药有限公司生产, 批号 : ) 治疗, 患者服药时间为每天上午 8:00~10:00 在跟踪调查治疗的 8 周中不服用其他任何可以降低血压的药物首次服药前测量 3 次血压取平均值, 并记录为治疗前血压, 首次服药后第 2,4,8 周的上午 8:00~9:00 量血压治疗满 8 周后测量 3 次平均血压, 记录为治疗后血压每次由固定人员固定台式水银血压表测量治疗前及治疗后抽取患者空腹静脉血测生化指标, 包括空腹血糖血脂肝功能及肾功能 ; 同时

3 汉族高血压人群 CAMK4 基因多态性与氨氯地平降压疗效的相关性钟广伟, 等 779 将静脉血 3~4 ml 加入 EDTA 抗凝管中, 置 70 低温储存, 用于提取基因组 DNA( 采用血液基因组 DNA 小量抽提试剂盒抽提基因组 DNA) 治疗反应判别根据 1988 年高血压疗效评定标准进行评定 : 高效组, 收缩压变化值 (change in systolic blood pressure, ΔSBP)>20 mmhg 或舒张值变化值 (change in diastolic blood pressure,δdbp)>10 mmhg; 中效组,ΔSBP 10~20 mmhg 或 ΔDBP5~10 mmhg; 低效组,ΔSBP< 10 mmhg 或 ΔDBP<5 mmhg; 无效组, 未达到以上 3 项标准基因扩增及分型仪器与试剂 GeneAMP PCR System 9700 系美国 Applied Bisystems 公司产品 ;MassARRAY Compact System 系美国 Sequenom 公司的产品 ; 人血全基因组 DNA 抽提试剂盒购于上海生工生物有限公司 ; 多重 PCR 引物及延伸引物由上海生工生物有限公司 Sequenom 公司 Assay Design3.1 程序设计, 由北京三博远志生物技术有限责任公司合成 PCR 引物及延伸引物序列 PCR 扩增 PCR 引物 : 上游引物,5'-AGGCCCTATGGTAGT- GCCTT-3'; 下游引物,5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTC- AC-3' 反应总体积 50 μl, 扩增条件 : 预变性 94 5 min,94 30 s,59 40 s,72 45 s, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 10 min 扩增产物为 384 bp, 经 2% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色, 置紫外灯下观察结果并照相 SNP 分型采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术对 CAMK4 基因 rs 位点进行分型 PCR 产物经 BanII 内切酶于 37 下酶切过夜 (BanII 内切酶购自 Fermentas 公司, 货号 Eco24I), 酶切产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色, 于紫外灯下观察结果并照相以进行 SNP 分型 1.3 统计学处理应用 SPSS 13.0 软件包进行数据处理计量资料用均数 ± 标准差 (x±s) 表示 ; 样本群体代表性采用 Hardy- Weinberg 平衡检验 ; 计量资料比较采用 t 检验 ; 计数资料比较采用 χ 2 检验 ;P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 CAMK4 基因的各基因型鉴定经过 PCR 扩增的产物得到 384 bp, 经过 BanII 内切酶酶切后得到 266 和 118 bp 2 个片段, 是野生型基因 TT; 酶切后产物既得到 384 bp 又得到 266 和 118 bp 3 条片段, 是突变型杂合子 CT; 酶切产物只得到 1 条 384 bp 片段, 是突变型纯合子 CC, 结果见图 bp 500 bp 300 bp 100 bp 图 1 CAMK4 基因 rs C T 多态位点 BanII 酶切后 2% 琼脂糖凝胶电泳结果 Figure 1 CAMK4 gene rs C T polymorphism by BanII restriction with 2% agarose gel electrophoresis 1 and 7: Marker; 2 and 6: CC genotype; 4: TT genotype; 3 and 5: CT genotype 2.2 高血压患者基因型分布及频率基因分型表明轻中度汉族高血压患者 CAMK4 基因 rs 存在 CC 纯合 CT 杂合及 TT 纯合 3 种基因型 108 例患者中,CC 基因型 88 例,CT 基因型为 16 例,TT 基因型为 4 例, 基因型频率分别为 81.48%,14.81%,3.71%,C 等位基因频率为 88.89%, T 等位基因频率为 11.11% 把等位基因频率带入公式 p+q=1(p 为 C 基因型的频率,q 为 T 基因型的频率 ), p 2 +2pq+q 2 =1, 符合 Hardy-Weinberg 平衡检验, 即所选样本具有群体代表性 2.3 不同基因型高血压患者的一般资料比较 108 例轻中度汉族高血压患者按照 CAMK4 基因 rs 多态性中 CC,CT,TT 3 种基因型分组后各组临床资料间差异均无统计学意义 (P>0.05, 表 1) 2.4 治疗前后的临床指标比较用苯磺酸氨氯地平片治疗 8 周后, 收缩压和舒张压分别比治疗前明显下降 (P<0.05); 但在改善患者治疗前后的体质量指数空腹血糖及血脂等方面无明显异常 ( 均 P>0.05); 口服降压药物治疗 8 周, 患者治疗前后无明显肝功能和肾功能损害 ( 均 P>0.05, 表 2)

4 780 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(8) CAMK4 基因多态性与钙通道阻滞药降压疗效的相关性 108 例轻中度汉族原发性高血压患者治疗前各基因型组的收缩压和舒张压比较差异无统计学意义 (P>0.05); 用钙通道阻滞药降压治疗后,CC,CT 和 TT 基因型高血压患者收缩压和舒张压较治疗前下降 (P<0.05) 携带不同 CAMK4 基因型的高血压患者经氨氯地平治疗 8 周后,CC 型与 CT 型在降低收缩压幅度方面显著优于 TT 型 (P<0.05) CAMK4 各基因型组在治疗后舒张压下降差异无统计学意义 (P>0.05), 但 CC 型和 CT 型有优于 TT 型的趋势 ( 表 3) 将服用钙通道阻滞类降压药的患者, 按其疗效分组, 可见高效组中效组低效组无效组间基因型频率分布差异有统计学意义 (P<0.01), 其中 CC 型高血压患者的总有效率明显高于 CT 及 TT 型者 (P<0.01); 但 CT 型与 TT 型高血压患者的总有效率差异无统计学意义 (P>0.05, 表 4) 表 1 高血压患者 CAMK4 基因 rs C/T 分型间的一般临床资料比较 (x±s) Table 1 Comparison of general information in all essential hypertension patients with CAMK4 gene (x±s) 基因型男性 / 例女性 / 例年龄 / 岁收缩压 /mmhg 舒张压 /mmhg 体质量指数 / (kg/m 2 ) 空腹血糖 /(mmol/l) CC ± ± ± ± ±1.28 CT ± ± ± ± ±1.46 TT ± ± ± ± ±1.34 基因型三酰甘油 / 胆固醇 / 高密度脂蛋白 / 低密度脂蛋白 / 脂蛋白 a/ 游离脂肪酸 / 总胆红素 / (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mg/l) (mmol/l) (μmol/l) CC 2.36± ± ± ± ± ± ±3.24 CT 2.42± ± ± ± ± ± ±3.36 TT 2.45± ± ± ± ± ± ±3.72 基因型直接胆红素 / 总胆汁酸 / 谷草转氨酶 / 谷丙转氨酶 / 尿素 / 尿酸 / 肌酐 / (μmol/l) (μmol/l) (mmol/l) (μmol/l) (μmol/l) CC 5.79± ± ± ± ± ± ±45.84 CT 5.73± ± ± ± ± ± ±47.42 TT 5.71± ± ± ± ± ± ±45.46 CC,CT,TT 3 种基因型间两两相互比较,P>0.05 表 2 高血压患者治疗前后的临床指标比较 (n=108,x±s) Table 2 Comparison of the clinic indexes after calcium channel blocker therapy in all essential hypertension patients (n=108, x±s) 组别收缩压 /mmhg 舒张压 /mmhg 体质量指数 / 空腹血糖 / 三酰甘油 / 胆固醇 / (kg/m 2 ) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) 治疗前 ± ± ± ± ± ±1.24 治疗后 ±12.06* 83.17±9.84* 22.94± ± ± ±1.05 组别高密度脂蛋白 / 低密度脂蛋白 / 游离脂肪酸 / 总胆红素 / 直接胆红素 / 脂蛋白 a/(mg/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (μmol/l) (μmol/l) 治疗前 0.56± ± ± ± ± ±1.95 治疗后 0.68± ± ± ± ± ±2.08 组别总胆汁酸 / 谷草转氨酶 / 谷丙转氨酶 / (μmol/l) 尿素 /(mmol/l) 尿酸 /(μmol/l) 肌酐 /(μmol/l) 治疗前 9.17± ± ± ± ± ±46.81 治疗后 10.65± ± ± ± ± ±48.19 与治疗前比较,*P<0.05

5 汉族高血压人群 CAMK4 基因多态性与氨氯地平降压疗效的相关性钟广伟, 等 781 表 3 药物干预后不同基因型的高血压患者血压比较 (x±s) Table 3 Comparison of the blood pressure after calcium channel blocker therapy in different genotypes of essential hypertension patients (x±s) 基因型 n 收缩压 /mmhg 舒张压 /mmhg 治疗前治疗后降幅治疗前治疗后降幅 CC ± ±12.89* 18.02± ± ±9.76* 14.28±6.37 CT ± ±13.06* 15.78± ± ±8.92* 13.45±6.13 TT ± ±13.72* 8.23± ± ±9.06* 12.45±6.02 与治疗前比较,*P<0.05; 与 TT 型比较, P<0.05 表 4 药物干预后不同基因型的原发性高血压患者有效率比较 Table 4 Comparison of the efficacy after calcium channel blocker therapy in different genotypes of essential hypertension patients 基因型高效组 / 例中效组 / 例低效组 / 例无效组 / 例总有效率 /% CC ** CT TT 合计与 TT 型比较,**P<0.01; 与 CT 型比较, P< 讨论本研究初步探讨了轻中度汉族原发性高血压患者人群中,CAMK4 基因多态性对氨氯地平片的降压疗效影响, 发现 CAMK4 基因 rs 的 T 型对氨氯地平片的降压效果的贡献不及 C 型突出, 提示 CAMK4 基因 rs C-T 的多态性可能会对使用钙通道阻滞药治疗轻中度汉族高血压患者的效果产生影响氨氯地平是临床常用降压药, 属于钙离子拮抗药, 其抑制钙诱导的主动脉收缩作用是硝苯地平的 2 倍, 可用于治疗各种类型高血压, 且对肾有一定的保护作用 [7] 氨氯地平对治疗高血压具有较好的临床疗效, 但是仍然有部分患者减压效果不佳越来越 [8] 多的研究显示基因多态性是影响药物疗效的一个重要因素 CAMK4 基因编码钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 4, 其基因 CAMK4 位于染色体 5q21.3 该基因产物属于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族, 并属于钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族 [9] CAMKs 在心血管病理生理方面发挥作用 : CAMK2 参与心脏反应调节功能 [10] ;CAMK4 通过激活内皮型一氧化氮磷酸化来调节血压 [11] ; 在高血压患者中,CAMK4 基因引起该蛋白质的表达降低可导致患者具有更高的血压水平 [12-13], 显示这个基因在血管功能和血压的调节方面有重要作用 CAMK4 基因 rs 位点与维吾尔族人群高血压存在关联 [14], 提示 CAMK4 基因多态性参与高血压的发病机制本研究结果显示 :CAMK4 基因 rs 多态性与氨氯地平的降压效果具有相关性,CC 或 CT 基因型携带者服用氨氯地平 8 周后, 收缩压下降程度均显著高于 TT 基因型携带者 ; 同时, 在降压的临床疗效方面,CC 基因型携带者总有效率明显高于 CT 基因型携带者及 TT 基因型携带者, 提示 C 型基因携带者影响了轻中度汉族高血压患者对氨氯地平的反应 CAMK4 基因 rs c-t 是同义突变, 最可能的机制是选择性剪接作用导致了 CAMK4 在心肌血管内皮细胞和血管平滑肌的表达水平出现差异性, 形成了细胞内外钙离子转运障碍离子电生理学性质及功能差异, 致使钙离子通道与钙拮抗剂的亲和力发生变化, 从而影响钙离子内流的量与速度, 最终表现出不同基因型间血压下降值的差异以上研究结果为临床上通过基因型指导高血压患者选用合适的降压药提供了一定的药物遗传学理论依据, 可避免患者使用无效或低效的药物, 使得抗高血压治疗更加经济有效本研究存在以下不足 : 样本例数相对较少, 而且缺乏正常对照组 ; 没有检测钙通道阻滞药的血药浓度 ; 每种钙通道阻滞药在体内代谢不是只有一种途径, 影响其发挥临床作用的也并不仅仅

6 782 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(8) 是 CAMK4, 以后笔者会在此基础上进行更深入的研究参考文献 [1] Dingemanse J, Otasevic P, Shakeri-Nejad K, et al. Efficacy and safety of the dual L- and T-type calcium channel blocker, ACT : a proof-of-concept study in patients with mild-to-moderate essential hypertension[ J]. J Hum Hypertens, 2015, 29(4): [2] 王文, 马丽媛, 刘明波, 等. 初始低剂量氨氯地平加替米沙坦或复方阿米洛利联合治疗对高血压患者血压控制率影响的阶段报告 [ J]. 中华心血管病杂志, 2009; 37(8): WANG Wen, MA Liyuan, LIU Mingbo, et al. Effects of amlodipine plus telmisartan or amlodipine plus amiroride regimen on blood pressure control in hypertensive patients: preliminary report of Chinese hypertension intervention efficacy (CHIEF) trial[ J]. Chinese Journal of Cardiology, 2009, 37(8): [3] Julius S, Kjeldsen SE, Weber M, et al. Outcomes in hypertensive patients at high cardiovascular risk treated with regimens based on valsartan or amlodipine: the VALUE randomised trial[ J]. Lancet, 2004, 363(9426): [4] Marques FZ, Booth SA, Charchar FJ. The emerging role of non-coding RNA in essential hypertension and blood pressure regulation[ J]. J Hum Hypertens, 2015, 29(8): [5] Wayman GA, Tokumitsu H, Davare MA, et al. Analysis of CaMkinase signaling in cells[ J]. Cell Calcium, 2011, 50(1): 1-8. [6] 中国高血压防治指南修订委员会年中国高血压防治指南 ( 实用本 )[ J]. 高血压杂志, 2004, 12(6): The Revise Committee of Guidelines for prevention and treatment of hypertension in China. Guidelines for the prevention and treatment of hypertension in China (2004)[ J]. Journal of Hypertension, 2004, 12(6): [7] Kearney PM, Whelton M, Reynolds K, et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data[ J]. Lancet, 2005, 365(9455): [8] Levy D, Ehret GB, Rice K, et al. Genome-wide association study of blood pressure and hypertension[ J]. Nat Genet, 2009, 41(6): [9] Kameshita I, Fujisawa H. Phosphorylation and functional modification of calmodulin-dependent protein kinase IV by campdependent protein kinase[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 180(1): [10] Zhang T, Brown JH. Role of Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II in cardiac hypertrophy and heart failure[ J]. Cardiovasc Res, 2004, 63(3): [11] Santulli G, Cipolletta E, Sorriento D, et al. Camk4 gene deletion induces hypertension[ J]. J Am Heart Assoc, 2012, 1(4): e [12] Nikpay M, Šeda O, Tremblay J, et al. Genetic mapping of habitual substance use, obesity-related traits, responses to mental and physical stress, and heart rate and blood pressure measurements reveals shared genes that are overrepresented in the neural synapse[ J]. Hypertens Res, 2012, 35(6): [13] Malovini A, Illario M, Iaccarino G, et al. Association study on longliving individuals from Southern Italy identifies rs in the CAMKIV gene that regulates survival proteins[ J]. Rejuvenation Res, 2011, 14(3): [14] Chen SZ, Wang Z, Zhang LN, et al. CAMK4 gene variation is associated with hypertension in a Uygur population[ J]. Genet Mol Res, 2016, 15(1): 1-7. ( 本文编辑陈丽文 ) 本文引用 : 钟广伟, 陈雨丝, 刘丽华, 刘英哲, 杨柳, 罗燕丽, 姚佳梅. 汉族高血压人群 CAMK4 基因多态性与氨氯地平降压疗效的相关性 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2016, 41(8): DOI: /j.issn Cite this article as: ZHONG Guangwei, CHEN Yusi, LIU Lihua, LIU Yingzhe, YANG Liu, LUO Yanli, YAO Jiamei. Association between gene polymorphism of calcium/calmodulin-dependent kinase 4 and efficacy of amlodipine in the treatment of hypertension in Chinese Han nationality[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2016, 41(8): DOI: /j.issn

对象方法

对象方法艾永飞赵连友章燕薛玉生赵小燕侯小玲景晓娟高血压血管加压素一氧化氮氨氯地平替米沙坦对象方法统计学处理一般资料及血压各组药物降压效果比较表治疗前后各组血压心率的比较用药时间和剂量对血压达标率的影响表用药时间和剂量对各组血压达标率的影响治疗前后各组血浆含量的变化图治疗前后各组血浆含量的变化治疗前后各组血浆含量的变化图治疗前后各组血浆含量的变化