食品卫生微生物学检验

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1 食品卫生微生物学检验 周传云 主编 湖南农业大学

2 食品卫生微生物学检验 主编 编者 周传云 周传云 胡亚平 周红丽 夏 菠 审稿 温琼英 供食品科学与工程 食品安检等各专业用 湖南农业大学食品科技系微生物教研室 二 五年八月

3 目 录 绪论 1 第一章食品卫生与微生物 3 第一节食品中微生物的污染与控制 3 第二节微生物引起食品腐败变质的条件 12 第三节微生物与食物中毒 20 第四节食品卫生微生物学指标 26 第二章食品卫生微生物学检验的基本理论与方法 35 第一节食品中微生物的个体形态检查 35 第二节微生物的培养特性检查 36 第三节微生物的生理生化反应 40 第四节微生物的血清学检验 45 第五节动物试验 57 第三章食品卫生微生物学检验 59 第一节总则 59 第二节菌落总数测定 62 第三节大肠菌群测定 65 第四节霉菌和酵母数测定 70 第四章几类主要的食品卫生微生物学检验 73 第一节食品用水卫生微生物学检验 73 第二节空气中细菌的检验 76 第三节肉与肉制品检验 76 第四节乳与乳制品检验 78 第五节蛋与蛋制品检验 80 第六节水产食品检验 82 第七节冷冻饮品饮料检验 83 第八节调味品检验 85 第九节冷食菜 豆制品检验 86 第十节糖果 糕点 蜜饯检验 87 第十一节酒类检验 88 第十二节罐头食品商业无菌的检验 88 第十三节鲜乳中抗生素残留量检验 91 第十四节粮谷 果蔬类食品检验 93 第五章食品中几种主要病原微生物的检验 95 第一节沙门氏菌检验 95 第二节志贺氏菌检验 109 第三节致泻大肠艾希氏菌检验 115 第四节金黄色葡萄球菌检验 121 第五节溶血性链球菌检验 125 第六节蜡样芽胞杆菌检验 128 附录 134 参考资料 167

4 绪 论 一 食品卫生微生物学检验的重要性 民以食为天 食物的生产与供应, 是国民经济发展的重要组成部分 丰富的食品, 是人类生存的最基本保证 食品的卫生质量是确保人类健康与生命安全的不容勿视的大事 食品一旦被附着 混入或生成了对人类健康有害 有毒的物质时, 就会发生食物中毒性疾病, 乃至危及人类生命安全, 尤其是食品的微生物污染 在自然界中到处都存在着各种无数的微生物, 在食品的生产制作 加工 贮藏 运输 销售等各个环节, 以及食品暴露在自然环境中时, 均不可避免的会经常遭受到微生物的污染 特别是一些直接危害人类健康的病原微生物均有可能进入到食品中, 被人摄食后, 将造成疾病的流行, 引起社会的不安, 酿成严重的经济损失 食品卫生微生物学检验是通过各种科学的方法和手段, 检验和检测各类食品的微生物污染问题, 是了解和掌握各类食品的卫生质量状况及人类食用后是否安全的重要手段 ; 可以使人类辨别各类食品中哪些是有益无害的 哪些是腐败变质的 哪些是含有病原菌不能食用的食品 ; 也可以指导人们在食品加工 贮藏中充分利用有益微生物, 控制和消灭引起食品变质的有害微生物及病原微生物的活动, 以防止被污染的和变质的食品对人体健康造成的威胁, 从而保障食品的安全 保障人民身体健康, 增强各族人民的体质 二 食品卫生微生物学检验的特点食品卫生微生物学检验. 具有研究范围广 涉及学科多 应用性强 与人类的健康和生命安全关系密切等特点 食品种类越来越繁多, 来源越来越复杂, 各种食品均有其特定的加工 生产 贮存 运输 销售渠道, 加之地区和气候条件的差异, 微生物对食品污染的复杂性, 要对各类食品卫生进行微生物学检验的方法是极繁杂的 对检测人员的知识面 道德 素质的要求也很严格 食品卫生微生物学检验是微生物学的一个分支学科, 是食品卫生学的一个重要组成部分 它不仅与普通微生物学 食品微生物学 医学微生物学 兽医微生物学 畜牧微生物学 农业微生物学 工业微生物学 环境微生物学与食品学等有关学科相互融合, 而且还涉及物理学 生物学 普通化学 分析化学 生物化学等基础学科, 又与传染病学 流行病学 人兽共患病学 寄生虫病学 环境卫生学等专业学科相交 其深广的基础理论与科学的方法, 不仅可以检测出各类食品中的有害微生物, 确定该食品的卫生质量及其对人类生命的安全性 ; 还可指导人们对食品加工工艺的不断改进 创新 以使食品加工制作 贮运 销售等环节的卫生管理科学化, 使食品的数量和质量日趋提高, 满足人类生活水平的需求 是食品行业全面实行 GMP 管理体系与 HACCP 质控体系的极为重要的手段 除此, 食品卫生微生物学检验还在许多方面受法规的约束和保护 我国以宪法为母法, 制定了现行食品卫生法, 它既对食品的卫生质量进行法规约束, 对食品卫生检验人员提出其应负的法律责任 ; 同时对从事食品卫生检验的人员也予以法律保护, 以便其行

5 使对人类生命安全负责进行食品卫生质量检验的神圣职责 我国及世界各国均制定了各自统一的食品卫生质量标准, 规定了明确的微生物学指标和相应的检测方法 因此, 每一个从事食品卫生质量检验工作者, 必须严格按国标所规定的方法严肃认真地贯彻执行, 凡超标者, 按食品卫生法要求, 不能食用, 并作好相应的处理 三 食品卫生微生物学检验的发展简史人类是古以来就把食品中微生物的检验工作放在很重要的位置 早在周朝时期就设置官职专门管理肉品的卫生和检验工作 东汉名医张仲景通过调查提出 伤寒流行与环境季节有关, 并在他的名著 金匮要略 中记载 六畜自死. 皆疫死, 则有毒. 不可食之 ; 肉中如有朱点者. 不可食之 ; 秽饭馁肉臭鱼食之皆伤人 南北朝时代的 食经 元代 饮食正要 都记载着有关食品检验内容 到 19 世纪 50 年代, 法国伟大的微生物学家巴斯德通过实验研究, 认为酒精发酵是徽生物引起的, 酒的变质也是污染微生物的结果, 只是两者由不同的微生物引起而已, 他还发明了巴氏消毒法, 并用于食品工业和医药行业的消毒, 把传染病的病原体作为食品受到污染的主要标志 我国历代皇官虽都设有专职人员检验食品, 甚至利用侍从人员对食品进行试验性品尝, 但真正对食品进行科学的检验工作是 1949 年中华人民共和国成立后开始的 1950 年后, 全国各地卫生部门都建立了卫生防疫站, 站内设立食品检验科负责对食品加工 销售进行管理, 对各类食品进行检验和监督, 至今全国各县 市 省 自治区都已建立了食品检测站 所等食品卫生质量检测监督机构, 国家统一制定了食品检验规程 (1959 年制定了肉品卫生检验试行规程 ) 食品检验力法 食品卫生标准( 国标 ) 食品法(1982 年全国人民代表大会颁布了现行食品卫生法的前身 ), 等等一系列的有关食品安全性的法规, 从而为食品检验工作提供了法律根据与保证, 使我国的食品卫生质量检验工作真正进入了正常的 科学的轨道 由于微生物的种类繁多 其生理生态学特性极为复杂, 加之食品的加工工艺 种类及其营养特性的多样性等, 食品卫生微生物学检验的现行方法, 还有待进一步的完善, 有赖于生产的发展和科学技术的发展, 而逐步得到提高和发展 随着人民生活水平的不断提高, 人们对食品的要求也会愈来愈高 为给人类提供营养丰富 有益于健康的 量多质好的安全的, 且能在色 香 味 形等诸方面给人类一种美的享受, 食品卫生微生物学检验及其工作者, 将在人类文明发展史 食品科学与食品卫生学发展史上, 更加任重道远 限于作者的水平和能力, 不当和错漏之处在所难免, 敬请广大读者批评指正 谢谢! 第一章食品卫生与微生物

6 食品是人类赖以生存的最基本物质, 在色 香 味 形等方面给人类一种美的享受 然而一旦食品被有害, 有毒的物质污染时, 就会使人类发生食源性疾病, 该种食品也就成了不安全 不卫生的 质量有问题的食品 近年来, 食品的质量和安全越来越受到人们广泛重视, 尤其是食品的微生物污染问题 在人类生活的自然界中生存着无数的微生物, 在食品生产 加工 贮存 运输和销售等各个环节, 均不可避免的不止一次地受到微生物的污染 特别是人 畜的消化道 呼吸道, 化脓灶等存在的病原微生物, 一旦排出, 污染食品和水, 则会在其内 表面繁殖, 甚至引起食品色 香 味发生不同程度的变化 当人误食了这些被污染的食品后, 则会引起消化系统传染病或细菌性食物中毒, 乃至会引起全身性感染的疾病 因而, 必须对食品卫生问题, 特别是食品的微生物污染问题, 应给予高度重视 第一节食品中微生物的污染与控制 食品污染, 是指食品原材料中本身含有或者加工时人为添加的 或者流通领域再次附入的生物性和非生物性物质污染, 其共同结果将对健康造成急性或慢性危害 食品污染类型, 根据污染源的性质, 可分为以下几类 : 生物性污染 : 包括微生物污染, 如病毒 细菌 细菌毒素 霉菌 霉菌毒素 ; 寄生虫污染, 如旋毛虫, 囊虫 弓形虫及肉孢子虫 ; 昆虫污染, 如蝇 蛆等 非生物性污染 : 包括化学性污染及物理性污染 如汞 铅 砷 镉等重金属 ; 乐果 敌百虫 1059 等化学农药 ; 硝酸盐 亚硝酸盐 苯甲酸等食品添加剂 ; 抗菌素, 磺胺 激素等其他化学物质 ; 铀 镭等放射性物质对食品的物理性污染 微生物对食品的污染, 可以是一种或多种, 可以是微生物本身也可以是微生物产生的毒素, 直接或间接地通过从食品的原料产地 加工 储藏 运输 销售以及烹调等各个环节各种途径使食品污染, 当人食用后便可对健康造成不同程度的危害, 而失去该食品的食用价值 故本节重点讨论食品的微生物污染问题 一 食品中微生物污染源微生物个体微小 繁殖快 数量多, 在自然界分布极广, 可以从多渠道污染食品, 究其污染源主要有以下几个方面 : 1. 土壤中微生物对食品的污染土壤含有丰富的有机物, 无机物, 适当的水份 适量的氧 适宜的酸碱度和比较恒定的温度, 是微生物生长发育的合适生境, 素有 微生物的天然培养基 之称, 故而在土壤中居住着大量的各种各样的微生物, 是微生物的大本营, 并且经常由于蒸发和雨水的冲刷将微生物传播到空气和水中 据分析统计, 肥沃的耕作土中微生物总数可 > 10 8 cfu/g, 贫脊土壤中也含有微生物 10 6 ~10 7 cfu/g, 且以 10~20cm 深的土壤中微生物含量最多 当然土壤中微生物的种类和数量也随土壤中有机物及水分含量 气候等外界环境的影响而不断变化 土壤中的微生物包括细菌 真菌 放线菌 藻类 螺旋体 病毒及原生动物等

7 以细菌最多, 占土壤微生物总数的 70~90%, 放线菌 真菌次之, 藻类和原生动物的数量较少 绝大部分微生物对人类是有益的, 是人类可利用微生物资源的主要来源, 部分微生物对土壤中有机物的分解及无机物质的转化起着重要的作用 引起食品变质的大多数腐败微生物都存在于土壤中, 如腐生性球菌 需氧性芽胞杆菌 ( 枯草杆菌 蜡样芽胞杆菌 巨大芽胞杆菌 ) 厌氧芽胞菌( 肉毒梭状芽胞杆菌 腐败梭状芽胞杆菌 ) 非芽胞杆菌 ( 大肠杆菌属 变形杆菌 ) 等 土壤中的致病微生物, 来源于动物尸体及排泄物和带有致病微生物的污水及垃圾等 由于土壤中缺乏病原菌所需的营养物质和合适的理化条件, 不适宜病原菌在土壤中的生长繁殖, 所以病原微生物在土壤中只能短期存活, 多数病原微生物迅速死亡, 只有能形成芽孢的细菌才能长期生存 ; 有少部分病原微生物进入土壤后不立即死亡, 而逐渐适应外界环境能较长时期的生存下去, 但其特性有所改变也可能失去原有的致病力 土壤中的微生物不仅直接污染新鲜蔬菜 谷物 水果等, 而且还可被各种因素带入江河 湖泊及池塘中造成水质污染, 或随风飘入空气成了空气中微生物的来源 食品在生产加工 运输 贮藏 销售 烹调制作的某个环节, 接触了土壤, 特别是污染病原微生物的土壤, 即可造成食品的污染, 乃至引起对人体健康的危害 2. 水中微生物对食品的污染江河 湖 海 池塘及下水道的水中都有很多微生物, 甚至温泉中也有耐高温的微生物 水域中的微生物来自土壤 空气 动物排泄物 动植物尸体 工厂和生活废水等 水中的微生物种类繁多, 海水中的微生物一般具有嗜盐特性, 且主要为细菌, 海鱼体表常有无色杆菌属 黄杆菌属及假单孢菌属的细菌存在, 常引起鱼体腐败, 海水中有些细菌是鱼类的病原菌, 有些则能引起人类食物中毒, 如副溶血性弧菌 江河 湖泊 池塘等淡水中的微生物大部分来自土壤和生活污水, 其中包括有人畜肠道的正常寄生菌, 如大肠杆菌 粪链球菌 魏氏杆菌和许多其他腐生菌, 如变形杆菌 厌氧性梭状芽孢杆菌等, 以及霍乱 伤寒 痢疾等肠道致病菌 水是传染病的重要传播途径之一, 特别是肠道传染病 通过水传播的病原体包括细菌 病毒 霉菌 螺旋体 原虫 蠕虫等, 这些病原体多从人或动物的粪便排出 通过污水的排放, 粪便下河 土壤经雨水冲洗等直接或间接地污染各种水源 水中的营养条件和其它条件不适于病原菌的发育 大部分病原菌在自然水中只可存活一段时间 水中微生物的种类和数量与水域中有机质的含量有直接关系, 例如江 河 湖 溪中的微生物数量能因河水泛滥 多雨季节发生剧烈变化, 主要是由于陆地上的表土和污物被冲入到这些水域中所致 由于食品生产加工 地板 器具的洗刷都需要大量的水, 因此水的卫生质量, 即水中含有微生物种类和数量与食品污染有直接关系 3. 空气中微生物对食品的污染由于空气中缺乏微生物发育的必需营养物质, 以及日光的照射与干燥 空气成分和性质的不断变化等, 致使空气中没有固定的微生物种类, 只能以浮游状态存在于空气中 空气中的微生物主要来源于土壤 水 人与动物体 空气中的微生物种类很多, 主要是霉菌, 其次是酵母菌 球菌 微球菌 八叠球菌 嗜氧性芽孢菌 常见的病原微生物有

8 结核杆菌 溶血性链球菌 脑膜炎 双球菌 流感病毒等. 空气中的微生物可附着于灰尘颗粒或小水滴, 随着气流游动, 飞扬传播于空气中, 并在短时间内停留于空气中 空气中微生物的分布 种类和数量随季节 高度 地区 人口居住密度 室内外 风速等有明显差异 一般来讲, 越接近地面的空气, 含微生物越多 人口众多 交通拥挤 牲畜活动场所的空气比农村 海洋 高山 森林等地带的微生物要多 例如居民生活区空气中的微生物一般有 2000 cfu/m 3, 而在海洋上空一般只有 1~2 cfu/m 3 尘埃越多, 微生物也越多 相反, 下雨或下雪后, 微生物就显著减少 空气中微生物可直接或间接降落在食品及生产食品的工具以及包装器材上, 污染食品, 从而引起人类疾病, 或引起食品变质 4. 人和动植物中微生物对食品的污染人及动植物因生活在一定的自然环境中, 体表就会受到周围环境中微生物的污染 健康的人体和动物的消化道 上呼吸道均有一定种类的微生物存在 ( 表 1-1) 当人和动物有病原微生物寄生而造成病害时患者体内就会有大量的病原微生物通过呼吸道和消化道排泄物向体外排出, 其中少数菌是人畜共患病原微生物, 如沙门氏菌 结核杆菌 布氏杆菌 (Bacterium burgeri) 它们污染食品和饲料造成人畜患病或食物中毒 有些菌可造成食品原料的污染, 引起食品腐败变质 如水果上的酵母菌 乳酸菌和醋酸菌造成瓜果的腐烂 而且有些植物病原微生物的代谢产物具有毒性, 引起食物中毒, 如黄曲霉菌可以产生致癌的黄曲霉毒素 表 1-1 人体各部位的正常菌群 部位 主要微生物的种类 皮 口 肤 腔 葡萄球菌 类白喉杆菌 绿脓杆菌 非致病性抗酸杆菌等 奈氏球菌 某些链球菌 梭形杆菌 乳酸杆菌 螺旋菌和真菌等 鼻咽腔 葡萄球菌 链球菌 肺炎球菌 奈氏球菌 绿脓杆菌等 肠 道 大肠杆菌 产气杆菌 变形杆菌 绿脓杆菌 葡萄球菌 肠链球菌 产气荚膜杆菌 破伤 风梭菌等 眼结膜 尿道 白色葡萄球菌 结膜干燥杆菌 类白喉杆菌等 白色葡萄球菌 类白喉杆菌 非致病性抗酸杆菌等 5. 食品加工设备与包装材料中微生物对食品的污染各种加工机械设备本身没有微生物所需的营养物质, 但在食品加工过程中, 由于食品的汁液或颗粒粘附于内表面, 食品生产结束时机械设备没有得到彻底的清洗灭菌, 使原本少量的微生物得以在其上大量生长繁殖, 成为微生物的污染源 这种机械设备在后来的使用中会通过与食品接触而造成食品的微生物污染 例如, 在果汁 奶等饮料生产线上的管道死角若不能及时清洗灭菌就会成为一个污染源, 这在生产中应该特别注意

9 各种包装材料如果处理不当也会带有微生物, 已经过消毒灭菌的食品, 如果使用的包装材料未经过无菌处理或者处理不当, 则会造成食品的重新污染 一次性包装材料通常比循环使用的材料所带有的微生物数量要少 塑料包装材料由于带有电荷会吸附灰尘及微生物 6. 食品原料中的微生物对食品的污染动物性原料屠宰前健康的畜禽具有健全而完整的免疫系统, 能有效地防御和阻止微生物的侵入和在肌肉组织内扩散 所以正常机体组织内部 ( 包括肌肉 脂肪 心 肝 肾 血液等 ) 是无菌的, 而畜禽体表 被毛 消化道 上呼吸道等器官总是有微生物存在, 如未经清洗的动物被毛 皮肤微生物数量可达 10 5 ~10 6 cfu/cm 2 如果被毛和皮肤污染了粪便, 微生物的数量会更多 刚排出的家畜粪便微生物数量可多 10 7 cfu g -1, 瘤胃成分中微生物的数量可达 10 9 cfu g -1 患病的畜禽其器官及组织内部可能有微生物存在, 如病牛体内可能带有结核杆菌 口蹄疫病毒, 病死的猪体内可能有猪链球菌存在, 病死的鸡体内可能存在有禽流杆病毒, 等等 这些微生物能够冲破机体的防御系统, 扩散至机体的其他部位, 此多为致病菌 动物皮肤发生刺伤 咬伤或化脓感染时, 淋巴结会有细菌存在 其中一部分细菌会被机体的防御系统吞噬或消除掉, 而另一部分细菌可能存留下来导致机体病变 畜禽感染病原菌后有的呈现临床症状, 但也有相当一部分为无症状带菌者, 这部分畜禽在运输和圈养过程中, 由于拥挤 疲劳 饥饿 惊恐等刺激, 机体免疫力下降而呈现临床症状, 并向外界扩散病原菌, 造成畜禽相互感染 屠宰后的畜禽即丧失了先天的防御机能, 微生物侵入组织后迅速繁殖 屠宰过程卫生管理不当将造成微生物广泛污染的机会 最初污染微生物是在使用非灭菌的刀具放血时, 将微生物引入血液中的, 随着血液短暂的微弱循环而扩散至胴体的各部位 在屠宰 分割 加工 贮存和肉的配销过程中的每一个环节, 微生物的污染都可能发生 屠宰前畜禽的状态也很重要 屠宰前给予充分休息和良好的饲养, 使其处于安静舒适的条件, 此种状态下进行屠宰其肌肉中的糖元将转变为乳酸 在屠宰后 6~7h 内由于乳酸的增加使胴体的 ph 降低到 5.6~5.7,24 h 内 ph 值至 5.3~5.7 在此 ph 条件下, 污染的细菌不易繁殖 如果宰前家畜处于应激和兴奋状态, 则将动用贮备糖元, 宰后动物组织的 ph 接近于 7, 在这样的条件下腐败细菌的侵染会更加迅速 禽蛋健康禽类所产生的鲜蛋内部本应是无菌的, 但是鲜蛋中经常可发现微生物存在, 即使是刚产出的鲜蛋也是如此 微生物污染的来源 :1 卵巢内病原菌通过血液循环进入卵巢, 在蛋黄形成时进入蛋中 常见的感染菌有雏沙门氏菌 (S.pullora) 鸡沙门氏菌 (S.gallinarum) 等 2 排泄腔 ( 生殖道 ) 禽类的排泄腔内含有一定数量的微生物, 当蛋从排泄腔排出体外时, 由于蛋内遇冷收缩, 附在蛋壳上的微生物可穿过蛋壳进入蛋内 3 环境鲜蛋蛋壳的屏障作用有限, 蛋壳上有许多大小为 4~6μm

10 的气孔, 外界的各种微生物都有可能进入, 特别是贮存期长或经过洗涤的蛋, 在高温 潮湿的条件下, 环境中的微生物更容易借水的渗透作用侵入蛋内 鲜乳刚生产出来的鲜乳总是会含有一定数量的微生物, 这是由于即使是临床上健康乳畜的乳房内, 也可能生存有一些细菌, 特别是乳头管及其分枝, 常生存着特定的乳房菌群 主要有微球菌属 链球菌属 乳杆菌属 当乳畜患乳房炎时, 乳房内还会含有引起乳房炎的病原菌, 如无乳链球菌 (Str.agalactia) 化脓棒状杆(Cor.pyogenes) 乳房链球菌和金黄色葡萄球菌等 患有结核或布氏杆菌病时, 乳中可能有相应的病原菌存在 鱼类鱼类生活在水域中, 由于水域中含有多种微生物, 所以鱼的体表 鳃 消化道内都有一定数量的微生物 活鱼体表附着的细菌有 10 2 ~10 7 cfu/cm 2, 鱼的肠液中含细菌数为 10 5 ~10 8 cfu/ml 因此, 刚捕捞的鱼体所带有的细菌主要是水生环境中的细菌 主要有假单胞菌属 黄色杆菌属 无色杆菌属等, 淡水中的鱼还有产碱杆菌属 气单胞菌属和短杆菌属 (Brevibacterium) 等 近海和内陆水域中的鱼可能受到人或动物的排泄物污染, 而带有病原菌如副溶血性弧菌 它们在鱼体上存在的数量不多, 不会直接危害人类健康, 但如贮藏不当, 病原菌大量繁殖后可引起食物中毒 在鱼上发现的病原菌还可能有沙门氏菌 志贺氏菌和霍乱弧菌 红斑丹毒丝菌 产气荚膜梭菌, 它们也是由环境污染的 捕捞后的鱼类在运输 贮存 加工 销售等环节中, 还可能进一步被陆地上的各种微生物污染 这些微生物主要有微球菌属和芽孢杆菌属, 其次还有变形杆菌 大肠杆菌 赛氏杆菌 八叠球菌及梭状芽孢杆菌 植物性原料健康的植物在生长期与自然界广泛接触, 其体表存在有大量的微生物, 所以收获后的粮食一般都含有其原来生活环境中的微生物 据测定, 粮食含有的细菌 >10 3 cfu/g 这些细菌多属于假单胞菌属 微球菌属 乳杆菌属和芽孢杆菌属等 此外, 粮食中还含有相当数量的霉菌孢子, 主要是曲霉属 青霉属 交链孢霉属 镰刀霉属等, 还有酵母菌 粮食在加工过程中, 经过洗涤和清洁处理, 可除去籽粒表面上的部分微生物, 但某些加工工序可使其受环境 机具及操作人员携带的微生物再次污染 多数市售面粉的细菌含量 >10 3 cfu/g, 同时还含有 50~100 cfu/g 左右的霉菌孢子 植物体表还会附着有植物病原菌及来自人畜粪便的肠道微生物及病原菌 健康的植物组织内部应该是无菌或仅有极少数菌, 如有时外观看上去是正常的水果或蔬菜, 其内部组织中也可能有某些微生物的存在 有人从苹果 樱桃等组织内部分离出酵母菌, 从番茄组织中分离出酵母菌和假单孢菌属的细菌 这些微生物是果蔬开花期侵入并生存于果实内部的 感染病后的植物组织内部会存在大量的病原微生物, 这些病原微生物是在植物的生长过程中通过根 茎 叶 花 果实等不同途径侵入组织内部的 果蔬汁是以新鲜水果为原料, 经加工制成的 由于果蔬原料本身带有微生物, 而且在加工过程中还会再次感染, 所以制成的果蔬汁中必然存在大量微生物 果汁的 ph 值

11 一般在 2.4~4.2 之间, 糖度较高, 可达 60~70 Brix, 因而在果汁中生存的微生物主要是酵母菌, 其次是霉菌和极少数的细菌 二 微生物污染食品的途径食品在生产加工 运输 贮藏 销售以及食用过程中都可能遭受到微生物的污染, 其污染的途径可分为两大类 : 内源性污染和外源性污染 凡是作为食品原料的动植物体在生活过程中, 由于本身带有的微生物而造成食品的污染称为内源性污染, 也称第一次污染 如畜禽在生活期间, 其消化道 上呼吸道和体表总是存在一定类群和数量的微生物 当受到沙门氏菌 布氏杆菌 炭疽杆菌等病原微生物感染时, 畜禽的某些器官和组织内就会有病原微生物的存在 当家禽感染了鸡白痢 鸡伤寒等传染病, 病原微生物可通过血液循环侵入卵巢, 在蛋黄形成时被病原菌污染, 使所产卵中也含有相应的病原菌 食品在生产加工 运输 贮藏 销售 食用过程中, 通过水 空气 人 动物 机械设备及用具等而使食品发生微生物污染称外源性污染, 也称第二次污染 其污染途径来自多方面, 主要通过水 空气 人和动物 用具及杂物等而污染食品, 这些也是食品加工当中最常见的污染途径, 以下重点介绍 1. 由土壤引起的污染有一些植物性食品的原料来自田园, 例如蔬菜 水果等, 它们表面污染有土壤中的微生物 有人对刚从田里采来的番茄进行检验, 结果番茄含有酵母菌和细菌 cfu/g 细菌芽孢 个 /g 霉菌 cfu/g 它们均可随果实进入食品工厂而污染车间内的空气和用具, 最后则对半成品或成品的质量产生影响 2. 通过水而污染水既是食品的配料成分, 也是清洗 冷却 冰冻不可缺少的物质 各种天然水源包括地上水 ( 海水 河水 湖水 塘水 ) 和地下水 ( 深井水 泉水 ), 不仅是微生物的污染源, 也是微生物污染食品的主要途径 很多情况下水是微生物污染食品的媒介 深井和泉水水源因不受外来微生物的污染, 不会有病原微生物存在, 非病原微生物的含量也极少, 有时甚至无菌检出, 在未污染的情况下是安全的 食品生产过程中如果直接应用未经净化消毒的地面水则会有较多的微生物污染食品, 同时还可能有其他污染物和有毒物品使食品污染, 这是食品加工卫生所不允许的 自来水是将天然水净化消毒而供饮用, 达到了国家卫生标准 因此在正常情况下不受外来微生物污染, 也就起不了传播微生物途径的作用, 用于食品加工是安全的但有时遇到自来水管有漏洞 管道中压力不足以及暂时变成负压时, 就会引起管道周围泥土中的微生物进入管道, 在雨后的自来水中就会出现细菌数剧增的现象 自来水中发现有大量微生物存在就说明水已被有机物污染, 若用这种水来处理食品, 不仅会引起微生物污染, 同时还有将其他物质带入食品中去的危险 有时在应用洁净自来水的过程中, 由于方法不当, 自来水仍可能成为污染食品的媒介 如在屠宰加工场中经常可以发现屠宰后牲畜体表沙门氏菌检出

12 率明显高于宰前牲畜粪便中沙门氏菌的检出率, 原因在于一系列宰杀 除毛 拉肠的工序过程中, 皮毛肠道内容物通过水的散布而导致微生物污染范围扩大, 这些微生物也经常通过用水造成畜体之间的相互污染并通过污水的排出向周围环境扩散 3. 通过空气而污染空气中的微生物分布是不均匀的, 空气中微生物的变动情况与灰尘变动的情况大体相似 随着灰尘, 水沫的飞扬或沉降, 使微生物附着在食品上 此外人体的痰沫 鼻涕与唾液的小水滴中含有的微生物, 在讲话 咳嗽或打喷嚏时均可直接或间接污染食品 人在讲话或咳嗽时, 距人体 1.5 m 以内的范围是直接污染区, 大的水滴呈浮游状停留在空气中能达 30min 之久, 小的水珠可在空气中停留 4~6 h, 因此食品暴露在空气中被微生物污染是不可避免的, 而且接触时间愈长, 污染则愈严重 4. 通过人和动物而污染人接触食品时, 人体可作为媒介, 引起微生物污染 从事食品生产的人员, 如果他们的身体 衣帽不经常清洗, 不保持清洁, 就会有大量的微生物附着其上, 通过皮肤 毛发 衣帽与食品接触而造成污染 如果他们本身患有某些疾病 接触食品部位不注意清洗消毒, 指甲不经常修剪, 那么就更容易使食品引起微生物污染 有些动物也会使食品引起微生物污染, 而且有食品的地方, 正是某些动物活动频繁的场所, 例如老鼠 苍蝇 蟑螂等, 它们的皮肤及消化道上带有大量微生物, 常常把微生物传播至食品, 引起污染 实验证明, 每只苍蝇带有的细菌 >10 7 cfu,80% 的苍蝇肠道中带有痢疾杆菌 鼠类粪便中带有沙门氏菌等病源微生物, 因此食品中如有沙门氏菌污染很可能与鼠类接触食品有关 5. 通过用具及杂物而污染应用于食品的一切用具, 如原料的包装容器 运输工具 生产加工设备和成品的包装材料或容器, 在未消毒或灭菌前总是带有不同数量的微生物, 都有可能成为媒介使微生物污染食品, 遇到包装物品的更换和运输环节的变动就会造成更多的污染 特别是装运易腐败食品的运输工具和容器, 如果用过后未经彻底清洗和消毒而连续使用, 就会使运输工具和容器中残留较多数量的微生物, 从而污染以后装运的食品 食品在加工过程中, 通过不加高热的设备越多, 造成污染的机会也越多 已经过消毒或灭菌的食品, 常因包装材料或容器不洁净, 使含菌不多的食品或无菌的食品重新遭受污染, 这样的食品就不易保藏, 或者产品一经包装完毕后, 即已成为不符合食品卫生质量指标的制品 三 食品中微生物污染的控制要完全清除食品中微生物引起的人 畜疾患和食物中毒, 以及防止食品在贮运中由微生物引起的变质, 仅从微生物学的角度来看是完全可以做得到的 例如, 利用高温长时间的灭菌就可以使食品中的微生物全部杀灭 然而这样的无菌食品就难于符合人们对食品既希望能不失去或尽可能少失去原有的营养价值, 又能保持食品原有的或应有的色 香 味和好的组织性状这一要求 故在清除食品中的微生物时, 还必须考虑到食品的营养成分和感官性状有无影响的问题 无论什么食品, 必须在保证无病原微生物和其

13 它毒害物的前提下, 再尽量考虑到人们所希望的 对食品的其它一些要求 虽然少量非病原微生物随食品进入人体后, 并不会对人体有什么危害, 可是在一定条件下, 存在于食品中的少量非病原微生物很容易引起食品腐败变质, 不利于保存 若食品中含有大量的杂菌, 不仅是难于保存, 而一旦被人摄食了此种食物后, 往往会引起食物中毒 从食品卫生角度看, 食品中含有大量杂菌, 是由于遭到严重污染的结果, 也就是食品不卫生的标志 同时, 含有大量杂菌的食品, 也必然会影响到食品消毒 灭菌的效果 综上所述, 要控制或排除微生物对食品的污染, 必须做好以下几个方面的工作 1. 控制原料污染食品原料在栽培 捕捞 屠宰 运输等过程中都有可能被微生物污染, 造成原材料的腐败变质, 造成加工工艺 消毒灭菌的困难, 影响产品的卫生质量 因此, 首先要注意原材料的选择与处理, 减少微生物的来源 被选用的食品材料应是无病和无寄生虫的物料 同时, 应及时洗涤, 清洗泥沙 杂质 腐烂变质部分及表面附着的部分微生物, 食品生产的水源 用水必须符合国家饮用水的卫生标准 ; 而人口密集和工矿业发达区 医院附近等的水域中, 微生物的种类和数量都很多, 均必须严格地经过人工净化和消毒处理, 而且使用方法也必须得当 2. 加强环境卫生管理食品工厂应建在远离重工业区, 周围不应有农药厂 化肥工厂 垃圾场 粪场 污水坑及大医院等, 以免受到废水 废气 废渣和病原微生物及其它污染物的污染, 对食品加工厂本身的污染物也必须进行无害化处理 垃圾和粪便可制成堆肥, 通过微生物的发酵作用, 产生高温而杀灭病原微生物和寄生虫卵蛹等 生活污水或工业污水应集中通过污水净化设备进行处理, 可用化学或生物的方法净化, 分解污水中的有机毒物, 杀灭病原微生物 3. 抓好食品生产的卫生管理首先是食品生产的场所, 应符合卫生要求, 易于清洗消毒, 空间可采用空气过滤器, 造成洁净的生产环境 ; 第二, 保持生产车间四周墙壁 天花板和地面等六面清洁 生产设备应该经常清洗消毒, 以减少微生物孳生的场所 第三, 严格执行各项生产卫生制度 生产中应注意简化工艺, 缩短生产流程, 做到生产自动化 密闭化和连续化, 尽量减少食品在空间暴露的时间, 做到不接触或少接触人手和其他未经消毒的物品, 这是降低微生物污染食品, 提高食品质量的有效措施 第四, 加强用水的管理和处理 第五, 食品从业人员必须身体健康, 并经常对从业人员进行有针对性的体检, 以便及时排除患者及病原菌携带者对消费者健康的威胁 从业人员应勤理发 剪指甲 洗手 洗澡, 保持个人卫生 ; 工作衣帽 口罩等要经常清洗, 保持清洁, 特别是操作前双手的清洗和消毒更为重要 4. 加强食品贮运 销售等过程中的卫生管理食品在制造过程中, 只要认真贯彻卫生管理的有关规定, 杜绝微生物污染, 生产出符合卫生质量标准的食品是不太困难的 但食品在储运 销售等环节中, 如何保证食品少受或不受微生物的污染, 显得非常重要 首先是注意贮存卫生, 杜绝微生物对食品的污染 控制微生物生长发育的各种因素, 防止微生物在食品中大量繁殖 引起食品变质 ; 其次是注意食品运输卫生, 主要是防止再次污染 ; 故必须专车运输, 特别是直接供食用的熟食制品, 更应有高度清洁的消毒专用车 ; 肉 鱼 蛋等易腐食品应在具有冷冻设备的条件下运输, 以防腐败变质 ; 食品运输时要注意生 熟分装, 食品与非食品分装, 严格禁止食品与化肥 农药等有毒物

14 质同车装运, 防止微生物及有毒物质或异味 异气物质污染食品 再次是必须重视食品的销售卫生, 食品在销售环节中被污染的机会甚多, 其卫生质量不易得到保证 ; 这一方面是从业人员不遵守卫生制度, 不讲究个人卫生所造成, 特别是手的清洁更为重要 ; 从业人员在销售食品时, 除应注意穿戴好工作衣帽外, 还要洗净双手, 推行工具售货, 避免用手直接接触食品 ; 另一方面是食品滞销积压 储存包装不良, 造成食品受外界环境的微生物污染 5. 抓好食品企业自身的卫生管理各食品企业必须有本企业的食品卫生管理与检验机构, 以保证食品卫生管理与检验工作 企业对本单位食品的卫生质量控制首先是规定有科学根据的生产工艺, 保留工艺记录, 把每个工段必须完成的卫生措施用表格固定下来, 每班填写, 卫生管理人员随时抽查, 把这项工作做为生产工段的任务 利用检验手段进行监测, 对卫生质量控制最有效 一般应对成品逐批检验 较先进的方式则是对生产工艺也利用检验手段进行因素分析 不仅检测成品, 还要经常对工具 工人的手 半成品进行微生物学检验, 从检验结果中分析出影响食品卫生质量并进一步提高的因素, 再反馈到工艺规程中加以改进, 如此循环反馈不断提高本企业的食品卫生质量 生产卫生质量有了保证, 便能更有利于提高食品的生产力, 也可以为发展食品资源, 扩大企业食品的花色品种和制定新的卫生标准, 提供参考资料 微生物广泛分布于自然界 食品中不可避免的会受到不同类型和数量的微生物污染, 当环境条件适宜时, 它们就会迅速生长繁殖, 造成食品的腐败与变质, 不仅降低了食品的营养和卫生质量, 而且还可能危害人体的健康 因此, 控制食品的腐败和食品的保藏, 无论在理论上或是在实践中都有重大的现实意义 第二节微生物引起食品腐败变质的条件 食品的腐败变质 (food spoilage) 是指食品受到各种内外因素的影响, 其原有化学性质或物理性质和感观性状发生变化, 降低或失去其营养价值和商品价值的过程 如鱼肉的腐臭 油脂的酸败 水果 蔬菜的腐烂和粮食的霉变等 食品腐败变质的机理实质上是食品中蛋白质 碳水化合物 脂肪等被污染的微生物的分解代谢作用或自身组织酶进行的某些生化过程 例如新鲜的肉 鱼类的后熟, 粮食 水果的呼吸等可以引起食品成分的分解 食品组织溃破和细胞膜碎裂, 为微生物的广泛侵入与作用提供条件, 结果导致食品的腐败变质 当然, 由于食品成分的分解过程和形成的产物十分复杂, 因此建立食品腐败变质的定量检测尚有一定的难度 食品的腐败变质原因较多 包括物理因素 化学因素和生物性因素 比如动 植物食品组织内酶的作用, 昆虫 寄生虫以及微生物的污染等 其中由微生物污染所引起

15 的食品腐败变质是最为重要和普遍的, 故本章只讨论有关由微生物引起的食品腐败变质问题 食品是微生物生长的天然培养基, 在加工 包装 运输和贮藏等过程中, 都可能被霉菌 细菌 酵母菌等微生物污染, 在合适的温 湿度条件下可以迅速生长, 产生各种毒素 食品加工前的原料, 也总是带有一定数量的微生物 ; 在加工过程中及加工后的成品, 也不可避免地要接触环境中的微生物, 因而食品中总是存在一定种类和数量的微生物 然而微生物污染食品后, 能否导致食品的腐败变质, 以及变质的程度和性质如何, 受多方面因素的影响 一般来说, 食品发生腐败变质, 与食品本身的性质 污染微生物的种类和数量以及食品所处的环境等因素有密切的关系 它们三者之间是相互作用 相互影响的 一 食品具备微生物生长繁殖的基本条件 1. 食品的营养成分食品含有蛋白质 糖类 脂肪 无机盐 维生素和水分等丰富的营养成分, 是微生物的良好培养基 因而微生物污染食品后很容易迅速生长繁殖造成食品的变质 但由于不同的食品中, 上述各种成分的比例差异很大, 同时各种微生物分解各类营养物质的能力不同, 这就导致了引起不同食品腐败的微生物类群也不同 如肉 鱼等富含蛋白质的食品, 容易受到对蛋白质分解能力强的变形杆菌 青霉等微生物的污染而发生腐败 ; 米饭等含糖类较高的食品, 易受到曲霉属 根霉属 乳酸菌 啤酒酵母等对碳水化合物分解能力强的微生物的污染而变质 ; 脂肪含量较高的食品, 易受到黄曲霉和假单胞杆菌等分解脂肪能力很强的微生物的污染而发生酸败变质 2. 食品的氢离子浓度各种食品都具有一定的氢离子浓度 根据食品 ph 范围的特点, 可将食品划分为两大类 : 酸性食品和非酸性食品 一般规定 ph 在 4.5 以上者, 属于非酸性食品 ;ph 在 4.5 以下者为酸性食品 例如动物食品的 ph 值一般在 5~7 之间, 蔬菜 ph 值在 5~6 之间, 它们一般为非酸性食品 ; 水果的 ph 值在 2~5 之间, 一般为酸性食品 各类微生物都有其最适宜的 ph 范围 食品中氢离子浓度可影响菌体细胞膜上电荷的性质 当微生物细胞膜上的电荷性质受到食品氢离子浓度的影响而改变后, 微生物对某些物质的吸收机制会发生改变, 从而影响细胞正常物质代谢活动和酶的作用, 因此食品 ph 高低是制约微生物生长 影响食品腐败变质的重要因素之一 大多数细菌最适生长的 ph 是 7.0 左右. 酵母菌和霉菌生长的 ph 范围较宽, 因而非酸性食品适合于大多数细菌及酵母菌 霉菌的生长 ; 细菌生长下限一般在 4.5 左右, ph 3.3~4.0 以下时只有个别耐酸细菌, 如乳杆菌属尚能生长, 故酸性食品的腐败变质主要是酵母和霉菌的生长 另外, 食品的 ph 也会因微生物的生长繁殖而发生改变 当微生物生长在含糖与蛋白质的食品基质中, 微生物首先分解糖产酸使食品的 ph 下降 ; 当糖不足时, 蛋白质被分解,pH 又回升 由于微生物的活动, 使食品基质的 ph 发生很大变化 当酸或碱积累到一定量时, 反过来又会抑制微生物的继续活动 3. 食品的水分

16 水分是微生物生命活动的必要条件 微生物细胞组成不可缺少水, 细胞内所进行的各种生物化学反应, 均以水分为溶媒 在缺水的环境中, 微生物的新陈代谢发生障碍, 甚至死亡 但各类微生物生长繁殖所要求的水分含量不同 因此, 食品中的水分含量决定了生长的微生物种类 一般来说, 含水分较多的食品, 细菌容易繁殖 ; 含水分少的食品, 霉菌和酵母菌则容易繁殖 食品中水分以游离水和结合水两种形式存在 微生物在食品上生长繁殖, 能利用的水是游离水, 因而微生物在食品中的生长繁殖所需水不是取决于总含水量 (%), 而是取决于水分活度 (Aw, 也称水活性 ) 因为一部分水是与蛋白质 碳水化合物及一些可溶性物质, 如氨基酸 糖 盐等结合, 这种结合水对微生物是无用的 因而通常使用水分活度来表示食品中可被微生物利用的水 水分活度 (Aw) 是指食品在密闭容器内的水蒸气压 (P) 与纯水蒸气压 (P0) 之比, 即 Aw=P/P0 纯水的 Aw=l; 无水食品的 Aw=0 由此可见, 食品的 Aw 值在 0~l 之间 表 l 2 给出了不同类群微生物生长的最低 Aw 值范围 从表 1-2 中可以看出, 食品的 Aw 值在 0.60 以下. 则认为微生物不能生长 一般认为食品 Aw 值在 0.64 以下, 是食品安全贮藏的防霉含水量 新鲜的食品原料, 例如鱼 肉 水果 蔬菜等含有较多的水分 Aw 值一般在 0.98~ 0.99, 适合多数微生物的生长 如果不及时加以处理, 很容易发生腐败变质 为了防止食品变质 最常用的办法, 就是降低食品的含水量, 使 Aw 值降低至 0.70 以下, 这样可以较长期地进行保存 许多研究报道,Aw 值在 0.80~0.85 之间的食品, 一般只能保存几天 ;Aw 值在 0.72 左右的食品, 可以保存 2~3 个月 ; 如果 Aw 在 0.65 以下, 则可保存 l~3 年 表 1-2 食品中主要微生物类群生长的最低 Aw 值范围微生物类群最低 Aw 值范围微生物类群最低 Aw 值大多数细菌 0.99~0.90 嗜盐性细菌 0.75 大多数酵母菌 0.94~0.88 耐高渗酵母 0.60 大多数霉菌 0.94~0.73 干性霉菌 0.65 在实际中, 为了方便也常用含水量百分率来表示食品的含水量, 并以此作为控制微生物生长的一项衡量指标 例如为了达到保藏目的, 奶粉含水量应在 8% 以下, 大米含水量应在 13% 左右, 豆类在 15% 以下, 脱水蔬菜在 14%~20% 之间 这些物质含水量百分率虽然不同, 但其 Aw 值约在 0.70 以下 4. 食品的渗透压渗透压与微生物的生命活动有一定的关系 如将微生物置于低渗溶液中, 菌体吸收水分发生膨胀, 甚至破裂 ; 若置于高渗溶液中, 菌体则发生脱水, 甚至死亡 般来讲, 微生物在低渗透压的食品中有一定的抵抗力, 较易生长, 而在高渗食品中, 微生物常因脱水而死亡 当然不同微生物种类对渗透压的耐受能力大不相同 绝大多数细菌不能在较高渗透压的食品中生长. 只有少数种能在高渗环境中生长 如盐杆菌属 (Halobacterium) 中的一些种, 在 20%~30% 的食盐浓度的食品中能够生

17 活 ; 肠膜明串珠菌能耐高浓度糖 而酵母菌和霉菌一般能耐受较高的渗透压 如异常汉逊氏酵母 (Hansenula anomala) 鲁氏酵母(saccharomyces rouxii) 膜毕赤氏酵母 (Pichia membranafaciens) 等能耐受高糖, 常引起糖浆 果酱 果汁等高糖食品的变质 霉菌中比较突出的代表是灰绿曲霉 (Aspergillus glaucus) 青霉属 芽枝霉属等 食盐和糖是形成不同渗透压的主要物质 在食品中加入不同量的糖或盐, 可以形成不同的渗透压 所加的糖或盐越多, 则浓度越高, 渗透压越大, 食品的 Aw 值就越小 通常为了防止食品腐败变质, 常用盐腌和糖渍方法来较长时间地保存食品 5. 食品的存在状态完好无损的食品, 一般不易发生腐败 如无破碎和伤口的马铃薯 苹果等. 可以放置较长时间 如果食品组织溃破或细胞膜碎裂, 则易受到微生物的污染而发生腐败变质 二 食品中微生物的主要特性在食品发生腐败变质的过程中, 起重要作用的是微生物 如果某一食品经过彻底灭菌或过滤除菌, 则食品长期贮藏也不会发生腐败 反之, 如果某一食品污染了微生物, 一旦条件适宜, 就会引起该食品腐败变质 所以说. 微生物的污染是导致食品发生腐败变质的根源 能引起食品发生腐败变质的微生物种类很多, 主要有细菌 酵母和霉菌 一般情况下细菌常比酵母菌占优势 在这些微生物中, 有病原菌和非病原菌, 有芽孢和非芽孢菌, 有嗜热性 嗜温性和嗜冷性菌, 有好气或厌气菌, 有分解蛋白质 糖类 脂肪能力强的菌 现将容易引起不同食品腐败变质的微生物概括为表 1 一 3: 表 1-3 引起腐败的微生物和部分食品腐败类型 食品腐败类型微生物 面包发霉产生粘液糖浆产生粘液发酵呈粉红色发霉新鲜水软腐果和蔬灰色霉菌腐烂菜黑色霉菌腐烂泡菜和 表面出现白膜酸菜新鲜腐败变黑 黑根霉 (Rhizopus niger) 青霉属(Penicillium) 黑曲霉 (Aspergillus niger) 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes) 酵母属(Saccharomyces) 接合酵母属 (Zygosaccharomyces) 玫瑰色微球菌 (Micrococcus roseus) 曲霉属(Aspergillus) 青霉属 (Penicallium) 根霉属 (Rhizopus) 欧文氏杆菌属(Erwinia) 葡萄孢属 (Botrytis) 黑曲霉 (Aspergillus niger) 假单胞菌属(Pseudomonas) 红酵母属 (Rhodotorula) 产碱菌属 (Alcaligenes) 梭菌属(Clostridium) 普通变形菌 (Proteus vulgaris) 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)

18 腐败假单胞菌 (Pseudomonas putrefaciens) 肉的 发霉 曲霉属 (Aspergillus) 根霉属(Rhizopus) 青霉属(Penicillium) 保存 变酸变绿色 变粘 假单胞菌属 (Psendomonas) 微球菌属(Micrococcus) 乳杆菌属 (Lactobacillus) 明串珠菌属 (Leuconostoc) 鱼 变色腐败 假单胞菌属 (Psendomonas) 产碱菌属(Alcaligenes) 黄杆菌属 (Flavobacterium) 腐败桑瓦拉菌 (Shewanella putrefaciens) 蛋 绿色腐败 褪色腐败黑色腐败 荧光假单胞菌 (Psendomonas fluorescens) 假单胞菌属 (Psendomonas) 产碱菌属 (Alcaligenes) 变形菌属(Proteus) 家禽 变粘 有气味 假单胞菌属 (Psendomonas) 产碱菌属(Alcaligenes) 浓缩桔汁 失去风味 乳杆菌属 (Lactobacillus) 明串珠菌属(Leuconostoc) 醋杆菌属 (Acetobacter) 1. 分解蛋白质类食品的微生物分解蛋白质而使食品变质的微生物, 主要是细菌 霉菌和酵母菌, 它们多数是通过分泌胞外蛋白酶来完成的 肉 鱼 禽蛋和豆制品等富含蛋白质的食品, 主要是以蛋白质分解为其腐败变质特征 由微生物引起蛋白质食品发生的变质, 通常称为腐败 蛋白质在动 植物组织酶以及微生物分泌的蛋白酶和肽链内切酶等的作用下, 首先水解成多肽, 进而裂解形成氨基酸 氨基酸通过脱羧基 脱氨基 脱硫等作用, 进一步分解成相应的氨 胺类 有机酸类和各种碳氢化合物, 食品即表现出腐败特征 微生物蛋白酶肽链内切酶脱羧基作用 食物中蛋白质多肽氨基酸氨十胺十硫化氢等组织蛋蛋白酶脱氨基 脱硫等作用 蛋白质分解后所产生的胺类是碱性含氮化合物质, 如胺 伯胺 仲胺及叔胺等具有挥发性和特异的臭味 各种不同的氨基酸分解产生的腐败胺类和其他物质各不相同 甘氨酸产生甲胺, 鸟氨酸产生腐胺, 精氨酸产生色胺进而又分解成吲哚, 含硫氨基酸分解产生硫化氢和氨 乙硫醇等 这些物质都是蛋白质腐败产生的主要臭味物质 细菌中, 芽孢杆菌属 梭状芽孢杆菌属 假单胞菌属 变形杆菌属 链球菌属等分解蛋白质能力较强, 即使无糖存在, 它们在以蛋白质为主要成分的食品上生长良好 ; 肉毒梭状芽孢杆菌分解蛋白质能力很微弱, 但该菌为厌氧菌, 可引起罐头的腐败变质 ; 小球菌属 葡萄球菌属 黄杆菌属 产碱杆菌属 埃希氏杆菌属等分解蛋白质较弱 许多霉菌都具有分解蛋白质的能力, 霉菌比细菌更能利用天然蛋白质 常见的有青霉属 毛霉属 曲霉属 木霉属 根霉属等 多数酵母菌对蛋白质的分解能力极弱 如啤酒酵母属 毕赤氏酵母属 汉逊氏酵母属 假丝酵母属 球拟酵母属等能使凝固的蛋白质缓慢分解 但在某些食品上, 酵母菌竞争不过细菌, 往往是细菌占优势

19 2. 分解碳水化合物类食品的微生物食品中的碳水化合物包括纤维素 半纤维素 淀粉 糖原以及双糖和单糖等 含这些成分较多的食品主要是粮食 蔬菜 水果和糖类及其制品 在微生物及动植物组织中的各种酶及其他因素作用下, 这些食品组成成分被分解成单糖 醇 醛 酮 羧酸 二氧化碳和水等低级产物 由微生物引起糖类物质发生的变质, 习惯上称为发酵或酵解 分解糖类的微生物碳水化合物有机酸十酒精十气体等碳水化合物含量高的食品变质的主要特征为酸度升高 产气和稍带有甜味 醇类气味等 食品种类不同也表现为糖 醇 醛 酮含量升高或产气 (CO2) 有时常带有这些产物特有的气味 水果中果胶可被一种曲霉和多酶梭菌 (Cl.multifermentans) 所产生的果胶酶分解, 并可使含酶较少的新鲜果蔬软化 细菌中能分解淀粉的为数不多, 主要是芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的某些种, 如枯草杆菌 巨大芽孢杆菌 马铃薯芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌 淀粉梭状芽孢杆菌等 它们是引起米饭发酵 面包黏液化的主要菌株 能分解纤维素和半纤维素只有芽孢杆菌属 梭状芽孢杆菌属和八叠球菌属的一些种 但绝大多数细菌都具有分解某些糖的能力 特别是利用单糖的能力极为普遍 某些细菌能利用有机酸或醇类, 能分解果胶的细菌主要有芽孢杆菌属 欧氏植病杆菌属 梭状芽孢杆菌属中的部分菌株, 它们参与果蔬的腐败 多数霉菌都有分解简单碳水化合物的能力 能够分解纤维素的霉菌并不多, 常见的有青霉属 曲霉属 木霉属等中的几个种, 其中绿色木霉 里氏木霉 康氏木霉分解纤维素的能力特别强 分解果胶质的霉菌活力强的有曲霉属 毛霉属 蜡叶芽枝霉等 曲霉属 毛霉属和镰刀霉属等还具有利用某些简单有机酸和醇类的能力 绝大多数酵母不能使淀粉水解 ; 少数酵母如拟内胞霉属能分解多糖 ; 极少数酵母如脆壁酵母能分解果胶 ; 大多数酵母有利用有机酸的能力 3. 分解脂肪类食品的微生物虽然脂肪发生变质主要是由于化学作用所引起的, 但是许多研究表明, 它与微生物也有着密切的关系 脂肪发生变质的特征是产生酸和刺激的 哈喇 气味 人们一般把脂肪发生的变质称为酸败 脂肪酸败也包括脂肪的加水分解作用, 产生游离脂肪酸 甘油及其不完全分解的产物 如甘油一酯 甘油二酯 微生物的解脂酶等食物中脂肪脂肪酸 + 甘油 + 其它产物 脂肪酸可进而断链形成具有不愉快味道的酮类或酮酸 ; 不饱和脂肪酸的不饱和键可形成过氧化物 脂肪酸也可再氧化分解成具有特臭的醛类和醛酸, 即所谓的 哈喇 气味 这就是食用油脂和含脂肪丰富的食品发生酸败后感官性状改变的原因 脂肪自身氧化以及加水分解所产生的复杂分解产物, 使食用油脂或食品中脂肪带有若干明显特征 : 首先是过氧化值上升, 这是脂肪酸败最早期的指标 ; 其次是酸度上升, 羰基 ( 醛酮 ) 反应阳性 脂肪酸败过程中, 由于脂肪酸的分解其固有的碘价 ( 值 ) 凝固点 ( 熔点 ) 比重 折光指数 皂化价等也必然发生变化, 因而形成脂肪酸败所特有的 哈

20 喇 味 ; 肉 鱼类食品脂肪的超期氧化变黄 ; 鱼类的 油烧 现象等也常被作为油脂酸败鉴定中较为实用的指标 分解脂肪的微生物能生成脂肪酶, 使脂肪水解为甘油和脂肪酸 一般来讲, 对蛋白质分解能力强的需氧性细菌, 同时大多数也能分解脂肪 细菌中的假单胞菌属 无色杆菌属 黄色杆菌属 产碱杆菌属和芽孢杆菌属中的许多种, 都具有分解脂肪的特性 能分解脂肪的霉菌比细菌多, 在食品中常见的有曲霉属 代氏根霉 娄地青霉和芽枝霉属等 酵母菌分解脂肪的菌种不多, 主要是白地霉 解脂假丝酵母, 特别是解脂假丝酵母对糖类不发酵, 但分解脂肪和蛋白质的能力却很强 因此, 在肉类食品 乳及其制品中脂肪酸败时, 也应考虑到是否因酵母而引起 三 食品所处的环境条件在某种意义上讲, 引起食品变质, 环境因素也是非常重要的 食品中污染的微生物能否生长, 还要看环境条件 例如, 天热饭菜容易变坏, 潮湿粮食容易发霉 影响食品变质的环境因素和影响微生物生长繁殖的环境因素一样, 也是多方面的 由于篇幅有限, 在这里. 仅就影响食品变质的最重要的几个因素, 例如温度 湿度和气体等进行讨论 1. 温度根据微生物对温度的适应性, 可将微生物分为三个生理类群, 即嗜冷 嗜温 嗜热三大类微生物 每一类群微生物都有最适宜生长的温度范围, 但这三群微生物又都可以在 20~30 之间生长繁殖 当食品处于这种温度的环境中 各种微生物都可生长繁殖而引起食品的变质 ⑴. 低温对微生物生长的影响低温对微生物生长极为不利 但由于微生物具有一定的适应性, 在 5 左右或更低的温度 ( 甚至 -20 以下 ) 下仍有少数微生物能生长繁殖, 使食品发生腐败变质, 我们称这类微生物为低温微生物 低温微生物是引起冷藏 冷冻食品变质的主要微生物 食品在低温下生长的微生物主要有假单胞杆菌属 黄色杆菌属 无色杆菌属等革兰氏阴性无芽孢杆菌 ; 小球菌属 乳杆菌属 小杆菌属 芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属等革兰氏阳性细菌 ; 假丝酵母属 隐球酵母属 圆酵母属 丝孢酵母属等酵母菌 ; 青霉属 芽枝霉属 葡萄孢属和毛霉属等霉菌 食品中不同微生物生长的最低温度见表 1-4 表 1-4 食品中微生物生长的最低温度生长最低生长最低食品微生物食品微生物温度 ( ) 温度 ( ) 猪肉细菌 -4 乳细菌 0~-1 牛肉霉菌 酵母菌 细菌 -1~1.6 冰淇凌细菌 -3~-10 羊肉霉菌 酵母菌 细菌 -1~-5 大豆霉菌 -6.7 火腿细菌 1~2 豌豆霉菌 酵母菌 -4~6.7 腊肠细菌 5 苹果霉菌 0 熏肋肉细菌 -5~-10 葡萄汁酵母菌 0 鱼贝类细菌 -4~-7 浓桔汁酵母菌 -10

21 草莓霉菌 酵母菌 细菌 -0.3~-6.5 这些微生物虽然能在低温条件下生长 但其新陈代谢活动极为缓慢, 生长繁殖的速度也非常迟缓, 因而它们引起冷藏食品变质的速度也较慢 有些微生物在很低温度下能够生长, 其机理还不完全清楚 但至少可以认为它们体内的酶在低温下仍能起作用 另外也观察到嗜冷微生物的细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高 推测可能是由于它们的细胞质膜在低温下仍保持半流动状态, 能进行活跃的物质传递 而其他生物则由于细胞膜中饱和脂肪酸含量高 在低温下成为固体而不能履行其正常功能 ⑵. 高温对微生物生长的影响高温, 特别在 45 以上, 对多数微生物生长来讲 是十分不利的 在高温条件下, 微生物体内的酶 蛋白质 脂质体很容易发生变性失活, 细胞膜也易受到破坏, 这样会加速细胞的死亡 温度愈高, 死亡率也愈高 然而, 在高温条件下 仍然有少数微生物能够生长 通常把凡能在 45 以上温度条件下进行代谢活动的微生物, 称为高温微生物或嗜热微生物 嗜热微生物之所以能在高温环境中生长, 是因为它们具有与其他微生物所不同的特性 如它们的酶和蛋白质对热稳定性比中温菌强得多 ; 它们的细胞膜上富含饱和脂肪酸 由于饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键, 从而使膜能在高温下保持稳定 ; 它们的生长曲线独特, 和其他微生物相比, 延滞期 对数期都非常短, 进入稳定期后, 迅速死亡 在食品中生长的嗜热微生物, 主要是嗜热细菌 如芽孢杆菌属中的嗜热脂肪芽孢杆 菌 (Bacillus stearothermophilus) 凝结芽孢杆菌(B.coagulans); 梭状芽孢杆菌属中的肉毒梭菌 (Clostridium botulinum) 热解糖梭状芽孢杆菌 (Cl.thermosaccharolyticum) 致黑梭状芽孢杆菌(Cl.nigrificans); 乳杆菌属和链球菌属中的嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 嗜热乳杆菌等 霉菌中纯黄丝衣霉 (Byssochlamys fulva) 耐热能力也很强 在高温条件下, 嗜热微生物的新陈代谢活动加快, 所产生的酶对蛋白质和糖类等物质的分解速度也比其他微生物快, 因而使食品发生变质的时间缩短 由于它们在食品中经过旺盛的生长繁殖后, 很容易死亡, 所以在实际中, 若不及时进行分离培养, 就会失去检出的机会 高温微生物造成的食品变质主要是酸败, 分解糖类产酸而引起 2. 气体微生物与氧有着十分密切的关系 一般来讲, 在有氧的环境中, 微生物进行有氧呼吸, 生长 代谢速度快, 食品变质速度也快 ; 缺乏氧条件下, 由厌氧性微生物引起的食品变质速度较慢 氧存在与否决定着兼性厌氧微生物是否生长和生长速度的快慢 例如当 Aw 值是 0.86 时, 无氧存在情况下, 金黄色葡萄球菌不能生长或生长极其缓慢, 而在有氧情况下则能良好生长 新鲜的食品原料中, 由于组织内一般存在着还原性物质 ( 如动物原料组织内的巯基 ), 因而具有抗氧化能力 在食品原料内部生长的微生物绝大部分应该是厌氧微生物 ; 而在原料表面生长的则是需氧微生物 食品经过加工, 物质结构改变, 需氧微生物能进入组织内部, 食品更易发生变质 另外, 氢和二氧化碳等气体的存在, 对微生物的生长也有一定的影响 实际中可通

22 过控制它们的浓度来防止食品变质 3. 湿度空气中的湿度对于微生物生长和食品变质来讲, 起着重要的作用, 尤其是未经包装的食品 例如把含水量少的脱水食品放在湿度大的地方, 食品则易吸潮, 表面水分迅速增加 长江流域梅雨季节, 粮食 物品容易发霉, 就是因为空气湿度太大 ( 相对湿度 70 % 以上 ) 的缘故 Aw 值反映了溶液和作用物的水分状态, 而相对湿度则表示溶液和作用物周围的空气状态 当两者处于平衡状态时,Aw 100 就是大气与作用物平衡后的相对湿度 每种微生物只能在一定的 Aw 值范围内生长, 但这一范围的 Aw 值要受到空气湿度的影响 第三节微生物与食物中毒 食品在生产 加工 运输 贮藏 发售 制作以至食用过程中都可能受到不利于营养卫生的有害因素污染, 主要有物理性 化学性和生物性等因素, 其中微生物污染食品后造成危害健康的现象最易发生而且较为多见 微生物污染了食品, 在食品中生长繁殖后, 除引起食品的腐败变质外, 还可导致误食者的食物中毒, 而危害人体健康乃至危及生命安全 微生物污染主要有 : 细菌与细菌毒素 ; 霉菌与霉菌毒素 一 食物中毒概述 1. 食物中毒的概念食品卫生国家标准 GBl4938 食物中毒诊断标准及技术处理总则 对食物中毒给予了界定 食物中毒, 指摄入了含有生物性 化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性 ( 不属于传染病 ) 的急性 亚急性疾病 即食物中毒指通过饮料或食物及其盛具 容器 包装材料进入人体的某种致病性微生物及其毒素 有害有毒的化学物质 ( 包括有毒动植物 ) 等引起的, 多数是以急性胃肠炎症状为主要特征的一群疾病 但不包括已知的传染病, 寄生虫病 人畜共患性疾病 食物过敏和暴饮暴食所引起的急性胃肠炎等食源性疾病 2. 食物中毒的特点食物中毒常呈集体性爆发, 其种类很多, 病因也很复杂, 一般具有下列共同特点 : (1) 潜伏期较短, 来势急剧, 在短时间内可能有很多人同时发病 (2) 病人都有大致相同的临床表现 (3) 发病和吃某种有毒食品有关 凡进食这种有毒食品的人大都发病, 没有进食该种有毒食品的人不发病 发病和食物有明显关系, 一旦停止食用这种有毒食品, 发病立即停止 (4) 发病率高, 人与人之间不直接传染 一般没有传染病流行时的余波

23 ⒊ 食物中毒的分类食物中毒有多种多样, 其分类有按食品中所含病因的种类而分类者 ; 有按食物中毒发病机理而分类者 ; 也有按症状的异同而分类者 最常见的分类方法是按病原物质分类, 将食物中毒分为五类 ⑴. 细菌性食物中毒是指由于食入被病原菌或其有毒代谢产物污染的食物后, 所引起的以急性肠胃炎为主要中毒症状的疾病 细菌性食物中毒是食物中毒中最常见的一类, 通常有明显的季节性, 多发生于气候炎热的季节, 一般以 5~10 月份最多 发病率较高, 但病死率一般较低 ⑵. 真菌性食物中毒指食入被真菌及其毒素污染的食物而引起的食物中毒 有一定的地区性, 如霉变甘蔗中毒发生在北方 季节性因真菌繁殖 产毒的最适温度不同而异 发病率较高, 病死率因真菌的种类不同而有所差别 ⑶. 动物性食物中毒指摄入动物性有毒食品引起的食物中毒 发病率和病死率因动物性中毒食品种类不同而有所差异, 有一定的地区性 如河豚鱼中毒常见于海河交界地区, 病死率高 ⑷. 植物性食物中毒摄入植物性中毒食品引起的食物中毒 如毒蕈 发芽马铃薯 木薯等引起的中毒 季节性 地区性比较明显, 多散在发生, 发病率 病死率因引起中毒的食品种类不同而异 ⑸. 化学性食物中毒摄入化学性有毒食品引起的食物中毒 季节性 地区性均不明显 发病率 病死率一般都比较高 如农药 亚硝酸盐中毒等 二 细菌性食物中毒出现在食品中的细菌其种类繁多, 包括能引起食物中毒 人畜共患传染病以及其他以食品作为传播媒介的致病菌 ; 还包括能引起食品腐败变质并可作为食品受到污染标志的非致病菌 所谓细菌性食物中毒是指由于食入被病原菌或其有毒代谢产物污染的食物后, 所引起的以急性肠胃炎为主要中毒症状的疾病 是食物中毒事例中最为常见的一类 全年皆可发生, 但在夏秋季节发生较多, 因该时期微生物容易生长繁殖和产毒, 加之此时期内人体防御机能往往降低, 易感性增高 诱发的食物主要为动物性食品, 如肉 鱼 奶 蛋类等及其制品 ; 植物性食物, 如剩饭 糯米凉糕 豆制品等 其共同的临床表现为 : 潜伏期短 来势急剧 食用者集体发病且发病率高, 发烧 呕吐 腹痛腹泻等急性胃肠炎症状, 但无传染性, 只与食物有关 根据临床表现的不同, 有时将细菌性食物中毒分为三类, 第一类, 感染型食物中毒, 是指人体食入含有大量活的病菌的食物后, 引起消化道感染而造成的中毒, 有上述典型的临床表现, 又称胃肠型食物中毒 引起此类中毒型的细菌, 常见的有 : 沙门氏菌属 副溶血性弧菌 变形杆菌 致病性大肠杆菌 蜡样芽孢杆菌 魏氏梭菌及金黄色葡萄球菌等 第二类, 毒素型食物中毒, 是指人体食入了含有细菌毒素的食物后所引起的中毒, 既使无活菌随食物侵入人体仍可能发生中毒 它能引起眼肌 咽部肌肉麻痹, 重者可影响颅神经乃至死亡, 故又称神经型食物中毒 细菌的毒素可分为肠毒素及外毒素两种 第三类, 其他, 由于中毒机理不明, 难以确切区分的细菌性食物中毒, 都属此类 我国常见细菌性食物中毒的特征见表 1-5

24 表 1-5 细菌性食物中毒的主要特征 病源菌常见食品潜伏期病程产生的主要症状重点检查材料 沙门氏菌 副溶血性弧菌 变形杆菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 致病性大肠埃希氏菌 肉类 乳类 蛋品 水产品 腌制品 肉 蛋 水产品 奶 蛋 肉 水产品 凉拌菜 肉类食品 最短 6~8 h, 长达 2~5h 8~24h 3~5h, 长达 16h 10d 左右, 经水或食物暴发 3~5d 1~2h 3~7d 1~3d 1~3d 3~14d 1~3d 空肠弯曲菌肉 牛奶 水 1~10d 12h~7d 恶心呕吐 腹痛 发热 (38 ~40 ) 出冷汗 头痛 全身疼痛恶心 呕吐 腹痛 ( 以上腹部为主 ) 腹泻( 多为水样便或带血 ) 图 1 恶心 呕吐 腹痛 腹 泻 发热 (38 ) 恶心 呕吐 腹痛 腹泻 头痛 发热 结节性红斑 恶心 呕吐 腹痛 腹泻 水样便或粘液便 发热 ( 不超过 39 ) 发热 头痛 臃晏 背痛 肌肉痛 战栗 呕吐 腹痛 粪便 食品 血液 粪便 食品 食品 粪便 粪便 食品 粪便 食品 肉 牛奶 水等 椰毒假单胞菌酵米面亚种 蜡样芽孢杆菌 葡萄球菌 ( 肠毒素 ) 酵米面 变质银耳 米饭 肉 乳 淀粉类制品 肉 乳 淀粉类制品 1~48h, 一般 1~10h 30min~ 60min, 长达 8h 30min~6h 1~14d 恶心 呕吐 发热 黄疸 昏迷 谵语 四肢抽搐 少尿 血尿 尿闭 休克 酵米面 变质银耳 醋 凉粉 约 1d 恶心 呕吐 腹痛 腹泻食品 呕吐物 1~2d 恶心 呕吐 ( 频繁而剧烈 ) 腹痛 腹泻 食品 呕吐物 溶血性链球菌 粪链球菌 肉毒梭菌 ( 肉毒毒素 ) 产气荚膜梭菌 ( 魏氏梭菌 ) 肉类 ( 特别是 牛 猪肉 ) 肉 乳 水产品 冷食 罐头 香肠 鱼 豆制品 肉类食品 6~12h 5~10h 2h~14d, 平均 1~2d 8~22h, 平均 1~2d 2~7d 1~2d 2~20d 恶心 呕吐 腹痛 腹泻 尿急 尿频 关节炎 膝关 节痛 头痛 中等程度发热, 咽头及扁桃体红肿, 有白膜恶心 呕吐 腹痛 腹泻 少数发热 咽食困难, 复视 失音 呼吸困难 食品 咽头涂抹 食品 呕吐物 粪便 食品 呕吐物 1~2d 腹痛 腹泻 少数有呕吐粪便 食品 三 真菌性食物中毒真菌性食物中毒主要是指真菌毒素的食物中毒 真菌毒素 (Mycotoxin) 是真菌的代谢产物, 主要产生于碳水化合物性质的食品原料, 经产毒的真菌繁殖而分泌的细胞外

25 毒素 其中产毒素的真菌以霉菌为主 霉菌在自然界分布很广, 同时由于其可形成各种孢子, 因而很容易污染食品 霉菌污染食品后不仅可造成腐败变质, 而且有些霉菌还可产生毒素, 造成误食人畜霉菌毒素中毒, 并产生各种中毒症状 霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次生代谢产物, 自从 20 世纪 60 年代发现强致癌的黄曲霉毒素以来, 霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视 霉菌毒素通常具有耐高温, 无抗原性, 主要侵害实质器官的特性, 而且霉菌毒素多数还具有致癌作用 因此, 粮食及食品由于霉变不仅会造成经济损失, 有些还会造成误食人畜急性或慢性中毒, 甚至导致癌症 ⒈ 霉菌产毒的特点霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌, 而产毒菌种中也只有一部分菌株产毒 产毒菌株的产毒能力还表现出可变性和易变性, 产毒菌株经过累代培养可以完全失去产毒能力, 而非产毒菌株在一定情况下, 也会出现产毒能力, 在实际工作中, 应该随时考虑这种相对的概念 霉菌毒素的产生并不具有一定的严格性 即一种菌种或菌株可以产生几种不同的毒素, 而同一种霉菌毒素也会由几种霉菌产生 产毒霉菌产生毒素也需要一定条件, 主要是基质 ( 食品 ) 水分 湿度 温度及空气流通情况 霉菌污染食品在上面繁殖是产毒的先决条件, 而霉菌能否在食品上繁殖又与食品种类和环境因素等多方面的影响有关 一般情况下, 霉菌在天然食品上比在人工合成培养基上更易繁殖, 不同的食品, 容易污染和繁殖的霉菌种类也有所不同, 如花生 玉米的黄曲霉及毒素的检出率就很高, 小麦 玉米以镰刀菌 (Fusarium) 及其毒素污染为主, 青霉及其毒素主要在大米中出现 ⒉ 主要产毒霉菌如前所述, 一种霉菌并非所有的菌株都能产生毒素, 所以确切地说产毒霉菌是指已经发现的具有产毒菌株的一些霉菌, 已知的产毒菌现有以下一些属种 : ⑴. 曲霉属 (Aspergillus) 曲霉在自然界分布极为广泛, 对有机质分解能力很强 曲霉属中有些种如黑曲霉 (A.niger) 等被广泛用于食品工业 同时, 曲霉也是重要的食品污染霉菌, 可导致食品发生腐败变质, 有些种还产生毒素 曲霉属中可产生毒素的种有黄曲霉 (A.flavus) 赫曲霉(A.ochraceus) 杂色曲霉(A.versicolor) 烟曲霉 构巢曲霉 (A.nidulans) 和寄生曲霉 (A.parasiticus) 等 ⑵. 青霉属 (Penicillium) 青霉分布广泛, 种类很多, 经常存在于土壤和粮食及果蔬上 有些种具有很高的经济价值, 能产生多种酶及有机酸 另一方面, 青霉可引起水果 蔬菜 谷物及食品的腐败变质, 有些种及菌株同时还可产生毒素 例如, 岛青霉 (P.islandicum) 桔青霉(P.citrinum) 黄绿青霉(P.citreo-viride) 红色青霉 (P.rubrum) 扩展青霉(P.expansum) 圆弧青霉 纯绿青霉 展开青霉(P.patulum) 斜卧青霉 (P.decumbens) 等 ⑶. 镰刀菌属 (Fusarium) 镰刀菌属包括的种很多, 其中大部分是植物的病原菌, 并能产生毒素 如禾谷镰刀菌 (F.graminearum) 三线镰刀菌(F.trincintum) 玉米赤霉 梨孢镰刀菌 (F.poae) 无孢镰刀菌 雪腐镰刀菌 串珠镰刀菌 拟枝孢镰刀菌 (F.sparotrichioides) 木贼镰刀菌 茄属镰刀菌 粉红镰刀菌等

26 ⑷. 交链孢霉属 (Alternaria) 菌丝有横隔, 匍匐生长, 分生孢子梗较短, 单生或成丛, 大多不分枝 分生孢子梗顶端生长分生孢子, 其形状大小不定, 形态为桑椹状, 也有椭圆形和卵圆形, 其上有纵横隔膜 顶端延长成喙状, 多细胞 孢子褐色, 常数个连接成链 尚未发现有性世代 交链孢霉广泛分布于土壤和空气中, 有些是植物病原菌, 可引起果蔬的腐败变质, 产生毒素 ⑸. 其他菌属粉红单端孢霉 木霉属 漆斑菌属 黑色葡萄穗霉等 ⒊ 真菌毒素中毒真菌毒素是真菌的代谢产物, 当人体摄入了含有真菌毒素的食物后引起的中毒现象, 即称为真菌毒素中毒 许多霉菌能在玉米 小麦 大米等粮食制品上生长发育, 产生霉菌毒素, 能引起人 畜中毒乃至癌症或死亡 据估计目前大约有 2000 多种真菌毒素, 其中与人 畜关系密切的近 100 种 几种常见真菌性食物中毒特征见表 1-6 表 1-6 几种常见真菌性食物中毒的特点真菌毒素产毒菌易被污染的食品毒素名称症状 黄曲霉毒素 黄变米毒素 赤霉病毒素 霉变甘蔗 黄曲霉 寄生曲霉 花生 花生油 玉黄曲霉毒素杂色曲霉米 大米 茹干等黄绿青霉 桔青霉岛青霉素 黄天精素 大米 岛青霉枯青霉素 黄绿青霉素 禾谷镰刀菌 三隔镰刀菌 甘蔗阜孢霉 串珠镰刀菌 梨孢镰刀菌 拟枝孢镰刀菌 麦类 玉米 稻谷玉米赤霉烯酮 T~2 毒素等 霉变甘蔗 串珠镰刀菌素 拟枝孢镰刀菌毒素 毒蕈伞菌类 240 余种毒蘑菇毒伞肽 毒肽等 麦角子囊菌类的麦角菌麦类 麦角毒碱 麦角胺 麦角新碱 引起肝硬化及肝细胞坏死, 引起人畜发生肝癌引起中枢神经和肝脏损害或引起肝癌或损害肾脏引起急性中毒 出现恶心 晕眩 腹胀 呕吐 手足发麻等症状引起消化道功能紊乱和各种神经症状, 出现恶心 呕吐 腹泻 头痛 头晕 严重者可死于呼吸衰竭恶心 呕吐 腹泻 腹痛 乏力 不思食, 损坏肝 肾, 死亡引起肠胃障碍 头痛 头晕 知觉障碍 痉挛等 四 食品介导传染病自然界中有些病原菌不能在食品上生长, 但能为食品所携带, 以食品为媒介, 即使菌数很少, 也能引起取食人发生疾病, 并且人与人之间可直接传染, 故称这些病原菌为传染病病原菌 这些病原菌是由患者或带菌者的粪便排出, 存活于外界被污染的食品和饮用水中, 经口进入消化系统, 对人有强烈的致病性, 故一般也称为消化系统传染病 常见的主要有如下几种 : 1. 赤痢包括细菌性赤痢和阿米巴赤痢 前者由志贺氏菌属的细菌引起, 通过被污染的食品 饮用水等经口传入, 潜伏期通常 2~3d 主要症状为里急后重, 腹泻频繁 腹泻初期为水样便, 继之混有粘液 血液和脓, 小儿痢疾引起高烧和痉挛等脑神经

27 症状 阿米巴赤痢, 则由阿米巴赤痢原虫引起, 通过取食被污染的 生的或未经充分煮熟的蔬菜和饮用水感染 潜伏期一般 3~4 个月, 引起带有粘血便腹泻症状 2. 伤寒及副伤寒病原菌为沙门氏菌属的伤寒杆菌和副伤寒杆菌等 从患者 带菌者的粪便 尿液排出后, 直接或间接污染食品和饮用水, 取食者经口传入 潜伏期 l~2 周 主要症状为 : 初期头痛 全身倦怠 发热, 随后出现持续高烧 食欲不振 腹胀 肝脾肿大, 白血球减少 重者引起肠出血 3. 霍乱 副霍乱病原菌为霍乱弧菌 EITor 弧菌, 从患者 带菌者的呕吐物 粪便排出 污染水域, 用具和食品 ( 特别是鱼贝类 ), 经口感染 潜伏期几小时至 5d 主要症状为严重腹泻 ( 洗米水样 ) 呕吐, 导致脱水 体温下降, 陷入虚脱乃至死亡 4. 流行性肝炎病原菌为肝炎病毒 A, 从患者粪便中排出, 污染水源和食品, 经口感染 潜伏期一般 15~40d 发病时表现为发烧 头痛 胃肠障碍, 退烧后出现黄疸, 通常为 3~4 周, 有时持续数月, 往往转化为肝肿大 肝硬化 5. 病毒介导的食源性感染在食品安全方面, 与细菌和真菌相比, 现在对食品中的病毒的了解还相对甚少, 这有几方面的原因 首先, 就已发现的大规模食品介导感染或食物中毒频率而言, 病毒不如细菌或真菌等重要, 因此, 人们对其重视不够 第二, 由于病毒不能在食品中繁殖 ( 但可在食品中生存 ), 可检出数量较低, 且检验方法复杂 费时, 一般食品检验室难以有效地检测 第三, 有些食品介导的病毒感染还难以用现有技术培养分离 病毒通过食品传播的主要途径是粪 - 口传播模式 尽管食品中可能存在任何病毒, 但由于病毒对组织具有亲和性, 所以真正能起到传播载体功能的食品也只能是针对人类肠道的病毒 能引起腹泻或胃肠炎的病毒包括轮状病毒, 诺沃克病毒, 肠道腺病毒, 嵌杯病毒, 冠状病毒等 引起消化道以外器官损伤的病毒有脊髓灰质炎病毒, 柯萨奇病毒, 埃可病毒, 甲型肝炎病毒, 呼肠孤病毒和肠道病毒 71 型等 在食品环境中胃肠炎病原病毒常见于海产食品和水源中 常见的原因主要是在水生贝壳类动物对病毒能起到过滤浓缩作用, 病毒会存活较长时间, 这些环境对病毒具有保护作用 通过水传播的病毒性疾病还有结膜炎等 在污水和饮用水均发现有病毒存在 饮用水即使经过灭菌处理, 有些肠道病毒仍能存活, 如脊髓灰质炎病毒, 柯萨奇病毒, 轮状病毒 海产品带毒率相对较高, 在礁石 岛屿少的海洋中的水生贝壳类动物带毒率为 9-40%, 而在有较多礁石的海洋中的水生贝壳类动物带毒率为 13-40% 病毒进入水生贝壳类动物体内只能延长生活周期, 但不能繁殖 发病机理存在于食品中的病毒经口进入肠道后, 聚集于有亲和性的组织中, 并在粘膜上皮细胞和固有层淋巴样组织中复制增殖 病毒在粘膜下淋巴组织中增殖后, 进入颈部和肠系膜淋巴结 少量病毒由此处再进入血流并扩散至网状内皮组织, 如肝, 脾, 骨髓等 在此阶段一般并不表现临床症状, 大多数情况下因机体防御机制的抑制而不能继续发展 仅在极少数被病毒感染者中病毒能在网状内皮组织内复制, 并持续地向血流中排入大量病毒 由于持续性病毒血症, 可能使病毒播散至靶器官 病毒在神经系统中的传播虽可沿神经通道, 但进入中枢神经系统的主要途径仍是通过血流, 直接侵入毛细血管壁

28 第四节食品卫生微生物学指标 图 2 所谓食品卫生, 世界卫生组织专门委员会所给的定义是 : 食品卫生就是在食品的来源 生产 制造至最后被人摄取的一切阶段中, 为确保食品的安全性 健全性及防止恶劣化的所有手段 因而, 食品卫生是在食品的来源 生产 制造 流通以及消费过程中, 为确保安全, 防止饮食引起的病害 ---- 食物性病害的知识和技术 一般食品的卫生要求是 : 无毒 ; 无病原微生物 ; 无寄生虫污染 ; 无螨类污染 ; 无其它有害物质等 本节只讨论食品卫生的微生物学问题 目前, 我国食品卫生标准中的微生物指标一般是指 : 细菌总数 大肠菌群数 致病菌 霉菌和酵母菌数等五项微生物指标进行综合评定 这些项目也都有国家标准检验方法 在不同的国家食品卫生标准中的微生物指标含义 表示方法及检测方法不尽相同, 应区别对待, 并按规定方法检验 一 食品的细菌菌相及其食品卫生学意义共存于食品中的细菌种类及其相对数量的构成, 通常称为食品的细菌菌相 其中相对数量较大的细菌称为优势菌种 ( 属 株 ) 食品在细菌作用下所发生的变化程度和特征, 主要取决于菌相, 特别是优势菌种 菌相变化因细菌污染来源 食品理化性质 所处环境条件和细菌共生与抵抗等因素的影响而不同 所以通过对食品性质及其所处条件的调查, 常可预测食品菌相, 而检测食品菌相又可对食品的变化程度和特征作出统计 食品中微生物的种类和数量, 因食品的种类不同而异 例如 : (1). 肉类食品的菌相变化来自健康的 没被污染的新鲜动物性食品, 一般是没有或很少有细菌存在的, 但由于屠宰 加工 运输 贮存过程中的污染, 则使其存有不同数量的细菌 一般说来, 常温下放置的肉类, 随着存放时间的延长, 其菌相发生变化 早期常以需氧的芽胞杆菌属 微球菌属和假单胞菌属为主 ; 其次有假单胞杆菌属, 且局限于肉的浅表 随着腐败过程的发展, 肠杆菌科各属陆续增多, 中后期变形杆菌类各属可能占较大比例 由于具体条件不同, 还可能存在其它各种细菌与霉菌 冷冻食品解冻早期多为嗜冷菌, 如假单胞菌属 黄杆菌属和嗜冷微球菌等 然后肠杆菌科各属和葡萄球菌属渐次增殖 (2). 含糖及不同水分下的食品菌相变化当食品的含水量高 含糖丰富时, 细菌繁殖快 通过对基质的分解 代谢物质的累积 随之 ph 值发生变化等, 微生物优势种的构成发生变化 一般含水量多的食品, 细菌的繁殖占优势 ; 干燥食品 干果等, 霉菌生长良好 ; 通气性好和表面积大的食品, 好氧性菌多 反之通气不良 厚的食品内部, 厌氧性菌容易繁殖 (3). 罐藏食品的菌相变化罐头食品中的细菌主要以其内容物的 ph 值高低为转

29 移 ph>5.0 时主要是嗜热平酸菌和厌氧性腐败菌 ; 中等酸 (ph5.0~4.5) 下主要是嗜热厌氧菌 ; 酸性较大时 (ph4.5~3.7) 则一般只有芽孢杆菌属和梭菌属中耐酸嗜热菌 ; 酸性更强 (ph<3.7) 的只有乳杆菌属中某些细菌及酵母菌 霉菌存在 由于食品菌相及其优势菌种不同, 食品的腐败变质变化也具有相应的特征 如分解蛋白质的细菌主要有需氧的芽孢杆菌属 假单胞菌属 变形杆菌属 厌氧的梭菌属 酸性下分解蛋白质的微球菌属等 分解脂肪的细菌主要有产碱杆菌等 分解淀粉和纤维素类的有芽孢杆菌属 梭菌属 八叠球菌属 产生色素的细菌可使其污染的食品带有特异颜色, 例如粘质沙雷氏菌 粉红微球菌等细菌可使食品带有红色 ; 微球菌属 黄杆菌属 葡萄球菌属 荧光假单胞菌 八叠球菌属和乳杆菌属等细菌可使食品带有黄色与黄绿色 ; 黑梭菌属 变形杆菌属 假单胞菌属等细菌可使食品带有黑色 有些细菌可使食品变粘或使食品发荧光或磷光, 如食品的变粘主要由芽孢杆菌属 柠檬酸杆菌属 克雷伯氏菌属和微球菌属等引起 ; 荧光主要来自假单胞菌属 ( 绿 黄 红 白各色荧光 ) 产碱杆菌属 ( 混合荧光 ) 和黄杆菌属等, 磷光则来自磷光发光菌 白色弧菌等 鲜鱼等水产品则常以水中细菌和嗜低温菌为主, 如弧菌属 假单胞菌属 微球菌属 黄杆菌属等 各种盐制食品中按含盐量的不同其菌相可发生改变, 含食盐 1.5~5.0% 的食品可能存在假单胞菌属 黄杆菌和弧菌属等微嗜盐菌 ; 含食盐 10% 以下的食品主要存在芽孢杆菌属 葡萄球菌属等耐盐菌 ; 含盐 10%~30% 的食品主要含八叠球菌属和盐杆菌属等高度嗜盐菌 二 菌落总数及其食品卫生学意义 1. 菌落总数的概念菌落是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物, 它是由数以万计的相同细菌聚集而成的, 故又有细菌集落之称 菌落总数 ( 即细菌总数或现存活菌的总数 ) 是指在被检样品的单位重量 (g) 容积(mI) 或表面积 (cm 2 ) 内, 所含能于某种培养基上, 在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数, 但不考虑其种类 国家卫生标准中的细菌总数 (Bacteria count) 是指在普通营养琼脂培养基上在一定条件下 ( 需氧情况下,36±1,48±2h) 培养长出的菌落总数 (Colony forming unit 菌落形成单位, 简称 cfu), 一般以 1g 食品或 1 ml 食品或 1 cm 2 食品表面积上所含的细菌数来表示 ( 报告结果 ) 即实际计出的细菌总数只是一些能在营养琼脂上生长 好氧性的嗜中温细菌的活菌总数, 但它们作为细菌总数已得到公认, 在许多国家的食品卫生标准中, 都采用这项指标, 规定了各类食品菌落总数的最高允许限量 2. 菌落总数在食品卫生质量评价中的意义菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志, 也可以用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖动态, 以便对该食品进行卫生学评价时提供科学依据 我国和许多国家均在食品卫生标准中, 规定了各种食品的菌落总数的充许限量, 以促进提高食品的卫生状况 食品中细菌数量对食品卫生的意义 : (1). 食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度一般来讲, 食品中细菌总数

30 越多, 则表明该食品污染程度越重, 腐败变质速度加快 新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的, 但由于外界污染情况不同, 食品被细菌污染的多少就有所不同 食品中细菌数量越多, 说明被污染的程度就越严重, 越不新鲜, 对人体健康威胁越大 相反, 食品中菌数越少, 说明该食品被污染的程度越轻, 食品卫生质量越好, 对人体健康影响也越小 (2). 食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间一般讲, 细菌数越少, 食品耐放时间越长 ; 相反, 食品耐放时间就越短, 例如用 O 保存牛肉, 菌落总数为 10 3 cfu /cm 2 时, 可保存 18d, 而当菌落总数增至 lo 5 cfu/cm 2 时则只能保存 7d 另外, 用 0 保存鱼时, 菌落总数为 10 5 cfu/cm 2 时可保存 6d. 而菌落总数在 10 3 cfu/cm 2 时则可保存 12d (3). 食品中细菌数量可估测出食品腐败状况一般认为日常食品的活菌数为 lo 4 ~ 10 7 cfu/g 而当活菌数达到 10 8 cfu/g 则可认为处于初期腐败阶段 例如, 活的家禽, 皮肤表面的细菌数可低到 cfu/cm 2 而加工后马上检测可达 cfu/cm 2 当菌落数为 10 7 cfu/cm 2 时表示确已经腐败, 鸡肉的细菌数达 10 8 cfu/cm 2 时可有气味并变粘 一般讲, 食品中细菌数量越多, 则会加速腐败变质过程的进程, 甚至可能引起食用者的不良反应 3. 菌落总数的测定和表示方法平板培养计数法是我国卫生标准规定采用的方法 测定食品中菌落总数时, 是在严格规定的条件下, 将食品检样做成几个不同的 10 倍递增稀释液, 然后从各个稀释液中分别取出一定量在无菌平皿内与营养琼脂相混合, 经一定温度培养后, 按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数, 并再根据检样的稀释倍数, 计算出每 g 或 ml 或 cm 2 样品中所含细菌菌落的总数 它实际上是把检样中的致病菌 非致病菌 酵母菌和霉菌都计算在内的微生物杂菌总数 应报告为单位质量或体积样品在培养基上形成的菌落数, 称为菌落形成单位数 (colony forming units, cfu 或 CFU) 三 大肠菌群的食品卫生学意义 1. 概念大肠菌群不是细菌学上的分类命名, 而是根据卫生学方面的要求, 提出来的一组与粪便污染有关的细菌, 这些细菌在生化反应及血清学方面并非完全一致 其定义为 : 大肠菌群 (coliform group) 是指一群需氧或兼性厌氧, 在 37 24h 能分解乳糖, 产酸 产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌 大肠菌群所含细菌种类繁多, 它包括肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 的埃希氏菌属 (Escherichia) 柠檬酸杆菌属(Citrobacter) 克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 产气肠杆菌属(Enterobacter) 等 其中以埃希氏菌属为主, 称为典型大肠杆菌, 其它三属习惯上称为非典型大肠杆菌 目前, 大肠菌群已被许多国家 ( 包括我国 ) 用作食品卫生质量评价的指标菌 2. 大肠菌群的食品卫生学意义大肠菌群被国内外广泛应用为评价食品卫生质量的主要指标之一, 主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染 一般认为, 大肠菌群都是直接或间接来自于人

31 与温血动物的粪便, 人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方 粪便内除了一般健康人畜体内的正常细菌外, 同时也会有一些肠道致病菌存在 ( 如沙门氏菌 志贺氏菌 结核杆菌和肠道病毒等 ) 因而食品中有粪便污染, 就意味着有可能被肠道传染病 人畜共患病等病原菌所污染, 就将对人体健康造成一定的危害 由于微量粪便的污染不可能以化学方法检查出来, 在食品中大肠菌群的存在即使是少数也很容易而且准确地被检出, 如大肠埃希氏菌属约以 10 8 cfu/g 存在于粪便中 因此, 检测大肠菌群 : 第一, 它可作为粪便污染食品的指标菌, 大肠菌群数的高低, 表明了食品被粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小 如食品有典型大肠杆菌存在, 即说明受到粪便近期污染, 这主要是由于典型大肠杆菌常存在于排出不久的粪便中 ; 非典型大肠杆菌主要存在于陈旧粪便中 第二, 它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌 食品安全性的主要威胁是肠道致病菌, 如沙门氏菌属 志贺氏菌等 肠道病患者或带菌者的粪便中, 有一般正常细菌, 也有肠道致病菌存在, 若对食品逐批或经常检验肠道致病菌有一定困难 ; 而大肠菌群容易检测, 且与肠道致病菌有相同来源, 一般条件下在外界环境中生存时间也与主要肠道致病菌相近, 故常用其作为肠道致病菌污染食品的指示菌 当食品中检出大肠菌群数量多, 肠道致病菌存在的可能性就愈大 当然, 这两者之间的存在并非一定平行 因此, 为确保食品卫生质量就必须要求尽可能使大肠菌群的数量降低到最小的程度 在国家规定的食品卫生标准中, 对一些食品的大肠菌群允许量做了明确规定, 不得超出 将我国规定的常见食品中大肠菌群的限量指标列于表 l-7 中 在规定限量以内的食品, 经过人们的长期食用证明基本上是安全的 3. 大肠菌群的测定和表示方法要求食品中完全不存在大肠菌群, 实际上是不大可能的, 重要的是它的污染程度, 即菌量 食品中大肠菌群的数量, 我国和许多其它国家均采用相当于 100g 或 100ml 食品中的最可能数来表示, 简称大肠菌群 MPN(maximum probable number) 这是按一定的方案检查结果, 根据 Mccrady 及 Hopkins 等按概率论所求出的统计数值, 编制成 MPN 检索表 所谓一定检验方案, 在我国统一采用一个样品三个稀释度各三管的乳糖胆盐发酵三步九管法, 再根据检验结果证实为大肠菌群阳性的管数, 查 MPN 检索表, 从而得出样品中活菌密度的估测数, 即最可能数 (MPN) 表 1-7 常见食品中大肠菌群限量指标大肠菌群大肠菌群食品名称食品名称 MPN/100ml(g) MPN/100ml(g) 藻肠类 ( 销售 ) 150 瓶装汽水 ( 含盐汽水 ) 5 酱卤肉类 ( 销售 ) 150 果汁水 果味及果汁类饮料 5 烧烤肉 ( 销售 ) 100 仅含淀粉或果类的冷饮食品 100 肴肉 ( 销售 ) 150 生啤酒 10 肉松 ( 销售 ) 40 酱油 30 消毒牛奶 10 酱 30 酸牛奶 90 食醋 3 甜炼乳 40 酱腌菜 30

32 全脂牛乳 40 发酵性豆制品 ( 销售 ) 30 冰淇淋等 250 全蛋粉 110 生活用水 3(cfu/L) 冰全蛋 肠球菌 (1) 肠球菌的定义及其食品卫生学意义肠球菌属于链球菌属中的肠球菌群, 根 据血清学分类是 D 群 ( 粪大肠菌群 ), 包括粪链球菌 (Streptococcus faecalis) 类粪链球菌 (S.faecium) 及它们的一些变种 肠球菌是呈双球菌或短链状排列的革兰氏阳性球菌, 可在 10 及 45 ph %NaCl 等的环境下生长, 过氧化氢酶阴性 对氨基酸 维生素类等的营养要求比大肠菌群严格 肠球菌和大肠菌群, 主要来源于人和动物的肠道, 随粪便散布于自然界中而造成污染, 使周围环境 食品等含有多少不良的肠球菌 尤其是土壤中有大量的肠球菌存在, 可通过食品原料 产 储 运 销等各环节的不卫生操作而使食品受到污染, 造成对人类健康的潜在危险 Ostrolenk(1947 年 ) 曾提出用肠球菌作为污染指标, 以后 Burton (1949) Jay(1970) 等通过对肠球菌和大肠菌群进行比较观察, 认为肠球菌对恶劣环境和冷冻条件均比大肠菌群的抵抗力要强 因此有些国家已把它作为粪便污染食品的指示菌并规定其限量要求 ( 一般为 0~lO 5 cfu/g) 我国目前尚未考虑这方面的工作 但肠球菌的污染在某些食品是经常出现的, 从预防食物中毒考虑, 防止该菌对食品的大量污染, 制定适宜的污染限量, 对保障人民身体健康是具有实际意义的 (2) 肠球菌检定方法目前尚未有法定检查方法, 但计数方法可采用平板直接计数法和 MPN 计数法 ( 培养采用 44±1 的温度条件 ) 两大类 其分离和计数方法主要是以叠氮化钠为基础 四 致病菌的食品卫生学意义 中华人民共和国食品卫生标准 规定, 任何食品都不得检出致病菌, 即食品中均不能有致病菌存在, 这是一项非常重要的食品卫生质量指标, 是绝对不能缺少的项目 食品中致病菌的存在所引起的对人类健康的危险, 已不再是推测性和潜在性的, 而是肯定性和直接的 由于食品种类繁多, 加工贮藏条件各异, 加之致病菌种类也很繁多 ( 在国家食品卫生标准中要求检验的病源菌至少有 15 种 ), 不能用少数几种方法将多种致病菌全部检出, 而且在绝大多数情况下, 污染食品的致病菌数量不多, 所以在食品中致病菌的检验, 不可能将所有病原菌都作为重点检验, 只能根据不同食品被污染情况的特点, 选定某个种类或某些种类致病菌作为检验的重点对象 如蛋类 禽类 肉类食品以沙门氏菌检验为主 ; 罐头制品以肉毒梭菌 肉毒毒素为主, 牛乳以结核杆菌和布氏杆菌为主 在不同情况下, 还根据需要有重点地增加一定的致病菌检验项目 发生食物中毒时要结合流行病学, 对食品进行有关病原菌的检查, 如沙门氏菌 志贺氏菌 变形杆菌 肠道出血性大肠杆菌 (O157H7) 金黄色葡萄球菌 溶血性链球菌 副溶血性弧菌等 另外, 细菌毒素也是检测致病菌的重要方面, 因为许多食品经加热 辐射等方法杀菌处理后, 其中的致病菌被杀死, 但细菌性外毒素 内毒素等抗性较强, 并未完全破坏, 由此发生的食物中毒事件屡屡发生 表 1-8 列举了部分食品的食品卫生细菌学国家标准

33 表 1-8 部分食品的食品卫生微生物学国家标准 标准代号 产品名称 细菌总数 cfu/ g (ml) 大肠菌群 MPN 致病菌 GB 非发酵豆制品及面筋 出厂 销售 不得检出 ( 系指肠道致病菌及致病性球菌 ) 定型包装 GB 发酵性豆制品 30 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 GB 淀粉类制品 出厂 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 销售 GB 酱腌菜 散装 30 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 瓶 ( 袋 ) 装 30 GB 酱油 不得检出 ( 指肠道致病菌 ) GB 酱 30 不得检出 ( 指肠道致病菌 ) GB 食醋 不得检出 ( 指肠道致病菌 ) GB 肉灌肠 出厂 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 销售 GB 酱卤肉类 出厂 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 销售 GB 烧烤肉 出厂 5000 销售 不得检出 ( 系指肠道致病菌及致病性球菌 ) GB 西式蒸煮 出厂 不得检出 烟熏火腿 销售 GB 熟制鱼糜灌肠 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌致病性厌氧菌 ) GB 熟制鱼丸 ( 半成品 ) GB 牡蛎 ( 蚝 海蛎子 ) 不得检出 ( 系指肠道致病及致病性球菌 ) GB 酸牛奶 90 不得检出 GB 全脂加糖炼乳 ( 甜炼乳 ) 特级 一级 不得检出 全脂无糖炼乳 二级 GB 消毒乳牛 不得检出 GB GB 婴儿配方乳粉 Ⅰ 婴儿配方乳粉 Ⅱ 不得检出沙门氏菌 志贺氏菌 葡萄球菌 GB 断奶期配方食品 不得检出 GB 全脂乳粉脱脂乳粉 特级 一级 不得检出

34 GB 二级 GB 奶油 特级 一级 不得检出 二级 GB 硬质干酪 90 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌 ) GB 巴氏消毒全鸡蛋粉 不得检出 ( 系指沙门氏菌 ) GB 鸡全蛋粉 不得检出 ( 系指沙门氏菌 ) GB 发酵酒生啤酒熟啤酒黄酒葡萄酒 GB 麦乳精 ( 含乳固体 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌 ) 饮料 ) GB 裱花蛋糕 出厂 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌 ) 销售 GB 糕点 饼干 面包 含奶油出厂 不得检出 ( 系指肠道致病菌及致病性球菌 ) 销售 2000 不含奶油出厂 750 销售 GB 碳酸饮料 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌 ) GB 活性乳酸菌 ( 乳酸菌指标 : 3 不得检出 ( 肠道致病菌及致病性球菌 ) 饮料 出厂 : 销售 : 有活菌检出 ) GB 含乳饮料 不得检出 GB 饮用天然矿泉水 GB 蘑菇罐头 不得检出肠道致病菌及致病性球菌 GB 果蔬类罐头 GB 番茄酱罐头 符合罐头食品商业无菌要求 GB 肉类罐头 符合罐头食品商业无菌要求 GB 鱼罐头 GB 胶原蛋白肠衣 30 不得检出 ( 沙门氏菌 志贺氏菌 ) GB 蜜饯 出厂 750 销售 不得检出 ( 系指肠道致病菌及致病性球菌 ) GB 辐照扒鸡 不得检出

35 GB 辐照花粉 ( 系指肠道致病菌及致病性球菌 ) GB 辐照果脯 GB 辐照熟肉制品 五 霉菌和酵母菌数的食品卫生学意义 1. 食品中霉菌和酵母菌数的概念是指食品检样经过处理, 在一定条件下培养后, 经计数所得 lg 或 1ml 检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数 ( 粮食样品则指 lg 粮食表面的霉菌总数 ) 2. 霉菌和酵母菌数的食品卫生学意义酵母菌和霉菌广泛分布于自然界, 并可作为食品中正常菌相的一部分 长期以来被人类用来供制造食品 ( 如面包 馒头 干酪 酱油 酿酒等 ) 时, 作为发酵菌剂 但在某些情况下, 霉菌和酵母菌也可使食品和粮食发生霉坏变质 它们常常在 ph 低 湿度低 含盐和含糖量高的食品中出现 还可在低温贮藏的或含有抗生素而不适于细菌生长的食品中出现 霉菌和酵母菌能合成有毒的代谢产物引起各种急性和慢性中毒, 特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性 实验证明一次大量食入或长期少量食入皆能诱发癌症 目前巳知的产毒霉菌如青霉 曲霉和镰刀菌在自然界分布较广, 对食品侵染的机会亦多 其中黄曲霉素 B1 是毒性和致癌性最强的剧毒物, 故在食品监测中以黄曲霉素 B1 作为污染指示菌 毒素 霉菌和酵母菌能抵抗热 冷冻以及抗生素和辐照等贮藏及保藏技术 ; 还能转换某种不利于细菌的物质, 而促进致病菌的生长, 霉菌和酵母菌往往使食品表面失去色 香 味 例如酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖, 可使食品发生难闻的异味 它们还可使液体发生混浊 产生气泡 形成薄膜 改变颜色以及散发不正常的气味等 因此, 霉菌和酵母菌也作为评价食品卫生质量的指示菌, 并以霉菌和酵母菌数作为判定食品被霉菌和酵母菌污染程度的标志, 以便对被检佯品进行卫生学评价时提供依据 目前已有若干国家制订了某些食品的霉菌和酵母数的限量标准 3. 测定及表示方法食品中霉菌和酵母含量多少的测定, 我国食品卫生微生物学检验标准规定采用平板培养菌落计数法, 培养基必须选择具有抑制细菌作用的选择性培养基 培养的温度一般为 25~28, 培养时间为 3~7d 通常以每 g( 或每 ml) 食品所含霉菌和酵母数以 cfu/g 或 cfu/mi 表示

36 第二章食品卫生微生物学检验的基本原理与方法 微生物在自然界中分布十分广泛, 它们的个体微小, 细胞结构简单, 在食品卫生微生物学检验中, 为了对被检微生物进行鉴定, 必须采用各种分类鉴定方法技术, 如形态特征观察 培养特征 生理特性 血清反应以及动物毒力试验等基本方法, 才能正确判断被检微生物的分类地位及致病性 第一节 食品中微生物的个体形态检查 微生物的个体形态微小, 必须在显微镜下观察细胞的大小 形状 排列等 ; 观察能否运动 鞭毛的着生情况 有无芽孢和荚膜 芽孢的大小 着生部位和形状, 细菌的革兰氏染色反应和抗酸性染色等 一 不染色标本检查 1. 水浸片法在载玻片上滴加一滴生理盐水, 再在其中滴加少许要观察的含菌液体或少量要观察的固体培养物, 使菌体均匀分布在生理盐水中, 然后盖上盖玻片, 即可进行观查 2. 悬滴法将待检含菌液滴在盖玻片上, 然后将其翻转盖在凹孔载片上, 使液体悬挂在凹孔室内 不染色标本检查法主要是观察细菌的运动性以及霉菌和酵母菌的形态 二 染色标本检查 1. 细菌的简单染色法观察细菌营养体的一般外形常用简单染色法 染色程序如下 :

37 查 涂片 干燥 火焰固定 石炭酸复红或结晶紫染色 1 分钟 水洗 干燥 油镜检 2. 细菌的革兰氏染色法此法是细菌学中一个重要的鉴别染色法, 可把所有细菌区别为两类, 即革兰氏正反应细菌即阳性菌 (G + ) 和革兰氏负反应菌即阴性菌 (G - ) G + 细菌为紫色,G - 细菌为红色 染色方法见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 抗酸性染色法芽孢杆菌属 (Bacillus) 的某些种, 分枝杆菌属 (Mycobacterium) 的所有成员有这样一种特性, 它们经石炭酸复红染色后, 虽用酸性酒精处理, 仍能保持染上的颜色, 所以称为抗酸性染色, 这也是一项重要的染色法, 如萋一倪二氏法, 见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 1.3 除上述外, 根据需要见 附录 染色法 培养基和试剂 部分 第二节微生物的培养特性检查 在食品卫生微生物学检验工作中, 分离培养检验是一项主要的工作, 它对进一步确定微生物的种类, 研究它们的特性等具有重要的意义 一 培养基的种类培养基是用人工方法按照微生物的生长需要, 制成的供微生物生长的一种营养制品 主要用途是繁殖及分离微生物 ; 传代保存微生物 ; 鉴别微生物 ; 研究微生物的生理生化特性 ; 制造菌苗疫苗等生物制品 因微生物的种类繁多, 营养要求各异, 因此培养基的种类也很多, 但微生物对营养的基本要求也有共同之处 在食品卫生微生物学检验工作中最常用的培养基有 : 1. 按照配制培养基的物质来源, 可将培养基分为天然培养基 半合成培养基 合成培养基等三类 (1) 天然培养基凡是利用来自生物的组织 器官以及它们的抽提物或制品制成的培养基, 称为天然培养基 牛肉汁 马铃薯汁 麦芽汁 玉米粉 麸皮 米糠 豆饼粉 蚕蛹粉等可用于制备此类培养基 (2) 半合成培养基采用天然有机物质作为氮源和生长物质, 再添加一部分已知成分的化学药品作为碳源和无机盐来源的培养基, 称为半合成培养基 在微生物学工作中, 半合成培养基是应用最广泛的一类培养基 此类培养基的特点是 : 一部分成分和量是已知的, 而一部分的成分和量还不十分清楚 例如马铃薯蔗糖培养基成分为 : 马铃薯 200g, 蔗糖 20g, 水 100mL 其中蔗糖是已知的, 而马铃薯的成分则不完全知道 (3) 合成培养基完全采用已知成分的化学药品配制而成的培养基, 称为合成培养基 此种培养基, 由于可精确地掌握各成分的性质和数量, 常用于研究微生物形态 生理特性以及微生物代谢产物的测定等方面 2. 按照培养基制成后的状态, 可以分为液体培养基 固体培养基 半固体培养基 这些培养基是根据不同试验或研究目的以及观察微生物不同特性而采用的 我们不能把

38 它们看成是根本不同的类别, 因为, 通常情况下, 同一组成的培养基即可分别配制这三种不同形式 (1) 液体培养基把各种材料的抽提物或化学药品按一定量溶于定量的水中, 即得到液体培养基 微生物在液体培养基中生长时, 可更均匀地接触和利用营养物质, 有利于微生物的生长和代谢产物的积累 目前, 微生物发酵工业和微生物制品工业大都采用液体培养基在发酵罐中进行深层培养或深层通气培养进行生产 实验室中, 多用液体培养基观察微生物的生长特性, 如好气或兼性厌气微生物, 常使液体培养基变得混浊或产生沉淀 絮凝等 液体培养基还用研究微生物的某些生理生化特性, 如糖类发酵 V.P 反应 吲哚产生 硝酸盐还原等 (2) 固体培养基在液体培养基中添加凝固剂, 即制成固体培养基 常用的凝固剂有琼脂 ( 或称冻粉 洋菜 ) 明胶 硅酸钠等, 其中以琼脂最为常用 就物理性质而言, 琼脂在 95 以上的热水中开始由凝胶融化为溶胶, 融化后的琼脂, 冷却到 45 以下才重新凝固, 加热后可融化, 冷却后又可凝固, 反复多次性质不变 此外, 琼脂溶于水冷凝后, 形成透明的胶冻, 在用琼脂制成的固体培养基上培养微生物, 便于观察和识别微生物菌落的形态 微生物实验中, 用琼脂制成的培养基对研究微生物的分离 纯化 培养 保存 鉴定等方面均占有重要地位 实验室中, 琼脂的使用量一般可控制在 1.5%-2.0%^ 此外, 明胶也可作凝固剂, 但其化学成分是动物蛋白质, 一般在 25 以上即融化,22 以下凝固, 因而不能作为常用的凝固剂 由于不少微生物能够分解利用明胶而使之融化, 所以用明胶制成的固体培养基多用于穿剌培养, 用以观察不同微生物对明胶液化的不同情况 明胶在制固体培养基时的用量为 10%-12% 或更多 (3) 半固体培养基此类培养基实际是加入少量凝固剂制成的质地柔软的固体培养基, 一般在液体培养基中加入 0.2%-0.5% 琼脂即成 此种培养基可用来观察细菌的运动性, 经穿刺培养后, 可运动的细菌, 沿穿刺线向外活动, 在穿刺线周围都有细菌生长发育, 不能运动的细菌则只在穿刺线内生长 半固体培养基也常用于观察细菌对糖类的发酵能力, 因为在发酵过程中产生的气体, 可以以气泡形态保持在培养基内而易于识别 3. 按照培养基使用的用途, 可分为基础培养基 加富培养基 选择培养基 鉴别培养基等 (1) 基础培养基营养要求相似的微生物所需要的物质比较接近, 除少数几种外, 其大多数物质是相同的 例如牛肉膏蛋白胨琼脂, 其中含有一般腐生性细菌所需的营养成分, 是适用于细菌培养的基础培养基 同理, 马铃薯葡萄糖琼脂 麦芽汁琼脂培养基, 可作为酵母和霉菌的基础培养基 另外, 根据某些微生物种类要求大部分营养相同这一原则, 也可先配制一种基础培养基, 再根据某种微生物的特殊需求, 在基础培养基内加入需要的物质 (2) 加富培养基也称增殖培养基, 此类培养基是在培养基中加入有利于某种微

39 生物生长繁殖所需的营养物质, 使这类微生物增殖速度比其他微生物快, 从而使这类微生物能在混有多种微生物的情况下占优势地位 特别是那些自然界中为数较少的微生物, 经过有意识的培养后再进行分离, 就增多了分离这种微生物的机会 (3) 选择培养基此类培养基是在一定的培养基中加放某些物质或除去某些营养物质以阻抑一般腐生性微生物的生长, 从而达到有利于某一个类群或某一种微生物的生长 藉此, 我们即可从微生物混杂的自然环境中分离出某种我们所需要的微生物 有时也可在培养基中加入某些药剂 ( 如染料 有机酸 抗生素等 ) 以抑制某些微生物的生长而造成对特定微生物种类优先生长的条件 例如培养肠道致病菌的 SS 培养基, 含有胆酸盐, 能抑制 G + 细菌, 柠檬酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌, 这样就可使致病的沙门氏菌和志贺氏菌容易生长繁殖 (4) 鉴别培养基此类培养基主要用来检查微生物的某些代谢特性, 一般是在基础培养基的基础上, 将培养基的组成成分进行补充或调整而制成的 利用微生物分解糖类和蛋白质的能力及代谢产物不同, 在培养基中加入特定的作用底物, 观察代谢产物的变化情况, 如在无糖的基础培养基中加入乳糖和指示剂, 根据指示剂颜色的变化, 判断某微生物分解乳糖能否产酸 常用的糖发酵管 硫化氢培养基等都是鉴别培养基 例如, 利用乳糖胆盐发酵管及 EMB 培养基可用来检测 鉴别食品中存在的大肠菌群 醋酸铅培养基可用于鉴别细菌是否产生硫化氢 ; 明胶培养基可用来观察细菌是否有液化明胶的能力等 二 微生物的接种根据不同的要求有不同的接种方法 : 1. 涂布法取 0.1mL 含菌液放入固体培养基表面, 然后用无菌三角玻璃刮铲进行涂抹, 使菌液均匀分布在固体培养基的表面 2. 划线法将检样或培养物用接种环在固体培养基的表面进行划线, 使其接种量由多逐渐依次减少, 起到稀释作用, 这是常规的接种方法 3. 倾注法取 1mL 检样菌液放入无菌平皿中, 然后倾入已融化并已冷却至 48 左右的琼脂培养基, 使它与菌液混合均匀, 冷却使其凝固 4. 穿刺法用接种针将微生物纯种经穿刺而进入半固体深层培养基中, 通过穿刺培养, 可观察到该菌对氧的需要情况以及有无动力或分解蛋白质产硫化氢的能力 对明胶分解液化的程度等 三 微生物的培养在人工培养微生物的过程中, 除了提供必需的营养 水分之外, 还须控制一些环境条件, 如温度 湿度 空气等, 一般食品卫生微生物检验培养温度为 36 士 l. 霉菌 酵母菌 25~28 1. 需氧培养一般实验室的恒温箱培养都是有氧培养, 因试管或平皿中总是有空气接触的, 但进行大量液体发酵时, 必须采用通无菌空气搅拌或振动方法来充分供氧 2. 厌氧培养

40 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在, 故在培养厌氧菌时必须创造无氧环 境条件, 现将较简便且常用的几种方法介绍如下 : (1). 焦性没食子酸法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板, 称焦性没食子酸 1g 和 10% 氢氧化钠 lml, 置于小玻璃皿中, 并将其放在一块玻璃板上, 再将已接种好的培养皿复盖于带有药皿的玻璃板上, 平皿周围用融化好的石腊涂封, 使之与外空气隔绝, 放恒温箱内培养一定时间, 观察培养结果 (2). 疱肉 ( 肝片 ) 肉汤培养基培养法在基础培养液中加入肝 肾 心 肉渣等组织作为还原物质, 以吸收游离氧 常用的有肝片肉汤 肝片肝汤 ( 疱肉 ) 等培养基 培养前将疱肉肉汤煮沸 lomin, 速放冷水中冷却, 以排除其中的空气, 然后接种 并在培养基的表面加一层无菌的液体石腊, 以杜绝空气的进入, 培养效果更好 (3). 厌氧罐法厌氧罐是一种特制设备, 通常称墨一菲二氏罐 (MoIntosh and Fildes Jar) 此法操作简单, 只要抽出罐内空气, 使之成为真空状态, 即为厌氧环境, 罐内的去氧程度可用亚甲兰指示剂测知 如此指示剂呈无色, 即表示为无氧环境 3. 二氧化碳培养少数细菌如布氏杆菌等, 需在含 10% 二氧化碳环境中方能生长, 常用的培养法有 : (1). 蜡烛缸法将接种好的培养皿放入玻璃干燥器内, 取蜡烛一支放在缸内点燃, 加盖, 周围涂以凡士林油密封, 当缸内氧气被耗尽, 蜡烛熄灭, 此时缸时约含 10% 的二氧化碳, 将此缸置于恒温箱内培养 (2). 硫酸与碳酸钠或碳酸氢钠作用生成二氧化碳若用 0.4% Na2CO3 与 30% H2SO4 各 1 ml, 则可产生 22.4 ml 的二氧化碳气体, 反应如 : Na 2 C0 3 + H 2 SO 4 Na 2 SO 4 + H C0 2 四 培养结果观察各种微生物经过培养之后, 常表现一定的特征, 菌落特征是鉴别微生物种类的重要依据 1. 固体培养基上的菌落特征在固体培养基上, 单个细菌细胞只能在固定的地方生长繁殖, 经过一定时间培养, 形成肉眼可见的单个细菌集团, 叫做菌落 ; 许多个菌落融合在一起, 叫做菌苔 由于各种细菌的化学组成 结构 分裂和排列方式不同, 其菌落形态 大小 色泽 干湿 硬度 扁平 凸起 透明和粘稠度等亦不一致, 因而对识别细菌也有一定的帮助 2. 液体培养特征不同细菌在液体培养基中培养时要注意观察 : 液体表面生长状况 ( 膜或环等 ) 混浊程度 沉淀的形态 有无气泡 培养基有无颜色等 3. 半固体培养特征将细菌用穿刺法接种到半固体培养基中可以识别 : 该细菌有无动力, 沿穿刺线生长的无动力, 由穿刺线向周围弥漫生长的为有动力 ; 该细菌对氧气的需要程度, 只能在穿刺线培养基表面生长的为需氧菌, 沿穿刺线长在培养基深处的为厌氧菌 ; 可以观察细菌对明胶的液化能力 ; 也可观察细菌分解蛋白质产硫化氢的能力

41 第三节微生物的生理生化反应 不同微生物含有不同的酶系统, 它们在代谢过程中, 产生的分解产物及合成产物各有其特点, 可借此特点来鉴别微生物的种类 用于生理生化反应的菌种, 必须是纯培养, 否则即可出现错误的结果, 生化试验的项目很多, 应根据检验的目的需要适当选择, 现介绍几种常用的生化试验如下 : 一 含碳物质的代谢 1. 糖发酵的试验在肠道细菌鉴定时, 糖或醇发酵是最常用的生化反应, 细菌在分解糖或醇 ( 如葡萄塘 乳糖 蔗糖 甘露醇 甘油 ) 的能力上有很大的差异 发酵后产生各种有机酸 ( 乳酸 醋酸 甲酸 琥珀酸 ) 和各种气体 ( 如 H2 CO2 和 CH4) 等 (1). 培养基配方 : 牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g 氯化钠 3 g Na2HPO4 12H20 2 g O.2% 溴麝香草酚兰溶液 12 ml 蒸馏水 1000 ml ph 7.4 上述成分配后, 按 O.5% 加入糖类, 分装试管, 并在其中装入一个倒置的小管, 高压蒸气灭菌 12l,15min (2). 方法 : 将纯培养菌种或待检材料接入培养液中, 于 36 士 1 培养, 逐日观察微生物在各种糖类发酵的情况, 并作详细记载 (3). 结果观察 : 如分解糖类产酸, 则使培养基内指示剂变黄, 如同时产气, 则倒置小管内看到气泡, 不分解者无变化 2. 缓冲葡萄糖蛋白胨水 (MR 或 VP 试验 ) (1). 培养基 : 缓冲葡萄糖蛋白胨水磷酸氢二钾 5 g 多胨 7 g 葡萄糖 5 g 蒸馏水 1000 ml ph 7.0 溶化后校正 ph, 分装小试管, 每管 lml, 高压灭菌 12l 15min (2). 试剂 : 1 甲基红试剂 : 甲基红 0.1g, 95% 酒精 300mL, 蒸馏水 200mL 先将甲基红溶于酒精中, 然后加入蒸馏水 2 6%α 一萘酚酒精溶液, 40% 氢氧化钾溶液 (3). 试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种于缓冲葡萄塘蛋白胨水中,36 士 l 培养 2~4d,

42 哈夫尼亚菌则应在 22~25 中培养, 进行结果检查 (4). 结果检查 1 甲基红 (MR) 试验检查某些微生物如大肠杆菌, 志贺氏菌 产气杆菌等, 在糖代谢过程中产生丙酮酸, 丙酮酸再进一步分解生成乙酸 乳酸 琥珀酸等 酸类增加愈多, 则培养基中的 ph 值愈下降, 当降至 ph4.5 以下时, 甲基红指示剂呈红色, 即为阳性反应, 如 ph 值高于 4.5 则培养物呈黄色, 即阴性反应 因此, 在培养物中加入一滴甲基红试剂, 立即可观察上述结果 2 V P(Voger Proskauer) 试验某些微生物如产气杆菌等能分解葡萄糖产生丙酮酸, 再将丙酮酸脱羧成为中性的乙酰甲基甲醇 (aeetylmethyl earbinol), 乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧所氧化, 生成二乙酰 (diacetyl), 二乙酰与培养基中含有胍基 (guanidinogroup) 的化合物发生反应, 立刻或于数分钟内生成红色化合物, 即为 V P 试验阳性 如为阴性, 应放在 36 士 l 培养 4h, 再观察 因此, 在培养物中加放 6% 萘酚酒精溶液 O.5mL( 促进反应 ),40%KOH 溶液 O.2mL, 充分振摇试管, 即可观察结果 V-P 反应变化如下 : 2CH 3 COCOOH CH 3 COCHOHCH 3 +2CO 2 ( 丙酮酸 ) ( 乙酰甲基甲醇 ) -2H CH 3 COCHOHCH 3 CH 3 COCOCH 3-2H ( 二乙酰 ) ( 胍 ) ( 红色化合物 ) 二 含氮物质的代谢 3. 靛基质试验某些微生物如大肠杆菌 变形杆菌 霍乱弧菌等含有色氨酸酶, 能分解培养基中的色氨酸, 产生靛基质 (indolo) 当它与对二甲氨基苯甲醛(P dimethyl aminobenaldehyde) 作用, 形成玫瑰靛基质 (rosindole) 而呈红色 培养基及试剂的配制以及结果观察, 见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中的 2.13.

43 ( 色氨酸 ) ( 靛基质 ) ( 对二甲氨基苯甲醛 ) ( 玫瑰靛基质 ) ( 微量快速法 ): 试剂 :L 一色氨酸 0.1g 0.01M ph 6.8 磷酸缓冲盐水 100mL 贮存于 4 方法 : 在上述试剂中加入大量纯培养菌, 使成悬液, 置 36 士 l 水浴中 lh, 然后滴加对二甲基氨基苯甲醛液, 观察结果 结果 : 阳性者在液面呈粉红色至玫瑰红色 4. 硫化氢试验某些微生物 ( 如沙门氏菌 变形杆菌等 ) 能分解蛋白质中的含硫氨基酸 ( 如胱氨酸 半胱氨酸等 ) 产生硫化氢, 硫化氢遇到铅盐或铁盐, 则发生作用而生成黑色的硫化铅或硫化铁 COOHCHNH 2 CH 2 S SCH 2 NH 2 COOH + 4H 2 O 2H 2 S+2NH 3 +2CH 3 COOH+2HCOOH H 2 S + Pb(CH 3 COO) 2 PbS + 2CH 3 COOH ( 硫化氢 ) ( 醋酸铅 ) 硫化铅 ( 黑色沉淀 ) 培养基配制及试验方法见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 2.14 ( 微量快速法 ): 试剂 : 盐酸半胱氨酸 O.1g O.02M ph7.0 磷酸缓冲盐水 100mL 贮存于 4 方法 : 取上述试剂 O.4mL, 挑取一环纯培养物, 制成悬液, 于管口棉塞间夹一条醋酸铅试纸 ( 不可接触试剂 ), 于 36 士 l 中每 15min 观察一次, 直至 lh 结束 结果 : 试纸条呈棕色至黑色为阳性 5. 尿素酶试验有些微生物含有尿素酶, 能分解培养基中的尿素产生氨, 使培养基变成碱性 酚

44 红指示剂变为红色 培养基配制及试验方法见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 2.15 ( 微量快速法 ): 试剂 : 尿素 10g 0.2M ph6.5 磷酸缓冲液 100mL 0.4% 酚红液取 10% 尿素液 100mL, 加入 0.4 % 酚红液 0.6mL, 于 4 保存, 试剂的颜色为黄色, 如变成淡红色, 说明尿素已被分解, 不宜使用 方法 : 取一灭菌试管 加入上述试剂 0.2mL, 再加入一环纯培养体, 于 36 士 l 培养 10~30min 观察结果 结果 : 呈淡红色为阳性 三 呼吸酶类试验 6. 硝酸盐还原试验某些微生物如沙门氏菌能使硝酸盐还原为亚硝酸盐, 在酸性环境下, 亚硝酸盐可与氨基苯磺酸结合成重氮盐, 若再遇 α 一萘胺可形成红色偶氮化合物 培养基及试剂的配制, 试验方法及结果观察见 附录 部分中 2.17 ( 微量快速法 ):

45 试剂 ; 硝酸钠 0.05g 溶于 M ph6.8 磷酸缓冲液中, 于 4 保存 方法 : 取试剂 0.2mL 装一支小试管内, 取一环纯培养物, 制成悬液, 置 36 士 l 培养 1h, 然后加入甲液和乙液各 0.2mL, 立即观察结果 结果 : 阳性者呈红色 7. 过氧化氢酶试验某些微生物能产生过氧化氢酶, 将过氧化氢分解而放出氧气 过氧化氢酶 2H 2 O H ( 气泡 ) 多数需氧或兼性厌氧微生物皆能产生过氧化氢酶, 而一般厌氧微生物不产生此酶. 试剂 :3% 过氧化氢溶液方法 : 取一环纯培养体置于洁净的小试管内, 滴加 3% 过氧化氢液 2mL,30s 内产生气泡者为阳性, 不产生气泡者为阴性 8. 氧化酶试验具有氧化酶的微生物, 可使盐酸二甲基对苯二胺脱氢, 氧化成有色的醌类化合物. 试剂配制及实验方法见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 2.18 四 有机酸的利用 9. 柠檬酸盐利用试验如某些微生物能利用铵盐作为唯一氮源, 同时又利用柠檬酸作为唯一的碳源时, 则可在柠檬酸盐培养基上生长 微生物生长时分解柠檬酸钠, 生成碳酸钠, 使培养基变碱, 培养基中的指示剂由淡绿色转为兰色 西蒙氏柠檬酸盐培养基及试剂的配制, 试验方法及结果观察见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 丙二酸盐利用试验丙二酸盐又称缩苹果酸盐, 本试验用以测定微生物能否利用丙二酸盐作为碳源 无机铵盐作为氮源 丙二酸钠培养基及试剂的配制, 试验方法及结果观察见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 2.7 五 毒性酶类试验 11. 卵磷脂酶试验有些微生物如产气荚膜杆菌能产生卵磷脂酶, 即 α 一毒素 在有钙离子存在时, 此酶能迅速分解卵磷脂, 生成甘油脂和水溶性磷酸胆碱 培养基配制方法见 附录 染色法 培养基和试剂 部分中 3.51 试验方法 : 将纯培养物划线接种于卵黄琼脂平板上, 或点种在培养基上亦可, 于 36 士 1 培养 18~24h, 观察结果.

46 结果 : 卵磷脂酶阳性者, 在菌落周围形成乳白色混浊环 第四节微生物的血清学检验 血清学检验是报据抗原与抗体在体外发生特异性结合, 并在一定条件下出现各种抗原一抗体反应的现象, 如凝集反应 沉淀反应等 因抗体存在于血清等体液中, 在试验中一般采用血清, 故而又称为 血清学反应 血清学反应可用已知抗原检测未知抗体, 也可以用已知抗体检测未知抗原, 这一技术常用来对某些病原菌进行鉴定, 以及对某些疾病作早期诊断, 在食品卫生微生物学检验工作中, 血清学检验也是一项很重要的检验方法 一 抗原 (antigen) 抗原是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞, 并能与这些产生物在体内或体外发生特异性反应的物质 抗原物质有两种能力 : 一种是刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的能力, 称为免疫原性 ; 另一种能力是能与它所刺激产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应的能力, 称为反应原性 免疫原性和反应原性统称为抗原性 1. 抗原的性质 (1). 异物性是指进入机体内的抗原物质必须与该机体的组织细胞或体液的成分有差别, 即抗原必须是非自身物质, 差别越大, 其抗原性就愈强 如马血清对马来说是自身物质, 不能引起马产生抗体, 而对家兔是异体物质, 当马血清注入兔体内, 则能使兔产生抗体 各种微生物及其某些代谢产物 ( 如外毒素 ), 对动物来说, 它们是异种物质, 所以它们对动物有抗原性 (2). 大分子胶体性和结构复杂性分子的大小对抗原性是很重要的 抗原物质的分子量通常 >10 4 (10KD), 分子量越大 (>100KD), 抗原性越强 因为大分子物质能积累成胶体状态, 不易被排出, 在体内停留时间较长, 有充分的机会与产生抗体的细胞接触 大多数蛋白质都是很好的抗原, 一般的多糖和类脂因分子量不够大而无抗原性, 但

47 有些结构复杂的多糖和有些核酸 磷壁酸也有抗原性 抗原物质除需要较大的分子量以外, 还需要有一定的化学组成与结构 明胶虽是分子量高达 100KD 的蛋白质, 但抗原性很弱, 这可能是由于明胶是直链氨基酸, 若在明胶分子中加入少量酪氨酸, 其抗原性就会增加 一般是球状分子蛋白质的抗原性较直链分子蛋白质为强, 聚合状态的蛋白质比单体蛋白质的抗原性强 (3). 特异性通常某种抗原只能与相对应的抗体或致敏淋巴细胞发生结合反应 如抗伤寒杆菌的抗体只对伤寒沙门氏菌起作用 鸡卵蛋白刺激机体所产生的抗体只能与鸡卵蛋白发生反应, 而不能与其他蛋白发生反应 抗原的特异性是由其表面上的特定化学基团所决定的, 这种基团称为抗原决定基, 这与氨基酸的种类和排列顺序有关, 抗原表面的糖类也可决定其特异性 (4). 完整性只有带抗原决定基的大分子胶体物质, 完整地进入免疫活性细胞所存在的场所, 如脾 淋巴结和血液等处, 才能刺激机体产生抗体, 若在未进入这些场所之前, 在消化道内就分解成小分子的氨基酸或短肽链时, 由于氨基酸的结构在各种生物体内皆相同, 则失去异物的特性而使之没有抗原性 抗原物质的表面活性基团称为抗原决定基 ( 簇 )(antigen determinant), 抗原决定基 ( 簇 ) 是抗原特异性的物质基础, 抗原所携带的抗原决定基数目为抗原价或称功能价, 例如一种抗原表面有三个决定基 ( 活性基因 ), 其抗原价为 3 通常抗原都是多价的 个体内产生抗体的 B 细胞, 具有显著的多样性 ( 而对某个浆细胞及其克隆则是针对某一抗原决定基的 ), 由此产生的血清抗体, 也是多价的, 称多克隆抗体 单个杂交瘤细胞及其克隆针对某个抗原决定基产生相应单一抗体的这种抗体, 称单克隆抗体 2. 抗原的种类 (1). 完全抗原指能刺激机体产生抗体, 并能在体内或体外与相应的抗体发生结合反应的抗原 如细菌 病毒 细菌外毒素 动物血清 卵蛋白 酪蛋白等都是完全抗原, 即通常所说的抗原 (2). 不完全抗原不能单独刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞, 但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应, 这些物质称为不完全抗原, 又称半抗原 低分子量的物质如药物 脂类和多糖 绝大多数寡糖等均为不完全抗原, 若与蛋白质结合即可成为完全抗原 3. 微生物的抗原结构细菌 病毒 立克次氏体等都是很好的抗原, 微生物的化学成分相当复杂, 含有多种不同性质的蛋白质及与蛋白质结合的类脂与多糖, 这些都是不同的抗原成分, 都具有抗原的特异性, 其中有些抗原性强, 有些抗原性弱, 微生物的抗原结构是分类鉴定的重要依据之一, 下面以细菌为例, 主要的细菌抗原有以下几种 : (1). 菌体抗原一个细菌细胞含有许多菌体抗原, 如上述是一个由不同蛋白质 多糖 脂类所组成的复合抗原 不同种或不同型的细菌各有自己特殊的抗原, 叫做特异抗原, 所产生的特异性抗体只能和该种或该型细菌发生反应 但有些不同种或不同型之间还有相同的抗原, 叫做类属抗原或共同抗原, 它们所产生的类属抗体既能与产生抗体的该细菌发生反应, 又能与含有相同抗原的其他种细菌发生反应, 叫做交叉反应, 如表

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