920 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 公司 ; 兔抗 CD3 多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司 ;rhtnfr:fc 购于上海中信国健药业有限公司 ; 重组 TACI Ig 融合蛋白 ( 批号 :201206

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1 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 919 网络出版时间 : :52:31 网络出版地址 :htp:// 基础医学研究 重组 TACI Ig 融合蛋白抑制抗 CD3 抗体诱导 T 淋巴细胞增殖与活化 杨思民, 汪庆童, 刘亢亢, 汪龙生, 吴莉, 魏伟 摘要目的探讨抗 CD3 抗体诱导小鼠 T 淋巴细胞增殖与活化的机制并观察重组人 TACI Ig 融合蛋白 (rhtaci Ig) 对其的影响 方法免疫磁珠纯化得到小鼠 T 淋巴细胞, 用抗 CD3 抗体刺激, 同时给予 rhtaci Ig rhtnfr Fc 或 IgG Fc [ 3 H] TdR 参入法检测 T 细胞增殖能力, 流式细胞术检测 T 细胞亚群比率,Westernblot 法检测 B 淋巴细胞刺激因子 BAFF 受体 (BAFFR) 和跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子 (TACI) 两个受体及 IL 2 受体 (IL 2R) 表达水平和 NF κb 活性, 采用小干扰 RNA(siRNA) 抑制 T 细胞 BAFFR 或 TACI 的表达 结果抗 CD3 抗体体外可促进 T 细胞增殖与活化,BAFF 白细胞介素 2(IL 2) γ 干扰素 (IFN γ) 和转化生长因子 β(tgf β) 分泌,BAFFR TACI IL 2R 表达升高和 NF κb 活性增强 (P<0 05) RhTACI Ig( μg/ml) 体外给药可抑制抗 CD3 抗体诱导的 T 淋巴细胞增殖 (P<0 05);rhTACI Ig( μg/ml) 可明显降低抗 CD3 抗体诱导产生的细胞因子水平 (P<0 05,P<0 01), 显著抑制 CD4 + CD69 + T 细胞 CD4 + CD154 + T 细胞比率, 提高 CD4 + CD62L + T 细胞比率 (P<0 05,P<0 01), 且 rhtaci Ig (10 100μg/ml) 能降低 T 细胞上 BAFFR TACI IL 2 受体的表达, 抑制 NF κb 活性 (P<0 05) 沉默 BAFFR 或 TACI 对抗 CD3 抗体诱导的 T 细胞增殖有抑制作用 (P<0 01) 结论抗 CD3 抗体部分通过产生 BAFF, 激活 BAFFR 信号而促进 T 细胞增殖与活化,rhTACI Ig 中和 BAFF, 抑制 BAFF 相关受体的表达和 NF κb 活性, 减少 T 细胞表达 IL 2 受体, 阻止 T 细胞过度增殖与活化 关键词 B 淋巴细胞刺激因子 ; 重组 TACI Ig 融合蛋白 ;T 淋巴细胞 ; 免疫治疗 ; 自身免疫病 接收基金项目 : 国家自然科学基金 ( 编号 : ); 安徽省自然科学基金 ( 编号 : QH146); 安徽医科大学青年拔尖人才支持计划 (2013); 第三批安徽医科大学校级中青年学术技术带头人基金作者单位 : 安徽医科大学临床药理研究所 抗炎免疫药物教育部重点实验室 安徽抗炎免疫药物协同创新中心, 合肥 作者简介 : 杨思民, 男, 硕士研究生 ; 魏伟, 男, 教授, 博士生导师, 责任作者,E mail:wwei@ ahmu.edu.cn; 汪庆童, 女, 副教授, 硕士生导师, 责任作者,E mail:hf wqt727@163.com 中图分类号 R593 22;R392 3;R392 5;R967;R979 5 文献标志码 A 文章编号 (2016) 抗 CD3 抗体可以上调 T 淋巴细胞白细胞介素 2 受体 (interleukine 2receptor,IL 2R) 表达, 诱导细胞增殖与活化 [1] 活化的 T 细胞能分泌 IL 1 IL 2 IL 6 IL 10 和 B 淋巴细胞刺激因子 (Blymphocytestim ulator,blysorbaff) 等多种细胞因子 [2] BAFF 及 APRIL 水平的异常与类风湿关节炎 (rheumatoidar thritis,ra) 等自身免疫病的发病密切相关 [3] BAFF 与 APRIL 有两个共同受体, 即跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子 (transmembraneacti vatororcalcium modulatingcyclophylinligand interac tor,taci) 和 BAFF 受体 (receptorforb celactiva tingfactor,baffr) 重组 TACI Ig 融合蛋白 (rhta CI Ig) 是 TACI 的胞外部分和人 IgG1 的 Fc 段链接而成, 能竞争性结合 BAFF 和 APRIL 该实验观察 rhtaci Ig 对抗 CD3 抗体活化的 T 淋巴细胞及其相关受体和细胞因子的调节作用, 并从 BAFFR 和 TACI 及其下游信号分子通路的角度, 进一步探讨 BAFF 影响 T 细胞的机制, 为 rhtaci Ig 控制 T 细胞增殖与活化提供实验依据 1 材料与方法 1.1 实验动物雄性 SPF 级 C57BL/6J 小鼠,7~8 周龄,(20±2)g, 购于上海实验动物研究中心 实验中涉及的小鼠实验方案均经安徽医科大学临床药理研究所动物伦理委员会批准 1.2 药物和试剂小鼠淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 ; 全 T 细胞分选试剂盒购于德国美天旎生物技术有限公司 ;DMEM 培养基购于美国 Gibco 公司 ; 氚标记的胸腺嘧啶核苷 (3H TdR) 购于中国科学院上海应用物理研究所 ; T 细胞培养上清液 IL 2 IL 4 干扰素 γ(interferon γ,ifn γ) 和转化生长因子 β(transforminggrowth factor β,tgf β) 水平 ELISA 试剂盒购于美国 R&D

2 920 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 公司 ; 兔抗 CD3 多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司 ;rhtnfr:fc 购于上海中信国健药业有限公司 ; 重组 TACI Ig 融合蛋白 ( 批号 : ) 和阴性对照 IgG Fc( 批号 : ) 由烟台荣昌生物制药有限公司提供 ; 流式抗体 CD69/PE CD154/ PE CD62L/PE CD4/FITC 购于美国 Biolgend 公司 ; 抗 BAFFR TACI IL 2R 一抗购于美国 SantaCruz 公司 ; 抗 NF κbp100/p52 和抗磷酸化 NF κbp100/ p52(s865) 一抗购于英国 Abcam 公司 ; 辣根酶标记的山羊抗兔 IgG 及山羊抗鼠 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ; 小干扰 RNA(smalinterfering RNA,siRNA) 购于上海吉玛制药技术有限公司 1.3 方法 小鼠脾脏 T 淋巴细胞的分离处死小鼠, 无菌剥离脾脏, 常规制备小鼠脾脏细胞悬液后用小鼠淋巴细胞分离液纯化, 分离得脾脏单个核细胞悬液后进行细胞计数 调节细胞浓度至每 40μl 含 10 7 个细胞 每 10 7 个细胞加入 10μl 非 T 细胞的生物素化抗体混合物, 轻轻震荡混合经 4 孵育后再按照每 10 7 个细胞加入 20μl 抗生物素微珠的比例, 轻轻震荡混合经 4 孵育后, 将细胞悬液在冲洗的 PBS 流净前加入处于磁场中的分离柱, 收集流出液, 再用 500μlPBS 冲洗 3 遍后得到未被磁性标记的 T 淋巴细胞 将得到的 T 淋巴细胞重新计数铺板培养 分组和给药将收集到的 T 淋巴细胞分为正常组 刺激组 rhtaci Ig 浓度组 ( μg/ml) IgG Fc(10μg/ml) 阴性对照组和重组人 Ⅱ 型肿瘤坏死因子受体 抗体融合蛋白 (tumour necrosisfactorfcfusionprotein,rhtnfr:fc)(10 μg/ml) 阳性对照组 除正常组外, 其余各组均用 anti CD3(10μg/ml) 刺激 T 淋巴细胞给药培养 72 h 后分别用于细胞增殖检测 细胞因子水平测定 细胞亚群检测以及受体和信号分子表达水平测定 T 淋巴细胞增殖检测在 96 孔培养板上, 每孔加入 100μl 纯化 T 淋巴细胞悬液 ( 终浓度为 /ml) 及 anti CD3( 终浓度为 10μg/ml), 同时每个孔加入不同浓度的 rhtaci Ig( 终浓度为 μg/ml) rhtnfr:fc( 终浓度为 10 μg/ml) 或 IgG Fc( 终浓度为 10μg/ml), 每孔的终容积为 200μl, 置 37 5%CO 2 培养箱培养 在收集细胞前 12h 时每孔加入 25μl 3 H TdR(10 5 Bq/ml) 后培养结束, 用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上, 用液闪仪测其放射性 T 淋巴细胞培养上清液中 IL 2 IFN γ IL 4 TGF β 水平检测在 24 孔培养板上, 每孔加入 500 μl 纯化 T 淋巴细胞悬液 ( /ml) 和 anti CD3 ( 终浓度为 10μg/ml), 同时每个孔加入不同浓度的 rhtaci Ig rhtnfr:fc 或 IgG Fc, 每孔的终容积为 1 ml 培养 72h 后离心 (3000r/min,10min), 取上清液, 采用 ELISA 法检测 IL 2 IFN γ IL 4 TGF β 水平 T 淋巴细胞亚群比例检测在 50ml 培养瓶中, 每瓶分别加入 个经纯化 T 淋巴细胞悬液和抗 CD3( 终浓度为 10μg/ml), 加入后最终的容积为 2ml, 加入不同浓度的 rhtaci Ig rhtnfr:fc 或 IgG Fc, 培养 72h 后, 收集细胞, 每管 300μl 细胞悬液 ( /ml), 分别加入 5μl 适当稀释的 CD154 PE/CD4 FITC 一抗 CD69 PE/CD4 FITC 一抗 CD62L PE/CD4 FITC 一抗,4 避光孵育 30min 后用流式细胞仪检测 T 淋巴细胞 BAFFR TACI IL 2R 磷酸化和总 NF κbp100/p52 检测将 6 孔板内给药处理后的 T 淋巴细胞转移至 2mlEP 管中, 离心 (3000r/ min,5min), 弃去培养液 每管加入 50μl 蛋白裂解液 (PMSF1 100), 充分混匀, 冰上静置裂解 30min 后, 在 -80 和 4 冰箱间反复冻融 3 次, 离心 (14 000r/min,15min), 小心吸取上清液即得总蛋白, 用 Westernblot 法检测 BAFFR TACI IL 2R 磷酸化和总 NF κbp100/p52 的表达 将提取的蛋白定量后加入上样缓冲液, 进行 SDS PAGE 电泳, 转移至 PVDF 膜后, 用封闭液封闭 2h, 洗脱缓冲液洗 3 次, 4 冰箱孵育一抗过夜 次日, 室温下复温 10min, 洗脱缓冲液洗 3 次,37 摇床孵育对应的二抗 2h, 洗脱缓冲液洗 3 次,ECL 试剂盒显色 用凝胶成像系统扫描结果, 以特异性条带的灰度值来反映蛋白表达水平 sirna 转染将分离的 T 淋巴细胞按 / 孔接种在 12 孔培养板中,1000r/min, 离心 10 min, 弃上清液 每管加入 100μlNucleofectorSolu tion 100nmol/LsiRNA, 使用细胞核转染仪进行电转 电转后, 立即补充培养液至 1 5ml, 培养 24h 后加 BAFF 继续作用 24h TACIsiRNA 序列为 5 CAGCGGAGTGGAGAAGTTGAA 3 ; BAFFR sirna 序列为 5 TGTGGAAAGGACGAAACACC 统计学处理应用 SPSS17 0 软件处理和分析数据, 结果以表示, 两组均数间差异比较用 t 检验, 多组均数间差异的比较采用 OneWayAnova 检验

3 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 921 图 1 rhtaci Ig 体外对抗 CD3 抗体诱导的 T 淋巴细胞增殖能力的影响 1: 正常组 ;2:anti CD310μg/ml;3:rhTACI Ig0 01μg/ml;4:rhTACI Ig0 1μg/ml;5:rhTACI Ig1μg/ml;6:rhTACI Ig10μg/ml;7:rhTACI Ig 100μg/ml;8:rhTNFR Fc10μg/ml;9:IgG Fc10μg/ml; 与正常组比较 : ## P<0 01; 与抗 CD3 刺激组比较 : P<0 05, P< 结果 2.1 抗 CD3 抗体诱导 T 淋巴细胞 BAFF 分泌和增殖及 rhtaci Ig 的作用抗 CD3 抗体不同浓度梯度和作用时间实验显示,10μg/ml 抗体刺激 T 淋巴细胞 72h 为体外刺激的亚适浓度和最适时间 抗 CD3 抗体 (10μg/ml) 刺激 72h,T 淋巴细胞分泌大量 BAFF 且增殖功能明显亢进 (F=2 869,P= ) rhtaci Ig( μg/ml) 和 rht NFR Fc(10μg/ml) 可明显抑制异常活化的 T 淋巴细胞增殖反应 (F=51 75,P<0 05,P<0 01) 见图 抗 CD3 抗体刺激对 T 淋巴细胞培养上清液中细胞因子水平的影响以及 rhtaci Ig 对其的影响 抗 CD3 抗体刺激可使 T 淋巴细胞培养上清液中 IL 2 IFN γ 和 TGF β 水平显著升高 (P<0 05,P< 0 01),IL 4 浓度升高但无显著性 rhtaci Ig( μg/ml) 可明显降低 IL 2(F=5 571,P< 0 01) 和 IFN γ(f=3 876,P<0 01) 水平 ; 降低 IL 4 (F=7 105,P<0 05) 和 TGF β(f=1 663,P< 0 05) 水平 RhTNFR:Fc 可以显著降低抗 CD3 抗体刺激后升高的 IL 2 IL 4 水平 (P<0 05), 但对 IFN γ 和 TGF β 无明显作用 ;IgG Fc 组对上述经抗 CD3 刺激后升高的细胞因子水平均无明显影响 见图 rhtaci Ig 对抗 CD3 抗体刺激的 T 淋巴细胞亚群比率的影响抗 CD3 抗体体外刺激 T 淋巴细胞, 可使 CD4 + CD69 + 和 CD4 + CD154 + 细胞比率显著升高 (P<0 01), 同时显著降低 CD4 + CD62L + 细胞比率 (P<0 01) rhtaci Ig( μg/ml) 可显著抑制被升高的 CD4 + CD69 + 细胞比率 (F= 14 19,P<0 05,P<0 01);rhTACI Ig( μg/ml) 可明显降低 CD4 + CD154 + 细胞比率 图 2 抗 CD3 抗体刺激对于 T 淋巴细胞培养上清液中细胞因子水平的影响以及 RhTACI Ig 对其的影响 1: 正常组 ;2:anti CD310μg/ml;3:rhTACI Ig0 01μg/ml;4: rhtaci Ig0 1μg/ml;5:rhTACI Ig1μg/ml;6:rhTACI Ig10μg/ml;7: rhtaci Ig100μg/ml;8:rhTNFR:Fc10μg/ml;9:IgG Fc10μg/ml; 与正常组比较 : # P<0 05, ## P<0 01; 与抗 CD3 抗体刺激组比较 : P <0 05, P<0 01 (F=19 31,P<0 05,P<0 01);rhTACI Ig( μg/ml) 可显著升高 CD4 + CD62L + 细胞比率 (F= 12 69,P<0 05);rhTNFR Fc 可以明显升高 CD4 + CD62L + 细胞比率 (P<0 05), 但对 CD4 + CD69 + 和 CD4 + CD154 + 无影响 ;IgG Fc 组对上述细胞亚群比率均无影响 ( 图 3) 2.4 RhTACI Ig 对 T 淋巴细胞 BAFFR TACI IL 2R 表达和 NF κbp100/p52 蛋白表达情况活性的影响纯化培养 T 细胞, 抗 CD3 抗体体外刺激可显著升高 T 淋巴细胞 TACI BAFFR IL 2R 的表达 ;

4 ９２２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ｔ ａｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓａｎ ｈ ｕ ｉ２ ０ １ ６Ｊ ｕ ｌ ５ １ ７ 图 ３ ＲｈＴＡＣＩ Ｉ ｇ对抗 ＣＤ３抗体刺激的 Ｔ淋巴细胞亚群比率的影响 １ 正常组 ２ ａ ｎ ｔ ｉ ＣＤ３１ ０μｇ ｍｌ ３ ｒ ｈ ＴＡＣＩ Ｉ ｇ０ ０ １μｇ ４ ｒ ｈｔａｃｉ Ｉ ｇ０ １μｇ ｍｌ ５ ｒ ｈ ＴＡＣＩ Ｉ ｇ１μｇ ｍｌ ６ ｒ ｈ ＴＡ ｍｌ ＣＩ Ｉ ｇ１０μｇ ｍｌ ７ ｒ ｈ ＴＡＣＩ Ｉ ｇ１ ０ ０μｇ ｍｌ ８ ｒ ｈ ＴＮＦＲ Ｆｃ１ ０ ｍｌ ９ Ｉ ｇ Ｇ Ｆｃ１０μｇ ｍｌ Ａ ＣＤ４ＣＤ６ ９ Ｂ ＣＤ４ＣＤ１ ５４ Ｃ μｇ ＣＤ４ＣＤ６ ２Ｌ 与正常组比较 Ｐ ０ ０ ５ Ｐ ０ ０ １ 与抗 ＣＤ３ 抗体刺激组比较 Ｐ ０ ０５ Ｐ ０ ０ １

5 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 923 rhtaci Ig(1 10μg/ml) 体外给药对异常升高的 TACI(F=562 3,P<0 01) BAFFR(F=1032,P< 0 01) IL 2R(F=9 126,P<0 05) 水平有抑制作用, 提示 rhtaci Ig 抑制 BAFF 受体信号通路, 并阻止 T 细胞活化 抗 CD3 抗体可促进 T 细胞 NF κb p100/p52865 位点丝氨酸磷酸化活化, 不改变总 NF κbp100/p52 水平 ;rhtaci Ig(1 10μg/ml) 阻止了抗 CD3 抗体诱导的 NF κbp100/p52 磷酸化 (F= 20 60,P<0 05) 见图 4 TACIsiRNA 分别转染入分离纯化的小鼠 T 淋巴细胞内, 转染 48h 后用 Westernblot 法检测转染效率, 筛选最佳 sirna 序列 实验表明 BAFFRsiRNA 的最高沉默率为 58 3%(F=64 05),TACIsiRNA 的最高沉默率为 63 4% (F=41 35)( 图 5) 沉默 BAFFR 后, 抗 CD3 抗体虽然仍能刺激 T 细胞轻度增殖, 但增殖程度显著低于对照组 (F=51 49,P< 0 01); 沉默 TACI 也对抗 CD3 抗体诱导的 T 细胞增殖有抑制作用 (F=57 63,P<0 001)( 图 6), 提示抗 CD3 抗体体外促进 T 细胞增殖和活化的作用部分通过分泌 BAFF, 激活 BAFFR 和 TACI 受体及下游信号通路来实现 图 5 沉默 BAFFR 或 TACI 对抗 CD3 抗体受体表达水平的影响 1: 阴性对照 ;2:siRNA 沉默 24h;3:siRNA 沉默 48h;4:siRNA 沉默 72h; 与阴性对照比较 : # P<0 05, ## P<0 01 图 4 RhTACI Ig 对 T 淋巴细胞 BAFFR TACI IL 2R 表达和 NF κb 活性的影响 1: 正常组 ;2:anti CD310μg/ml;3:rhTACI Ig0 1μg/ml;4: rhtaci Ig1μg/ml;5:rhTACI Ig10μg/ml; 与正常组比较 : # P<0 05, ## P<0 01; 与抗 CD3 抗体刺激组比较 : P<0 05, P< T 淋巴细胞 BAFFR 或 TACI 受体对抗 CD3 抗体诱导细胞增殖的影响用电转法将 BAFFR 或 图 6 沉默 BAFFR 或 TACI 对抗 CD3 抗体诱导 T 淋巴细胞增殖的影响 1: 阴性对照 ;2: 阴性对照 +anti CD310μg/ml;3:SiRNA;4:SiR NA+anti CD310μg/ml; 与阴性对照比较 : ## P<0 01; 与阴性对照 + anti CD3 组比较 : P<0 01; 与 SiRNA 组比较 : && P<0 01

6 924 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 3 讨论 免疫调节的异常在自身免疫病的发病机制中起着关键作用, 涉及到多种免疫性细胞, 其中 T 淋巴细胞的异常增殖与活化在自身免疫性疾病的发生发展及病理损伤起着重要的作用 [4] CD3 分子作为分布于所有 T 淋巴细胞膜上的重要分化抗原, 是 T 淋巴细胞共有的分子表面标志物 当 CD3 与 T 淋巴细胞上的 T 淋巴细胞受体 (TCR) 特异性识别结合后,CD3 通过 TCR CD3 复合体将信号转导到 T 淋巴细胞胞质内, 在诱导 T 淋巴细胞活化过程中起着关键的作用, 从而促进 T 淋巴细胞的增殖以及各种细胞因子的分泌 [5] 因此, 抗 CD3 抗体能够模拟抗原与 TCR 结合, 向 T 淋巴细胞传递有效的信号模拟 CD3 与 TCR 结合后产生的效应 静息 T 细胞不表达 IL 2R, 一旦被活化,T 细胞分泌大量 IL 2 并迅速表达 IL 2R [6] 本实验显示, 抗 CD3 抗体促进 T 淋巴细胞高表达 IL 2R, 活化 NF κbp100/p52, 产生大量 BAFF, 进一步促进 T 细胞的增殖活化 抑制 BAFF 受体 BAFFR 或 TACI 表达可减弱抗 CD3 抗体对 T 细胞的刺激作用, 提示 BAFF 通路是除 TCR 信号外, 抗 CD3 抗体活化 T 细胞的重要通路之一 目前, 在 B 淋巴细胞中作为 BAFF 的竞争性拮抗剂 rhtaci Ig 对其作用以及相关的作用机制的研 [7] 究已较深入, 但在 T 淋巴细胞中 rhtaci Ig 的影响及相关作用机制尚未清楚 然而在 RA SLE 等自身免疫病中,CD4 + T 淋巴细胞对于炎症免疫反应的诱发和持续起重要作用 CD4 + T 细胞被自身抗原或细胞因子刺激活化后, 分化为不同的功能亚群, 如 Th1 Th2 细胞或调节性 T 细胞 这些 CD4 + T 细胞通过与其他免疫细胞的相互作用, 形成复杂的功能网络, 释放 Th1(IL 2 IFN γ) Th2(IL 4) Treg(TGF β) 型细胞因子 [8] 本实验表明, 经抗 CD3 抗体刺激的 T 淋巴细胞上清中上述细胞因子均出现了不同程度的升高, 而在 rhtaci Ig 体外用药时发现其能不同程度地降低其水平 CD62L 表达于初始 T 淋巴细胞, 在相关特异性细胞因子或趋化因子激活淋巴细胞后, 可使其细胞表面 CD62L 表达迅速下调 [9] CD69 在 T 淋巴细胞活化后很短时间即可表达并迅速达到高峰, 也是最早表达的分子表面标志, 其作为细胞共刺激信号可进一步增强 T 淋巴细胞的活化或增殖分化 [10] CD154(CD40L) 与 B 淋巴细胞表面的 CD40 结合, CD154 与 CD40 这对共刺激分子在 B 淋巴细胞中产 生关键的作用, 可以活化 B 淋巴细胞 刺激抗体产生以及免疫球蛋白类型转换等, 同时, 对于 T 淋巴细胞活化与增殖及调节其所分泌的细胞因子等过程中也起重要的作用 未活化 Th 细胞 (CD4 + CD62L + ) 表达活化诱导分子 Th 细胞 (CD4 + /CD69 +) 和表达 CD40L 的 Th 细胞 (CD4 + /CD154 + ) 比例及其所分泌的细胞因子在 RA SLE 等自身免疫疾病的发病机制中起着关键作用, 其比例变化可反映机体的免疫功能状态及药物的作用疗效 [11] RhTACI Ig 可调节 T 细胞表面活化标志分子的表达 TACI 和 BAFFR 与肿瘤坏死因子受体相关因子 (TNFreceptor asociatedfactor,traf) 偶联, 活化核因子 κb(nuclearfactor κb,nf κb)p52, 降解促凋亡蛋白 Bim, 介导细胞活化 [12] RhTACI Ig 作为一种诱骗受体, 可作为竞争性拮抗剂结合 BAFF 和 A PRIL, 阻止它们与其表达在细胞上的相应受体结合, 从而阻断其下游信号通路, 减少炎性免疫细胞因子的产生 [13] 在一些自身免疫病的报道中, 使用 rhtaci Ig 后病情可以得到一定的缓解, 体内的血清中免疫球蛋白和自身抗体水平快速降低, 并且能使病人体内表达水平升高的 BAFF/APRIL 同源三聚体及异源三聚体降低 [14-15] 本研究显示,rhTACI Ig 可以通过中和抗 CD3 抗体刺激 T 细胞产生的 BAFF, 抑制 BAFF 受体信号和 NF κb 活性, 减少 T 细胞表达 IL 2R, 阻止 T 细胞增殖, 显著抑制 Th1 型细胞因子产生, 明显降低活化 Th 细胞 (CD4 + / CD69 + 和 CD4 + /CD154 + ) 比例, 升高未活化 T 细胞 (CD4 + CD62L + ) 比例 综上,rhTACI Ig 对治疗 T 细胞反应依赖的自身免疫病有良好前景 参考文献 [1] HirschR,GresRE,PluznikDH,etal.Efectsofinvivoad ministrationofanti CD3monoclonalantibodyonTcelfunctionin mice. I.InvivoactivationofTcels[J].JImmunol,1989,142 (3): [2] BoymanO,KoliosAG,RaeberM E.ModulationofTcelre sponsesbyil 2andIL 2complexes[J].ClinExpRheumatol, 2015,33(4Suppl92):54-7. [3] WeiF,ChangY,WeiW.TheroleofBAFFintheprogresionof rheumatoidarthritis[j].cytokine,2015,76(2): [4] BurmesterGR,FeistE,D rnert.emergingcelandcytokine targetsinrheumatoidarthritis[j].natrevrheumatol,2014,10 (2): [5] MasopustD,SchenkelJM.TheintegrationofTcelmigration, diferentiationandfunction[j].natrevimmunol,2013,13 (5):

7 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 925 [6] Ruiz MedinaBE,RosJA,KirkenRA.Interleukin 2receptor βthr 450phosphorylationisapositiveregulatorforreceptorcom plexstabilityandactivationofsignalingmolecules[j].jbiol Chem,2015,290(34): [7] WadaK,MaedaK,TajimaK,etal.ExpresionofBAFF Rand TACIinreactivelymphoidtisuesandB cellymphomas[j]. Histopathology,2009,54(2): [8] ChenL,FliesDB.MolecularmechanismsofTcelco stimulation andco inhibition[j].natrevimmunol,2013,13(4): [9] IvanovaI,SeledtsovaG,MamaevS,etal.Immuneresponsesin ducedbyt celvaccinationinpatientswithrheumatoidarthritis [J].HumVaccinImmunother,2014,10(5): [10]SchoenbergerSP.CD69guidesCD4 + Tcelstotheseatofmemo ry[j].procnatlacadsciusa,2012,109(22): [11] 吴华勋, 陈镜宇, 汪庆童, 等. 重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白体外对佐剂性关节炎大鼠淋巴细胞功能的影响 [J]. 安 徽医科大学学报,2012,47(11): [12] StohlW.TherapeutictargetingoftheBAFF/APRILaxisinsys temiclupuserythematosus[j].expertopinthertargets,2014, 18(4): [13]WangQT,MaYK,WeiW,etal.EfectofrhTACI Igfusion proteinonantigen specifictcelresponsesfrom keyholelimpet haemocyaninchalengedmice[j].molimmunol,2011,49(1 2): [14] ZhangL,LiP,WeiW,etal.ComparativeeficacyofTACI Ig withtnf alphainhibitorandmethotrexateindba/1micewith colagen inducedarthritis[j].eurjpharmacol,2013,708(1 3): [15]YangZ,FujiH,MohanSV.Phosphofructokinasedeficiencyim pairsatpgeneration,autophagy,andredoxbalanceinrheumatoid arthritistcels[j].natrevrheumatol,2013,210(10): InhibitoryefectofrhTACI Igonanti CD3antibodyinduced Tlymphocytesproliferationandactivation YangSimin,WangQingtong,LiuKangkang,etal (InstituteofClinicalPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofAnti inflammatoryand ImmuneMedicineofEducationMinistryofChina,ColaborativeInnovationCenterofAnti inflammatory andimmunemedicine,hefei ) Abstract Objective Toinvestigatethemolecularmechanismofanti CD3antibodyinducedTlymphocytesprolif erationandactivationandobservetheefectofrecombinationhumantaci Ig(rhTACI Ig).Methods Tlympho cyteswerepurifiedfromthespleensofmicebyimmunomagneticbeadsandtreatedwithanti CD3antibodywithor withoutdiferentconcentrationsofrhtaci Ig,recombinanthumantumornecrosisfactor αreceptori:iggfc(rht NFR:Fc)orIgGFc.TheproliferationofTlymphocyteswasdeterminedby[ 3 H] TdRincorporation,thepercenta gesoftlymphocytessubsetsweretestedbyflowcytometry.westernblotwasappliedtoevaluatetheexpresionofb celactivatingfactorreceptor(baffr),transmembraneactivatororcalcium modulatingcyclophylinligand interac tor(taci),il 2receptor(IL 2R)andthephosphorylationofNF κb.smalinterferingrnaswereusedtoblock BAFFRorTACIexpresion.Results Anti CD3obviouslyinducedtheactivationofTlymphocytes,upregulated BAFF,interleukin 2(IL 2),interferon γ(ifn γ)andtransforminggrowthfactor β(tgf β)secretion,promoted BAFFR,TACIandIL 2Rexpresion,activatedNF κb(p<0 05).TheadministrationofrhTACI Ig(0 1,1, 10,100μg/ml)inhibitedtheproliferationofTlymphocytesinducedbyanti CD3antibody(P<0 05).RhTACI Ig(1,10,100μg/ml)significantlydecreasedtheproductionofcytokines(P<0 05,P<0 01),markedlydown regulatedthepercentageofcd4 + CD69 + andcd4 + CD154 + Tlymphocytes,elevatedtheproportionofCD4 + CD62L + Tlymphocytes(P<0 05,P<0 01).Meanwhile,rhTACI Ig(10,100μg/ml)treatmentdecreasedthe levelofbaffr,taci,il 2onTlymphocytes,aswelasatenuatedtheactivationofNF κb(p<0 05).Deple tionofbaffrortacimarkedlyblockedanti CD3antibodydependentTcelproliferation(P<0 05,P<0 01). Conclusion Anti CD3antibodypromotesTlymphocytesactivationpartialythroughBAFFproductionandBAFF receptorssignaling.rhtaci IgneutralizesBAFF,inhibitsBAFFsignalingandthereforeatenuatesTlymphocytes activation. Keywords B celactivatingfactor;recombinationhumantaci Ig;Tlymphocytes;immunologicaltherapy;au toimmunediseases

8 926 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 网络出版时间 : :52:31 网络出版地址 :htp:// survivin 启动子调控肿瘤干细胞标记 CD133 基因 sirna 增殖型溶瘤腺病毒的构建及对肝癌细胞生长的抑制作用 牛坚 1, 王月 1, 刘斌 1, 王人颢 1, 朱志军 2 3, 申海莲 摘要目的构建 survivin 启动子调控的靶向 CD133 基因的 sirna 增殖型溶瘤腺病毒, 研究其对肝癌细胞生长的影响 方法 RT PCR 法扩增 survivin 启动子, 测序鉴定, 双酶切连接, 获得 ph XC2 survivin 酶切 ph XC2 survivin pzd55 CD133 sirna 获得 survivin 启动子表达框的亚克隆和 CD133 sirna 基因表达框的亚克隆, 连接获得 survivin 启动子调控的 sirna 增殖型溶瘤腺病毒表达载体质粒 pt ZD55 CD133 sirna 增殖型溶瘤腺病毒 survivin T ZD55 CD133 sirna 经 PCR 和测序鉴定 qrt PCR 法检测 CD133 表达, Westernblot 法检测 E1A,CCK 8 法检测细胞生长, 流式细胞术检测细胞凋亡 结果成功构建增殖型溶瘤腺病毒 sur vivin T ZD55 CD133 sirna qrt PCR 法检测 CD133mRNA 明显下降,Westernblot 证实 survivin T ZD55 CD133 sirna 在肿瘤细胞中表达 E1A 能抑制肝癌细胞 CD133 表达及生长 结论构建的增殖型溶瘤腺病毒可有效降低肝癌细胞 CD133 的表达, 用于肝癌基因治疗的进一步研究 主题词 肝癌 ; 干细胞 ;CD133; 细胞增殖 ; 基因表达 中图分类号 R349.5 文献标志码 A 文章编号 (2016) 肿瘤干细胞是指存在于肿瘤组织中的数量很少但有干细胞性质的细胞群体 [1-2], 在肿瘤的发生 发展中起重要作用, 同时也在肿瘤耐药性 复发及转移的发生中发挥关键作用 [3] CD133 是肝癌干细胞表面特征性的标志物 [4] 靶向性是肿瘤基因治疗的关键环节 实现靶向性的手段之一就是利用特异性的基因表达调控序列使治疗基因序列在肿瘤细胞中特异表达 survivin 基因的特点是在多种肿瘤细胞中表达水平高, 但是在相应的正常组织少有表达 [5] 据此可以利用 survivin 基因的启动子在肿瘤 接收基金项目 : 天晴甘美基金项目资助 ( 编号 :CFHPC ); 江苏省 333 人才项目 ( 编号 :Ⅲ 2290); 徐州市重大科研项目 ( 编号 :KC14SX011) 作者单位 : 1 徐州医学院附属医院肝脏病研究中心, 徐州 作者简介 : 牛 2 北京友谊医院肝胆外科, 北京 上海交通大学附属同济医院干细胞研究中心, 上海 坚, 男, 副教授, 责任作者,E mail:njnj_001@163.com 细胞表达的特异性而作为肿瘤基因治疗的新的靶向性调控序列 该研究通过构建 survivin 基因启动子调控的针对 CD133 的 sirna 增殖型溶瘤腺病毒, 探讨该增殖型溶瘤腺病毒对人肝癌细胞系 Hep3B 的生物学行为影响, 探索肝癌基因治疗的新的方法 1 材料与方法 1.1 材料 293T 细胞 ph XC2 pzd55 pzd55 EG FP pzd55 CD133 sirna 由上海交通大学附属仁济医院干细胞研究中心惠赠 ; 人肝癌细胞系 Hep3B ( 缺乏正常 p53 活性 ) 由徐州医学院附属医院肝病研究中心保存 ;E1A E1B 一抗购自美国 SantaCruz 公司 ;CCK 8 试剂盒购自日本 DOJINDO 公司 1.2 survivin 启动子的 RT PCR 扩增及鉴定根据 survivin 启动子序列设计一对引物, 上游引物 :5 ACGTTACGTACGCGTTCTTTGAAAGCAGTC 3, 下游引物 :5 TATACTCGAGCCAGGCAGGGGGCAACGT 3 ; 以上引物分别含有 SnaBⅠ 和 XhoⅠ 限制性酶切位点 以 HeLa 细胞的基因组 DNA 为模板,RT PCR 扩增 survivin 启动子 PCR 产物回收纯化同时测序分析 1.3 穿梭质粒 ph XC2 survivin 的构建 survivin 启动子 PCR 扩增产物以 SnaBⅠ 和 XhoⅠ 分别双酶切, 连接至同样双酶切的 ph XC2(E1A 区缺少启动子的增殖型溶瘤腺病毒质粒 ) 中, 转化大肠杆菌, 扩增, 用转 EcoRⅠ 和 BamH Ⅰ 双酶切鉴定, 测序, 提取质粒名为 ph XC2 survivin 1.4 穿梭质粒 survivin pt ZD55 CD133 sirna 的构建 EcoRV ClaⅠ 酶切 ph XC2 survivin 获得包含 survivin 启动子表达框的亚克隆 ;EcoRV ClaⅠ 酶切 pzd55 CD133 sirna 获得包含 CD133 sirna 基因表达框的亚克隆 ; 上述 2 个亚克隆进行连接, 获得 survivin pt ZD55 CD133 sirna 1.5 病毒的包装 鉴定将质粒 survivin pt ZD55 CD133 sirna pzd55 EGFP 分别与腺病毒右臂质粒 pbhge3, 通过 Lipofectamin2000 共转染 293T 细胞, 经过病毒空斑纯化, 包装成完整病毒颗粒 提取重

9 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 927 组病毒 DNA, 测序鉴定正确者, 即为目的病毒 sur vivin ZD55 CD133 sirna ZD55 EGFP 1.6 survivin ZD55 CD133 sirna 的 PCR 鉴定病毒感染细胞, 待细胞病变后, 收集细胞上清液, 抽提病毒 DNA RT PCR 检测重组腺病毒是否插入目的基因, 上游引物 :5 TCGTTTACTGAACCGT CAGATC 3, 下游引物 :5 ACACGGTCTCGTAGGT CAAG 3, 反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析 1.7 病毒滴度的测定病毒滴度的测定参考文献 [6] 1.8 细胞培养及分组细胞用含 10% 的小牛血清 DMEM 常规培养, 实验所用细胞均处在对数生长期 根据实验要求分为 :1 Blank 组 :Hep3B;2 shnc 组 :Hep3B ZD55 EGFP;3 shcd133 组 :Hep3B survivin ZD55 CD133 sirna 1.9 荧光定量 PCR 检测 CD133 在 mrna 水平的变化将 Hep3B 细胞低密度铺于 6 孔板,1d 后用感染复数 (multiplicityofinfection,moi)=10 的 sur vivin pt ZD55 CD133 sirna 感染细胞,48h 后 TR Izol 法提取各组细胞的总 RNA, 按反转录试剂盒说明进行反转录 引物序列为上游引物 :5 TGCT CAGAACTTCATCACAAACAAT 3, 下游引物 : 5 TAGGACAATACTGTTCGGGTAGTGT 3 ; 内参 β actin 上游引物 :5 GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT 3, 下游引物 :5 CAGTGTACAGGTAAGCCCTG 3 qrt PCR 循环参数 : 第一步 95 预变性 30s,1 个循环 ; 第二步 95 5s,60 30s,40 个循环 ; 第三步 : 熔解曲线 95 15s,60 1min,95 15s 数值分析采用最大二阶导数法 (2 -ΔΔCt ) 分析 1.10 Westernblot 法检测 E1A E1B 蛋白表达将 Hep3B 细胞低密度铺于 6 孔板,24h 后用 MOI= 10.0 的 survivin ZD55 CD133 sirna 感染细胞,48h 后提取蛋白和蛋白缓冲液混合, 煮沸后上检测蛋白样品, 进行 SDS PAGE 电泳 电泳停止后, 电转移法将细胞蛋白分离到 PVDF 膜上 一抗 (1 1000), 二抗 (1 5000) 室温孵育后,PVDF 膜用 ECL 发光检测盒反应并在暗室显影 1.11 survivin ZD55 CD133 sirna 对 Hep3B 细胞增殖的影响具体操作参照 CelCountingKit 8 试剂盒操作说明 在酶联免疫测试仪上测定各样品吸光度 (opticaldensity,od) 值绘制生长曲线, 计算各组实验对象 1 周的扩增情况 每孔设 3 个复孔 1.12 细胞凋亡检测转染 24h 后, 收集 Blank 组 shnc 组和 shcd133 组细胞后加入 20ng/ml 表皮生 长因子 (EGF) 及 10ng/ml 成纤维细胞生长因子 (bfgf) 的无血清 DMEM 培养液, 培养 96h 后, 用 AnnexinV/FITC 和 PI 染色, 样品用流式细胞仪分析检测细胞凋亡情况 1.13 统计学处理采用 SAS6 12 软件进行方差和 t 检验分析, 数据以 x±s 珋表示 2 结果 2.1 survivin 启动子有效片段 PCR 扩增以 HeLa 细胞 DNA 为模板,PCR 扩增 survivin 启动子有效片段, 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳, 得到约 298bp 大小的 DNA 片段, 见图 1 经测序验证正确 图 1 survivin 启动子片段 PCR 电泳图 M:DNAMarker;1:PCR 产物 2.2 survivin ZD55 CD133 sirna 鉴定和滴度测定用 survivin ZD55 CD133 sirna 病毒 DNA 作为 PCR 反应模板, 产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 可观察到在约 500bp 的位置有一条带, 与作为阳性对照的 pt ZD55 CD133 sirna 相同, 与作为阴性对照的 pzd55, 在约 436bp 的位置有一条带, 表明 survivin ZD55 CD133 sirna 含有干扰序列 见图 2 图 2 增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna 鉴定 M:DNA Marker;1:survivin ZD55 CD133 sirna;2:pt ZD55 CD133 sirna;3:pzd Westernblot 法检测结果 E1A 基因保留了病毒在肿瘤细胞中的复制能力 剔除了 E1B(55 ku) 基因, 使病毒不能在正常细胞内复制 这两个方面都需要验证 结果表明, 增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna ZD55 EGFP 感染 Hep3B 细胞 48h 后, 可以检测到 E1A 的表达, 而 Hep3B 组没有 E1A 的表达 同时实验显示 3 组无 E1B 的表达 见图 3

10 928 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 图 3 Westernblot 法检测 Hep3B 感染增殖型溶瘤腺病毒后 E1A 蛋白的表达 1:survivin ZD55 CD133 sirna;2:zd55 EGFP;3:Hep3B 2.4 qrt PCR 检测结果各组重组增殖型溶瘤腺病毒颗粒转染人肝癌细胞 Hep3B 后,qRT PCR 结果显示 : 以 Blank 组表达量为 1,shCD133 组相对 Blank 组的 CD133 表达量的平均值为 0 18±0 04, CD133 的相对表达量下调了 80%,shNC 组相对 Blank 组表达量的平均值为 0 96±0 06 shcd133 组相对 Blank 组有显著的敲减作用 (F=25 9,P< 0 05),Blank 组和 shnc 组表达量差异无统计学意义 2.5 增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna 对 Hep3B 细胞增殖的影响 shcd133 组 Blank 组和 shnc 组细胞生长曲线显示 shcd133 组细胞生长明显减慢 (P<0 05) 见图 4 图 4 shcd133 组 Blank 组和 shnc 组生长曲线与 shcd133 组比较 : P< 增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna 对 Hep3B 细胞凋亡的影响为了探讨增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna 对肝癌细胞的增殖抑制作用是否依赖细胞凋亡性死亡, 本研究采用 AnnexinV/PI 染色分析细胞凋亡情况 结果表明, 与 Blank 组 (25 3%,F=36 9,P<0 05) shnc(24 3%,F=46 9,P<0 05) 比较,shCD133 组细胞阳性凋亡比例 (41 3%) 显著增加 ( 图 5) 3 讨论 肿瘤的发生 发展 转移及复发的关键是由那些能自我更新 无限增殖及多向分化潜能的干细胞亦即肿瘤干细胞引起的 肿瘤干细胞在很多实体瘤中普遍存在 [7-8] CD133 是一个 5 次跨膜糖蛋白, 表达在未分化细胞和肿瘤细胞, 是最重要的肿瘤干细胞标志物 CD133 分子在胰腺癌 [9-10] [11] 肝细胞肝癌及结直 [12] 肠癌等肿瘤组织中有明显表达, 通过对肿瘤细胞膜突起的改变而影响细胞的极性 迁移及与相邻细胞的作用 [13] 本实验通过构建增殖型溶瘤腺病毒 survivin ZD55 CD133 sirna 沉默 CD133 基因, 为 CD133 基因的功能研究提供有效手段 肿瘤基因治疗的难点是将治疗基因特异且高效的导入癌细胞中, 同时实现在肿瘤细胞中高表达, 这就要求构建高靶向性的载体, 这也是肿瘤基因治疗中被高度关注的领域 [14] 近年增殖型溶瘤腺病毒成为研究的热点之一, 以其为基础构建肿瘤基因治疗的载体, 优点是可以充分利用腺病毒颗粒较小 扩散能力快的特点, 与此同时大量扩增的病毒可以直接分解被感染的肿瘤细胞, 还能感染附近的肿瘤细胞 增殖型溶瘤腺病毒载体一方面在肿瘤细胞内特异性扩增, 另一方面还能将嵌合的外源基因的表达量放大成千上万倍, 这极大增加了肿瘤的治疗效 图 5 AnnexinV/PI 检测 survivin ZD55 CD133 sirna 对 Hep3B 细胞凋亡影响 A:Blank 组 ;B:shNC 组 ;C:shCD133 组

11 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 929 果, 现已有利用增殖型腺病毒治疗肿瘤的实验报道 [15] 本实验显示增殖型溶瘤腺病 ZD55 EGFP 对 Hep3B 细胞的生长有明显抑制作用 治疗基因进入细胞, 在细胞内高效 特异的表达, 是需要解决的重要问题, 而利用肿瘤细胞的特异性启动子控制治疗基因表达, 是实现肿瘤基因治疗的重要手段 本研究成功构建 survivin 启动子替换表达 CD133 sirna 的增殖型腺病毒 ZD55 CD133 sirna 的 E1A 启动子, 经 PCR 测序鉴定证实 survivin 启动子调控靶向 CD133 基因 sirna 增殖型腺病毒 sur vivin ZD55 CD133 sirna 构建成功 对肝癌 Hep3B 细胞进行体外研究表明构建的靶向 CD133 基因 sirna 增殖型腺病毒对 Hep3B 细胞的生长有明显抑制作用, 较对照组更易诱导细胞凋亡 本研究所改造的增殖型腺病毒表达载体在基础研究和应用研究中都有重要的作用 参考文献 [1] HuM,XiangFX,HeYF.Arecancerstemcelsthesolesource oftumor[j].jhuazhongunivscitechnologmedsci,2014,34 (5): [2] MichishitaM,EzakiS,OgiharaK,etal.Identificationoftumor initiatingcelsinacaninehepatocelularcarcinomacelline[j]. ResVetSci,2014,96(2): [3] HaoPP,LeeM J,YuGR,etal.IsolationofEpCAM(+)/ CD133(-)hepaticprogenitorcels[J].MolCels,2013,36 (5): [4] RomanoM,DeFrancescoF,PiroziG,etal.Expresionofcanc erstemcelbiomarkersasatoolforacorecttherapeuticapproach tohepatocelularcarcinoma[j].oncoscience,2015,2(5): [5] LiZL,UekiK,KumagaiK,etal.Regulationofbcl 2transcrip tionbyestrogenreceptor alphaandc Juninhumanendometrium [J].MedMolMorphol,2014,47(1): [6] SasoneF,MarguletsV,MaraschiA,etal.Bcl 2/adenovirus E1B19 kdainteractingprotein(bnip3)hasakeyroleinthemi tochondrialdysfunctioninducedbymutanthuntingtin[j].hum MolGenet,2015,24(22): [7] LiaoW T,YeYP,DengYJ,etal.Metastaticcancerstemcels: fromtheconcepttotherapeutics[j].am JStem Cels,2014,3 (2): [8] MertinsSD.Cancerstem cels:asystemsbiologyviewoftheir roleinprognosisandtherapy[j].anticancerdrugs,2014,25 (4): [9] TanaseCP,NeaguAI,NeculaLG,etal.Cancerstemcels: involvementinpancreaticcancerpathogenesisandperspectiveson cancertherapeutics[j].worldjgastroenterol,2014,20(31): [10] TangSC,ChenY C.Noveltherapeutictargetsforpancreatic cancer[j].worldjgastroenterol,2014,20(31): [11] TuT,BudzinskaMA,MaczurekAE,etal.Novelaspectsofthe livermicroenvironmentinhepatocelularcarcinomapathogenesis anddevelopment[j].intjmolsci,2014,15(6): [12] RenF,ShengW Q,DuX.CD133:acancerstemcelsmarker, isusedincolorectalcancers[j].worldjgastroenterol,2013,19 (17): [13]GaedickeS,BraunF,PrasadS,etal.Noninvasivepositronemis siontomographyandfluorescenceimagingofcd133 + tumorstem cels[j].procnatlacadsciusa,2014,111(6): [14] 赵明, 范楚玲, 郭强, 等.RunX2 的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响 [J]. 安徽医科大学学报, 2015,50(11): [15]JianW,ZhongL,WenJ,etal.SEPTIN2andSTATHMINregu latecd99 mediatedcelulardiferentiationinhodgkin slymphoma [J].PLoSOne,2015,10(5):e Constructionandidentificationofreplication competentadenovirus expresingsirnatargetingcd133generegulatedbysurvivin promoteranditsinhibitionoflivercancercelgrowth NiuJian,WangYue,LiuBin,etal (LiverDiseaseResearchCenter,TheAfiliatedHospitalofXuzhouMedicalColege,Xuzhou ) Abstract Objective Toconstructareplication competentadenovirusexpresingsirna targetingcd133gene regulatedbysurvivinpromoterandinvestigateitsinhibitoryefectonhep3bcels.methods Thefragmentofthe survivinpromoterwasamplifiedbypcrandinsertedintoph XC2toreconstructarecombinantplasmidpH XC2 survivin.completedigestionph XC2 survivinandpzd55 CD133 sirna,combinationaljoiningthesubclones, thengetingreplication competentadenovirusexpresingshortinterferencernatargetingcd133generegulatedby

12 930 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 网络出版时间 : :52:31 网络出版地址 :htp:// 沉默 Ska2 基因对人胶质瘤细胞增殖的影响 贺小军, 马春春, 卞尔保, 王洪亮, 宗钢, 赵兵 摘要目的采用 sirna 沉默 Ska2 基因, 探讨其对人胶质瘤细胞生长的影响及其潜在的分子机制 方法对照组人胶质瘤细胞予以 sirna 阴性序列转染, 实验组予以 sirna Ska2 序列转染 每组细胞转染 48h 后应用实时荧光定量聚合酶链式反应 (qrt PCR) 分析 Ska2mRNA 表达情况 Westernblot 法分析 Ska2 PCNA 和 CyclinD1 蛋白表达情况, MTT 法及细胞克隆实验分析 Ska2 对 A172 细胞增殖及克隆形成能力的影响 结果 qrt PCR 结果显示实验组 Ska2 mrna 表达较对照组显著减少 (P<0 01),Westernblot 结果显示实验组 Ska2 PCNA 和 CyclinD1 蛋白表达水平亦较对照组显著降低 (P<0 01),MTT 实验显示实验组中活细胞数明显低于对照组 (P<0 05); 细胞克隆法显示实验组细胞的增殖克隆形成能力明显低于对照组 (P<0 01) 结论沉默 Ska2 基因 减少人胶质瘤细胞 Ska2 基因的表达能够抑制胶质瘤细胞的增殖 关键词 Ska2; 胶质瘤 ; 细胞增殖中图分类号 R 文献标志码 A 文章编号 (2016) 纺锤体与动粒相关复合物 (spindleandkineto 接收基金项目 : 国家自然科学基金青年基金 ( 编号 : ); 安徽省自然科学基金项目 ( 编号 : MH194) 作者单位 : 安徽医科大学第二附属医院神经外科, 合肥 作者简介 : 贺小军, 男, 硕士研究生 ; 赵兵, 男, 副教授, 主任医师, 硕士生导师, 责任作者,E mail:zhaopumcmd@yeah.net choreasociatedcomplex,ska) 包括 Ska1 Ska2 和 Ska3 [1] Hanischetal [2] 发现了 Ska1, 并通过酵母双杂交技术进一步筛选得到一个新的能够与 Ska1 结合的蛋白即 FAM33A, 将其重新命名为 Ska2 近年,Ska 家族的第 3 个成员 Ska3 也几乎同时被发现并报道 [3] Ska2 是一个最近鉴定的参与细胞周期调控与肿瘤发生发展的新基因 [2,4] Ska2 在细胞周期中的作用, 目前认为该基因可通过与 Ska1 Ska3 形成 Ska 复合体, 维持有丝分裂中期赤道板和关闭纺锤体检测点, 保证细胞能够 适时 完成有丝分裂中期并进入有丝分裂后期 [2,5] Hanischetal [2] 采用 RNA 干扰技术抑制 Ska2 表达后, 大量细胞被停滞或延迟在有丝分裂中期, 虽然细胞仍能最终完成有丝分裂, 但细胞从有丝分裂前期进入后期所需的时间明显延长 Shietal [6] 发现 Ska2 在小细胞肺癌和乳腺癌中呈现表达上调 此外,Ska2 还可通过糖皮质激素受体等途径参与细胞增殖调节和肿瘤发生发展 [7-10] 然而,Ska2 基因在人胶质瘤的作用尚未见文献报道, 该研究旨在探讨 sirna 沉默 Ska2 后对人胶质瘤 A172 细胞增殖的影响, 为进一步深入研究 Ska2 在胶质瘤中的作用机制奠定基础 1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂人胶质瘤细胞株 A172 购自上海生命科学研究院细胞库 ; 培养基 DMEM 胎牛 survivinpromoter,replication competentadenoviruswasconstructed.therecombinedadenoviruses(t ZD55 CD133 sirna)wereverifiedbypcrandsequencing.theefectoft ZD55 CD133 sirnaoncd133expresion inhep3bcelswasdetectedbyqrt PCR.TheexpresionofE1AwasdetectedbyWesternblot.Theantitumorpo tentialofreplication competentadenovirusinhep3bcelswereevaluatedbycck 8asayandcelapoptosiswas detectedbyflowcytometry.results Replication competentadenoviruswereconstructedsuccesfuly.western blotanalysesindicatedthatt ZD55 CD133 sirna mightexprese1a inadenovirus infectedhep3b cels.t ZD55 CD133 sirnaweremoreefectivetoinhibitcd133mrnaexpresionandhep3bcelsproliferation.apop tosiswassignificantlyincreasedintheinterferencegroupcomparedwiththecontrolgroup.conclusion Survivin T ZD55 CD133 sirnaexpresingcd133 sirnacaninhibitcd133expresionandmaybeusedforfurtherinvesti gationofgenetherapyforlivercancer. Keywords livercancr;cancerstemcel;cd133;celproliferation;geneexpresion

13 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 931 血清 胰酶消化液均购自美国 Hyclone 公司 ; 脂质体 Lipofectamine2000 TRIzol 均购自美国 Invitrogen 公司 ;Ska2 抗体购自英国 Abcam 公司 ;PCNA Cyclin D1 抗体购自北京博奥生物公司 ; 反转录试剂盒 Pri mescript TM RTMasterMix(PerfectRealTime) 购自日本 TaKaRa 公司 ;7900 型荧光定量 PCR 仪购自美国 ABI 公司 ;20μl 的反应体系包括 10μl2 SYBR GreenPCRMasterMix 购自美国 ABI 公司 ;5 和 3 端引物 (3μmol/L) 各 1μl 和 1μl 的 cdna 模板 7μl ddh 2 O 购自上海生物科技有限公司 ; 兔抗人 Ska2 羊抗人 β actin 多克隆抗体 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 兔抗羊 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ;ECL 购自美国 ThermoFisher 公司 ; FlexCycler 多功能 PCR 仪购自德国 Jena 公司 ;MTT 试剂购自美国 Sigma 公司 ;SDS PAGE 蛋白上样缓冲液 DMSO 试剂 Western 一抗稀释液及 RIPA 裂解液 ( 强 ) 均购自上海碧云天公司 ;NanoPhotometer Pearl330 购自德国 IMPLEN 公司 ;sirna 寡核苷酸片段由上海吉玛公司合成 ;Ska2 引物由上海生物工程公司合成 sirna Ska2 序列和 sirna 阴性对照序列见表 1 表 1 引物序列 项目序列 (5 3 ) sirna Ska2 sirna 阴性对照 1.2 方法 F:GAAAUCAAGACUAAUCAUCTT R:GAUGAUUAGUCUUGAUUUCTT F:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT R:ACGUGACACGUUCGGAGAATT 细胞转染购买 50 代以内人胶质瘤细胞株 A172, 将其培养于含 10% 新生胎牛血清 DMEM 培养液中, 恒温恒湿培养箱设定参数为 37 5%CO 2 浓度 取对数生长期 A172 细胞, 用 0 25% 胰酶消化液消化,800r/min 离心 5min, 取适量培养基制成细胞悬液并计数, 按 个 / 瓶接种于培养瓶中 ; 接种 24h 后, 待培养瓶中细胞汇合达约 70% 时即可进行脂质体 Lipofectamine2000 介导的转染 第一组予以 sirna 阴性对照序列 ( 对照组 ) 第二组予以 sirna Ska2 序列 ( 实验组 ) 进行转染, 以此建立细胞模型 qrt PCR 检测 A172 细胞中 Ska2mRNA 表达变化细胞转染后, 提取实验组及对照组细胞总 RNA, 分别将其逆转录成 cdna 用 7900 型荧光定量 PCR 仪进行反应扩增,Ska2 上游引物 :5 CCGCTTTAAACCAGTTGCTG 3, 下游引物 :5 CTCTGCCGCAGTTTTCTCTT 3 ;GAPDH 上游引物 : 5 AGCAAGAGCACAAGAGGAAG 3, 下游引物 :5 GGTTGAGCACAGGGTACTTT 3 反应条件如下:95 预热 10min;95 变性 15s;60 退火 1min, 共 45 个循环 并于反应结束后记录实验组和对照组结果 以 GAPDH 作为内参, 相对表达量 =2 -ΔΔCt 值, 以对照组 mrna 表达量的均数为 1, 计算出实验组 mrna 的相对表达量 Westernblot 法检测 A172 细胞中 Ska2 PC NA 和 CyclinD1 蛋白表达情况细胞转染后, 提取实验组及对照组细胞总蛋白, 用 BCA 试剂检测各组蛋白浓度并定量 取 20μg 蛋白行 SDS PAGE 凝胶电泳 ( 浓缩胶浓度 5%, 分离胶浓度 8%), 电转 30 min 后转至 PVDF 膜上,5% 脱脂奶粉封闭 2h; 加入一抗为兔抗人 Ska2 抗体 (1 1000),4 孵育过夜, 洗膜 ; 加入二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG( ), 室温轻摇 1h, 洗膜 ; 加入 ECL 反应液, 暗室显影 定影后扫描 以 β actin 作为参照 MTT 法检测 A172 细胞生长细胞培养和处理同前, 将对照组正常 A172 细胞及实验组转染后 A172 细胞按 / 孔接种于 96 孔板, 每组设复孔 5 个, 作常规培养 分别取培养后 h5 个时间点的培养板, 弃去培养基, 每孔依次加入 MTT(5mg/ml)10μl, 继续孵育 4h 后吸尽每孔中的培养液 ; 加入 DMSO150μl/ 孔, 于水平摇床上振荡 6min, 测定 492nm 的吸光度 (absor bance,a) 值 以时间为横坐标, 细胞存活率为纵坐标, 绘制细胞生长曲线图 存活率 (%)= 实验组细胞 A 值 / 对照组细胞 A 值 100% 细胞克隆实验检测细胞增殖细胞培养和处理同前, 将转染后的 A172 细胞按 200 个 / 孔接种于 6 孔板, 设为实验组 ; 取相同数目的正常 A172 细胞接种于 6 孔板, 设为对照组 ; 每组各设 3 个复孔进行常规培养 每孔加入培养基 2ml, 每 3d 换液并观察细胞增殖情况,10d 后弃培养基, 每孔加入 4% 多聚甲醛 1ml 固定 30min 后, 再加入美兰染料 0 8 ml 染色,20min 后弃去染料, 轻轻漂洗数次后晾干, 在显微镜下观察并进行拍照 1.3 统计学处理采用 SPSS16 0 统计软件进行分析, 实验数据以 x±s 珋表示, 组间比较采用 t 检验或方差分析

14 932 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 2 结果 2.1 A172 细胞 Ska2 基因表达 qrt PCR 结果显示, 实验组 Ska2mRNA 水平的表达量明显低于对照组, 差异有统计学意义 (t=7 28,P<0 01), 见图 Ska2 基因对 A172 细胞增殖的影响 MTT 实验结果显示, 与对照组比较, 实验组在转染 h 时 A172 细胞生长差异无统计学意义, 但转染 48h 及 72h 后, 实验组 A172 细胞较对照组生长明显受抑制 (t=8 27,P<0 05), 见图 3 图 3 不同时间点 A172 细胞增殖生长情况 与对照组同一时间比较 : P<0 05, P<0 01 图 1 实验组与对照组 Ska2mRNA 的表达情况与对照组比较 : P< A172 细胞 Ska2 蛋白表达变化 Westernblot 结果显示, 两组内参 β actin 蛋白的表达相近, 而与对照组比较, 实验组 Ska2 蛋白表达明显减少 (t= 9 12,P<0 01), 见图 Ska2 基因对 A172 细胞增殖克隆形成能力的影响 10d 后将做细胞克隆实验的 6 孔板放置在显微镜下, 观察实验组与对照组细胞克隆增殖的情况 与对照组比较, 实验组细胞增殖明显受到抑制 (t= 10 45,P<0 01), 见图 4 图 4 细胞克隆增殖形成情况 100 与对照组比较 : P<0 01 图 2 Ska2 蛋白的表达情况 与对照组比较 : P< A172 细胞中 PCNA 和 CyclinD1 蛋白表达变化 Westernblot 结果显示, 两组内参 β actin 蛋白

15 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 933 的表达相近, 而与对照组比较, 实验组 PCNA 和 Cyc lind1 蛋白的表达明显减少 (t=12 13,P<0 01), 见图 5 3 讨论 图 5 PCNA 与 CyclinD1 蛋白的表达情况 与对照组比较 : P<0 01 胶质细胞瘤是人脑组织中最常见的原发恶性肿瘤, 有高度侵袭性 神经破坏性, 被认为是人类最致命的癌症之一 [11] 人类对恶性胶质细胞瘤的发病机制尚不清楚, 其治疗策略相对有限, 目前最主要的治疗手段是手术联合放化疗, 但治疗效果仍然不甚理想 因此, 研究胶质瘤基因改变的分子机制有助于从根源上发现与肿瘤相关的基因位点, 通过阻断和促进某位点基因的表达情况来说明此位点对胶质瘤致瘤性的影响 无限 不受控制地增殖是肿瘤细胞的特性, 通过阻断肿瘤细胞无限增殖的致癌基因无疑是研究的热点 Ska2 是细胞分裂过程中必不可少的调控因子 [6,12-13] 文献证实 Ska2 参与肺癌 乳腺癌等多种肿瘤发生发展过程 本实验采用 sirna 沉默 Ska2, 探究其对人胶质细胞瘤 A172 增殖的影响, 将胶质细胞 瘤 Ska2 基因沉默作为实验组, 同时建立仅予以 sir NA 阴性对照序列的对照组与之相比较 对两组细胞进行实验后, 首先 qrt PCR 和 Westernblot 结果均证实 Ska2 sirna 可明显抑制胶质瘤细胞中 Ska2 mrna 转录和蛋白表达 随后, 验证 Ska2 是否影响胶质瘤细胞的增殖 MTT 实验结果提示实验组在转染 Ska2 sirna 后, 细胞增殖生长显著受到抑制 ; 克隆实验结果证实了实验组细胞增殖克隆形成能力显著受到抑制 实验结果均支持沉默 Ska2 后, 可以抑制胶质瘤细胞的增殖活性 由此可见 Ska2 基因是一种重要潜在的原癌基因, 在促进肿瘤增殖生长中有重要作用 [12] 文献报道 Ska2 可通过参与糖皮质激素受体相关信号通路来调节细胞增殖 糖皮质激素因能抑制肿瘤细胞生长而被广泛用作肿瘤化疗药物 某些小细胞肺癌细胞也因本身糖皮质激素受体缺陷而表现出对糖皮质激素的耐药性 [14] Ska2 通过与糖皮质激素受体的直接相互作用而调节糖皮质激素受体的功能及糖皮质激素的细胞增殖抑制作用 过表达 Ska2 可导致 Dex 激活的糖皮质激素受体转录激活活性得到进一步增强 ; 而采用 RNAi 技术抑制 Ska2 的表达后,Dex 激活的糖皮质激素受体转录激活活性和细胞增殖抑制能力均显著削弱或丧失 [12] 此外, 敲减糖皮质激素受体 β 可特异性的抑制胶质瘤细胞增殖的能力 [15] 为进一步深入研究 Ska2 是如何调控胶质瘤细胞增殖分子机制, 本研究检测了增殖相关蛋白 Cyc lind1 与 PCNA 在实验组和对照组中的表达情况 Westernblot 结果提示敲减 Ska2 基因后, 实验组增殖相关蛋白 PCNA 与 CyclinD1 的表达含量与对照组比较明显抑制 以上实验结果说明沉默 Ska2 基因从而抑制胶质瘤细胞的增殖可能与减少了增殖相关蛋白 CyclinD1 与 PCNA 的表达有关 结合本次研究结果及 Ska2 对肺癌 乳腺癌等多种肿瘤的表达情况综合考虑,Ska2 基因与胶质瘤发生 发展密切相关 sirna 特异性沉默 Ska2 基因后, 明显抑制了胶质瘤细胞 A172 的增殖活性, 因此 Ska2 基因可能是治疗胶质瘤及其他肿瘤潜在的理想靶点 然而对于 Ska2 基因在胶质瘤细胞中的确切作用机制 作用途径及 Ska2 基因与其他和胶质瘤相关的基因相互作用的关系尚有待于进一步阐明 参考文献 [1] JeyaprakashAA,SantamariaA,JayachandranU,etal.Structur

16 934 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) alandfunctionalorganizationoftheskacomplex,akeycomponent ofthekinetochore microtubuleinterface[j].molcel,2012,46 (3): [2] HanischA,SiljeHH,NiggEA.Timelyanaphaseonsetrequires anovelspindleandkinetochorecomplexcomprisingska1andska2 [J].EMBOJ,2006,25(23): [3] WiliamsG H,StoeberK.Thecelcycleandcancer[J].J Pathol,2012,226(2): [4] 杜刚, 卜友泉, 杨正梅, 等. 人 FAM33A 基因启动子的克隆与鉴定 [J]. 医学分子生物学杂志,2009,6(3): [5] ChanYW,JeyaprakashAA,NiggEA,etal.AuroraBcontrols kinetochore microtubuleatachmentsbyinhibitingskacomplex kmnnetworkinteraction[j].jcelbiol,2012,196(5): [6] ShiW,GersterK,AlajezNM,etal.MicroRNA 301mediates proliferationandinvasioninhumanbreastcancer[j].cancerres, 2011,71(8): [7] 谢 宇, 张莹, 张春冬, 等.Ska2/FAM33A: 一个参与细胞周期调控与肿瘤发生的新基因 [J]. 中国细胞生物学学报, 2013,35(2): [8] BertrandFE,SteelmanLS,ChappelW H,etal.Synergybe tweenanigf 1R antibodyandraf/mek/erk andpi3k/akt/ mtorpathwayinhibitorsinsuppresingigf 1R mediatedgrowth inhematopoieticcels[j].leukemia,2006,20(7): [9] BoksM P,RutenBP,GeuzeE,etal.Ska2methylationisin volvedincortisolstresreactivityandpredictsthedevelopmentof post traumaticstresdisorder(ptsd) aftermilitarydeployment [J].Neuropsychopharmacology,2016,41(5): [10] WangY,ZhangY,ZhangC,etal.Thegenepairpr11andska2 sharesanf y regulatedbidirectionalpromoterandcontributesto lungcancerdevelopment[j].biochimbiophysacta,2015,1849 (9): [11] ThakkarJP,DolecekTA,HorbinskiC,etal.Epidemiologicand molecularprognosticreviewofglioblastoma[j].cancerepidemiol BiomarkersPrev,2014,23(10): [12] RiceL,WatersCE,EcclesJ,etal.Identificationandfunctional analysisofska2interactionwiththeglucocorticoidreceptor[j].j Endocrinol,2008,198(3): [13]LuZ,LiY,TakwiA,etal.miR 301aasanNF kappabactivator inpancreaticcancercels[j].emboj,2011,30(1): [14]PatkiM,GadgeelS,HuangY,etal.Glucocorticoidreceptorsta tusisaprincipaldeterminantofvariabilityinthesensitivityofnon smal cellungcancercelstopemetrexed[j].jthoraconcol, 2014,9(4): [15] WangQ,LuPH,ShiZF,etal.Glucocorticoidreceptorβactsas aco acivatoroft Celfactor4andenhancesgliomacelprolifera tion[j].molneurobiol,2015,52(3): EfectsofSka2silencingonthecelproliferationofhumangliomacels HeXiaojun,MaChunchun,BianErbao,etal (DeptofNeurosurgery,TheSecondAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective ToanalyzetheefectsofSka2aftersiRNAsilencingonhumangliomacelsgrowthandits potentialmolecularmechanisms.methods TheculturedhumanglioblastomacellineA172wasdividedintotwo diferentgroups:thecontrolgroupandtheexperimentalgroup.thecontrolgroupwastreatedwithsirnanegative sequencetransfection;theexperimentalgroupwithsirna Ska2sequencetransfection.48hourslater,theexpres sionsofska2mrnawasanalyzedbyqrt PCR.TheproteinexpresionsofSka2,PCNA,andCyclinD1wereana lyzedbywesternblot.theproliferationabilityandthecolony formationabilityofcelwereinvestigatedthrough MTTAsayandcelcloningAsay.Results qrt PCRanalysisshowedthatmRNAexpresioninSka2oftheexper imentalgroupwassignificantlyreducedcomparedwiththecontrolgroup(p<0 01);Westernblotindicatedagreat declineofska2inpcnaandcyclind1proteinexpresionintheexperimentalgroup(p<0 01);MTTAsayre vealedthatthenumberofviablecelwaslowerthanthatofthecontrolgroup(p<0 05);cloningexperimentindi catedthatcolony formationabilitywasweakerthanthatofthecontrolgroup(p<0 01).Conclusion Silencingof Ska2andreducingthegeneexpresionofSka2inhumangliomacelsinhibitcelproliferation. Keywords Ska2;glioma;celproliferation

17 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 935 网络出版时间 : :52:31 网络出版地址 :htp:// RTCA 实时定量动态监测 HCMV 在 MRC 5 细胞上的增殖的研究 张业婷, 钟峰, 姚瑶, 赵俊, 俞海洋, 张文昌, 陈敬贤, 王明丽 摘要目的采用实时细胞分析 (RTCA) 系统监测人巨细胞病毒 (HCMV) 在 MRC 5 细胞株上的复制增殖过程, 评价此方法在动态监测病毒增殖中的应用价值 方法应用 RTCA 动态观察 MRC 5 细胞在不同阶段的生长指数 (CI), 选择合适的细胞浓度进行 HCMV 增殖的研究, 同时采用传统的空斑形成试验和间接免疫荧光实验作为该方法学的比较和结果验证 结果选择 MRC 5 最适细胞浓度为 个 / 孔 ; 与空斑试验及免疫荧光结果比较, 半数细胞指数 CI 值对应时间 (CIT 50 ) 与病毒初始滴度有良好的线性关系 ; 同时 CI 值与病毒滴度随着时间的持续, 显示出明显的负相关性 (r=-0 977,P<0 05) 结论 RTCA 技术可实时监测记录细胞生长状态, 反应细胞贴壁 伸展, 同时能实时定量监测 HCMV 增殖复制状况, 数据客观可靠, 为今后基础实验研究提供了新的实验技术和方法 关键词实时细胞检测技术 ; 人巨细胞病毒 ; 增殖中图分类号 R373 9 文献标志码 A 文章编号 (2016) 人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,hcmv) 属于疱疹病毒 β 亚科, 是疱疹病毒科中最大的一种病毒, 结构复杂, 基因组全长超过 bp, 病毒颗粒的直径约为 200nm 据报道, 发达国家 HCMV 的成人平均感染率为 40% ~60%, 而发展中国家高达到 90% 以上 [1] 目前该病毒还被认为与恶性肿瘤 糖尿病 心血管疾病 ( 动脉粥样硬化 ) 有关 [2] HCMV 通常呈潜伏感染, 对免疫功能低下的个体, 如艾滋病 器官移植 肿瘤及使用免疫抑制剂的患者体内 HCMV 病毒会被再激活, 造成巨细胞病毒性视网膜炎 食管炎 胃炎 结肠炎 肝炎等终末器官综合征 HCMV 又是先天性感染最常见的病原体之一, 对孕妇和胎儿危害极大, 可引起死胎 流产 胎儿畸形和发育迟缓等病理性损害 HCMV 活动性感染的 接收基金项目 : 国家自然科学基金 ( 编号 : ); 安徽高校省级自然科学研究项目 ( 编号 :KJ2012ZD08) 作者单位 : 安徽医科大学微生物学教研室, 合肥 作者简介 : 张业婷, 女, 硕士研究生 ; 王明丽, 女, 教授, 硕士导师, 责任作者,E 孕妇可通过产道感染新生儿, 导致新生儿小头畸形 智力低下 黄疸 肝脾肿大 听力或视力丧失等多脏器 多系统不可逆性损害 [3] 美国国家科学研究院医学研究所曾于 1999 年把研制预防先天性 HC MV 感染疫苗列为优先级研究对象, 但至今仍无疫苗获准上市 [4] HCMV 在细胞上的增殖复制的研究, 能够为抗 HCMV 病毒药物的作用机制研究等方面提供一定的指导作用, 目前仍缺少监测 HCMV 增殖复制的可靠 新型 客观 准确和稳定的方法 该研究运用 RTCA 技术建立了实时动态监测 HCMV 病毒滴度的方法, 建立了运用该仪器动态测算病毒滴度的方法, 并与空斑形成实验和间接免疫荧光实验对比得出了一致的实验结果 1 材料与方法 1.1 材料 细胞 病毒株细胞株为人胚肺成纤维细胞 (MRC 5), 购自 ATCC HCMVAD169 株为实验室标准毒株, 由复旦大学上海医学院微生物学教研室提供, 安徽医科大学微生物教研室保存, 实验用毒株的滴度为 PFU/ml 试剂 DMEM 培养基 小牛血清 ( 美国 Gib co 公司 );HCMV pp65 抗体 ( 英国 Abcam 公司 ); FITC 标记羊抗鼠二抗 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ); 琼脂糖 ( 美国 Promega 公司 ) 仪器 RTCAiCeligence 实时细胞功能分析仪 (IXL8, 美国 ACEA 公司 );CO 2 培养箱 (HF90, 上海力申科学仪器有限公司 ); 倒置荧光显微镜 (IX53, 日本 Olypus 公司 );Countes 自动细胞计数仪 (C10281, 美国 Invitrogen 公司 ) 1.2 方法 RTCA 监测细胞生长周期使用 RTCA 实时无标记细胞功能分析仪监测 MRC 5 细胞生长周期 首先加入 100μl/ 孔含有 10% 小牛血清的营养液于 8 孔电子板内获得背景读数 随后按照 300 μl/ 孔加入 MRC 5 细胞悬液, 细胞终浓度分别为 个 / 孔 每个稀释度细

18 936 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 胞平行设置复孔 室温放置 30min 后放入 RTCA 分析仪内实时动态检测细胞的黏附伸展及繁殖状态, 将仪器设置 30min/ 次, 监测并记录细胞指数值 (celindex,ci), 于 37,5% CO 2 条件下培养, 连续观察 200h RTCA 监测 HCMV 感染 MRC 5 细胞的致细胞病变效应 (cytopathicefect,cpe) MRC 5 细胞以 个 / 孔的浓度接种于 8 孔电子板内, 培养 24h 后弃去营养液, 再加入 300μl/ 孔 10 倍系列稀释的 HCMVAD169 株病毒悬液以 PFU/ 孔到 8 孔电子板, 感染 MRC 5 细胞, 对照组加入 300μl 维持液 37, 5%CO 2 条件下孵育 1 5h 后弃去病毒悬液, 加入 300μl/ 孔含 2% 小牛血清的 DMEM 维持液继续培养, 每个病毒稀释度做复孔, 加入病毒后将 8 孔电子板放回实时细胞分析仪内, 设置每隔 30min 监测并记录 CI 值, 共 200h 空斑形成实验检测病毒悬液滴度将 MRC 5 细胞以 个 / 孔的量加入 24 孔细胞培养板内, 待细胞生长成单层时, 病毒以感染复数 (multi plicityofinfection,moi)=0 1 接种到 MRC 5 细胞上,37 5% CO 2 培养箱中孵育 1h 后弃去病毒液,PBS 洗 3 遍, 加入含有 2%FBS 的培养液于 37 5% CO 2 培养箱中培养, 分别于孵育后 h 收集培养液, 用维持液将病毒悬液 10 倍系列稀释后, 再以 0 2ml/ 孔的量加入到细胞培养板中, 同时设立细胞对照组,37 孵育 1 5h, 加入含有 1% 琼脂糖的 DMEM 培养液 0 5ml, 置于 37 5%CO 2 培养箱中培养 7d 其间逐日镜下观察细胞生长状况及其 CPE, 终止观察后加入含 10% 甲醛的结晶紫染色液, 染色 5min 后流水冲去琼脂凝块 在倒置显微镜下观察空斑并计数 病毒空斑形成单位 (PFU/ml)= 蚀斑均数 病毒稀释倍数 / 病毒接种量 免疫荧光检测 HCMV 在 MRC 5 细胞中复制将 MRC 5 细胞以 个 / 孔的量加入 24 孔细胞培养板内, 待细胞生长成单层时, 病毒以 MOI= 0 1 接种到 MRC 5 细胞上,37 5% CO 2 培养箱中孵育 1h 后弃去病毒液,PBS 洗 3 遍, 加入含有 2% NBS 的培养液于 37 5%CO 2 培养箱中培养, 分别于孵育后 h 收集培养液, 用间接免疫荧光实验分别检测不同时间段病毒的滴度, 具体操作步骤如下 :1 将细胞爬片取出后 PBS 冲洗 2 次,4% 多聚甲醛固定 30min;2 加 1%Trixon 至玻片上, 盖满玻片为准,37 5min;3 PBS 洗涤 3 次, 每次 3min, 加入 5% 小牛血清封闭液,37 1h;4 PBS 洗涤 3 次, 每次 3min, 加入 HCMVpp65 单抗于玻片上, 以盖满玻片为准,37 2h;5 PBS 洗涤 3 次, 每次 3min, 加入 FITC 标记羊抗鼠 IgG, 盖满玻片,37 1h;6 PBS 洗涤 3 次, 每次 3min, 50% 甘油封片, 荧光显微镜下观察记录结果 1.3 统计学处理采用 SPSS17 0 软件进行分析, 使用了重复测量资料方差分析 线性相关分析等方法处理, 数值变量采用 χ 2 进行统计描述 2 结果 2.1 MRC 5 细胞最适浓度的确定本实验使用 RTCA 技术实时监测细胞增殖 CI 值, 并由此确定接种病毒的最佳时间点 统计结果显示, 当 MRC 5 细胞以 个 / 孔加入孔板内时, 细胞在生长 24 h 后形成单层细胞层, 无细胞聚集叠加现象, 并且细胞平台期时间满足观察 HCMV 感染细胞 CPE 时间, 与倒置显微镜下观察结果一致 ( 图 1) 图 1 RTCA 监测 MRC 5 细胞增殖曲线 2.2 RTCA 监测 HCMV 致 MRC 5 细胞 CPE 效应在 MRC 5 细胞中, 当 MOI=2( 即 HCMV 滴度为 PFU/ml), 半数细胞指数值 (halfcelin dextime,cit 50 ) 为 77h, 而当 MOI=0 2( 即 HCMV 滴度为 PFU/ml), 细胞 CIT 50 为 104h, 水平线与细胞指数曲线相应交点所对应的时间即为 CIT 50 当病毒以 MOI=0 1 接种于 MRC 5 细胞 24 h 后, 显微镜下观察少数细胞出现变圆 肿胀现象, 折光性增强, 在接种达到 96h 时, 部分细胞出现脱落 凋亡现象 与镜下观察比较,RTCA 细胞分析系统能够准确得反映病毒致细胞 CPE 效应 见图 2 HCMV 感染 MRC 5 细胞后 CPE 效应随着时间增加

19 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 937 图 2 HCMV 接种 MRC 5 细胞致 CPE 效应 100 A: 细胞对照 ;B:24h;C:48h;D:72h;E:96h 而递增, 并且在不同 HCMV 感染剂量下, 细胞 CI 值下降随时间递增 ( 图 3) 分细胞开始脱落, 此时病毒滴度较初始病毒滴度增加约 2000 倍 ( 图 5) 图 3 RTCA 监测 HCMV 致 MRC 5 细胞 CPE 效应 2.3 空斑形成实验检测 HCMV 病毒滴度结晶紫染色液染色后, 空斑呈无色圆形, 散在均匀分布, 界限明显 ( 图 4) 空斑形成实验统计结果显示, HCMV 接种 MRC 5 细胞后在 40h 以内病毒滴度处于平稳期, 这个时间包含了病毒的吸附期及隐蔽期, 约在 50h 时病毒滴度出现陡升, 提示病毒在细胞内数量急剧增加, 动力学曲线呈线性函数关系 此时, 在显微镜下明显看出 CPE 到 150h 时病毒增殖速度明显下降, 此时镜下观察细胞病变处于, 部 图 4 空斑形成实验检测 HCMV 滴度 A:10-1 ;B:10-2 ;C:10-3 ;D:10-4 ;E:10-5 ;F: 对照 图 5 空斑形成实验检测 HCMV 在 MRC 5 细胞中复制 ( 珋 x±s,n=3) 2.4 间接免疫荧光验证 HCMV 在 MRC 5 细胞中复制荧光显微镜下观察,HCMV 在细胞中随着时间的增加,pp65 蛋白大量复制表达, 感染阳性细胞数不断增多 ( 图 6) 将不同方法检测病毒滴度结果进行重复测量资料方差分析 ( 表 1), 间接免疫荧光法和空斑形成实验相比较, 差异无统计学意义 (F= 0 745,P=0 437) 2.5 HCMV 增殖滴度与 CIT 50 及 CI 值相关分析 病毒在经过 10 倍系列稀释梯度下接种细胞后, 细胞 CIT 50 值随病毒滴度递减而呈递增趋势, 分别以 CIT 50 值为 Y 轴,HCMV 滴度为 X 轴绘制曲线, 获得线性图 ( 图 7) CIT 50 值与 HCMV 感染剂量的 logpfu 呈反比,R 2 值为 0 957, 提示两者之间有良好的线性回归关系, 通过生成的公式 Y= X , 由实验结果得出的 CIT 50 值可以直接计算出初始病毒的滴度 实验结果比较表明, 细胞指数与病毒滴度存在相关性, 在病毒接种后 36h 内, 细胞指数相对稳定 贴壁状况良好 ; 而随着感染时间的增加, 病毒开始大量复制, 细胞 CPE 效应增加, 细胞指数也随之急剧下降, 通过散点图显示病毒滴度与细胞指数是非线性趋势 因此对细胞指数进行对数转换 ( 图 8), 转换后的变量结果为 Ln( 代表细胞指数 ),

20 938 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 图 6 HCMV 在 MRC 5 中不同时间段荧光显微镜观察结果 200 表 1 两种方法检测 HCMV 病毒滴度结果比较 ( 10 3, x±s) 珋 方法 24h 48h 72h 96h 免疫荧光 (GFU/ml) 3.16± ± ± ±1.0 空斑形成 (PFU/ml) 3.08± ± ± ±3.3 通过散点图可以发现病毒滴度和 Ln 基本呈线性趋势, 对两个变量进行正态性检验, 结果表明两个变量都是正态分布 满足线性相关条件 病毒滴度和 Ln 的相关系数, 二者呈负相关性 (r=-0 977,P< 0 05) 以病毒滴度为因变量,Ln 为自变量进行线性回归分析, 结果显示自变量对变量的影响差异有统计学意义 (P<0 05) 3 讨论 图 7 MRC 5 细胞感染 HCMV 的滴度与 CIT 50 线性关系 图 8 病毒感染过程中病毒滴度与细胞指数的相关分析 目前对于 HCMV 增殖复制与宿主间复杂的相互作用缺乏深入了解 研究病毒的最常用方法仍是空斑形成实验, 但此法费时费力, 不宜快速检测, 且无法获取病毒复制及其引起的细胞病变的完整信息 各实验室条件和体系不同, 数据无法参比, 为基础研究带来了困难 另外, 此外某些病毒如减毒突变株可能会在细胞内复制成功, 但由于其作用微弱, 在单层细胞上产生的空斑难以识别, 因此空斑试验无法研究此类病毒的 CPE 本研究采用 RTCA 实时监测 HCMV 在 MRC 5 细胞中的增殖状况 在进行 MRC 5 细胞测试 HC MV 的 CPE 检测之前, 先使用 RTCA 对细胞生长繁殖进行定量分析, 以确定病毒感染性实验的最佳细胞浓度 判断依据为正常细胞增殖处于对数生长期, 并且平台期维持在 6d 以上, 确保感染病毒后细胞能被持续观察 本次实验结果得出, 当细胞浓度

21 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 939 为 个 / 孔时, 最适合病毒的接种,RTCA 检测细胞接种 HCMV 后的 CI 值与空斑形成实验结果比较, 病毒的滴度与 CI 值呈明显负相关性, 提示通过 RTCA 检测细胞 CI 值可实时反映病毒的滴度 RTCA 与传统的检测方法相比有明显优势, 操作简单 步骤少 人为干扰小 ; 完整细胞效应图谱, 提供大量 重要的动态反应信息 ; 实验结果客观 重复性好 ; 降低了操作人员与病毒接触的次数 ( 实验全过程仅需一次 ), 安全系数高, 尤其对高致病性病原体 ; 全自动实时监控, 全过程动态观察 ; 可以高通量的进行特异性抗体的检测及疫苗的保护性效果评价 RTCA 的应用领域非常广泛, 涉及新药研发 毒理学 肿瘤学 医学微生物学及病毒学等 Luet al [5] 运用 RTCA 技术评估了 H1N1 疫苗接种是否成功,Solyetal [6] 运用 RTCA 做一些以细胞为基础的实验, 为新药的研发奠定基础 本文运用 RTCA 细胞分析系统实现了对细胞实时全程动态监测, 在临床疾病指导治疗等方面的应用也具有很高的价值, 为今后抗病毒药物的研制及 疫苗的研发提供可靠有力的实验基本技术 参考文献 [1] HozRE,StephensG,SherlockC.Diagnosisandtreatmentap proachesofcmvinfectionsinadultpatients[j].clinvirol,2002, 25:S1-12. [2] DolcinoM,PuccetiA,BarbieriA,etal.Infectionsandautoim munity:roleofhumancytomegalovirusinautoimmuneendothelial celdamage[j].lupus,2015,24(4 5): [3] PiletS,RoblinX,CornilonJ,etal.Quantificationofcytomegalo virusviralload[j].expertrevantiinfectther,2014,12(2): [4] ArvinAM,FastP,MyersM,etal.NationalVaccineAdvisory Commitee.VaccinedevelopmenttoPreventcytomegalovirusdis ease:reportfrom thenationalvaccineadvisorycommitee[j]. ClinInfectDis,2004,39(2): [5] LuHZ,XuX.Label freereal timecelbasedasaysystemfore valuatingh1n1vaccinationsucces[j].asiapacbiotechnews, 2010,14(10):15-7. [6] SolyK,WangX,XuX,etal.Applicationofreal timecelelec tronicsensing(rt CEs)technologytocel basedasays[j].as saydrugdevtechnol,2004,2(4): MonitoringofHCMVreplicationwithreal timecelasayonmrc 5 ZhangYeting,ZhongFeng,YaoYao,etal (DeptofMicrobiololgy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Todetectthehumancytomegalovirus(HCMV)replicationinMRC 5celsbyapplyingreal timecelasay(rtca)system,andevaluatetheapplicablevalueofthismethodinthedynamicmonitoringofviral replication.methods RTCAwasapplicatedtomonitorcelindex(CI)indiferentgrowthstages.Theoptimalcon centrationofcelwasselectedtostudyhcmvreplication.additionaly,traditionalplaqueformationasayandim munofluorescenceasaywereusedtocompareandvalidatetheresultofrtcasystem.results Themostsuitable celconcentrationwas celsperplate.comparedwiththeplaqueformationasayandimmunofluorescence asay,thevalueofhalfcelindex(cit 50 )hadasatisfactorylinearcorelationwiththeinitialvirustiter.thertca systemshowedasignificantnegativecorelationwithtimecontinuationforthedetectionofcelindexandthevirus titer(r=-0 977,P<0 05).Conclusion RTCAtechniqueissuccesfulyestablishedtomonitorthegrowthsta tusofthecelsinrealtime,whichmightreflectthecel sadhesionandspreading.thertcasystemcouldtimely monitorhcmvtiterwithcelindex.althedataaresolidandreliable.themethodwouldbehelpfulforfuture basicexperimentsoncreatingnewexperimentaltechniquesandmethods. Keywords real timecelasay;humancytomegalovirus;proliferation

22 940 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 网络出版时间 : :52:31 网络出版地址 :htp:// HPV16E5 E6 和 E7 基因重组慢病毒载体的构建及其感染口腔上皮细胞 项先旺 1, 江彤 2 1,3, 陈传俊 摘要目的分别构建 HPV16E5 E6 和 E7 癌基因的重组慢病毒载体感染人口腔上皮细胞, 为研究 E5 基因对口腔上皮细胞的致癌机制奠定基础 方法克隆 HPV16E5 E6 和 E7 基因, 分别构建 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 重组慢病毒载体, 与包装质粒共转染 293T 细胞 收集 3 种慢病毒上清液, 分别感染口腔上皮细胞 腺嘌呤素筛选感染细胞,RT PCR 和 Westernblot 法检测目的基因的表达 结果成功构建 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 重组慢病毒载体, 获得 3 种慢病毒上清液, 筛选得到 3 个稳定的细胞株 RT PCR 和 Westernblot 均可检测到 HPV16E5 E6 和 E7 基因在口腔上皮细胞内表达 结论本研究构建的 3 个重组慢病毒载体能成功感染口腔上皮细胞 关键词人乳头状瘤病毒 ;HPV16 癌基因 ; 慢病毒载体 ; 口腔上皮细胞 中图分类号 R739.8 文献标志码 A 文章编号 (2016) 人乳头状瘤病毒 (humanpapilomavirus,hpv) 是宫颈癌发生的主要致病因子 大量的流行病学调查资料显示,HPV 也与口腔癌的发生密切相关 [1-2] 目前关于 HPV 与口腔癌关系的研究主要集中于对高危型 HPVE6 和 E7 基因的研究, 它们都可与肿瘤抑制物结合并使其失活 [3] 实际上,HPV E5 基因有其特殊的生物活性, 与肿瘤的发生关系同样非常密切 E5 基因可抑制细胞的凋亡, 导致细胞周期异常, 甚至还能增强 E6 和 E7 基因对细胞的恶性转化作用 [4-5] Schifmanetal [6] 比较不同型别 HPV 全基因组序列发现, 有生物活性的 E5 基因总是存在于引起恶性肿瘤的高危型 HPV 基因组中, 说 接收基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 编号 : ); 皖南医学院人才引进科研启动基金资助作者单位 : 1 安徽医科大学第三附属医院, 合肥 安徽农业大学植物保护学院, 合肥 皖南医学院口腔医学院, 芜湖 作者简介 : 项先旺, 男, 硕士研究生 ; 陈传俊, 教授, 硕士生导师, 责任作者,E mail:ccj6318@si na.com 明 E5 基因在 HPV 致癌过程中可能发挥着至关重要的作用 因此, 深入研究 HPVE5 基因的功能及其致癌性, 可能是进一步了解 HPV 致癌机制的重要突破口 该研究拟构建 HPV16E5 E6 和 E7 基因重组慢病毒载体, 感染口腔上皮细胞, 以期为研究高危型 HPVE5 基因在口腔上皮细胞癌的致病机制奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料 样本采集感染 HPV16 的口腔癌病理标本由本实验室保存, 取自临床肿瘤组织 ; 无菌口腔黏膜标本则取自安徽医科大学第三附属医院小儿唇腭裂术中多余上皮 菌种及载体大肠杆菌 DH5α 由本实验室保存 ; 克隆载体 pgem TeasyVector 购自美国 Promega 公司 ; 慢病毒核心质粒 plvx AcGFP N1 购自上海吉凯公司 ; 慢病毒包装质粒 pspax2 pmd2g 购自美国 Addgen 公司 酶与试剂反转录试剂盒 各种限制性内切酶 TaqDNA 聚合酶 T4DNA 连接酶 PrimeScript TM RTreagentKitwithgDNAEraser 等工具酶均购自日本 TaKaRa 公司 ; 脂质体 Lipofectamine2000 无血清培养基 DefinedKeratinocyte SFM 分散酶 Dis paseⅡ 嘌呤霉素购自美国 LifeTechnologies 公司 ; 293T 细胞购自美国 ATCC 公司 ; 质粒抽提试剂盒购自美国 OMEGA 公司 ; 一抗 (MouseAnti GFP) 二抗 (GoatAntiMouse) hexadimethrinebromide DMEM 胎牛血清购自美国 Sigma 公司 1.2 方法 HPV16E5 E6 和 E7 基因的克隆及 3 个慢病毒载体的构建根据本实验室已报道的 HPV16 (GenBank 登录号 :KC935953) 序列, 分别设计扩增 E5 E6 和 E7 特异性引物, 见表 1 上游引物 5 端引入 EcoRI 位点, 下游引物 5 端引入 BamH I 位点 提取感染 HPV16 肿瘤标本的总 DNA,PCR 扩增条件为 :94 30s 57 30s 72 14s,30 个循环

23 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2016Jul;51(7) 941 PCR 产物进行 0 8% 琼脂糖凝胶电泳, 回收目的 DNA 片段 EcoRI 和 BamHI 双酶切纯化的目的片段, 与同样双酶切的慢病毒载体 plvx AcGFP N1 连接, 转化大肠杆菌 DH5α PCR 筛选阳性克隆, 测序验证重组慢病毒载体 plvx AcGFP E5 plvx AcG FP E6 和 plvx AcGFP E7 携带的 E5 E6 和 E7 基因序列是否发生突变 表 1 引物序列 基因引物序列 E5 F:5 CCGGAATTCATGACAAATCTTGATACTGC 3 R:5 CGCGGATCCCGTGTAATTAAAAAGCGTG 3 E6 F:5 CCGGAATTCATGCACCAAAAGAGAACTG 3 R:5 CGGGATCCCGCAGCTGGGTTTCTCTA 3 E7 F:5 CCGGAATTCATGCATGGAGATACACCT 3 R:5 CGGGATCCCGTGGTTTCTGGGAACAG 重组慢病毒的包装分别将 3 个重组质粒与包装质粒 pspax2 和 pmd2g 共转染 293T 细胞, 48h 后收集病毒上清液, 浓缩后分装保存于 -80 冰箱 种慢病毒滴度测定逐步稀释法测定 3 种慢病毒滴度, 分别在 96 孔板中接种 293T 细胞, 第 2 天用完全培养基按 (1~10-9 )10 个梯度稀释病毒液, 每孔加入 100μl 稀释后的病毒液, 每个梯度设置 3 个重复 ;48h 后观察细胞中 GFP 的表达, 若 10-8 梯度孔中分别有 2 3 和 4 个细胞 GFP(+), 则取平均值, 此病毒滴度为 TU/ml 口腔上皮细胞的原代及传代培养将无菌口腔黏膜标本置于 2mg/mlDispaseⅡ 中,4 消化过夜 次日, 用眼科镊分离获取上皮层并用剪刀将其剪成 1mm 1mm 大小, 胰酶消化 10min, 含 10% 胎牛血清的 DMEM 中止消化 1000r/min 离心 10 min, 弃上清液, 加入 DefinedKeratinocyte SFM 培养基重悬细胞 以 个 /cm 2 接种到 35mm 的培养皿中,37 5% CO 2 培养箱中培养, 当细胞铺满瓶底的 70% ~80% 时, 按 1 3 的比例进行传代培养 获得稳定感染的细胞株取 P1 代口腔上皮细胞接种至 6 孔板, 待细胞融合度约 70% 时, 换液, 每孔分别加入 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 慢病毒 100μl, 并在每孔中加入终浓度为 8μg/ml 的 ploybrene, 隔天换液, 加入终浓度为 2μg/ml 嘌呤霉素, 培养 2 周, 即可得到稳定感染的细胞株 RT PCR 检测 E5 E6 和 E7 基因 mrna 表达水平分别取 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 慢病毒稳定感染的口腔上皮细胞株 各提取细胞总 RNA, 反转录 cdna 第一链 以 cdna 为模板,RT PCR 检测 E5 E6 和 E Westernblot 检测 E5 E6 和 E7 蛋白表达水平收集稳定感染 HPV16E5 E6 和 E7 基因的口腔上皮细胞株,PBS 洗 3 次, 加入细胞裂解液 200μl, 冰上孵育 3min; 将细胞收集到 500μlEP 管中, 置于冰上继续裂解 20min,12000r/min 4 离心 30 min; 加入 5 SDS PAGE 上样缓冲液,100 变性 5 min; 取 30μg 样品总蛋白进行 10% SDS PAGE 电泳, 蛋白电转至 PVDF 膜上 ;5% 脱脂奶粉液封闭 2 h, 加入 Anti GFP 一抗, 室温孵育 2h;TBST 洗膜 4 次, 再加入二抗, 室温孵育 1 5h;TBST 洗膜 10 次, 加入新配置的 Westernblot 化学显色剂进行显色,5 min 后拍照分析 2 结果 2.1 目的基因的扩增以感染 HPV16 肿瘤组织的总 DNA 为模板, 分别用 3 对特异性引物进行 PCR 扩增, 可以扩增出 3 条约 bp 的特异性条带, 条带大小与预期结果相符 见图 1 图 1 HPV16E5 E6 和 E7 基因的 PCR 产物 M:DNA 分子量标准 ;1:E5;2:E6;3:E7 2.2 重组慢病毒载体酶切和测序验证重组慢病毒载体 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 经双酶切体系验证, 酶切片段大小符合理论值 说明插入的 E5 E5 和 E6 基因读码框正确 测序进一步验证插入的基因序列未发生突变 见图 重组慢病毒滴度的测定 3 种慢病毒 plvx AcGFP E5 plvx AcGFP E6 和 plvx AcGFP E7 分别感染 293T 细胞, 逐步稀释法测定滴度, 分别为 TU/ml 2.4 口腔上皮细胞的原代及传代培养原代培养 6~7d, 上皮细胞开始增殖,15~20d 细胞开始融

24 ９４２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ｔ ａｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓａｎ ｈ ｕ ｉ２ ０ １ ６Ｊ ｕ ｌ ５ １ ７ 合 融合的口腔上皮细胞为不规则多边形 呈铺路石 ４６ ３ ９ｋ Ｄａ 与理论大小相符 上述检测结 约为 ３７ 样结构排列 见图 ３ 果表明 Ｅ５ Ｅ６和 Ｅ７蛋白在口腔上皮细胞中均能 成功表达 见图 ６ 图 ５ 稳定转染慢病毒口腔上皮细胞 总 ＲＮＡ反转录产物 ＰＣＲ检测 Ｍ ＤＮＡ分子量标准 １ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ５转染 ４ ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ 图 ２ 重组慢病毒质粒的 Ｅｃ ｏｒⅠ和 ＢａｍＨ Ⅰ双酶切鉴定 ７ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ７转染 ２ ５ ８ 阳性对照 ３ ６ ９ 阴性对照 Ｅ６转染 Ｍ ＤＮＡ分子量标准 １ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ５ ２ ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ６ ３ ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ７ 图 ３ Ｐ１代口腔上皮细胞形态 Ａ ５ ０ Ｂ １ ００ 图 ６ 稳定转染慢病毒的口腔上皮细胞 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂｌ ｏｔ检测 ＧＦＰ表达 Ｍ 蛋白分子量标准 １ 空载体转染 ２ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ５转染 ３ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ６转染 ４ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ７转染 ５ 对照组 ２ ５ ＲＴ ＰＣＲ和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂｌ ｏｔ检测目的基因的表 达 倒置显微镜下观察显示 慢病毒 ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ ３ 讨论 Ｅ５ ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ６和 ｐ ＬＶＸ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ７转 染 的 口 ７ Ｓ ｄ ｅ ｋｅ ｔａ ｌ 利用 ＨＰＶ１ ６Ｅ６和 Ｅ７基因转染人 腔上皮细胞均有绿色荧光蛋白表达 说明 ３种慢病 正常口腔上皮细胞引起永生化 与 ＨＰＶ１６在宫颈癌 毒均可转染口腔上皮细胞 见图 ４ ＲＴ ＰＣＲ检测 ５３上调 的致病机制不同是他检测到肿瘤抑制物 ｐ 表明 在转染 ３种慢病毒的口腔上皮细胞中 均可扩 提示高危型 ＨＰＶ引起口腔癌的机制可能与宫颈癌 增出特异性条带 大小分别约为 ２５ ０ ５ ００ ３０ ０ｂｐ 不同 但其未做进一步研究 尤其缺乏对 ＨＰＶ１ ６致 见图 ５ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂｌ ｏ ｔ检测显示 在转染 ３种慢病毒 癌基 因 Ｅ５的 研 究 本 课 题 组 前 期 研 究 ８ 显 示 的口腔上皮细胞中 均检测出特异性条带 大小分别 ＨＰＶ１ ６Ｅ５ 基因可在一定程度上促进人永生化口腔 图 ４ 稳定转染慢病毒的口腔上皮细胞 １ ００ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ５转染 Ｃ ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ６转染 Ｄ ｐｌｖｘ Ａｃ ＧＦＰ Ｅ７转染 Ｅ 未转染 Ａ 空载体转染 Ｂ ｐｌｖｘ