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1 第 34 卷第 5 期 2015 年 9 月 华中农业大学学报 JuHuzhgAguuUvy V.34 N.5 Sp.2015,13~18 草莓 AP1 基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达 袁友泉李超超许馨月张志宏刘月学 沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 摘要为研究草莓 AP1 同源基因 AP1 的功能, 构建了其植物表达载体 pbi121gap1, 并导入到农杆菌菌株 GV3101 中. 利用花序浸染法将该基因导入拟南芥, 经抗性筛选 PCR 检测表明获得了 3 个转化株系. 结果显示, 与对照相比, 转基因株系明显早花, 成花时间可提早 10d 以上 ; 同时其营养生长受到抑制, 植株个体矮小, 莲座叶数目减少 ; 在早花的同时, 转化株系花器官异常, 不能形成种子. 表明草莓 AP1 基因参与了成花过程的调控. 关键词草莓 ;AP1; 拟南芥 ; 超表达中图分类号 S668.4 文献标识码 A 文章编号 1000G2421(2015)05G0013G06 栽培草莓 (g Duh.) 是蔷薇 科草莓属植物, 果实柔软多汁, 营养丰富, 经济价值 较高, 在世界范围内广泛栽培, 目前中国的草莓栽培 面积和产量均居世界第一. 我国草莓生产中促成和 半促成栽培方式约占八成, 其中日光温室生产是我 AP1 基因的转录激活可以影响其他成花相关基因 国特有的栽培模式. 在草莓设施栽培生产过程中, 的表达, 如成花抑制因子 TL1(TERMINAL 如何促进植株进行高质量的花芽分化是使其提早上 市并提高产量和质量以最终增加经济效益的关键技 术环节. 同时, 草莓成花条件与模式植物拟南芥差 异很大, 如在光照需求方面, 拟南芥是长日照植物, 而大部分栽培草莓的成花需要短日照. 此外,GA 在拟南芥成花中起诱导作用, 而在草莓上则表现为 抑制成花, 促进匍匐茎抽生, 这说明草莓的成花分子 机制与拟南芥存在一定的差异 ; 同时, 栽培草莓中除 了一季型品种外还存在着可常年开花的四季类型 (vgbg), 对草莓成花调控的机制进行研究既 有助于指导生产中的环境因素调控, 也可为草莓育 种工作提供理论参考. 对成花基因的研究自 20 世纪 80 年代末兴起至 今, 对拟南芥等模式植物成花的分子机制及其遗传 控制研究取得了巨大的突破 [1G3], 为果树学科中类似 的研究提供了许多可以借鉴的信息和手段.AP1 (APETALA1) 是拟南芥中花序分生组织向花分生 组织转变过程中所必需的基因, 编码含有 MADS 结 构域的转录因子,AP1 基因不仅在时空上调控花分 生组织的形成与花器官的发生, 而且在拟南芥等植 物中参与外两轮花器官 ( 萼片和花瓣 ) 的形成 [4G6]. LOWER 1) 和 SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE) [7] 以及其他早期花器官发育所需的基因 [8] 等的表达都受到 AP1 的调控. 目前, 已从苹 [9G10] [11] [12] [13] [14] 果 葡萄 柑橘 桃 枇杷等多种果树 中分离出了 AP1 同源基因, 并证实了它们在相关果 树成花进程中的重要作用. 而且,AP1 基因的异源 超表达可以促进多年生木本果树提早成花 [15G16], 进 一步表明该基因在植物花发育中的 开关基因 作用. 目前对草莓成花调控的研究多着眼于环境条 件 激素等对其成花的影响表现, 成花过程中的生理 指标变化也有所报道, 但其内在的成花调控分子机 [17] 制了解甚少. 我们前期的研究表明草莓的 AP1 同源基因 AP1 在基因结构 序列特征等方面和 AP1 类同源基因保守性较高, 定量表达检测结果也 表明其参与了草莓成花进程的调控. 为了进一步确 认该基因的功能, 本研究对其在拟南芥中进行了超 收稿日期 :2014G10G12 基金项目 : 辽宁省自然科学基金优秀人才培育项目 ( ); 辽宁省教育厅科学研究一般项目 (L ) 袁友泉, 硕士研究生. 研究方向 : 草莓功能基因.EGm: @qq.m 通信作者 : 刘月学, 博士, 副教授. 研究方向 : 果树分子生物学.EGm:yuxuu@yu.m

2 14 华中农业大学学报第 34 卷 表达, 探讨其功能, 以期为深入阐述该基因在草莓成 花进程中的作用奠定基础. 1 材料与方法 1.1 材料 含目的基因 AP1 的重组质粒 pgmgap1 植物表达载体 pbi121 农杆菌 GV3101 拟南芥 (Abdph)C 野生型均由笔者所在 实验室保存 ; 实验中用到的 dntp(2.5mm/l 10 mm/l) ExTq DNA 聚合酶 (5 U/ μ L) DL2000 DNA mk T4 DNA 连接酶 限制性内切酶 SⅠ XbⅠ 购自 TKR 生物工程 ( 大连 ) 有限 公司 ; 质粒提取试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒购 自 AXYGEN 公司. 其他试剂均为分析纯试剂. 1.2 植物表达载体构建 将重组质粒 pgmgap1 和植物表达载体 pbi121 用限制性内切酶 XbⅠ 和 SⅠ 进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳后利用胶回收试剂盒分离回收 所需片段. 利用 T4DNA 连接酶将 AP1 定向插 入到 pbi121 植物表达载体中 GUS 报告基因的位 置. 将连接产物转化大肠杆菌 TOP10 感受态细 胞, 经 PCR 酶切和测序鉴定后, 获得重组植物表达 载体 pbi121gap1. 利用冻融法将含目的基因的 重组植物表达载体质粒导人农杆菌 GV3101 中. 1.3 拟南芥转化 挑取含重组植物表达载体的 GV3101 新鲜单 菌落, 于附加 K50 mg/l R100 mg/l 的 YEP 液体培养基中 28 振荡培养至 D600 为 0.6~0.8, 于超净台上按照 比例取 2 ml 菌液 ( 剩余 菌液无菌保存 备用 ) 于灭菌的新鲜 YEP 液体培养 基中继续培养至 D600 为 1.5~3.0, /m 离心 10 m 收集菌体. 用含 10% 蔗糖及 0.02% w 的 1/2MS 溶液稀释至 D600 约为 0.8~1.0 备用. 拟南芥转化采用花序浸染法, 将未开放的野生 型拟南芥花序在上述菌液中浸泡 50 左右, 避光生 长 20h 后正常培养,3~4d 后用同样方法再重新转 化 1 次. 正常培养至果颊成熟, 断水, 收获种子. 1.4 抗性株系的获得 收获的种子晒干后于 4 避光保存, 筛选时在 超净台上用 70% 乙醇消毒后用无水乙醇脱去多余 水分, 超净台吹干后播于含 K50 mg/l Amp50 mg/l 的 1/2MS 培养基上培养筛选. 挑选抗性株 系转移至营养钵中, 抗性株系和野生型对照植株均 于相同短日照培养条件下 (12h 光照 /12h 黑暗, 22~24 ) 生长. 1.5 转化株系的 PCR 鉴定及表型分析 [18] 采用快速提取法提取不同抗性株系及野生 型拟南芥的基因组 DNA, 以其为模板进行 PCR 扩 增, 鉴定是否含有重组质粒中所含抗性基因 NpⅡ 片段 ( 约 500bp), 以重组质粒为阳性对照, 以野生型 拟南芥和无菌水为阴性对照进行 PCR 扩增. 引物序 列为 KG:GTTCTTTTTGTCAAGACCGACC KGR:CAAGCTCTTCAGCAATATCACG.PCR 反 应条件为 :95 5m;95 40,56 1m,72 1.5m,30 个循环 ;72 延伸 10m. 采用 CTAB 法提取野生型和转化株的 RNA, 反转录采用宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司的 PmG Sp TM RTgKwhgDNAE 试剂盒 进行, 具体操作步骤参照其说明书. 以反转录后获 得的 DNA 为模板, 以扩增 AP1 基因全长序列 引物 AP1:ATGGGAAGGGGTAGGGTT 和 AP1R:TCATGAAGCAAAGCATCC 为扩增引物 进行 PCR 扩增, 检测基因是否表达. 表型分析主要观测记录转化株和对照株的成花 时间 植株高度 莲座叶数量 花器官变化等. 开花 时间从播种日起记为 0, 至初次成花日计算. 采用 佳能 EOS7D 单反相机和奥林巴斯体视显微镜观 察 拍照 记录表型. 2 结果与分析 2.1 表达载体的构建 将含 738bpAP1DNA 全长序列的重组克 隆载体和由 CMV 35S 组成型启动子驱动的 pbi121 植物表达载体用限制性内切酶 XbⅠ 和 S Ⅰ 双酶切, 琼脂糖凝胶电泳后分离 AP1 目 的基因及 pbi121 载体大片段, 二者经 T4DNA 连接 酶连接后转化大肠杆菌, 铺含 K50mg/L 的 LB 平板,37 培养箱中培养过夜. 从平板中长出的菌 落中随机挑取一些单菌落用无菌水悬浮后, 用扩增 AP1 全长的引物进行 PCR 检测, 取检测为阳性 的菌液重新划板, 再随机挑单菌落进行 PCR 检测 后, 获得完全为阳性菌落的平板. 从阳性平板上挑 取单菌落摇菌提取重组质粒 DNA, 经 Xb Ⅰ 和 SⅠ 限制性内切酶双酶切 ( 图 1) 和测序鉴定后, 获 得重组植物表达载体 pbi121gap1.

3 第5期 袁友泉 等:草莓 AP1 基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达 图 1 重组质粒的酶切鉴定 1 D h mb dp m d 2.2 w hd byxbⅠ dsⅠ g 抗性株系获得及 PCR 鉴定 农杆 菌 花 序 浸 染 后 收 获 拟 南 芥 种 子,干 燥 后 消 毒播种于含重组质 粒 抗 性 的 抗 生 素 平 板 上,共 筛 选 出 3 个能正常生根 叶片为正常绿色的抗性株系,其 余种子萌发所形成的小苗则失绿 变黄,不能形成正 常根系,并逐渐死亡. 对获得的 3 个抗性株系及野生型植株移栽入营 养钵,成 苗 后 分 别 提 取 其 基 因 组 DNA,经 电 泳 检 测 15 M:DL2000 m k ;1~3:抗 性 株 系;4:野 生 型 拟 南 芥. M: DL2000m k ;1 3: R ;4:W d A b dp yp 图 3 抗性株系的 RT PCR 检测 3 RT PCRd p 1)成花时间及成花习性.与未转化的野生型拟 南芥相比,转化 株 系 的 成 花 时 间 都 明 显 提 前. 在 本 研究设置的短日照 条 件 下,播 种 20 余 天 后,野 生 型 拟南芥仍处于旺盛的营养生长期,未见花轴形成,但 转化株系已经陆续成花(图 4A,图 5A),最 早 的 株 系成花时间要比野生型对照提早半个月左右 ( 2). 除了 成 花 时 间 提 早 外,成 花 习 性 也 发 生 明 显 变 质量良好.针对 NpⅡ 基 因 片 段 的 扩 增 结 果 表 明, 化.野生型拟南芥 为 标 准 的 无 限 型 花 序,其 花 轴 上 在质粒阳性对照及所获得的抗性植株中均可扩增出 可抽生大量 次 级 花 序,但 在 AP1 超 表 达 的 植 株 NpⅡ 基因目的 片 段,而 野 生 型 拟 南 芥 和 清 水 阴 性 中,次级花序提早转变为单独的花(图 5D). 对照中则扩增 不 出 该 条 带 (图 2),表 明 重 组 质 粒 已 经整 合 进 抗 性 株 的 基 因 组 DNA 中,确 认 为 转 化 株系. M: DL2000 m k ;1:质 粒 阳 性 对 照;2:野 生 型 拟 南 芥 阴 性 对 照;3:清水对照;4~6:抗 性 株 系. M: DL2000 m k ;1: P m d p v ;2:W d dp ;3: S w ypab g v ;4 6: R 图 2 抗性株系的 PCR 鉴定 2 PCRd p 对 3 个 PCR 鉴 定 为 阳 性 的 株 系 进 行 RTPCR 以检测目的基因 是 否 表 达. 结 果 表 明,在 以 所 有 阳 性株系提取 的 DNA 为 模 板 进 行 的 RTPCR 扩 增 结果中均可检测到 目 的 基 因 条 带,而 对 照 野 生 型 植 株中则检测不 到 条 带 (图 3),证 实 了 在 3 个 阳 性 株 系中所插入的目的基因都得到了表达. 2.3 表型分析 野生型 WT;b 转化株系 1L 转化株系 2L 转 1; 2;d 化株系 3L 3 图 4 转化株与野生型性状比较 4 Ch mp m d WT 对获得并经 PCR 鉴 定 确 认 的 转 化 株 系 和 野 生 2)营养生长状况.与成花时间所代表的生殖生 长提前相反,代表营 养 生 长 的 莲 座 叶 数 量 在 野 生 型 草莓 AP1 基因的超表达可 以 明 显 促 进 拟 南 芥 生 和转化株间也具有明显差别.在抑制其成花的短日 型对照拟南芥进行 相 同 条 件 的 培 养,表 型 观 察 表 明 殖生长,并对其营养生长具有显著的抑制作用. 照条件下,野生型 拟 南 芥 莲 座 叶 数 量 多,大 而 厚,而

4 16 华 中 农 业 大 学 学 报 在超表达株系中,莲座叶数量明显减少,叶片小而薄 (图 4B,图 5A).同 时 由 于 过 早 成 花,转 化 植 株 高 第 34 卷 外,转化株的花 器 官 也 发 生 了 一 定 变 化. 在 转 化 株 中可发现 有 顶 端 花 中 重 新 抽 生 新 的 花 器 官 的 现 象 度也远矮于野生型对照,其中一个株系仅生长到1 5 (图 5C),花器官畸形的现象同样存在(图 5B).由 于花器官的形态发 生 了 变 异,转 化 株 系 都 表 现 为 败 m 就停止生长(图 4C). 3)花 器 官 特 征 变 化. 除 了 成 花 时 间 明 显 提 早 育,不能产生正常的种子. A:野生型(左)和提早成花的转化株(右);B:种 子 败 育 的 畸 形 花;C:复 合 花;D:转 变 为 单 花 的 次 级 花 序 A:WT ( )d y w g Ab dp p ( );B:Ab m w wh h u d g m d;c:dup d w ;D: S g gh d u g g w y 图 5 超表达 AP1 基因拟南芥表型 5 Ph A b dp p v xp gap1 yp 3 讨 论 作为 草 本 水 果,草 莓 的 成 花 并 不 像 多 年 生 木 本 果树那样存在童期 等 问 题,但 生 产 中 也 存 在 如 何 合 理调节花期以 提 高 草 莓 的 商 品 价 值 等 问 题. 同 时, 生组织特征基因,又是花器官形态特征基因,与萼片 和花瓣的发育有关 [2122].很多其他物种中的该类同 源基因也被证实参与了成花调控 [1014], AP1 类 基 因 的表达标志着成花的启动. 我们前期的研究已从栽培草莓中分离出了该同 栽培草莓中存在不 同 成 花 习 性 的 品 种 类 型,了 解 其 源基因,其序列结构 和 表 达 特 性 都 揭 示 了 其 很 可 能 成花的分子调控机制对于指导生产和育种工作具有 在草莓成花的分子调控网络中发 挥 重 要 作 用 [17],本 同样重要的意义. 研 究 对 其 在 拟 南 芥 中 的 超 表 达 证 明 了 这 一 点. 分子生物学研 究 已 经 揭 示 了 AP1 类 基 因 在 植 AP1 基 因 的 超 表 达 明 显 促 进 了 拟 南 芥 的 提 早 成 物成花进程中的关 键 作 用,多 个 成 花 分 子 调 控 通 路 花,表明该基因与 拟 南 芥 中 的 AP1 基 因 功 能 类 似, [] [ ] 的产 物 如 LY ( LEAY )和 T ( LOWER LO 苹果 9 柑橘 12 等 植 物 中 的 AP1 类 基 因 也 具 有 相 CUST )等都可 以 与 AP1 基 因 互 作,并 启 动 其 表 达 进而 促 进 成 花 [1920].拟 南 芥 中 AP1 基 因 既 是 花 分 同的作用.花序分生组织的形成和花分生组织的形 成是两个不同的过 程,在 转 化 株 系 中 顶 花 序 和 次 级

5 第 5 期袁友泉等 : 草莓 AP1 基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达 17 花序被单花代替的表型表明 AP1 基因的超表达 抑制了花序分生组织的形成而强烈刺激了花分生组 织的形成. 生殖生长和营养生长在植物生长发育过程中存 在着既相关又竞争的关系,AP1 的超表达使拟南 芥的生殖生长进程显著提前的同时明显抑制了其营 养生长, 因此, 在本研究中, 明显早花的转化株系表 现出植株矮小 莲座叶数量减少等营养生长缩短的 现象. 除了启动花分生组织的形成外, 拟南芥中的 AP1 基因还参与花器官的形成, 是成花的 ABC 模 式中的 A 类型基因, 与萼片和花瓣的形成有关 [6]. 但在其他植物中的研究表明虽然有些该类同源基因 也参与了花器官的形成, 但并不局限于 A 类型基因 [12] [23] 的作用. 如柑橘和番红花中该同源基因在所 有的四轮花器官中都有表达. 我们的前期研究表明 AP1 基因也参与了草莓部分花器官的形成. 其 在草莓的萼片中表达强度最高, 在花瓣中有痕量表 达, 在内两轮花器官中检测不到其表达 [17]. 在拟南 芥中的超表达导致转化株中多数花器官畸形, 证实 了其参与花器官形成的调控. 另外, 拟南芥中 AP1 基因不仅决定着外两轮花器官的形成, 而且也影响 控制其他花器官形成基因的表达 [5], 这可能也是导 致转化株中花器官畸形的原因. 本研究以草莓的 AP1 类基因为切入点, 通过在 拟南芥中的异源超表达初步证实了 AP1 基因在 诱导花分生组织形成和花器官形成中的作用. 同 时, 鉴于该类基因在植物成花进程中所扮演的 开关 基因 的重要作用, 本研究中对 AP1 基因功能的 初步确认也可为后续阐明草莓成花分子调控网络的 研究奠定基础. [5] MEDARD N G,YANOSKY M.AvhAbG dpbhmgbyapetala1[j].thp C,2001,13(4):739G753. [6] KAUMANN K,WELLMER,MUIÑOJ M,.OhG byapetala1[j].s,2010, 328(5974):85G89. [7] WELLMER,RIECHMANNJL.Gwkg hwdvpm[j].td G, 2010,26(12):519G527. [8] MANDEL M A,YANOSKY M.Aggggw mabdp[j].nu,1995,377(6549):522g 524. [9] SUNGSK,YU G H,ANG.ChzMdMADS2, mmbhsquamosa ubmygpp[j]. PPhygy,1999,120(4):969G978. [10]KOTODA N,WADA M,KOMORIS,.Expp hmgummdyglydap1 dugwdvpmpp[j].juhamg SyHuuS,2000,125(4):398G403. [11]CALONJE M,CUBASP,MARTÍNEZGZAPATERJ M,. mmdygxpddugddg vpmgpv[j].pphygy,2004,135(3): 1491G1501. [12]PILLITTERILJ,LOVATTCJ,WALLINGLL.Id hzleaydapetala1hmgum Cu L.Obk Whg [J].Juh AG msyhuus,2004,129(6):846g 856. [13]LIC,XIEH,ZHANGL,.Muhzh PpMADS1gm ph[j].tg & Gm, 2012,8(4):831G840. [14]LIU Y,SONG H,LIUZ,.MuhzG quejap1gwg[j].pgwh Rgu,2013,70(3):287G296. [15]PEÑAL,MARTÍNGTRILLO M,JUÁREZJ,.Cuv xpabdpleay APETALA1g uduhgm[j].nubhgy, 2001,19(3):263G267. 参考文献 [1] RATCLIE OJ,BRADLEY DJ,COEN ES.Sp hddy Abdp [J].Dvpm, 1999,126(6):1109G1120. [2] ARAKIT.Tm vgvpduvph [J].CuOpPBgy,2001,4(1):63G68. [3] BATTEY N H,TOOKE.Mudv h[j].cu Op P Bgy, 2002,5(1):62G68. [4] PARCY,NILSSON O,BUSCH M A,.AgmG wkpg[j].nu,1998,395(6702):561g 566. [16]LACHOWSKY H,PEIL A,SOPANEN T,.OvxpG BpMADS4mvbh(Bu pdurh.) duygwgpp (Mu dm Bkh.) [J].PBdg,2007,126(2):137G145. [17] 邹冬梅. 草莓成花相关基因的克隆及表达分析 [D]. 沈阳 : 沈阳农业大学园艺学院,2012. [18] 徐平丽, 赵晋平, 孟静静, 等. 一种适宜拟南芥 PCR 检测的 DNA 提取方法 [J]. 安徽农业科学,2010,38(13):6653G6654. [19]WAGNER D,SABLOWSKIR W M,MEYEROWITZ E M. TpvAPETALA1byLEAY [J].SG,1999,285(5427):582G584. [20]WIGGE P A,KIM M C,JAEGER K E,.Ig pdmpmdugduag

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