Untitiled

Transcription

1 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 述评 DNA 甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值 潘世扬 [ 摘要 ] DNA 甲基化是指基因组 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 5 号碳原子上共价结合一个甲基基团, 其主要参与基因的表达调控 DNA 甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关 抑癌基因启动子区甲基化是肿瘤发生发展的重要事件 DNA 甲基化, 不仅可作为肿瘤分子诊断的标志物, 同时也可作为分子治疗的靶标 [ 关键词 ] DNA 甲基化 ; 抑癌基因 ; 分子 ; 诊断 ; 治疗 DNA methylation as a biomarker and its clinical application on molecular diagnosis and treatment PAN Shiyang (Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing , China) [ABSTRACT] DNA methylation involves the addition of a methyl group to the number 5 carbon of the cytosine pyrimidine ring, participating in gene expression regulation. Aberrant DNA methylation is associated with human diseases, particularly in cancers. Methylation of tumor suppressor gene promoter is an important event during the occurrence and development of tumors. So,it could be not only a molecular diagnostic biomarker,but also a therapeutic target of cancer diseases. [KEY WORDS] DNA methylation; Tumor suppressor gene; Molecule; Diagnosis; Therapy 在最近的二十年中, 随着新的 DNA 甲基化检测技术的建立和应用,DNA 甲基化 (DNA methylation) 在人类遗传表达及基因调控异常所致疾病中的作用, 得到进一步地展示 许多基因的甲基化被证明与各种临床疾病密切相关, 有些甚至可以被确定为疾病致病的独立因素 1 DNA 甲基化与表观遗传学的概念遗传物质染色体双链 DNA 中, 胞嘧啶 5 号碳原子 [1] 上增加的 CH 3 基团被称为 DNA 甲基化 DNA 甲基化在人基因组中存在是一种十分常见的现象, 通常胞嘧啶甲基化 (C-CH 3) 发生在基因的启动子或编码序列的 CpG 中, 这种基因的甲基化可能会对基因的结构和功能产生一定的影响, 如使基因的表达发生异常, 通常会使基因的表达降低或使基因沉默, 最终导致生物 [2~3] 体产生发育障碍或引起各种疾病 一般认为基因的甲基化可以遗传, 而这种遗传学的改变并非是由 DNA 的一级结构即四种碱基的突变和缺失等所致, 而只是由甲基化和非甲基化胞嘧啶所致, 由此 DNA 的序列并未发生变化, 因此目前称这一改变为表观遗传学改变 (epigenetic change) 随着对基因调控研究的深入, 已经诞生了与传统遗传学有本质差别的表观遗传学 (epigenetics), 也有称之为表遗传学 DNA 甲基化, 尤其是特定基因启动子部位的 DNA 甲基化被认为是基因表达的开关 干细胞中的某些基因启动子所存在的甲基化或非甲基化使得这些基因开放或关闭, 最终可导致干细胞的定向分化 这一点可以从怀孕母体中检测到, 在孕妇的血浆游离 DNA 中可同时检测到从母体来源的某一特定基因的甲基化以及 [4] 从胎儿来源的启动子部位非甲基化 证明在成年的 基金项目 : 江苏省卫生厅重大项目科研基金 ( :H200707); 江苏省科技厅社会发展基金 ( :BS , :BM ); 江苏省实 验诊断学重点实验室基金 ( :XK200731); 江苏省医学检验学实验教学示范中心 ( :JX ) 作者单位 : 南京医科大学第一附属医院医学检验科, 江苏, 南京

2 146 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 女性中这一基因已经关闭, 而在胎儿生长发育的时期 这样的基因仍然在发挥着十分重要的作用 因此, 基 因的甲基化尤其是某些基因启动子部位的甲基化是 基因开关的重要元件, 研究这些基因的启动子部位在 成人和胎儿之间的差异, 不仅可以探索在个体正常发 育过程中各个不同的基因所产生的程序性或交叉互 动性的作用关系, 同时也为个体发育异常 产前诊断 以及后天由于表观遗传异常所致疾病的诊断提供重 要的依据 2 DNA 甲基化检测技术的发展 随着 DNA 甲基化在临床疾病中重要性认识的日 益加深, 促使临床实验诊断技术研究人员不断探索新 的 DNA 甲基化检测技术 最初的 DNA 甲基化检测是利用非常繁琐的质谱 [5] 技术, 后来由 Herman JG 等于 1996 年发明了甲基化 特异性基因扩增检测技术 该技术的基本原理是通 过化学物质对原始 DNA 的化学修饰, 使得未发生 DNA 甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化 DNA 中的胞嘧啶由于有 CH 3 基团的存在, 经修饰后仍然保 持甲基化胞嘧啶不变, 从而使得原始的 DNA 模板在 修饰后被区分开来, 通过设计分别针对甲基化和非甲 基化的两对基因扩增引物, 分别对修饰后的模板进行 甲基化特异性基因扩增 (methylation specific PCR, MSP), 电泳后可判断原始模板 DNA 甲基化 非甲基 化或两者均存在 ( 即既有甲基化扩增产物, 又有非甲 基化扩增产物 ) 由于该技术的应用, 使得在随后的 十年中, 每年数以百计的研究学术论文得以发表 目 前, 国内外许多医学研究机构已将这一检测技术用于 对临床肿瘤等疾病的分子诊断和治疗研究中 尽管 MSP 检测技术为 DNA 甲基化的基础及临床研 究带来了极大的方便, 同时也拓展了 DNA 甲基化的研 究空间, 但是 MSP 仍然存在很大的局限性 其中主要有 三点 : 首先要对 DNA 模板进行化学修饰, 而这一过程不 但耗时太长 ( 通常为 16 h), 而且由于化学修饰可对 DNA 产生降解, 因此对于 DNA 含量少的检测样本, 可能会由 于化学修饰所致的 DNA 降解产生假阴性 ; 其次是 DNA 扩增可能存在的产物污染 ; 再者普通 MSP 是一种定性检 测技术, 做不到对待测模板中 DNA 甲基化的定量检测 因此, 在随后的研究方法的探索中逐步有学者报道了采 用实时荧光定量甲基化特异性基因扩增, 即 (quantitative real-time methylation specific PCR,QMSP) [6~7] 由于考 虑到多基因甲基化的同步检测, 随后又有学者报道了定 [8] 量甲基化基因芯片检测技术, 从而提高了检测的效率 而 QMSP 仍然是建立在对原始的 DNA 模板的化学修饰以及随后的基因扩增基础之上, 因而仍然存在相应的缺陷 近年来, 基于甲基化特异性核酸限制性内切酶 [9] 的检测方法被广泛应用 目前已经使用的酶有多种同时可以识别多个甲基化和非甲基化的特定核酸序列, 可以做到对核酸样品进行快速的检测与分析 其基本的技术原理是以酶切替代了 DNA 的化学修饰, 然后对产物进行扩增, 以能否检测出该扩增产物来判定原始靶核酸中是否存在 DNA 甲基化的位点, 方法十分简便 在最新发展的 DNA 甲基化检测技术中, 多采用针对 DNA 甲基化的特异性结合蛋白或抗体, 以及芯片检测技术平台, 以达到快速高通量地检测 DNA 甲 [10~11] 基化 3 抑癌基因 (TSG) 启动子甲基化的临床意义 DNA 异常甲基化, 尤其是抑癌基因 (tumor suppressor gene,tsg) 启动子高甲基化, 已经被确认 [12] 为是目前各种临床肿瘤早期基因改变事件 在肿瘤细胞形成的初期就已经出现多种抑癌基因的低表达或不表达, 由于在这样的细胞内出现了两种拮抗基因即抑癌基因和癌基因的表达失衡, 从而加速了肿瘤 [13~14] 的最终形成 因此,TSG 启动子甲基化是肿瘤的生物学标志 在绝大多数的临床肿瘤患者的肿瘤细胞中, 可以检测到一个以上的 TSG 启动子甲基化, 而在健康的细胞中没有 因此, 可以通过检测特定 TSG 启动子甲基化对临床肿瘤进行分子诊断, 也可以通过监测这一肿瘤标志物, 跟踪观察临床化学治疗的疗效, 这 [15] 对肿瘤患者的预后评估具有重要的价值 TSG 启动子甲基化, 不仅是肿瘤分子诊断的生物标志, 同样也是肿瘤分子治疗的重要靶标 Sorm [16] 等的研究, 已证明通过使用去甲基化的药物可以使抑癌基因启动子去甲基化, 从而恢复该抑癌基因的表达, 如 APC 和 RASSF-1A 基因, 可以用 5-aza-dC 使肺癌细胞系恢复这两种基因的表达 Kantarjian [17] 等, 对临床肿瘤患者也进行了相应的研究, 结果证明去甲基化药物可以在人体产生作用使 TSG 恢复正常表达 然而, 值得一提的是, 目前所有去甲基化药物均无基因和组织器官的选择性 ; 因此, 将去甲基化药物用于人体时, 这种药物可能不仅对所关注的肿瘤组织细胞中的某几种 TSG 启动子起到去甲基化的作用, 同时对其他的

3 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 一些癌基因 DNA 甲基化也会产生去甲基化的作用 所以, 以抑癌基因甲基化作为靶标的去甲基化的临床治疗仍有很多未解开的谜团, 必须慎重 4 DNA 甲基化研究的未来在 DNA 甲基化作为分子诊断和分子治疗的靶标正被逐步应用于临床的过程中, 我们仍需知道 :DNA 甲基化为何能在形成的肿瘤细胞中被遗传 ; 不同类型的肿瘤是否存在特定的抑癌基因甲基化方式 ; 去甲基化的药物治疗是否会使人体某些特定细胞内的特定基因重新因去甲基化而开放, 导致新的疾患 总之,DNA 甲基化研究进展迅速, 但已知的仅仅是冰山一角, 仍有一个漫长的过程, 需要更多学者的参与 参考文献 [1] Kappler J W. The kinetics of DNA methylation in cultures of a mouse adrenal cell line[j]. J Cell Physiol, 1970, 75(1): [2] Jones P A, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics[j]. Science, 2001, 293(5532): [3] 张丽霞, 潘世扬, 陈丹, 等. 肺癌细胞株 APC 基因启动子甲基化对其转录的影响 [J]. 癌症, 2007, 26(6): [4] Chim S S, Jin S, Lee T Y, et al. Systematic search for placental DNA-methylation markers on chromosome 21: toward a maternal plasma-based epigenetic test for fetal trisomy 21[J]. Clin chem, 2008, 54(3): [5] Herman J G, Graff J R, Myohanen S, et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[j]. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93(18): [6] Eads C A, Danenberg K D, Kawakami K, et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation[j]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(8): E32. [7] 高丽, 潘世扬, 束永前, 等. 实时荧光定量检测人血浆中 RASSF1A 基因启动子甲基化 [J]. 临床检验杂志, 2008, 26 (3): [8] 潘世扬, 王贤, 张丽霞, 等. APC 基因甲基化定量检测芯片的建立 [J]. 生物医学工程与临床, 2008, 12(2): [9] Xiong Z, Laird P W. Cobra: a sensitive and quantitative DNA methylation assay[j]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(12): [10] Gitan RS, Shi H, Chen CM, et al. Methylation-specific oligonucleotide microarray: a new potential for highthroughput methylation analysis[j]. Genome Res, 2002, 12(1): [11] 王贤, 潘世扬, 陆祖宏, 等. 芯片技术用于 APC 基因启动子甲基化定量检测 [J]. 临床检验杂志, 2006, 24(3): [12] 谢而付, 潘世扬, 高丽, 等. 血浆中 APC 基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用 [J]. 临床检验杂志, 2008, 26(2): [13] 潘世扬, 张寄南, 魏源华, 等. 肺癌中结肠多发性腺瘤样息肉基因启动子 1A 序列甲基化模式的研究 [J]. 中华检验医学杂志, 2006, 29(2): [14] Pan S Y, Zhang L X, Gao L, et al. The property of methylated APC gene promotor and its influence on lung cancer cell line[j]. Biomed & Pharmacother, 2009, 63(7): [15] 潘世扬, 谢而付, 束永前, 等. 肺癌患者血浆中 APC 基因甲基化定量检测研究 [J]. 癌症, 2009, 8(4): [16] Sorm F, Piskala A, Cihak A, et al. 5-Azacytidine, a new, highly effective cancerostatic[j]. Experientia, 1964, 20(4): [17] Kantarjian H, Oki Y, Garcia-Manero G, et al. Results of a randomized study of schedules of low-dose decitabine in higher-risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia[j]. Blood, 2007, 109(1):

4 148 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 论著 实时荧光定量 PCR 方法检测乙型肝炎病毒基因型 孙余婕 沈佐君 [ 摘要 ] 目的建立一种快速准确的实时荧光 PCR 方法检测乙型肝炎病毒基因型 用此方法对安徽地区乙肝患者进行检测, 了解该地区 HBV 基因型分布情况 方法首先用实时荧光定量 PCR 方法对 150 例安徽地区乙肝患者进行 HBV DNA 定量检测和分型检测, 然后对其中载毒量大于 IU/mL 的 113 例标本和 1 例 IU/mL 载毒量 < IU/mL 进行测序分型检测, 验证所建立方法的准确性, 了解安徽地区 HBV 基因型分布情况 结果 150 例 HBV 样本中 HBV DNA 含量 <1 000 IU/mL 30 例, 分型检测结果均为阴性, 对载毒量 IU/mL 的样本检出率为 97.35%(110/113); 对 IU/mL 载毒量 <5 000 IU/mL 的样本检出率为 14.29%(1/7); 对全部 DNA 阳性样本的检出率为 92.5%(111/120) HBV 分型检测与 HBV DNA 测序检测的 114 例样本中, 只要是 HBV B 基因型 C 基因型或 B/C 混合型, 乙型肝炎病毒基因分型检测都能检出来 ( 共 111 例 ), 其中部分样本经分型检测属于 B/C 混合基因型, 测序结果都是混合基因型中占优势的基因型结果, 总体符合率为 100% 未能被本法检出的样本共 3 例,3 例样本经测序分型均为 D 型 120 例病毒载毒量 IU/mL 乙肝患者中 B 型病例占 51.67% (62/120);C 型占 29.17% (35/120);B/C 混合型占 11.67% (14/120) PCR 测序检出为 D 型 3 例, 占 2.5% (3/120) 结论应用 TaqMan 探针的实时荧光定量 PCR 方法能快速对我国 HBV 主要基因型 B 基因型 C 基因型进行检测, 结果准确可靠, 特异性高 安徽地区的 HBV 基因型以 B 型为主,C 型次之, 亦存在着 D 型的少数感染病例和 B/C 的混合感染 [ 关键词 ] 乙型肝炎病毒 ; 聚合酶链反应 ; 基因型 A real-time PCR method for determination of hepatitis B virus genotype SUN Yujie, SHEN Zuojun (Anhui Provincial Center for Clinical Laboratory, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University, Anhui, Hefei , China) [ABSTRACT] Objective A rapid method for the determination the genotype of hepatitis B virus was developed by real-time PCR. The distribution of HBV genotype in Anhui district was investigated using this method. Methods The copies and genotypes of HBV DNA of 150 patients from Anhui district were determined by the real-time florescence quantitative PCR. HBV DNA sequence was carried out for the 113 samples which HBV DNA copy was more than IU/mL, and for one sample which HBV DNA copy was from IU/mL to IU/mL. The validation of PCR method was performed by the DNA sequence. Results The copies of HBV DNA in 30 patients were less than IU/mL among 150 patients and genotype test was negative. The positive ratio of genotype was % for the copies of more than IU/mL, % for the copies from IU/mL to IU/mL and 92.5 % for the all DNA positive samples. Conclusion The real-time florescence quantitative PCR was a rapid, accuracy and specific method which could be used for the characteristic of HBV genotype. HBV genotype B was main genotype, genotype C took second place, and genotype D and B/C mix infectious was seldom in Anhui district. [KEY WORDS] Hepatitis B virus;polymerase chain reaction;genotypes 基金项目 : 安徽省自然科学基金 ( ); 安徽省人才开发资金 (2005Z040) 作者单位 : 安徽医科大学附属省立医院, 安徽省立医院, 安徽省临床检验中心, 安徽, 合肥 通讯作者 : 沈佐君, shenzuojun@yahoo.com

5 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No HBV 在复制过程中由于缺乏校对酶的作用容易 发生核苷酸配对错误, 以致基因突变频繁发生, 这种 原型病毒之间序列的差异称为自然异质性, 表现为不 同的 HBV 基因型 规定 HBV DNA 核苷酸序列异质 性 8 % 为一种基因型, 目前已鉴定的 HBV 基因型有 [1] A~H 8 种 HBV 基因型存在典型的地域分布差 异 我国 HBV 基因型主要为 B 和 C 型, 也存在少量 的 A 和 D 型以及这些基因型的混合感染 [2], 近年来研 究发现 HBV 基因型与病毒的传播方式, 抗病毒药物 的疗效, 及预后都有一定的相关性 [3] 目前对 HBV 基 因型进行检测的方法有全基因序列分析 [4],S 基因序 列分析法, 聚合酶链反应限制性片段长度多态性 [5], 型 特异性引物 PCR [6] [7], 型特异性探针核酸杂交分析等, 鉴于实时荧光定量 PCR 方法有着简捷快速 准确性 高 特异性强的特点, 我们设计了 TaqMan 探针荧光 PCR 方法针对我国主要 HBV 基因型 B 和 C 型进行检 测 应用所建立的方法对 150 例安徽地区 HBV 样本 进行分型检测, 通过 PCR 测序方式验证所建立方法的 准确性 了解安徽地区 HBV 基因型分布情况 现报 道如下 1 材料和方法 1.1 标本来源 2005 年 9 月至 2006 年 10 月来安徽医科大学附属 省立医院感染科就诊的 150 例慢性乙肝患者血清 其 中男性 104 例, 女性 46 例 ; 年龄在 14~62 岁 HBV DNA 含量为 ~ 拷贝 /ml 120 例,HBV DNA 含量 < 拷贝 /ml 30 例 1.2 试剂 荧光 PCR 检测通用试剂和 HBV DNA 提取试剂 由上海复星医学科技发展有限公司提供,HBV 分型的 荧光 PCR 检测引物和探针及测序 PCR 扩增引物由上 海百曼生物技术有限公司合成 乙肝病毒核酸荧光 PCR 检测试剂购自中山大学达安基因股份有限公 司 扩增产物委托上海超世生物科技有限公司测序 1.3 方法 HBV DNA 定量 :HBV DNA 定量依据该试剂 说明书进行 HBV 分型的荧光 PCR 检测 检测引物和探针如下 上游引物 : TGGATGTGTCTGCGGCGTT (19 bp) 下游引物 : GATGATGGGATGGGAATACA (20 bp) B 型探针 : 5 -FAM-TCATCTTCCTCTGCATCCTGCTG-TAM RA-3 (23 bp) C 型探针 : 5 -FAM-CTACTTCCAGGAACATCAACTACCA- TAMRA-3 (25 bp) 样本处理 : 取待测血清样本各 100 μl( 冻存血清使用前在室温融解, 振荡混匀 10 s), 分别加入 100 μl 核酸提取液 A, 振荡混匀 15 s, rpm 离心 10 min, 弃上清 分别加入 50 μl 核酸提取液 B 至沉淀中, 振荡混匀 10 s,100 保温 10 min, rpm 离心 2 min, 取上清供 PCR 扩增 反应体系 :Tris-HCl(pH8.3) 20 mmol/l,kcl 50 mmol/l,dntp 0.25 mmol/l,mgcl mmol/l, 上下游引物各 0.20 μmol/l,b C 型探针各 0.15 μmol/l,taq 酶 0.03 U/μL 总反应体积 30 μl 循环条件 :50 孵育 2 min,94 预变性 5 min, 按照 s s 扩增 40 个循环 测序 样本处理 : 同上 HBV 测序分型引物 ( 产物 : 约 439 bp) 上游引物 : TAGGACCCCTGCTCGTGTT (19 bp) 下游引物 : GATGATGGGATGGGAATACAGG (22 bp) 反应体系为 :Tris-HCl(pH8.3) 10 mmol/l,kcl 50 mmol/l,dntp 0.20 mmol/l,mgcl mmol/l, 上下游引物各 0.20 μmol/l,taq 酶 0.03 U/μL 总反应体积 30 μl 反应条件 :50 2 min 94 预变性 5 min; 然后 s s s, 共 35 个循环, 最后在 72 延伸 5 min,pcr 结束电泳鉴定后送测序 2 结果 2.1 实验结果的判定根据 B C 检测管的 Ct 值作为 HBV 荧光 PCR 分型的依据 如 C 管 Ct 36,B 管 Ct=40 则 HBV 的基因型为 C 型 ; 如 B 管 Ct 36,C 管 Ct=40 则 HBV 的基因型为 B 型 ; 如 C 管和 B 管均 Ct 36, 则 HBV 的基因型

6 150 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 为 B/C 混合型 ; 如 C 管和 B 管均 Ct=40, 则为 B C 外的其他型 ; 或 HBV-DNA 含量小于本方法的检测下限 测序结果经 NCBI 在线分型工具 ( gov/projects/genotyping/ formpage.cgi) 进行 HBV 基因分型 2.2 HBV 样本定量检测和荧光 PCR 分型结果以 HBV DNA 定量检测结果为依据, 对载毒量 IU/mL 的样本, 基因分型检测的检出率为 97.35% (110/113) ; 对 IU/mL 载毒量 < IU/mL 的样本, 基因分型检测的检出率为 14.29%(1/7); 对全部 DNA 定量阳性样本的检出率为 92.5%(111/120) 可以看出本法的检测下限定为载毒量 IU/mL 较为合适, 见表 HBV 荧光 PCR 分型与测序分型结果的比较 表 1 HBV 样本定量检测和荧光 PCR 分型检测结果 Table 1 The copies and genotypes of HBV DNA in 150 patients HBV DNA 定量结果 (IU/mL) 阳性 基因分型检测结果 B 型 C 型 B/C 混合型 - 合计 载毒量 载毒量 < 注 : 基因分型检测结果中 - 表示样本浓度低于检测限或为非 B 非 C 型 阴性 合计 HBV 荧光 PCR 分型检测与 HBV DNA 测序检测 的 114 例样本中, 只要是 HBV B 基因型 C 基因型或 B/C 混合型, 本方法都能检出来 ( 共 111 例 ), 其中部分 样本经分型检测属于 B/C 混合基因型, 测序结果都是 混合基因型中占优势的基因型结果, 总体符合率为 100% 本方法未能检出的 3 例样本经测序分型均为 D 型, 说明本法特异性强 HBV 荧光 PCR 检测分型结 果与测序结果比较如表 2 表 2 HBV 荧光 PCR 分型检测与测序分型结果的比较 Table 2 The comparison of HBV genotypes between the real-time PCR and the sequencing HBV DNA 测序分型 合计 B C D HBV 分型检测 2.4 安徽地区的基因型分布情况 B C B/C 120 例病毒载毒量 IU/mL 乙肝患者 B 型 病例占 51.67%(62/120);C 型占 29.17%(35/120);B/C 合计 混合型占 11.67%(14/120) 在本法未检测的病例中 PCR 测序检测出 D 型 3 例, 占 2.5%(3/120) 3 讨论乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus,hbv) 是严重危害人类健康的病毒之一, 是重要的肝脏疾病致病因子,HBV 具有病毒复制产量高和突变率高的特征, 长期的这种自发突变导致形成了 A~H 8 种 HBV 基因 [8] 型 HBV 基因型存在典型的地域分布差异, 如 A 型发现于北欧 西欧 美国 印度及中部非洲 ;B 型和 C 型明显分布于亚洲及太平洋地区, 如中国 日本 印度尼西亚 越南及中国台北 ;D 型分布在南欧 中东及印度 ;E 型唯独地分布于非洲 ;F 型分布在美洲中部和南部及玻利尼西亚地区 ;G 型最近被定位在美国 法国 德国和墨西哥 ;H 型由 F 型转化而来, 主要分布在美国中部印第安人居住地区 我国 HBV 基因型主要为 B 和 C 型, 也存在少量的 A 和 D 型以及这些基因型的 [9] 混合感染, 目前研究大体上认为我国北方以 C 型为 [9] 主, 南方以 B 型为主, 但不同地区也存在差异 D 型 [10] 仅见于西部及少数民族地区,A 型较为罕见 目前对 HBV 基因型进行检测的分子生物学方法 [4] 有全基因序列分析,S 基因序列分析法, 限制性片段

7 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 长度多态性 (RFLP) [5], 型特异性引物 PCR [6], 型特异性 [7] 探针核酸杂交分析等 这些分子生物学方法都是以 PCR 技术为基础,PCR 以高效 微量 高灵敏度等特 点, 已经成为分子生物学重要技术之一 但如何进行 PCR 产物的分析, 是各种方法学在其准确性 特异性和 实用性产生差异的原因 目前国际上公认的 PCR 产 物检测共有 5 种方法, 按其灵敏度高低顺序排列为 [11] : 毛细管电泳法 固相杂交法 液相杂交法 高压液相 法 凝胶电泳法 现有核酸序列分析多采用毛细管电 泳法, 它以其方法学的优势已成为 HBV 基因型检测 金标准, 但测序成本高, 过程复杂, 需要昂贵的仪器设 备, 从而限制了其临床应用 限制性片段长度多态性 和型特异性引物 PCR 分型方法产物分析完全依靠凝 胶电泳来判断结果, 敏感性较差, 假阴性率较高, 不利 于结果的判断 型特异性探针核酸杂交分析采用了 杂交原理, 较之电泳法有更好的灵敏度 本文的 TaqMan 探针荧光 PCR 采用液相杂交技术, 本法的乙 肝病毒基因分型检测与 HBV DNA 测序分型结果进 行比较, 两者之间有很好的一致性,HBV 分型检测与 HBV DNA 测序检测的 114 例样本中, 只要是 HBV B 基因型 C 基因型或 B/C 混合型, 乙型肝炎病毒基因分 型检测试剂都能检出来 ( 共 111 例 ), 其中部分样本经 分型检测属于 B/C 混合基因型, 测序结果都是混合基 因型中占优势的基因型结果基本符合检测结果, 总体 符合率为 100% 本法未检出的样本共 3 例经测序分 型均为 D 型, 说明特异性比较强 以 HBV DNA 定量 检测结果为依据, 载毒量 IU/mL 的 30 例样本 本法检测结果为阴性, 对载毒量 IU/mL 的样 本检出率为 97.35%(110/113); 对 IU/mL 载毒 量 < IU/mL 的样本, 检出率为 14.28%(1/7); 对全 部 DNA 定量阳性样本的检出率为 92.5%(111/120) 可以看出本法的检测下限可定为载毒量 IU/mL, 有较高的灵敏度 本文报道的安徽地区 120 例病毒载毒量 IU/mL 乙肝患者中 HBV 基因型为 B 型病例占 51.67%(62/120);C 型占 29.17%(35/120);B/C 混合型 占 11.67%(14/120) 在本法未检测的病例中 PCR 测 序检测出 D 型 3 例, 占 2.5%(3/120), 可以看出安徽地 区的基因型以 B 型为主,C 型次之, 亦存在着 D 型的少 数感染病例和 B/C 的混合感染, 这与以往报道相似 [9] 4 结论应用 TaqMan 探针的实时荧光定量 PCR 方法能快速对乙型肝炎病毒 B 基因型 C 基因型以及 B/C 混合基因型进行检测, 结果准确可靠 特异性高 为临床乙型肝炎病毒感染监测提供一种有效的方法 安徽地区的 HBV 基因型以 B 型为主,C 型次之, 亦存在着 D 型的少数感染病例和 B/C 的混合感染 参考文献 [1] 黄月华, 周彬, 王战会, 等. 中国乙肝病毒 B 基因亚型的分布 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2007, 21(2): [2] 欧强, 陈良, 唐徐英. 上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析 [J]. 检验医学, 2007, 22(1): [3] 刘映霞, 胡国龄, 谭德明. 湖南省乙肝病毒基因型分布及临床意义 [J]. 湖南医科大学学报, 2002, 27(1): [4] Okamoto H, Tsuda F, Tanata T, et al. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surfacesubtype[j]. J Gent Viral, 1988, 69: [5] 朱冰, 苏燕莉, 仇瑞珍, 等. 聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性技术在乙型肝炎病毒基因分型中的应用 [J]. 中华检验医学杂志, 2003, 26(2): 110. [6] Naito H, Hayashi S, Abe K. Rapid and specific genotyping for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[j]. J Clin Microbiol, 2001, 39: [7] Kato H, Orito E, Sugauchi F, et al. Frequent coinfection with hepatitis B virus strains of distinct genotypes detected by hybridization with type-specific probes immobilized on a solid-phase support[j]. J Virol Methods, 2003, 110: [8] 胡盈莹, 江家骥. 乙肝病毒基因型的分子生物学特征及其临床意义 [J]. 中西医结合肝病杂志, 2003(SUPPL): [9] 许军, 王齐欣, 蒋栋, 等. 乙型肝炎病毒基因型与病情轻重的关系 [J]. 中华肝脏病杂志, 2003, 13(4): [10] 夏国良, Omana V, 贾志远, 等. 乙型肝炎病毒基因型和血清型在我国部分地区的分布及其特点 [J]. 中华流行病学杂志, 2001, 22(5): [11] 肖扬, 周岳进, 王开鉴, 等. 浙江温州地区 1020 例乙型肝炎患者 HBV 基因分型研究 [J]. 中西医结合肝病杂志, 2005, 15 (1):

8 152 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 论著 线粒体基因异常糖尿病临床预报的研究 1 张红春 2 崔之础 2 王粹芳 2 杨玲 3 白沂涛 [ 摘要 ] 目的建立糖尿病临床预报可能 方法对 103 例糖尿病 (DM) 患者和 50 例正常无糖尿病家族史对照者的线粒体 DNA (mtdna) 基因突变情况进行研究 结果糖尿病组有 20 例分别出现 1~3 处点突变, 突变点有 13 处 结论通过基因突变特点和临床资料, 用聚合酶链反应扩增 3161~3610 基因片段直接测序, 为糖尿病临床预报提供了可能 [ 关键词 ] 线粒体 ; 序列检测 ; 基因突变 ; 糖尿病 ; 预报 Clinical prediction on patients with diabetic mellitus by point mutation in mitochondrial DNA ZHANG Hongchun 1, CUI Zhichu 2, WANG Cuifang 2, YANG Ling 2, BAI Yitao 3 (1.The First People s Hospital of Qidong, Jiangsu, Qidong , China; 2.Affiliated Hospital of Nantong University, Jiangsu, Nantong , China; 3. Institute of Plant Physiology & Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS, Shanghai , China) [ABSTRACT] Objective To present a predict of diabetes mellitus. Methods In 103 cases patients with diabetes mellitus(dm) and 50 cases normal controls, the point mutation in mitochondrial DNA (mtdna) were studied. Results There were 13 gene mutation sites, in which 1 to 3 point mutation sites were detected in 20 of diabetic patients separately. Conclusion Combining the features of gene mutation and clinical data, it is possible that by a new method based on PCR and sequence analysis predict diabetes mellitus. [KEY WORDS] Mitochondrial; Sequence analysis; Gene mutation; Diabetes mellitus; Prediction 糖尿病 (DM) 是遗传和环境因素相互作用而引起的代谢紊乱综合症, 是仅次于心血管 癌症的第三大致死性疾病 到目前为止其诊断仍旧参照 1999 年 WHO 的糖尿病诊断标准, 然而这一标准是以葡萄糖代谢紊乱为依据, 在出现代谢紊乱前诊断比较困难 近年来对线粒体转运核糖核酸亮氨酸 (trna Leu(UUR) ) 基因突变 线粒体脱氢酶亚单位 -1(ND-1) 基因突变与糖尿病进行了研究, 证实 3243A G,3316G A, [1~3] 3394T A,3426A G 等与 DM 有关 本文对 103 例糖尿病患者和 50 例正常无糖尿病家族史对照者 mtdna3161~3610 基因片段出现的线粒体基因突变进行分析, 通过基因突变特点和临床资料, 探讨糖尿病的临床预报 1 对象和方法 1.1 对象 糖尿病组为 2004 年间在我院就医的 103 例无亲 缘关系糖尿病患者 ( 按 1999 年 WHO 糖尿病诊断标 准 ) 男 43 例, 女性 60 例, 年龄 14~95 岁, 平均 (54±16) 岁 对照组 50 例, 无糖尿病家族史, 空腹和餐后 2 h 血 糖均正常, 男 22 例, 女 28 例, 年龄 28~81 岁, 平均 (50±6) 岁 年龄 性别等两组比较无差异 (P>0.05) 1.2 方法 有核细胞制备和保存 所有样品均加入 EDTA 抗凝, 在抽血后 1 h 内分离白细胞 淋巴细胞分 离液 3 ml, 加抗凝全血 3 ml,3 000 rpm 离心 20 min, 基金项目 : 南通市政府社会发展基金 (S04035) 作者单位 :1. 江苏省启东市人民医院, 江苏, 启东 南通医学院附属医院, 江苏, 南通 中国科学院上海植物生理生态研究所, 上海

9 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 吸出中间白细胞层, 用生理盐水洗涤两次, 弃上清 置 -20 保存 细胞裂解加 600 μl 裂解液,5 μl 蛋白酶 K, 颠倒混匀至清亮后 56 3 h 提取 DNA 在上述混合液中加 200 μl 饱和 NaCl 混匀, rpm 离心 10 min 吸出上清液后加等量异丙醇 ( 约 500~600 μl), 颠倒混匀至 DNA 絮状沉淀, rpm 离心 10 min, 弃上清后加入 1 ml 70% 乙醇漂洗, 沉淀干燥, 加去离子水约 50 μl 溶解, 作为模板 反应体系引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成, 上游为 5 -GCGCCTTCCCCCGTAAATGA-3, 下游为 5 -GGCCTAGGTTGAGGTTGACC -3 反应总 体积为 50 μl, 内含模板 5 μl,10 倍缓冲液 ( 含 Mg 2+ )5 μl, dntp 0.4 μl,10 明胶 5 μl, 引物各 0.4 μl,taq 酶 2 单位, 重蒸馏水 33.8 μl, 加样后充分混匀 在带热盖 PE 9600 上扩增,93 预变性 5 min 后,93 45 s,55 45 s,70 90 s,30 次循环, 最后 70 延伸 5 min 用含 EB 的 1.2% 琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物 序列测定, 测序仪为美国 Beckman2000 型 2 结果正常对照结果与 Anderson [4] 等报道的人线粒体 DNA(mtDNA)3161~3610 基因密码编排序列完全一致, 如下所示 3161 GCGCCTTCCC CCGTAAATGA TATCATCTCA ACTTAGTATT ATACCCACAC trna Leu(UUR) 3211 CCACCCAAGA ACAGGGTTTG TTAAGATGGC AG A GCCCGGT AATCGCATAA 3261 AACTTAAAAC TTTACAGTCA GAGGTTCAAT TCCTCTTCTT AACAACATAC mrna 3311 CCATG G CCAA CCTCCTACTC CTCAT T GTAC CCATTCTAAT CGCAATGGCA 3361 TTCCTAATGC TTACCGAACG AAAAATTCTA GGC T AT ATAC AACTACGCAA 3411 AGGCCCCAAC G TTGTAGGCC CCTACGGGCT ACTA C AACCC TTCGCTGACG 3461 CCATAAAACT CTTCACCAAA GAGCCCCTAA AACCCG C CAC ATCTACCATC 3511 ACCCTCTACA TCACCGCCCC GACCTTAGCT CTCACCAT C G C T CTTCTACT 3561 ATGA A CCCCC C TCCCCATAC CCAACCCCCT GGTCAACCTC AACCTAGGCC 人线粒体 16SrRNA1671~3229, 运转核糖核酸亮氨酸 (trna Leu(UUR) )3230~3304, mrna3305~4263,nadh 脱氢酶亚单位 -1(ND-1)3307~4263 R 糖尿病组出现的突变位点 糖尿病组线粒体 DNA(mtDNA)3161~3610 基因密码编排序列, 共有 20 例分别出现 1~3 处点突变, 突变点有 13 处 基因突变引起氨基酸改变的有 12 例, 错义突变有 9 个突变点见表 1 50 例非糖尿病对照组中, 仅发现 1 例 3394 T C(0.96%),1 例 3549 C T (0.96%) 和 1 例 3552 T A(0.96%) 3 讨论 WHO 在 1980 年 1985 年 1997 年和 1999 年颁布 过糖尿病诊断标准, 标准都是以葡萄糖代谢紊乱为诊断依据, 即出现糖尿病症状后采用化学或免疫诊断方 [5] 法 1992 年 Balliger 和 Ouweland 等分别报导了线粒体 trna Leu(UUR) 3243 A G 基因突变与糖尿病的关系, 受到世界各国学者的重视 1995 年 Nakagawa 报导了线粒体 NADH 脱氢酶亚单位 1 基因 3316G A (dehydrogenase subunit 1, ND-1) 位点发生突变, 其相 [1~3] 关基因的定位和识别成为研究热点 近年来国内也对 trna Leu(UUR) 3243 A G 基因突变与糖尿病

10 154 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 Table 1 表 1 糖尿病患者基因突变情况 Gene mutation in patients with diabetes mellitus 编号 性别 年龄 ( 岁 ) 发病年龄 ( 岁 ) 基因突变点 氨基酸变化 突变定义 1 F C T 3571C T A(GCC) V(GTC) L(CTC) F(TTC) 错义 2 M C T 3571C T 3445 C T A(GCC) V(GTC) L(CTC) F(TTC) Q(CAA) 终 * (TAA) 错义 3 F C T 3571C T 3316G A A(GCC) V(GTC) L(CTC) F(TTC) A(GCC) T(ACC) 错义 4 F T A P(CCT) P(CCA) 同义 5 M T A P(CCT) P(CCA) 同义 6 M T A P(CCT) P(CCA) 同义 7 M T A P(CCT) P(CCA) 同义 12 M T A 3316G A 3397A G P(CCT) P(CCA) A(GCC) T(ACC) I(ATA) V(GTA) 错义 8 F G A A(GCC) T(ACC) 错义 9 F G A A(GCC) T(ACC) 错义 10 F G A A(GCC) T(ACC) 错义 11 F G A 3290T C A(GCC) T(ACC) I(AUU) T(ACU) 错义 12 F G A 3290T C A(GCC) T(ACC) I(AUU) T(ACU) 错义 3 F G A 3497C T 3571C T A(GCC) V(GTC) L(CTC) F(TTC) A(GCC) T(ACC) 错义 13 F T C I(AUU) T(ACU) 错义 11 F T C 3316 G A I(AUU) T(ACU) A(GCC) T(ACC) 错义 14 F G A V(GTT) I(ATT) 错义 15 F G A V(GTT) I(ATT) 错义 16 M C T N(AAC) N(AAT) 同义 17 M T C Y(TAT) H(CAT) 错义 18 F T C I(ATT) I(ATC) 同义 19 F C T I(ATC) I(ATT) 同义 20 F A G T(ACC) A(GCC) 错义 注 :M: 男性 ;F: 女性 ; 氨基酸 :A 丙氨酸 ;V 颉氨酸 ;L 亮氨酸 ;F 苯丙氨酸 ;Q 谷氨酸 ;* 终止信号 ;T 苏氨酸 ;P 脯氨酸 ;I 异亮氨酸 ;N 天冬酰胺 ;Y 酪 氨酸 ;H 组氨酸 mtdna ND-1 基因突变与糖尿病进行了研究, 证实 3243 A G,3316 G A,3394 T A,3426 A G 等与 [4~6] DM 有关 人类 mtdna 全长 bp 本研究选择 mtdna 3161~3610 基因片段是自行设计和随意 的, 主要根据测序仪器一次一般不超过 500 bp, 尽可能长并包含 trna Leu(UUR) 3243 ND-1 的 3316 和 3394 等突变点位置 由于大多数研究针对某个别突变点, 采用短片段

11 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No (200~300 bp)pcr 酶切方法, 呈阳性样本后再测序验证 内切酶质量及用量非常重要, 是该方法重复性不 [6] 好的原因之一 本研究直接检测 103 例糖尿病患者 mtdna3161~3610 基因序列, 发现有基因突变样本重复 PCR 检测, 并纯化产物重新测序验证 20 例出现的 1~3 处 13 个突变点都经验证无误 对 DM 线粒体基因的研究发现 DM 患者在 trna Leu(UUR) 3290 T C mrna 3306 C T mtdna ND-1 除 3316 G A,3394 T A 等点突变外还存在其他的点突变 如表 1 所示,3306 C T 3336 T C 3549 C T 和 3552 T A 为同义突变, 并未发生氨基酸改变 9 个错义突变尤其是 3497 C T 和 3571 C T 同时突变占 2.88%,3421G A 突变占 1.92% 而 50 例非 DM 对照组中, 仅发现 1 例 3394 T C;1 例 3549 C T 和 1 例 3552 T A, 尚未发现 1 例有上述基因突变 糖尿病基因突变情况由表 1 可见,mt DNA3316 G A 位点突变 6 例 (6.73%), 明显高于其他报道 3316 G A 位点突变合并其他点突变 3 例, 单一出现 3316 G A 位点突变 3 例, 可能与人群及研究方法有关 患者中 3306 C T 3336 T C 3549 C T 和 3552 T A 为同义突变, 并未发生氨基酸改变 是否属于衰老过程中存在的 mt DNA 突变, 或与年龄有关的线粒体疾病 其他 9 个错义突变位点尤其是 3497 C T 和 3571 C T 同时突变 3 例占 2.88%,3421 G A 突变占 1.92% 而 50 例非 DM 对照组中, 仅发现 1 例 3394 T C(0.96%),1 例 3549 C T(0.96%) 和 1 例 3552 T A(0.96%), 尚未发现 1 例有上述基因突变 mt DNA ND-1 基因 3497 C T 突变为丙氨酸错义为颉氨酸 (GCC GTC),3571 C T 突变为亮氨酸错义为苯丙氨酸 (CTC TTC),3421G A 突变为颉氨酸错义为异亮氨酸 (GTT ATT), 它们均位于线粒体呼吸链复合体 1 有关的基因 由于胰岛素的合成和分泌与线粒体的功能关系密切, 推测上述突变可能使线粒体 DNA ND-1 基因表达减弱, 可能改变线粒体 DNA [7,8] 的空间构型, 在环境因素下导致糖尿病 ND-1 基因突变在合并其他糖尿病的易感因素有可能出现胰岛素分泌不能满足糖代谢的需要而发生糖尿病 mtdna trna Leu(UUR) 3243 A G 突变, 本文虽未发现, 仍认为是与糖尿病有关的重要突变 推测 3497C T 3571C T 位点同时突变, 或同时合并其他基因突变 ;3316 G A 位点突变合并 3421G A 或其他错义基因突变时与糖尿病有关 其他错义突变由于例数较少, 但对于它们的发现及描述可能为糖尿病预报研究提供了重要参考 参考文献 [1] Lynns, Wardell T, Johnson M A, et al. Mitochoudrial diabetes:investigation and identification of a novel mutation [J]. Diabetes, 1998, 47: [2] Tawata M, ohtaka M, Iwase E, et al. New mitochondrial DNA homplasmic mutations associated with Japanese patients with type 2 diakete[j]. Diabetes, 2001, 40: [3] Nakagawa Y, Ikegami H, Yamato E, et al. A new mitochoudrial DNA mutatiom associated with non insulin dependent diabetes mellitus[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 209: [4] Anderson S, Banker A T, Barrell B G, et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome[j]. Nature, 1985, 290: [5] 候振江, 张宗英. 糖尿病实验室检查及临床应用 [J]. 现代诊断与治疗, 2003, 14(5): [6] 黄帆, 梁秀龄, 林正, 等. 荧光聚合酶链反应检测核变性基因突变 [J]. 中华检验医学杂志, 2000, 23: 297. [7] 钱杰, 张丽容. 线粒体 DNA ND-1 基因点突变与 2 型糖尿病的关系 [J]. 中华内分泌代谢杂志, 2003, 19: [8] 于佩, 于德民, 刘德敏. 一个 2 型糖尿病家系的线粒体基因 nt3426a G 突变分析 [J]. 中华医学遗传学杂志, 2003, 20:

12 156 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 论著 DNA 微阵列技术检测 HLA-DRB1 基因分型 1 周转 2 胡守旺 2 张帆 [ 摘要 ] 目的采用 DNA 微阵列分型方法, 对 HLA-DRB1 基因进行分型研究 方法设计分型检测寡核苷酸探针, 制备 HLA-DRB1 基因分型微阵列 设计 PCR 引物, 以 1:20 引物比例不对称扩增 HLA-DRB1 基因的第 2 外显子,Cy3 荧光标记扩增产物, 作为杂交模板 用差异选择法杂交信号强且特异性好的探针 Cy3 荧光标记 PCR 扩增产物与微阵列探针杂交反应, 结果经荧光扫描, 并用分型软件分析判断阳性探针和 HLA-DRB1 基因型 结果 10 例临床血样的 DNA 微阵列分型结果与 PCR-SSP 分型结果相符,20 例未知血样的 DNA 微阵列分型结果与 DNA 测序分型结果符合率为 97% 结论 DNA 微阵列技术具有高通量 简便 低成本的优势, 采用 DNA 微阵列分型方法, 对 HLA-DRB1 基因进行分型研究, 表明 HLA-DRB1 DNA 微阵列分型为一种可行的基因分型新技术 [ 关键词 ] HLA-DRB1; 基因分型 ;DNA 微阵列 ;PCR-SSP Detection for HLA-DRB1 genotyping by DNA microarray ZHOU Zhuan 1, HU Shouwang 2, ZHANG Fan 2 (1. The People s Hospital of Jiaozuo City, Henan, Jiaozuo , China; 2. DaAn Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou , China) [ABSTRACT] Objective To develop a DNA microarray method for HLA-DRB1 typing. Methods The specific oligonucleotide probes for HLA-DRB1 genotyping was designed and spotted on glass slides using a microarray spotter. DNA sample was unsymmtric PCR amplified for the exon 2 of HLA-DRB1 and was labeled with the fluorescent dye Cy3. Following hybridization between the Cy3-labeled PCR products and the oligonucleotide probes of each microarray on the slides and wash, the amount of probe hybridizing to each DNA sample was measured with a microarray scanner and the image was analyzed with a computer software, which was used to identify the positive probes and to determine the HLA-DRB1 genotype of each sample. Results There was good concordance between the genotyping results by oligonucleotide microarray and those of PCR-SSP or SBT. Conclusion The procedure described here has the potential of providing a rapid, simple, economical and accurate way for HLA-DRB1 genotyping. [KEY WORDS] HLA-DRB1; Genotyping; DNA microarray; PCR-SSP HLA( 人类白细胞抗原 ) 基因是目前所发现的最 复杂的人类功能基因系统, 分为 HLA-I II III 三类, 其 中 I 和 II 类基因所编码的 HLA 抗原在机体的免疫反 应, 尤其是器官移植排斥反应中起重要作用, 同时, 还 与一些疾病具有关联性 [1,2] HLA-DRB1 属于 HLA-II 类基因抗原, 是器官移植排斥反应的主要抗原之一 [3] HLA 基因分型在器官移植配型 法医鉴定 人类 [4~8] 学及疾病相关性等研究中具有重要的意义 HLA 基因分型的基础具有复杂的多态性 90 年代以来, HLA 分型方法已由血清学方法转向以 DNA 为基础的分子生物学方法 随着分子生物学技术的发展, 不但可以从基因座位 基因亚型水平分型, 而且可以对单个核苷酸变异进行检测, 确定同一特异性亚型的不同等位基因 目前通用的 PCR-SSOP 和 PCR-SSP 方法可以在单个等位基因位点水平对 HLA 分型, 且不受 [9,10] 机体免疫状态的干扰, 明显优于血清学分型法 但 基金项目 : 国家 863 计划重大专项 (2002AA2Z2032) 作者单位 :1. 河南省焦作市人民医院, 河南, 焦作 中山大学达安基因诊断中心, 广东, 广州

13 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 是,HLA 等位基因不断被发现, 临床对器官移植成活率的要求不断提高, 迫切需要用高通量 简便 低成本 标准化的 HLA 分型方法对 HLA 数百个等位基因进行分型, 以弥补现有方法低通量 操作繁琐 高成 [11] 本 检测结果缺乏可比性等不足 基因芯片技术是近年来出现的一种程序化 规模化基因研究新技术, 可将预先设计好的寡核苷酸或基因片段有序地排列在处理过的载体上, 制成芯片, 待测样品用荧光染料标记后与芯片进行杂交, 通过荧光扫 [12~16] 描及计算机分析, 获取样品分子数量核序列信息 基因芯片技术可平行 快速地进行单基因多位点和多基因多位点的多态性分析检测, 具有其它基因分型技术所无法比拟的优越性 本文将基因芯片技术的一种,DNA 微阵列技术用于 HLA-DRB1 基因分型研究, 探讨其在 HLA 基因分型中的优势和应用价值 1 材料和方法 1.1 材料 临床样本 10 例经 PCR-SSP 分型血样由深圳市输血医学研究所提供 20 例未知血样由临床随机获得的抗凝全血样本 试剂 DNA 提取试剂盒 PCR 试剂购自 Promage 公司 DNA 合成 修饰 荧光标记试剂盒及杂交液试剂分别购自 SIGAMA,Parmacia 等公司 仪器设备及分析软件核酸合成仪 (Expedite8909,ABI), 自动测序仪 (CEQTM2000XL, Beckman),PCR 仪 (PTC-100,MJ.Research), 微阵列点样仪 (Pixsys 5500,Cartesian), 扫描仪 (Scanarray3000, General Scanning Inc.) Cy3 荧光标记和非标记 PCR 引物在 HLA-DRB1 的第 2 外显子区域设计特异性引物, 并在负链引物的 5 端标记 Cy3 序列如下: 正链 :P1 5 CCG GAT CCT TCG TGT CCC CAC AGC ACG 3 ; 负链 :P2 Cy3-5 TCG CCG CTG CAC TGT GAA G 寡核苷酸探针根据 NCBI 数据库及 Tissue Antigen 最新公布的 HLA-DRB1 等位基因序列, 在第 2 外显子区域设计并筛选了分型探针, 序列见表 方法 全血基因组 DNA 的提取按照 Promage DNA 提取试剂盒操作程序, 每 300 μl 人抗凝血, 提取的 DNA 溶解于 100 μl TE,4 保存 扩增靶片段时, 每 20 μl PCR 反应体系加入 1 μl DNA 表 1 HLA-DRB1 分型检测探针 Table 1 Probes for HLA-DRB1 genotypes 探针 Probe 序列 Sequence D1 D3 D4 D6 D7 D8 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 N P 5 (NH 2)-(T)10- TGC TGG AAA GAT GCA 3 5 (NH 2)-(T)10-TGG AGC AGG CGC GGG C 3 5 (NH 2)-(T)10-GCC TAA GAG GGA GTG T 3 5 (NH 2)-(T)10-AGA AGC GGG GCC GGG TG 3 5 (NH 2)-(T)10-GTA CTC TAC GTC TGA G 3 5 (NH 2)-(T)10-GAG CAG GTT AAA CAT G 3 5 (NH 2)-(T)10-CCT GAT GAG GAG TAC 3 5 (NH 2)-(T)10-CTC TAC GGG TGA GTG TT 3 5 (NH 2)-(T)10-GGT TAC TGG AGA GAC AC 3 5 (NH 2)-(T)10-GGA AGA CGA GCG GGC 3 5 (NH 2)-(T)10-GCC TGC TGC GGA GCA C 3 5 (NH 2)-(T)10-GAA GAC AAG CGG GCC 3 5 (NH 2)-(T)10-CAG GGT AAG TAT AAG TG 3 5 (NH 2)-(T)10-GCG GGC CCT GGT GGA 3 5 (NH 2)-(T)10-GTG CGG TAT CTG CAC AG 3 5 (NH 2)-(T)10-ACG CGT CCA TAA CCA 3 5 (NH 2)-(T)10- TGG AAA AGC CAG CAG GAG 3 5 (NH 2)-(T)10- TGG AAA AGC CAG CAG GAG 荧光标记靶 DNA 片段的 PCR 扩增 采用 1:20 摩尔浓度比的引物, 荧光不对称 PCR 扩增, 使扩增产物 中荧光标记单链占多数, 有利于增强杂交信号 PCR 反 应体系为 20 μl, 扩增条件是 s, s,72 30 s,40 个循环 产物避光 4 保存 芯片载体玻片的表面化学处理 市售载玻片 用铬酸浸泡过夜, 蒸馏水洗, 浸入 25% 氨水过夜, Milli-Q 水洗, 再浸入氨丙基三甲氧基硅烷的 95% 乙醇 溶液中, 室温处理,95% 乙醇超声清洗,115 烘干 室温下 5% 的戊二醛水溶液作用, 水洗 2 次 寡核苷酸微阵列的点样制备 将分型探针溶解 在点样液 (3 SSC,0.01% SDS) 中, 终浓度为 20 μmol/l 使用点样机器人, 在载体玻片上点制 5 5 的探针微阵列, 室温放置过夜备用 杂交反应 0.2% SDS 和蒸馏水各洗涤芯片 2 min, 晾干 1 μl 荧光标记 PCR 产物和 9 μl 杂交液 (5 SSC, 0.1% SDS) 混合, 均匀加入芯片杂交区 将芯片放入杂 交盒,48 保温 1 h 依次在洗涤液 A(1 SSC,0.2% SDS),B(0.2 SSC),C(0.1 SSC) 中浸泡芯片各 3 min, 取出晾干 荧光扫描 信号分析及 HLA 型别判断 使用 Scanarray 3000 荧光扫描仪, 在 85% 激光强度下扫描 3

14 158 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 遍 根据 cutoff 值 借助分析软件 分析阳性探针组 成 判断血样 HLA-DRB1 型别 2 结果 2.1 荧光不对称 PCR 扩增有利于芯片杂交 采用荧光不对称 PCR 方法扩增靶 DNA 片段 PCR 产物不需热变性 可直接用于杂交 在不对称 图 2 探针浓度与杂交信号的关系 Figure 2 Relations between probes concentration and hybridization signal value PCR 条件的优化中 试验了五种摩尔浓度比例 非标 记引物:荧光标记引物 1:5 1:10 1:15 1:20 1:30 1:50 PCR 扩增产物与芯片杂交 荧光扫描结果显 示 非标记引物:荧光标记引物摩尔浓度之比大于 1:20 对于易出现假阳性或假阴性信号的探针 按照 或小于 1:20 时 杂交信号均较弱 当非标记引物 荧光 Tm 值和长度相近 多态性位点尽量居中的原则 围绕 标记引物摩尔浓度之比为 1:20 时 杂交信号最强 图 每个多态性位点 分别设计一组理论上可行的探针 1 因此选择 1:20 为非标记引物与荧光标记引物最 点样制备芯片 将构建的阳性杂交模板与芯片杂交 佳摩尔浓度比 经荧光扫描分析 在每个多态性位点的一组探针中 选 择 一 条 杂 交 信 号 强 且 特 异 性 好 的 探 针 作 为 HLA-DRB1 分型芯片最终使用的探针 以下是部分 探针的差异选择结果 其中下划线探针为通过杂交筛 选的特异性探针 表 临床血样的 HLA-DRB1 分型 DNA 微阵列检测 将筛选的 HLA-DRB1 基因分型探针 溶解在点样 液 3 SSC 0.01%SDS 中 终浓度为 20 μmol/l 点样 图 1 不对称 PCR 扩增产物芯片杂交信号值 Figure 1 Hybridization signal value of asymmetric PCR product 制备芯片微阵列 表 3 其中 D1 D19 探针共 16 条 为分型检测探针 N 为阴性对照质控探针 P 为阳性对 照质控探针兼坐标 分型探针与 HLA-DRB1 型别的 对应关系是 某一条或几条阳性和阴性探针的组合决 2.2 探针浓度对杂交信号的影响 定一个型别 将 μm 浓度的寡核苷 血 样 DNA 的 荧 光 不 对 称 PCR 扩 增 产 物 与 酸探针点样制备 DNA 微阵列芯片 室温放置过夜 与 HLA-DRB1 基因分型 DNA 微阵列杂交 结果经荧光 互补的荧光标记模板进行杂交反应 荧光扫描分析 测 扫描分析 获得芯片微阵列中每条探针的荧光信号数 定荧光信号强度 结果表明 当探针浓度为 1 15 μm 值 根据探针的信号值 本底值以及 cutoff 值 判断阳 时 杂交信号随浓度增加呈线性增加 当探针浓度为 性和阴性探针 再经分析软件判定各血样所属的 μm 浓度 探针的杂交信号随浓度增加而增加 HLA-DRB1 基因型别 但增幅趋缓 当探针浓度达到 20 μm 时 杂交信号强度 使用 HLA-DRB1 寡核苷酸分型芯片对 10 例已经 达到最大 20 μm 以上 杂交信号不再随浓度增加而增 PCR-SSP 分型的临床血样进行检测 结果见表 4 部分 强 见图 2 因此试验中使用探针点样浓度为 20 μm 血样芯片杂交的荧光扫描结果如图 3 表明芯片分型 2.3 HLA-DRB1 分型探针检测阳性杂交模板的构建 结果与 PCR-SSP 分型结果完全符合 以上实验重复 为检测 HLA-DRB1 各分型探针的特异性 设计了 3 次 结果相同 对另外 20 例未知血样采用 DNA 测 包含所有 HLA-DRB1 分型探针的互补序列 通过分段 序与 HLA-DRB1 分型芯片并行检测 符合率为 97% 合成 补平 特异引物扩增 回收扩增片段 克隆并测 序验证 构建了分型探针检测的阳性杂交模板 2.4 用差异选择方法设计和筛选HLA-DRB1分型探针 3 讨论 HLA 多态性或个体遗传差异的本质不是血清学

15 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 探针 Probe D1-1 D1-2 D1-3 D6-1 D6-2 D6-3 D15-1 D15-2 D15-3 表 2 三组差异选择探针及序列 Table 2 Three groups difference selection probes and sequences 序列 Sequence 温度 Tm( ) 5 (NH 2)-(T)10- TGC TGG AAA GAT GCA T (NH 2)-(T)10- TTG CTG GAA AGA TGC AT (NH 2)-(T)10- TGC TGG AAA GAT GCA TC (NH 2)-(T)10- AGA AGC GGG GCC GGG T (NH 2)-(T)10- GAA GCG GGG CCG GGT G (NH 2)-(T)10- AGA AGC GGG GCC GGG (NH 2)-(T)10-GGA AGA CAA GCG GGC CG (NH 2)-(T)10- GAA GAC AAG CGG GCC (NH 2)-(T)10- GGA AGA CAA GCG GGC C 3 56 长度 Length(nt) 表 3 HLA-DRB1 基因分型 DNA 微阵列探针 Table 3 DNA micoarray of HLA-DRB1 genotyping D1 D3 D4 D6 D7 D8 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 N P P P P P P 所能检测的基因产物, 而是编码这些抗原分子的 DNA, 因此基因分型方法比血清学方法更为直接可 靠, 且能检测血清学方法不能检出的多态性, 有助于进一步研究 HLA 基因的结构与功能 HLA 基因位于人类第 6 号染色体短臂上, 基因组全长达 kb, 约占人类基因组的 0.1% 现有研究 [11] 表明,HLA-DRB1 基因由 6 个外显子和 5 个内含子组成, 全长约 bp,6 个外显子总长 801 bp, 少于基因全长的 6%, 而单核苷酸多态性 (SNP) 位点绝大多数位于第 2 外显子的约 300 bp 的范围内, 目前国际上通用的 PCR-SSP,PCR-SSOP,PCR-SSCP,SBT 等基 样品编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 PCR-SSP 分型结果 DRB1*15/04 DRB1*15/07 DRB1*16/04 DRB1*15/10 DRB1*08/09 DRB1*15/11 DRB1*08/11 DRB1*15 DRB1*15/04 DRB1*15/09 表 4 DNA 微阵列分型方法与 PCR-SSP 分型方法的比较 Table 4 Comparison of DNA micoarray with PCR-SSP in genotyping 分型微阵列检测阳性探针 D3,D4,D8 D3,D4,D16 D4,D8 D3,D4,D19 D11,D17,D18 D3,D4,D10 D10,D11,D17 D3,D4 D3,D4,D7 D3,D4,D18 分型微阵列检测阴性探针 D3 HLA-DRB1 分型微阵列检测结果 DRB1*15/04 DRB1*15/07 DRB1*16/04 DRB1*15/10 DRB1*08/09 DRB1*15/11 DRB1*08/11 DRB1*15 DRB1*15/04 DRB1*15/09 两种分型方法的结果是否符合 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 因分型方法, 根据第 2 外显子的 SNP, 将 HLA-DRB1 基因分为 13 个型别, 即 HLA-DRB1*01,03,04,07, 08,09,10,11,12,13,14,15,16 由于这些分型方法仍然存在操作复杂 成本高且通量低等问题, 本文将基因芯片这一新技术应用于具有复杂多态性的 HLA 基因的分型 试验结果表明, 可发挥其特有的高通量 操作简便 低成本等优势 本试验采用荧光标记不对称 PCR 方法, 可以获得高 拷贝单链荧光标记杂交模板, 避免了双链模板在杂交时因自身互补而降低与探针的杂交效率, 同时也省去了双链杂交模板变性这一步骤, 简化了分型检测过程 按照 Tm 值和长度相近, 多态性位点尽量居中的原则, 结合 HLA-DRB1 亚型序列的特点, 设计一组长度为 17 nt 的寡核苷酸探针, 一条检测探针包含 2 个或 2 个以上的变异碱基, 不同检测探针组合决定一个 HLA-DRB1 亚型 将这组探针点样制备 DNA 微阵

16 160 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 Semin Hematol, 1999, 36(4 Suppl 7): [4] 应大明. HLA 与骨髓移植 [J]. 上海免疫学杂志, 1995, 15 (2): [5] 孔繁华, 金荔, 陈兴国. 骨髓移植供体选择的研究 [J]. 中华 S7 为纯合体, 亚型为 HLA-DRB1*15, 分型芯片检测 HLA-DRB1 探针 D3,D4 为阳性, 与 DNA 测序结果相符 S8 为杂合体, 亚型为 HLA-DRB1*11/*08, 分型芯片检测 HLA-DRB1 探针 D10,D11,D17 为阳性, 与 DNA 测序结果相符 图 3 临床血样 DNA 微阵列杂交扫描结果 Figure 3 DNA microarray hybridization result of clinical samples 列, 与已知序列的荧光标记 PCR 产物杂交, 试验中发 现部分多态性位点的检测探针出现假阳性和假阴性 信号 为了筛选这些位点的最佳检测探针, 采用了差 异选择方法 即对于这些假阳性和假阴性探针, 在不 改变探针序列所包含的变异点的前提下, 针对变异点 设计 3 种长度和 Tm 值不同的探针, 通过与人工构建 的阳性杂交模板杂交, 筛选杂交信号强且特异性好的 探针, 从而简化了探针调试和选择过程 本文使用 DNA 微阵列技术检测临床样本基因分 型的结果, 与目前通用的 DNA 测序及 PCR-SSP 方法 分型结果相比, 符合率高, 可靠性好, 并且可在一张微 阵列芯片上平行快速检测多份临床样本, 表明 DNA 微阵列技术适合于具有复杂多态性的 HLA-DRB1 基 因的分型 随着技术平台的成熟, 有望在一张微阵列 芯片上同时检测多个样本以及 HLA-A B C DRB1 DQ DP 等多个基因座位的基因型 [12] 参考文献 [1] Yamada S, Takatsuka H, Takemoto Y. Association of cytomegalovirus interstitial pneumonitis with HLA-type following allogeneic bone marrow transplantation[j]. Bone Marrow Transplant. 2001, 25(8): [2] van-den-berg H, Verjaal M, Boer K, et al. Prenatal HLAmatching to determine suitability for allogeneic bone marrow transplantation[j]. Bone Marrow Transplant, 2000, 25(6): [3] Thomas E D. Bone marrow transplantation: a review[j]. 器官移植杂志, 1995, 16(2): [6] 李丹, 刘海燕, 于妍, 等. HLA-A B C 基因第二外显子的单链构象多态性分析及骨髓移植受供者基因配型 [J]. 实验血液学杂志, 1996,4(1): [7] 刘广贤, 孔繁华, 张蕊芳, 等. PCR-SSP 基因分型技术的建立及其在骨髓移植配型中的应用 [J]. 中国实验临床免疫学杂志, 1996, 8(3): [8] Hurley C K, Maiers M, Ng J, et al. Large-scale DNA-based typing of HLA-A and HLA-B at low resolution is highly accurate specific and reliable[j]. Tissue Antigens, 2000, 55 (4): [9] Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typingby PCR amplification with PCR-SSP in 2 hours: an altenative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplatation[j]. Tissue Antigens, 1992, 39(3): [10] Jordan F, McWhinnie A J, Turner S, et al. Comparison of HLA-DRB1 typing by DNA-RELP, PCR-SSO and PCR-SSP methods and their application in providing matched unrelated donors for bone marrow transplantations [J]. Tissue Antigens, 1995, 45: [11] 杨文莉. HLA 配型在异基因骨髓移植中的研究进展 [J]. 西安医科大学学报, 2000, 21(6): [12] 王升启. 基因芯片技术及应用研究进展 [J]. 生物工程进展, 1999, 19(4): [13] 胡守旺, 张帆, 王晖, 耿永尧, 王升启. 寡核苷酸芯片用于 HLA-A 基因分型的研究 [J]. 中华血液学杂志, 2003, 24(7): [14] 蓝柯, 胡守旺, 张帆, 等. 寡核苷酸芯片用于 HLA-B 分型的初步研究 [J]. 中国实验血液学杂志, 2003, 11 (2): [15] Fan Zhang, Shouwang Hu, Jian Huang, et al. Development and clinical evaluation of oligonucleotide microarray for HLA-AB genotyping[j]. Pharmacogenomics, 2006, 7(7): [16] Zhang F, Hu S W, Huang J, et al. Oligonucleotide microarray for HLA-DRB1 genotyping: preparation and clinical evaluation[j]. Tissue Antigens, 2005, 65(5):

17 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 论著 呼吸道合胞病毒实时荧光 RT-PCR 定量检测方法的 建立 1 何瑰 2 程春燕 1 陈娟 [ 摘要 ] 目的建立实时荧光 RT-PCR(real-time fluorescent reverse transcriptase PCR,real-time fluorescent RT-PCR) 一步法定量检测人呼吸道合胞病毒的方法 方法以人呼吸道合胞病毒基因的保守序列为模板设计特异性引物和探针, 通过优化相关反应体系和条件, 建立实时荧光 RT-PCR 一步法检测样本中呼吸道合胞病毒的方法 ; 对方法的特异性, 灵敏度, 重复性进行了评价 结果本研究建立的实时荧光 RT-PCR 一步法检测方法特异性好, 灵敏度可以达到 500 PFU/mL, 重复性 Ct 值的变异系数均小于 5% 结论本研究建立的实时荧光 RT-PCR 定量检测方法可靠 准确 简便 稳定 [ 关键词 ] 呼吸道合胞病毒 ; 荧光定量 ;RT-PCR Establishment of respiratory syncytial virus detection by real-time fluorescent RT-PCR HE Gui 1, CHENG Chunyan 2, CHEN Juan 1 (1.DaAn Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou , China; 2. Guangzhou DaAn Clinical Laboratory Center, Guangdong, Guangzhou , China) [ABSTRACT] Objective To establish a one-step real-time fluorescent RT-PCR detection method of respiratory syncytial virus. Methods Specific primers and probe for specific PCR were designed based on the published sequences of RSV. By optimizing the reactive conditions,the one-step real-time RT-PCR approach was established. The specificity, sensitivity, reproducibility were evaluated. Results The fluorescent one-step real-time RT-PCR method was established. The study showed specificity was good, the sensitivity can be achieved 500 PFU/mL, the variability of repetitive Ct value is less than 5%. Conclusion This study established the real-time fluorescent quantitative RT-PCR detection method. It is reliable, accurate, simple and stable. [KEY WORDS] Respiratory syncytial virus; Fluorescent quantitative; RT-PCR 呼吸道合胞病毒 (respiratory sycytial virus,rsv) 是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒, 是 5 岁以下儿童病毒性肺炎的最主要病原体, 这种病毒性肺炎也是婴儿猝死的病因之一 本研究通过对 RSV 核酸一步法实时荧光 RT-PCR 检测方法进行研究, 并通过评价相关反应体系, 以期建立一个稳定可靠的 RSV 检测方法, 从而有利于加深对这种病毒的认识, 不仅对了解患病程度 预测 评价治疗效果有十分重要意义, 而且使得病毒感染发病机制的研究进入量化阶段, 为 新药的研究与试用提供极为重要的研究手段 1 材料与方法 1.1 仪器和试剂主要仪器为 ABI 7300 荧光定量 PCR 仪 ;MMLV, RNasin,dNTPs 购自 Promega 生物工程有限公司 ;Taq 酶,RNA 提取试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供 1.2 标准病毒株和标本 基金项目 : 国家科技型中小企业技术创新基金 (07C ) 作者单位 :1. 中山大学达安基因诊断中心, 广东, 广州 广州达安临床检验中心, 广东, 广州 通讯作者 : 何瑰, heguismile@163.com

18 162 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 标准病毒株 : 人呼吸道合胞病毒 A 型 (Long 株 ) B 型 (R6 株 ) 来源于武汉中国典型培养物保藏中心 ; 人腺病毒 (hadv) 副流感病毒 III 型 (PIV3) 和流感病毒 A,B 型 (IV A 和 IV B) 均来源于标准病毒株, 其中 IVA (VR-219) IVB(VR-295) PIV3 (VR-93) 来源于 ATCC;ADV 购自广州市钰程医疗器械有限公司 hadv PIV3 IV A 和 IV B 的病毒经细胞培养验证为相应病毒阳性 人偏肺病毒 (hmpv) 博卡病毒 (HBoV) 样本来源于临床标本, 使用 PCR 进行检测并测序验证为相应病毒阳性 1.3 引物和探针利用 Primer Express 3.0 软件, 针对人呼吸道合胞病毒 M 基因的保守区域设计引物探针, 均由中山大学达安基因股份有限公司合成 RSV F:5 -TGG AAA CAT ACG TGA ACA AGC -3,RSV R:5 - ACA TGG GCA CCC ATA TTG TA -3,RSV PF:5 FAM-TCC ACA TAC ACA GCT GCT GTT CAA T-TRAMA 3, 扩增产物长度 114 bp 1.4 核酸提取 RNA 提取试剂由 RNA 提取液 A 和 RNA 提取液 B 组成 RNA 提取液 A 主要含有 SiO 2,RNA 提取液 B 主要由异硫氰酸胍,Tris-HCl,EDTA 等组成 在高浓度异硫氰酸胍存在下, 从病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在 SiO 2 上 1.5 标准阳性参考品制备通过空斑减数实验对培养的 RSV 病毒进行定量 传 Hela 细胞于 24 孔板,37,5%CO 2 培养, 待细胞平铺皿底, 弃培养液, 以 PBS 洗细胞两遍, 接种 10 倍梯度稀释的病毒液 :10-2 ~10-6, 空白对照直接加 DMEM 基础培养基 每个梯度设 4 个复孔 吸附完毕加入覆盖培养基 35,5% CO 2 培养 7 d 染色, 计算 : 每孔加 1% 甲醛,30 min 固定细胞, 弃培养基, 加入 1% 结晶紫染色, 洗净, 计数不同稀释度的空斑数量 以毒种稀释度和空斑数为坐标做标准曲线, 对病毒液进行定量 1.6 实时荧光 RT-PCR 方法的建立通过对两种酶用量 引物和探针量 Mg 2 + 浓度 dntps 量进行筛选优化, 最终确定最佳的实时荧光 RT-PCR 反应条件 检测步骤 : 取 100 μl 样本, 加入含有 SiO 2 的 RNA 提取液 A 和含有异硫氰酸胍的 RNA 提取液 B, 漩涡振荡混匀后,8 000 rpm 离心 2 min, 弃上清, 再加入 75% 乙醇洗涤 2 次, 离心后尽可能弃去上 清,65 干燥, 加入 25 μl DEPC 水溶解 RNA, 然后直接取 10 μl 病毒核酸至配制好的 RT-PCR 反应液中, 在 ABI 7300 上进行荧光定量 PCR 反应 标准曲线建立以定量后病毒培养液作为标准品, 进行 10 倍依次稀释, 经核酸提取, 实时荧光 RT-PCR 后, 使用仪器自带软件得到标准曲线 特异性试验以常见其它呼吸道病毒和引起肺炎的其它病原体为样本, 提取核酸后, 使用确定的反应体系进行检测 如 :1 选用常见呼吸道病毒 : IVA IVB( 正粘病毒科 ),hmpv PIV I 和 PIV III( 副粘病毒科 ),ADV( 腺病毒科 ) HBoV( 细小病毒科 );2 引起肺炎的其它病原体 : 巨细胞病毒 (CMV) 肺炎支原体 (MP) 肺炎衣原体(CP) 灵敏度试验将定量标准品进行梯度稀释, 直至该方法无法检出, 以此确定本方法检测的灵敏度 重复性试验利用该方法对同一样本进行 8 次重复检测, 以 Ct 值的 CV 值进行统计分析 2 结果 2.1 实时荧光 RT-PCR 的反应条件经过比较筛选, 用于 RT-PCR 的反应液中的最佳引物 RSV F,R 各 10 pmol, 探针 PF 为 5 pmol; 酶的最佳用量 Taq 酶 3 U,MMLV 100 U;RNasin 20 U;dNTPs 10 mmol;5*rt-pcr 反应缓冲液 5 μl( 由 50 mmol L -1 Tris-Ac(pH8.5) 100 mmol L -1 KAc 10 mmol L -1 (NH 4) 2SO 4 10 mmol L -1 DTT 1.5 mmol L -1 MgSO 4 组成 );DEPC 水补足 15 μl, 加入模板量为 10 μl 反应总体积 25 μl 反应条件 :40 30 min,95 3 min; 然后 s,55 15 s,10 个循环 ( 预扩增 );93 45 s,55 15s,30 个循环 2.2 标准曲线的建立经过空斑减数试验定量, 病毒培养液浓度为 10 8 PFU/mL, 以此为起始浓度, 依次 10 倍稀释 : PFU/mL~ PFU/mL, 提取病毒核酸后, 进行实时荧光 RT-PCR 检测, 反应结束后根据背景信号情况, 调整基线和阈值, 软件自动生成标准曲线 结果如图 1 和图 2 所示, 起始模板浓度与 Ct 值间呈良好线性关系, 标准曲线的截距 35.48, 斜率 -3.87, 相关系数 特异性其他呼吸道病毒和引起肺炎的其他病原体经本

19 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 163 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 表 1 灵敏度检测结果 Table 1 Sensitivity result of RSV by real-time fluorescent RT-PCR 样本浓度 阳性数/样本数 阳性率 % 图1 实时荧光 RT-PCR 扩增 RSV 梯度( PFU/mL)上机图 Figure 1 The amplification result of RSV gradients by real-time fluorescent RT-PCR RSV-500 PFU/mL 24/ RSV-200 PFU/mL 10/ RSV-100 PFU/mL 5/ 重复性 通过对高 中 低样本的 8 次重复检测 结果显示 扩 增 曲 线 的 Ct 值 的 变 异 系 数 分 别 为 2.3% 4.6% 3.0% 均小于 5% 重复性好 结果如表 2 所示 表 2 重复性实验的 Ct 值统计分析 Table 2 The analysis data of precision by real-time fluorescent RT-PCR 图 2 实时荧光 RT-PCR 扩增 RSV 的标准曲线 Figure 2 Standard curve of RSV by real-time fluorescent RT-PCR Ct 值 高 中 低 平均值 STDEV CV(%) 讨论 图 3 特异性实验的实时荧光 RT -PCR 结果图 Figure 3 Specific identification of RSV by real-time fluorescent RT-PCR 呼吸道合胞病毒作为一种常见的呼吸道病原体 主要通过呼吸道侵入人体 并通过空气传播 在我 国 RSV 流行的高峰季节发生在南方的夏秋季和北方 的 冬 春 季 其 中 约 20% 48% 的 病 毒 性 肺 炎 和 方法检测均为阴性 无干扰 相互之间不存在交叉反 30% 75%的毛细支气管炎系由 RSV 引起 RSV 是 应 特异性达到 100 结果如图 3 所示 一种单链 RNA 病毒 有囊膜 囊膜表面两种糖蛋白 G 2.4 蛋白和 F 蛋白 与病毒吸附和膜融合相关 均可刺激 灵敏度 以 PFU/mL 为基准 用 DEPC H2O 进行稀 机体产生抗体 囊膜内面的内膜蛋白 M 蛋白 具 释 稀释的终浓度分别为 500 PFU/mL 200 PFU/mL 有维持病毒体的结构完整性作用 据 F G 抗原性的 100 PFU/mL 进 行 实 时 荧 光 RT-PCR 检 测 结 果 表 不同 RSV 分成 A B 两个亚型 明 确保检出的 RSV 样本的最低浓度为 500 PFU/mL 说明该方法具有较高灵敏度 结果如表 1 所示 在对试剂特异性进行评价时 选择了临床表现上 相 似 的 呼 吸 道 病 原 体 如 IVA IVB hmpv PIV

20 164 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 ADV HBoV CMV MP 和 CP 研究结果表明, 建立的实时荧光 RT-PCR 一步法检测方法与其它呼吸道病原体无交叉反应, 特异性好 ; 检测灵敏度高, 达到 500 PFU/mL; 重复性好,Ct 值的变异系数均小于 5%; 反应体系的扩增效率可以达到 81.3% 目前临床使用的商品化试剂盒主要采用免疫学方法进行检测, 如鼻咽分泌物等标本中特异抗原检测或血清中抗体检测 常见的快速胶体金法检测时间短, 但灵敏度低 ; 免疫荧光法进行抗原检测时对于低浓度 [1,2] 感染样本的检测效果不理想, 需经病毒培养后再进 [3] 行检测, 不同试剂盒灵敏度和特异性存在差异, 且对于操作人员要求较高, 存在非特异染色等问题, 给结果判断带来不确定性 病毒培养又需要有活病毒存在才能实现, 且操作繁琐 而血清中 RSV 特异免疫球蛋白 [4] G M A 检测的灵敏度远低于病毒分离和抗原检测 利用 PCR 方法可以直接检测病毒核酸, 灵敏度更高 在对呼吸道病毒检测研究中发现, 使用 DFA 方法和 [5] PCR 方法, 阳性检出率有明显差异, 不同设计, 不同对 [6,7] 象, 两种方法检测灵敏度存在差异, 有高有低 实时荧光定量 PCR 技术与传统的 PCR 技术 ( 终点检测 ) 相比, 实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析, 具有特异性和精确度更强 自动化程度更高以及污染的可能 [8] 性更小等优点 一步法 RT-PCR 只要加入模板 RNA 和特异性引物即可实现在同一反应管内连续进行 RNA cdna PCR 反应, 中途不需加入任何试剂, 在处理大量样品时易于操作, 有助于减少残余污染 参考文献 [1] Casiano-Colón A E, Hulbert B B, Mayer T K, et al. Lack of sensitivity of rapid antigen tests for the diagnosis of respiratory syncytial virus infection in adults[j]. J Clin Virol, 2003, 28(2): [2] Rabagliati R, Serri M, Montecinos L, et al. Utility of real time polymerase chain reaction in the diagnosis of respiratory syncytial virus infection among adult patients[j]. Rev Chilena Infectol, 2007, 24(6): [3] Freymuth F, A Vabret, Cuvillon-Nimal D, et al. Comparison of multiplex PCR assays and conventional techniques for the diagnostic of respiratory virus infections in children admitted to hospital with an acute respiratory illness[j]. J Med Virol, 2006, 78(11): [4] Meddens M J, Herbrink P. Serodiagnosis of respiratory syncytial virus (RSV) infection in children as measured by detection of RSV-specific immunoglobulins G, M, and A with enzyme-linked immunosorbent assay[j]. J Clin Microbiol, 1990, 28(1): [5] Mahony J, Chong S, Merante T, et al. Development of a respiratory virus panel test for detection of twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay[j]. J Clin Microbiol, (9): [6] Aslanzadeh J, Zheng X, Li H, et al. Prospective evaluation of rapid antigen tests for diagnosis of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus infections[j]. J Clin Microbiol, 2008, 46(5): [7] Landry M L, Cohen S, Ferguson D. Prospective study of human metapneumovirus detection in clinical samples by use of light diagnostics direct immunofluorescence reagent and real-time PCR[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(3): [8] 何瑰, 程春燕. 呼吸道合胞病毒及其基因检测 [J]. 分子诊断与治疗杂志, 2009, 1(1):

21 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 论著 福建地区造血干细胞捐献者 HLA 等位基因频率分析 王长青卓孝福郑莹 [ 摘 要 ] 目的 了解福建地区 HLA-A B DRB1 等位基因分布的特征 方法 采用 PCR-SSP 和 PCR-SSO 方法对中华骨髓库福建省分库 名造血干细胞捐献者样本进行 HLA-A B DRB1 等位基因分 型分析 结果 HLA-A B DRB1 等位基因频率较高的分别为 :A*11 A*02 A*24 B*40 B*58 B*15 DRB1*04 DRB1*12 DRB1*09 结论 福建地区人群 HLA-A B DRB1 等位基因频率具有较丰富的多态 性 [ 关键词 ] HLA; 基因频率 ; 造血干细胞 Allele frequency of human leukocyte antigen among hematopoietic stem cell donors in Fujian province WANG Changqing, ZHUO Xiaofu, ZHENG Ying (Fujian blood center, Fujian, Fuzhou , China) [ABSTRACT] Objective To investigate the characteristics of allele distribution of HLA-A B DRB1 in Fujian province. Methods By using PCR-SSP and PCR-SSO techniques,13817 blood samples of hematopoietic stem cell donors who registered in Fujian branch of Chinese Marrow Donor Program were analyzed for the allele of HLA-A, B, DRB1. Results A*11, A*02, A*24, B*40, B*58, B*15, DRB1*04, DRB1*12, DRB1*09 had frequent distribution among the allele of HLA-A, B, DRB1 in Fujian donors. Conclusion There are abundant allele polymorphim in Fujian population. [KEY WORDS] HLA; Gene frequency; Hematopoietic stem cell 本文通过对中华骨髓库福建省分库成立 5 年来 HLA 等位基因数据的分析 整理和统计, 探讨福建省人群 HLA 基因多态性分布的特征 1 材料与方法 1.1 实验材料分析对象为中华骨髓库福建省分库 2003~2008 年间造血干细胞志愿捐献者, 以公民居民身份证号为标准, 选择福建省常住人口进行统计分析, 一共有 名 1.2 实验方法采用顺序特异性引物聚合酶链反应 (polymerase chain reaction with sequence-specific primers,pcr-ssp) 和聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交 (polymerase chain reaction with sequence-specific oligonucleotide probe, PCR-SOP) 的方法检测 HLA-A B DRB1 位点等位基因 HLA-A B DRB1 等位基因检测试剂由 G&T pel-freez rose 等公司提供 DNA 提取使用 G&T 试剂提取全血 DNA 取 300 μl 全血于 1.5 ml eppendorf 管中, 加入 900 μl 红细胞裂解液震荡混匀, g 离心 30 s, 吸弃上清液, 加入细胞裂解液 300 μl, 震荡混匀致沉淀块消失, 加入 100 μl 蛋白沉淀液再次震荡混匀,13000 g 离心 60 s, 把上清液转移到另一个 1.5 ml eppendorf 管中, 加入 300 μl 异丙醇, 颠倒混匀 20 次, g 离心 60 s, 小心吸弃上清液, 加入 70% 无水乙醇颠倒混匀洗涤, g 离心 60 s, 小心吸弃上清液, 室温开盖干燥 5 min, 加入 100 μ L DNA 溶解液,65 溶解 5 min,-40 保存 HLA 位点 PCR-SSP 分型 作者单位 : 福建省血液中心, 福建, 福州

22 166 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 使用 pel-freez 试剂进行 PCR 扩增, 反应体系为 8 μl, 其中 DNA 模板 70 ng,taq 酶 0.3 U, 扩增条件为 :96 1 min(1 个循环 ),96 25 s s s(5 个循环 ),96 25 s s s(21 个循环 ),96 25 s s s(4 个循环 ), 4 保存,PCR 扩增仪为 ABI9700 型 扩增结束后 2% 琼脂糖电泳, 对照 HLA 分型格局表分析实验结果 HLA 位点 PCR-SOP 分型用 ROSE 试剂进行 PCR 扩增, 反应体系为 20 μl, 其中 DNA 模板 100 ng,taq 酶 1 U, 扩增条件为 :95 5 min(1 个循环 ),95 30 s s s(8 个循环 ),95 30 s s s(32 个循环 ),72 12 min(1 个循环 ),4 保存,PCR 扩增仪为 ABI9700 型 扩增结束每孔取 2.5 μl PCR 产 物, 加入 7.5 μl 微珠进行杂交, 条件为 :97 5 min,47 30 min,56 10 min, 在 56 下每孔加入 85 μl Dilution solution/pe-streptavidin 混合液, 运行 Luminex 200 仪器检测杂交结果, 杂交数据导入电脑分析 HLA 等位基因 2 结果在 名捐献者中共检出 A 等位基因 17 个 B 等位基因 35 个 DRB1 等位基因 14 个, 对只检出 1 个等位基因的均按纯合子对待, 检出频率较高的前 3 位分别是 A*11 A*02 A*24 B*40 B*58 B*15 DRB1* 04 DRB1*12 DRB1*09 未检出的表型特异性有: A25 A36 A43 A80 B73 B78 B82 B83 DR18 详细结果见表 1 等位基因 A*01 A*02 A*03 A*11 A*23 A*24 A*26 A*29 A*30 A*31 A*32 A*33 A*34 A*66 A*68 A*69 A*74 表 名捐献者 HLA-A B DRB1 位点的基因频率 Table 1 Gene frequency of HLA-A, B, DRB1 in donors 基因频率 等位基因 B*04 B*07 B*08 B*13 B*14 B*15 B*18 B*27 B*35 B*37 B*38 B*39 B*40 B*41 B*42 B*44 B*45 B*81 基因频率 等位基因 B*46 B*47 B*48 B*49 B*50 B*51 B*52 B*53 B*54 B*55 B*56 B*57 B*58 B*59 B*62 B*67 B*75 基因频率率 等位基因 DRB1*01 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*09 DRB1*10 DRB1*11 DRB1*12 DRB1*13 DRB1*14 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*17 基因频 讨论人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen,hla) 是目前人们所了解的最为复杂的一个血型系统, 具有高度遗传多态性, 不同人群的 HLA 多态性分布各有 特点,HLA 多态性研究对了解人类遗传的演变, 种族的迁徙及融合, 以及相关疾病研究等方面具有重要意义 为了了解福建地区人群 HLA 分布的特点, 我们对 2003~2008 年间收集的 名福建省常住人口造

23 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No 血干细胞捐献者的分型资料进行了统计分析, 共观察到 17 个 HLA-A 35 个 HLA-B 和 14 个 HLA-DRB1 等 [1~5] 位基因 通过对比中国南北方人群 HLA 位点, 发现福建地区人群 HLA-A DRB1 位点高发频率前 3 位与中国南北方人群的分布相同, 同时发现我省人群中 B*58( 占 13.44%) 与北方地区人群 ( 占 3.85%~8.35%) 相比有所不同, 提示我省人群中 B*58 有较高频率分布 本统计数据样本量较大, 基本能反映福建地区人群 HLA 的特点, 可作为今后在这一领域研究和应用的参考数据 参考文献 [1] 杨瑞云, 张伯伟, 程四国, 等. 中华骨髓库河南省捐献者 HLA-A B DRB1 基因频率及单倍型检测 [J]. 郑州大学学 报 ( 医学版 ), 2007, 42(5): [2] 孟庆丽, 于卫建, 梁晓华, 等. 辽南地区造血干细胞捐献者 HLA 基因分布和单倍型分析 [J]. 中国输血杂志, 2007, 20 (1): [3] 宋永红, 史军, 朱传福, 等. 中国北方汉族人群 HLA-A HLA-B HLA-DR 等位基因频率检测及其临床意义 [J]. 山东医药, 2005, 45(2): 4-6. [4] 马红京, 尹晓林, 郭坤元, 等. 广东汉族人群 HLAⅠ Ⅱ 基因多态性及单倍型分析 [J]. 中华医学遗传学杂志, 2005, 22(4): [5] 刘孟黎, 张艳, 刘晟. 西安地区造血干细胞捐献者 HLA-A B DR 等位基因多态性分析 [J]. 中国输血杂志, 2005, 18 (6):

24 168 分子诊断与治疗杂志 2009 年 9 月第 1 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, September 2009, Vol. 1 No. 3 论著 衰老小鼠线粒体 DNA 缺失突变的研究 1 陈姝 2 何蕴韶 2 程钢 2 高劲松 [ 摘要 ] 目的测定不同年龄组及 D- 半乳糖诱导的衰老小鼠线粒体 DNA(mtDNA) 缺失突变, 探讨 mtdna 缺失突变与衰老的关系 方法用聚合酶链反应技术和琼脂糖凝胶电泳检测 mtdna 缺失片段, 用密度扫描技术对扩增片段进行相对定量 缺失片段构建质粒后, 直接测序进行鉴定 结果全部小鼠的肝 脑与海马组织内均存在 bp 的 mtdna 缺失片段 老年鼠肝 脑与海马组织内 mtdna 缺失的比例较青幼年鼠明显增加 (P< 均 0.01) 衰老模型鼠不同组织 mtdna 缺失的相对百分含量均明显高于实验对照组 (P 均 <0.01), 肝组织中 mtdna 缺失的比例较大脑皮层和海马组织更高 结论 bp 的 mtdna 缺失片段普遍存在于小鼠中, 与增龄和衰老相关, 可作为衰老的一种分子生物标志 [ 关键词 ] 衰老 ;D- 半乳糖 ; 线粒体 DNA; 缺失 Study on mitochondrial DNA deletion in aging mice CHEN Shu 1, HE Yunshao 2, CHEN Gang 2, GAO Jinsong 2 (1.Institute of Medical Researches, the First People s Hospital of Foshan, Guangdong, Foshan , China; 2. DaAn Gene Diagnostic Center, Sun Yat-Sen University, Guangdong, Guangzhou , China) [ABSTRACT] Objective To measure mitochondrial DNA(mtDNA)deletion from in different age groups mice and senile mice induced by D-galactose, and study the relevance between the mtdna deletion and the aging. Methods Polymerase chain reaction technique and electrophoresis were used to examine the fragment deletion of mtdna. Quantitation of relative band densities was performed using densitometry scanning techniques. The deletion was identified by direct sequencing analysis. Results A bp mtdna deletion was present in liver, cerebral cortex and hippocampus tissues from all of mice. The relative percentage contents of mtdna deletion in various tissues increased significantly in old mice compared with young and adult mice (P<0.01, respectively). The deletion of mtdna was significantly higher in senile model mice induced by D-galactose than those of NS group mice (P<0.01, respectively). Deletion was more abundant in liver than in cerebral cortex and hippocampus. Conclusion The results indicated that such bp mtdna deletion was a common deletion, which was more causally linked to senescence and could be a kind of molecular biomarker of senescence. [KEY WORDS] Aging; D-galactose; Mitochondrial DNA(mtDNA); Deletion 线粒体是细胞内能量合成的主要场所, 在能量产生过程中伴有大量氧自由基的产生 线粒体 DNA (mtdna), 由于无组蛋白保护又缺乏有效的损伤修复系统, 易受氧自由基攻击损伤发生突变 目前认为线粒体 DNA 的缺失突变随增龄而积累, 影响线粒体的 [1] 正常功能, 导致能量产出缺陷 衰老和细胞死亡 我们已往实验发现 D- 半乳糖拟衰老小鼠体内清除自由 [2] 基的能力明显下降 本研究拟采用 D- 半乳糖衰老氧化损伤模型小鼠及不同年龄段小鼠, 探讨 mtdna 片段缺失与衰老及机体氧化损伤程度的关系, 寻找一种判断衰老的分子生物标志 1 材料与方法 1.1 材料 作者单位 :1. 广东省佛山市第一人民医院临床医学研究所, 广东, 佛山 中山大学达安基因诊断中心, 广东, 广州