822 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷胞周期停留在 G 1 期, 并进而抑制鼻咽癌细胞的增殖 [5] 还有研究发现,ZMYND10 可以通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (proteinkinaseb, PKB) 和哺乳动物雷帕霉

Size: px

Start display at page:

Download "822 新乡医学院学报 htp://www.xxyxyxb.com 2015 年第 32 卷胞周期停留在 G 1 期, 并进而抑制鼻咽癌细胞的增殖 [5] 还有研究发现,ZMYND10 可以通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (proteinkinaseb, PKB) 和哺乳动物雷帕霉"

智金
7 years ago
Views:

1 第 32 卷第 9 期 2015 年 9 月新乡医学院学报 JournalofXinxiangMedicalUniversity Vol.32 No.9 September 欁欁本文引用 : 王磊, 张亚平, 杨海杰, 等. 含 MYND 结构域的锌指蛋白 10 的原核表达及其多克隆抗体的制备 [J]. 新乡医学院学报,2015,32(9): 欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁基础研究含 MYND 结构域的锌指蛋白 10 的原核表达及其多克隆抗体的制备王磊, 张亚平, 杨海杰, 谢云飞, 丁琼琼, 张彬彬, 冯志伟 ( 新乡医学院生命科学技术学院, 河南新乡 ) 摘要 : 目的表达纯化含 MYND 结构域的锌指蛋白 10(ZMYND10) 的重组蛋白并制备其大鼠多克隆抗体方法全基因合成 ZMYND10 基因的开放阅读框, 构建原核表达载体 pet 28m ZMYND10 在大肠杆菌中诱导表达 His ZMYND10, 利用 His 标签镍柱纯化 His ZMYND10 重组蛋白, 并用泛素样蛋白酶 1 除去重组蛋白的 His 标签用纯化蛋白免疫大鼠, 蛋白 A/G 混合琼脂糖纯化血清得到抗体通过 Westernblot 和免疫沉淀方法鉴定抗体的特异性结果成功构建原核表达载体 pet 28m ZMYND10, 并获得可溶性表达利用 His 柱得到高纯度的重组 ZMYND10 抗原, 免疫大鼠后纯化得到的 ZMYND10 多克隆抗体可以检测到 B16F10 细胞中过表达及内源性表达的 ZMYND10 蛋白, 并可用于免疫沉淀实验结论本实验成功制备了 ZMYND10 的多克隆抗体, 为后续探索 ZMYND10 在肿瘤细胞中的功能奠定了基础关键词 : 锌指蛋白 10; 多克隆抗体 ; 纯化中图分类号 :Q51 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) ProkaryoticexpresionofZincfingerMYNDdomain containingprotein10andpreparatingitspolyclonal antibody WANGLei,ZHANGYa ping,yanghai jie,xieyun fei,dingqiong qiong,zhangbin bin,fengzhi wei (ColegeofLifeSciencesandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,HenanProvince,China) Abstract: Objective ToexpresandpurifyrecombinantproteinofZincfingerMYNDdomain containingprotein10 (ZMYND10),andtomakepreparationofpolyclonalantibodyagainstmouseZMYND10.Methods Theopenreadingframeof mousezmynd10genewassynthesizedandsubclonedintotheprokaryoticexpresionvectorpet 28m andtransformedinto E.coliBL21(DE3).His ZMYND10recombinationproteinwaspurifiedbyHis60Nigravitycolumns,andtheHistabwasre movedbyubiquitinprotease1.thefusionproteinhis ZMYND10wasusedasantigentoimmunizerats.Theratantiserumwas purifiedbyproteina/gmixagaroseanditsspecificitywasexaminedbywesternblotandimmunoprecipitation.results Pro karyoticexpresionvectorpet 28m ZMYND10wasbuiltsuccesfulandwasmadesolubilityexpresion.Thehighpurifiedre structuringzmynd10antigenwasobtainedbyhis60nigravitycolumnsandwasusedtoimmunizeratstoproducepolyclonal antibodyagainstzmynd10whichwasusedtodetectedtheover expresionandendogenousexpresionofzmynd10proteinin B16F10celusedinimmunoprecipitation.Conclusion PolyclonalantibodyagainstZMYND10wassuccesfulyprepared, providingafirmfoundationforfutureinvestigationonthefunctionofzmynd10intumorcels. Keywords: ZincfingerMYNDdomain containingprotein10;polyclonalantibody;purification 含 MYND 结构域的锌指蛋白 10(Zincfinger MYNDdomain containingprotein10,zmynd10) 位于染色体 3p21.3 区段, 编码 1 个含有 440 个氨基酸的蛋白质 [1] ZMYND10 在许多原发癌如肺癌乳 DOI: /xxyxyxb 收稿日期 : 基金项目 : 河南省高等学校重点科研项目 ( 编号 :15A180010) 作者简介 : 王磊 (1979-), 男, 山东德州人, 博士, 讲师, 研究方向 : 肿瘤细胞生物学干细胞生物学通信作者 : 冯志伟 (1958-), 男, 河南洛阳人, 博士, 教授, 研究方向 : 干细胞和肿瘤生物学 ;E mail: @163.com 腺癌肾癌神经母细胞瘤和食管鳞状细胞癌中由于启动子过甲基化均有明显下调 [2 3] ZMYND10 的表达在鼻咽癌中与基质金属蛋白酶 (metalmetalopro teinase,mmp) 家族中 MMP 19 的表达变化密切相关, 体内和体外研究发现,ZMYND10 过表达可以降低鼻咽癌细胞的迁移侵袭和血管形成能力 [4] ZMYND10 还可以通过抑制 c Jun 氨基末端激酶 (c JunN terminalkinase,jnk) 的磷酸化进而降低细胞周期蛋白 D1 的表达, 从而导致细胞周期阻滞, 使细

2 822 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷胞周期停留在 G 1 期, 并进而抑制鼻咽癌细胞的增殖 [5] 还有研究发现,ZMYND10 可以通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (proteinkinaseb, PKB) 和哺乳动物雷帕霉素靶点依赖性细胞周期, 或者抑制 B 细胞淋巴瘤 / 白血病 2 家族介导的细胞增殖途径, 以促进紫杉酚诱导的细胞凋亡 [6] 目前市场上虽有针对 ZMYND10 的商业化抗体, 但其特异性较差为了进一步研究并阐明 ZMYND10 抑制黑色素瘤转移的分子机制, 作者在大肠杆菌中表达和纯化了 ZMYND10 重组蛋白, 并用其免疫大鼠, 成功制备了 ZMYND10 的多克隆抗体, 为后续研究 ZMY ND10 抑制黑色素瘤转移的分子机制奠定基础 1 材料与方法 1.1 细胞菌株实验动物 B16F10 细胞大肠杆菌 Top10 和 BL21(DE3) 为本实验室保存雌性 Wistar 大鼠 3 只, 体质量约 300g, 由新乡医学院实验动物中心提供 1.2 主要试剂与仪器 ZMYND10 基因由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自美国 ThermoScientific 公司 ; 质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ;DNA 分子量标准购自康为生物科技有限公司 ; 蛋白分子量标准购自美国 Fermen tas 公司 ;His 标签镍柱购自美国 Clontech 公司 ; 蛋白浓度测定试剂购自美国 Bio Rad 公司 ; 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国 Sigma 公司 ; 蛋白 A /G 混合琼脂糖购自德国 Calbiochem 公司 ; 鼠抗人 c myc 单克隆抗体购自美国 CelSignalingTechnology 公司 ; 辣根过氧化物氧化酶 (horseradishperoxidase, HRP) 标记山羊抗小鼠和山羊抗大鼠免疫球蛋白 G (immunoglobuling,igg) 购自美国 SantaCruzBiotech nology 公司 ; 蛋白免疫印迹化学发光显影液购自美国 Milipore 公司 ; 凝胶成像系统 Amersham TM Imager600 购自美国 GEHealthcare 公司 ; 达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco smodifiedeagle smedium,dmem) 胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司 ; 蛋白 A/G 混合磁珠购自美国 Milipore 公司 ; 转染试剂脂质体 2000 购自美国 Introvigen 公司 ; 质粒 pxj40 myc 和 pet 28m 为本实验室保存 ;puc57 ZMYND10 由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司提供 1.3 方法原核和真核表达载体的构建在已合成的 puc57 ZMYND10 质粒的基础上, 构建小鼠 ZMY ND10 基因的原核表达载体 pet 28m ZMYND10 和真核表达载体 pxj40 myc ZMYND10 BamHI 和 XhoI 双酶切含有合成小鼠 ZMYND10 的 puc57 ZMYND10 质粒, 纯化回收插入的 ZMYND10 片段, 连接至经同样酶切的 pet 28m 原核表达载体和 pxj40 myc 真核表达载体, 转化至工程菌大肠杆菌 Top10 中, 挑起单菌落做聚合酶链式反应 (polymer asechainreaction,pcr), 所用 ZMYND10 正义链引物 :5 GAGAAGCTTATGGGTGACCTGGAACTG 3, 反义链引物 :5 AATCTCGAGTCACTTGGCTCTGTCACC 3 挑选阳性克隆提取质粒酶切, 对插入片段大小进行琼脂糖电泳鉴定后,DNA 测序确认插入片段的序列重组蛋白 His ZMYND10 在大肠杆菌中的表达和纯化提取 pet 28m ZMYND10 重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3), 然后分别挑取单克隆接种于 3mL 细菌培养基 ( 胰蛋白胨 16g L -1, 酵母粉 10g L -1, 氯化钠 5g L -1 ) 中,37 培养取过夜培养菌液, 按 1 50 的比例接种到 3mL 培养基中,37 培养使大肠杆菌生长至对数期加入异丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl b D thiogalactopyranoside, IPTG) 至终浓度 0.5mmol L -1, 分别在下培养 5h 取全菌做蛋白电泳, 根据蛋白表达情况确定最佳诱导温度, 在最佳温度下 100mL 培养基诱导培养大肠杆菌 BL21, 离心收集菌体, 加入磷酸盐缓冲液 (phosphatebuferedsaline,pbs)( 含 100mg L -1 溶菌酶 ), 超声破碎, r min -1 离心 10min, 收集上清利用 His 标签镍柱纯化 His ZMYND10 重组蛋白, 洗脱液加泛素样蛋白酶 1(ubiquitinlikespecific protease1,ulp1) 后用 PBS 透析,ULP1 切除蛋白 His 标签, 透析袋去除咪唑小分子, 透析后溶液重新挂柱收集流出液, 蛋白凝胶电泳分析蛋白纯度, 蛋白浓度测定试剂测蛋白浓度大鼠抗体制备取纯化的 ZMYND10 蛋白与弗氏完全佐剂 ( 后 3 次用不完全佐剂 ) 在振荡器上混合至抗原完全乳化 (20~30min); 在大鼠大腿内侧肌肉注射 ZMYND10 蛋白与佐剂混合物 ( 每只 100μg) 免疫大鼠, 每次 10d, 共免疫 4 次 ; 第 5 次用

3 第 9 期王磊, 等 : 含 MYND 结构域的锌指蛋白 10 的原核表达及其多克隆抗体的制备 823 不加佐剂的 ZMYND10 蛋白上清注射大鼠, 做冲击免疫 ; 第 5 次免疫 3d 后取大鼠全血,1200r min -1 离心 20min( 室温 ), 收集上清液 ( 大鼠血清 ) 用蛋白 A/G 混合琼脂糖在血清中纯化多克隆抗体 : 用 1mL 蛋白 A/G 混合琼脂糖装柱后, 加 5mL0.1mol L -1 Tris HCl(pH8.0) 平衡, 在血清中加入 1/10 血清体积的 1mol L -1 Tris HCl(pH8.0), 处理后血清全部加入预装柱中, 待血清全部流过柱子后先用 10 倍柱床体积的 0.1mol L -1 Tris HCl(pH8.0) 洗柱, 再用 10 倍柱床体积的 0.01mol L -1 Tris HCl(pH8.0) 洗柱, 最后用 5 倍柱床体积的 0 2mol L -1 甘氨酸 (ph2.5) 洗脱, 洗脱结束后立即在每 1mL 甘氨酸洗脱液中加入 100μL 的 1mol L -1 Tris HCl(pH 8 0), 所得洗脱液加叠氮钠后 -80 保存细胞转染及裂解液制备用含 2mmol L -1 L 谷氨酰胺和体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基培养 B16F10 细胞, 取对数生长期细胞接种于 35mm 培养皿中, 待细胞长至 80% 左右转染 pxj40 myc 和 pxj40 myc ZMYND10, 转染 48h 后使用含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析裂解液 [150mmol L -1 氯化钠,1mmol L -1 乙二胺四混合磁珠 4 孵育过夜使用含 Tween 20 的 PBS 漂洗 3 次, 然后加入 1 LoadingBufer 煮沸, 用 anti myc tag 抗体做 Westernblot 检测同时另取 0.5mL 细胞裂解液加入 2μganti myc tag 抗体做免疫沉淀, 用 anti ZMYND10 多克隆抗体做 Westernblot 检测 2 结果 2.1 重组质粒 pxj40 myc ZMYND10 和 pet 28m ZMYND10 的构建用 BamH 和 XhoⅠ 双酶切 puc57 ZMYND10 重组质粒得到 1324bp 的小鼠 ZMYND10 基因, 将 ZMYND10 基因亚克隆到 pet 28m 和 pxj40 myc 载体上, 菌落 PCR 筛选得到阳性克隆 ( 图 1), 双酶切鉴定可以观察到特异性的 ZMY ND10 酶切产物 ( 图 2) DNA 测序进一步表明得到的重组质粒 pxj40 myc ZMYND10 和 pet 28m ZMYND10 中 ZMYND10 序列及开放阅读框正确乙酸,50mmol L -1 Tris HCl(pH8.0),10g L -1 基苯基聚乙二醇,1mmol L -1 苯甲基磺酰氟, 0.5mg L -1 亮抑酶肽,0.5mg L -1 胃酶抑素, 1mg L -1 抑肽酶 ] 裂解细胞, r min -1 离心 10min, 收集上清, 用 anti myc tag 和 anti ZMY ND10 做 Westernblot 检测 Westernblot 检测抗体特异性电泳分离蛋白样品, 然后将蛋白样品电转至聚偏氟乙烯膜上, 浸泡于 50g L -1 脱脂牛奶中室温封闭 2h 加入一抗 anti myc 或 anti ZMYND10, 室温孵育 2h 三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液 (Tris HClbuferedsaline withtween20,tbst) 洗涤 3 次, 每次 10min 加入 HRP 标记的二抗, 室温孵育 1h,TBST 漂洗 3 次加入蛋白免疫印迹化学发光显影液显影 1min 后用 Amersham TM Imager600 曝光, 显示蛋白条带免疫沉淀确定抗体应用范围 B16F10 细胞长至 80% 左右转染 pxj40 myc 和 pxj40 myc ZMY ND10 质粒,48h 后加入裂解液裂解细胞, 测定蛋白浓度取 0.5mL 细胞裂解液, 加入 2μganti ZMY ND10 多克隆抗体,4 孵育 2h, 然后加入蛋白 A/G M:DNA 分子量标准 ;1: 阴性对照 ;2: 阳性对照 ;3~5:pXJ40 myc ZMYND10 的 PCR 鉴定 ;6~8:pET 28m ZMYND10 的 PCR 鉴定图 1 ZMYND10 重组表达质粒的 PCR 鉴定 Fig.1 IdentificationofrecombinantZMYND10plasmids withpcr M:DNA 分子量标准 ;1~2:pXJ40 myc ZMYND10 的酶切鉴定 ;3~4: pet 28m ZMYND10 的酶切鉴定图 2 ZMYND10 重组表达质粒的双酶切鉴定 Fig.2 IdentificationofrecombinantZMYND10plasmids withdoublerestrictionenzymedigestion

4 824 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷 2.2 重组蛋白 His ZMYND10 的纯化结果根据预实验结果, 选择在含有 0.5mmol L -1 IPTG 的细菌培养基中 20 诱导培养大肠杆菌 BL21,His 标签镍柱进一步亲和层析所收集上清中的带有 His 标签的重组蛋白, 蛋白电泳检测证实得到了较纯的相对分子质量目的蛋白 ( 图 3) 为了提高抗原的特异性, 在洗脱液中加入 ULP1 以去除融合蛋白中的 His 标签蛋白, 并使用 PBS 透析去除咪唑小分子, 透析后溶液重新挂柱收集流出液, 蛋白电泳分析蛋白纯度, 其分子量与 ZMYND10 蛋白的理论值 ( 相对分子质量 50000) 一致且纯度较高, 可以用于免疫动物制备抗体 M: 蛋白相对分子质量标准 ;1: 未诱导 ;2:0.5mmol L -1 IPTG,20 诱导全菌 ;3:0.5mmol L -1 IPTG20 诱导裂解上清 ;4:0.5mmol L -1 IPTG 20 诱导沉淀 ;5: 洗脱液 ;6:ULP1 消化流出液图 3 ZMYND10 重组蛋白的纯化 Fig.3 PurificationofrecombinantZMYND10protein 2.3 ZMYND10 多克隆抗体的特异性分析将重组蛋白和切去标签的蛋白做 Westernblot 检测结果显示, 在相对分子质量和处出现特异性的蛋白质条带 ( 图 4A), 说明其对体外重组蛋白有特异性用 myc tag 抗体检测重组 ZMYND10 在 B16F10 细胞中的过表达, 发现在相对分子质量约处出现特异性的蛋白质条带 ( 图 4B), 说明重组 ZMYND10 在 B16F10 细胞中有过表达用制备的 ZMYND10 多克隆抗体检测, 发现 ZMYND10 过表达的条带相对分子质量较大, 而对照的条带较小 ( 图 4C) 以上结果说明所制备的抗体可以与体外重组体内重组以及小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞中内源性表达的 ZMYND10 蛋白特异性结合, 表明本次实验制备的多克隆抗体确实有效 2.4 ZMYND10 多克隆抗体在免疫沉淀中的应用效果 ZMYND10 多克隆抗体对过表达的 ZMYND10 蛋白有很好的免疫沉降作用, 而对大鼠的 IgG 则没有作用 ( 图 5A) ZMYND10 抗体对 myc tag 免疫沉淀下拉的重组 ZMYND10 蛋白有很好的反应性 ( 图 5B) 说明纯化的 ZMYND10 抗体适于做免疫沉淀实验 A: 纯化的 His ZMYND10 和 ULP1 消化后的 ZMYND10 蛋白检测 ;B:myc Tag 抗体检测过表达的 ZMYND10 蛋白 ;C:ZMYND10 抗体检测内源性和过表达的 ZMYND10 蛋白图 4 ZMYND10 多克隆抗体特异性识别内源性和重组 ZMYND10 Fig.4 DetectionofendogenousandrecombinantZMYND10byZMYND10polyclonalantibody A:myc-Tag 抗体检测 ZMYND10 和 IgG 分别沉淀的蛋白 ;B:ZMYND10 抗体检测 myc-tag 抗体沉淀的蛋白图 5 Westernblot 检测 ZMYND10 多克隆抗体免疫沉淀的 ZMYND10 Fig.5 WesternblotanalysisofimmunoprecipitatedZMYND10byZMYND10polyclonalantibody 3 讨论 ZMYND10 是重要的抑癌基因, 目前市场上提供的商业化 ZMYND10 抗体很少, 且多为人源, 特异性较差为了阐明 ZMYND10 与黑色素瘤的发病机制之间的关系, 需要分析 ZMYND10 在黑色素瘤细胞中的表达情况和细胞定位, 并寻找可能与 ZMYND10 存在相互作用的蛋白, 因此需要制备 ZMYND10 抗体本研究中表达纯化了 ZMYND10 重组抗原并制备了其相应的多克隆抗体, 首先利用人工合成法得

5 第 9 期王磊, 等 : 含 MYND 结构域的锌指蛋白 10 的原核表达及其多克隆抗体的制备 825 到全长的 ZMYND10 基因, 并同时构建了该基因的原核和真核表达质粒原核表达显示全长的 ZMY ND10 抗原获得了可溶性表达用全长的 ZMYND10 作为免疫原制备的抗体理论上优于多肽片段作为免疫原制备的抗体, 这是因为前者含有更丰富的抗原表位, 同时前者可以诱导实验动物产生含有针对构象性表位的抗体, 而多肽则不具有该功能由于商业化的 ZMYND10 抗体的免疫原大多来自 ZMY ND10 多肽, 因此用全长的 ZMYND10 抗原制备的抗体具有无可比拟的优势本研究采用 His 标签镍柱亲和层析纯化目的蛋白菌体裂解后用蛋白电泳检测, 表明该重组蛋白以可溶性蛋白的形式表达离心收集的菌体沉淀经检测也含有重组蛋白, 可能是因为沉淀中含有未破碎的菌体, 或有以包涵体形式表达的重组蛋白, 这并不会影响下一步实验的进行但如果直接使用所纯化的重组蛋白作为抗原免疫大鼠, 其中含有的 His 标签蛋白可能会影响抗体的特异性所以作者在构建原核表达载体时使用其实验室前期构建的 pet 28m 原核表达质粒, 它在 His 标签蛋白和目的蛋白之间加入了一段小泛素相关修饰物, 可以被 UPL1 特异性切除, 从而去除重组蛋白上的 His 标签蛋白用切除 His 标签的 ZMYND10 蛋白制备的大鼠 ZMYND10 抗血清可以识别小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞中过表达的 ZMYND10 重组蛋白, 还可以特异性的识别小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞中的天然蛋白, 但是检测不到过表达的泳道中内源性 ZMYND10 的表达, 可能是因为转染质粒的 B16F10 细胞表达 ZMYND10 的量较大, 推测其可能对细胞中的天然蛋白产生一定的影响免疫沉淀实验进一步证明所制备的 ZMYND10 多克隆抗体还可特异沉淀小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞中过表达的 ZMYND10 重组蛋白, 这些结果说明该抗体是特异的 ZMYND10 多克隆抗体的成功制备, 为后续研究 ZMYND10 真核表达检测免疫定位和研究 ZMY ND10 相互作用蛋白如 TRAF2 smek1 LRRC6 等提供了可能 [7 8], 为进一步探讨 ZMYND10 抑制黑色素瘤转移的分子机制打下了基础参考文献 : [1] HesonLB,CooperW N,LatifF,etal.Evaluationofthe3p21.3 tumour suppresorgenecluster[j].oncogene,2007,26(52): [2] AbeM,OhiraM,KanedaAY,etal.CpGislandmethylatorpheno typeisastrongdeterminantofpoorprognosisinneuroblastomas [J].CancerRes,2005,65(3): [3] QiuGH,TanLK,LohKS,etal.Thecandidatetumorsuppresor geneblu,locatedatthecommonlydeletedregion3p21.3,isan E2F regulated,stres responsivegeneandinactivatedbybothepi geneticandgeneticmechanismsinnasopharyngealcarcinoma[j]. Oncogene,2004,23(27): [4] ChengY,HoRL,ChanKC,etal.Anti angiogenicpathwayaso ciationsofthe3p21.3mappedblugeneinnasopharyngealcarci noma[j].oncogene,2015,34:10. [5] ZhangX,LiuH,LiB,etal.TumorsuppresorBLUinhibitsprolif erationofnasopharyngealcarcinomacelsbyregulationofcelcy cle,c JunN terminalkinaseandthecyclind1promoter[j].bmc Cancer,2012,12: [6] ParkST,ByunHJ,KimBR,etal.TumorsuppresorBLUpro motespaclitaxelantitumoractivitybyinducingapoptosisthrough thedown regulationofbcl 2expresionintumorigenesis[J].Bio chembiophysrescommun,2013,435(1): [7] DongSM,ByunHJ,Kim BR,etal.TumorsuppresorBLUen hancespro apoptoticactivityofsmek1throughphysicalinteraction [J].CelSignal,2012,24(6): [8] ZariwalaMA,GeeHY,KurkowiakM,etal.ZMYND10ismutated inprimaryciliarydyskinesiaandinteractswithlrrc6[j].amj HumGenet,2013,93(2): ( 本文编辑 : 李胜利英文编辑 : 王燕 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

822 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷 胞周期停留在 G 1 期, 并进而抑制鼻咽癌细胞的增殖 [5] 还有研究发现,ZMYND10 可以通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (proteinkinaseb, PKB) 和哺乳动物雷帕霉

822 新乡医学院学报 htp:// 年第 32 卷胞周期停留在 G 1 期, 并进而抑制鼻咽癌细胞的增殖 [5] 还有研究发现,ZMYND10 可以通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (proteinkinaseb, PKB) 和哺乳动物雷帕霉