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本筒康
7 years ago
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1 氟西汀快速免疫检测用人工抗原的合成与鉴定 2 刘波, 袁利鹏, 聂燕华, 尹凯丹, 熊波 (. 广东农工商职业技术学院热作系, 广东广州 50507)(2. 广东产品质量监督检验研究院, 广东顺德 ) 摘要 : 本文针对药物减肥类保健食品中氟西汀成分及残留问题现状, 主要研究了氟西汀人工抗原的合成方法, 并对所合成的半抗原人工抗原进行了结构和特异性鉴定研究中先将氟西汀与丙烯酸甲酯反应后再经过水解制备出半抗原 (H-FXT), 再用活泼酯法将半抗原分别与牛血清白蛋白 (BSA) 和卵清蛋白 (OVA) 偶联制备了氟西汀人工免疫原 (H-FXT-BSA) 和氟西汀包被原 (H-FXT-OVA), 通过免疫原免疫 Balb/c 小鼠, 利用间接 ELISA 方法对抗血清进行了鉴定评价研究制备的人工抗原 H-FXT-BSA H-FXT-OVA 经紫外光谱扫描计算后偶联比分别达到 4.5: 和.3: 免疫小鼠后所获得抗血清的效价均达到以上, 半抑制量浓度 IC 50 值为 00 ng/ml 本研究首次合成了鉴定氟西汀人工抗原, 并成功获得了氟西汀抗体, 本研究可为后期在药物减肥类保健食品中氟西汀成分的免疫快速检测方法的建立和酶联免疫检测试剂盒等相关产品开发奠定了关键技术研究基础关键词 : 氟西汀 ; 半抗原 ; 完全抗原 ; 鉴定文章篇号 : (206) DOI: /j.mfst Synthesis and Identification of Artificial Antigen for the Rapid Immunological Detection of Fluoxetine LIU Bo, YUAN Li-peng, NIE Yan-hua, YIN Kai-dan, XIONG Bo 2 (.Tropical Crops Department, Guangdong AIB Polytechnic College, Guangzhou 50507, China) (2.Guangdong Provincial Product Quality Supervision and Inspection Institute, Shunde , China) Abstract: Currently, fluoxetine residues in drugs and slimming health foods pose a health problem. Therefore, the synthesis of artificial antigens for fluoxetine was explored, and the structures and specificities of the synthesized hapten and artificial antigen were identified. Fluoxetine reacted with methyl acrylate and underwent hydrolysis to produce the hapten (H-FXT). Subsequently, the active ester method was used to conjugate H-FXT with bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) separately, to obtain the fluoxetine immunogen (H-FXT BSA) and coated fluoxetine antigen (H-FXT-OVA), respectively. The H-FXT-BSA immunogen was used to immunize Balb/c mice and the generated anti-serum was analyzed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The artificial antigens, H-FXT-BSA and H-FXT-OVA, were analyzed by ultraviolet (UV) spectroscopy, and calculations showed that the coupling ratios were 4.5: and.3:, respectively. The antiserum titers after the immunization of Balb/c mice were all above , and the half maximal inhibitory concentration was approximately 00 ng / ml. The artificial fluoxetine antigens were successfully synthesized for the first time and anti-fluoxetine antibodies were obtained. This study can provide a key technical basis for further studies involving the establishment of a method for the rapid immunological detection of fluoxetine, including the development of an ELISA kit and other related products. Key words: fluoxetine; hapten; complete antigen; identification 盐酸氟西汀 (Fluoxetine Hydrochloride) 是目前临床广泛使用的一种第二代抗抑郁药物, 为选择性 5- 羟色胺再摄取抑制剂 (SSRI), 可选择性作用于神经递质受体 [], 它不仅对各型抑郁障碍患者均有明显抗抑收稿日期 : 基金项目 : 广东省自然科学基金项目 (205A ); 广东省教育厅高等学校优秀青年教师培养计划项目 (20445); 国家级星火计划面上引导项目 (S205E0008) 作者简介 : 刘波 (980-), 女, 讲师, 研究方向 : 食品安全检测通讯作者 : 袁利鹏 (979-), 男, 副教授, 研究方向 : 食品加工与检测郁抗焦虑作用, 在临床上还具有治疗偏头痛肥胖早泄进食障碍惊恐障碍儿童孤独症等多种疾病的作用 [2~4], 但由于精神类药品的安全范围比较窄, 且抑郁症患者对于治疗的顺应性较差 [5], 对氟西汀进行血药浓度的快速监测, 寻找疗效最佳副反应最轻的适宜血药浓度, 具有重要的临床意义此外, 近年来研究同时发现, 接受氟西汀治疗的抑郁症病人体重会明显减轻, 故氟西汀已被试用作减肥药研究对照试验结果证明, 氟西汀每日 40~80 mg, 8 周后体重下降 2~6 kg, 其效果明显超过比普通安慰 290

2 剂在对包括 600 多例肥胖的剂量一效应研究中发现, 使用氟西汀每日和 60 mg 引起的体重下降幅度主要取决于该药物剂量 [6], 因其减肥效果明显, 在利益的驱动下, 不法商贩随意加大减肥药中该成分剂量甚至在各类减肥保健食品中滥用极有可能 [7] 故此, 对减肥药及减肥保健食品中开展氟西汀的检测研究, 可有效的控制该药物的违法滥用, 对维护人民的健康安全非常必要关于氟西汀的血药浓度检测减肥保健食品中残留检测方法已有报道 [8~2], 主要是采用气相色谱法和高效液相色谱法, 设备昂贵, 操作繁琐, 不便于普及近年来, 免疫分析技术已经越来越广泛的应用于农兽药残留分析掺伪食品鉴定血药浓度测定等领域, 以其简单廉价快捷灵敏度高适用于大批量样品检测等优点而成为主要的初步帅选分析方法 [3] 目前国内外尚未见关于氟西汀的免疫化学检验方法及产品的相关报道本研究在首次设计合成了氟西汀半抗原全抗原, 旨在为后期氟西汀单克隆抗体的制备免疫检验试剂盒的研发提供关键性的研究基础, 也为医药和减肥食品中氟西汀免疫快速检测监测工作的开展奠定全新的技术基础材料与方法. 材料与试剂 6 周龄雌性 Balb/c 小鼠 8 只,20 g/ 只,SPF 级, 购于广东省医学实验动物中心,scxk( 粤 ) 氟西汀盐酸盐 ( 百灵威科技有限公司 ); 丙烯酸甲酯 N,N- 二环己基碳二亚胺 (DCC) N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)( 阿拉丁试剂公司 ); 牛血清白蛋白 (BSA,65 kd) 卵清蛋白(OVA,45 kd) 2,4,6- 三硝基苯磺酸 (TNBS) 考马斯亮蓝 G-250 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 (Sigma 公司 ); 其他试剂均为市售分析纯.2 仪器与设备 Mettler ToleDo 电子天秤 ( 梅特勒 - 托利多电子仪器 ( 上海 ) 有限公司 );UV-2450 紫外 - 可见分光光度计 ( 日本岛津分析仪器公司 ); 纯水系统 ( 美国 MILIPORE 公司 );Centrifuge 547R 冷冻离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 ); 透析袋 ( 分子质量 D) (Sigma 公司 );JB-3 型定时恒温磁力搅拌器 ( 上海雷磁仪器厂 );DRX-400/600NMR 核磁共振仪 ( 德国 Bruker 公司 );LCQEDCA 液质联用仪 ( 美国 Finnigan 公司 );MULTSKANGO 酶标仪 ( 美国 Thermo 公司 ); ZSB-200A2 生物安全柜 ( 苏州长留净化科技有限公司 ).3 氟西汀半抗原的合成如图所示, 将.7 g 氟西汀盐酸盐溶于 25 ml 蒸馏水中, 用 M 的 NaOH 将溶液 ph 值调成微碱性, 用乙酸乙酯萃取 3 次, 将有机相合并减压蒸干 ; 之后依次加入 50 ml 无水甲醇,0.8 g 丙烯酸甲酯, 回流过夜, 待反应结束后直接蒸干溶剂, 用硅胶柱分离纯化得到.2 g 中间体 M-FXT 称取.0 g 中间体 M-FXT, 然后加入 25 ml 0% 的 NaOH 溶液, 回流反应 2 h 后用 6 M 的稀盐酸将溶液 ph 值调至酸性, 用乙酸乙酯萃取 3 次, 合并有机相并将其减压蒸干即得到 0.8 g 纯的终产物 H-FXT 图氟西汀半抗原合成示路线 Fig. Synthetic route of fluoxetine hapten.4 氟西汀抗原的合成采用活泼酯法制备免疫原 H-FXT-BSA 包被原 H-FXT-OVA: 称取 9 mg 半抗原 H-FXT 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)7 mg 溶于 0.5 ml N,N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 磁力搅拌下, 将 25 mg N,N- 二环己基碳二亚胺 (DCC) 固体缓慢加入, 室温下搅拌 5 h, 4000 r/min 离心 5 min, 取上层清液即活泼酯然后在搅拌状态下将活泼酯逐滴加入到 5 ml 含 50 mg BSA ( 或 40 mg OVA)pH 7.4 磷酸盐缓冲液中,4 冰箱搅拌反应过夜 4 下用 0.9% 的生理盐水透析 2 d, 每 8 h 换一次透析液紫外扫描透析液无小分子吸收峰时将产物在无菌条件下通 0.2 μm 的滤膜, 分装后, -20 保存.5 动物免疫选取 8 只 6 周龄的 Balb/c 雌性小鼠, 两只用作阴性对照, 其余 6 只用免疫原 H-FXT-BSA 进行免疫免疫剂量为 50 μg/ 只, 首次免疫采用等量弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射, 以后每两周免疫一次, 采用等量弗氏不完全佐剂乳化后注射第 3 次免疫后 7 d 对小鼠进行尾部采血约 00 μl/ 只, 室温静置 2 h 后 4000 r/min 低温离心 0 min, 收集上层血清, 用.0 29

3 µg/ml 浓度的 H-FXT-OVA 作为包被原, 采用间接 [0] ELISA 方法测定免疫小鼠的抗血清效价及抑制率 2 结果与分析 2. 半抗原的结构鉴定通过核磁共振 (NMR) 与液质谱 (LC-MS) 两种方法对合成的半抗原 H-FXT 进行结构鉴定 2.. 核磁共振 (NMR) 氢谱分析其波谱数据及结构归属如下 : H-NMR (400 MHz, CDCl 3, TMS),δ 2.02(m, 2H, CO-CH 2 ),2.5(s, 3H, N-CH 3 ),2.3(m, 2H, CH 2 -COOH),2.46(m, 2H, N-CH 2 ), 2.65(m, 2H, N-CH 2 ),5.25 (m, H, O-CH),6.78~7.35(m, 9H, Ar-H), 结构归属合理 2..2 液质谱 (LC-MS) 分析由图 2 可见, 反应物质谱图中确实存在 m/z 为的质谱峰, 由于本次质谱为加氢的分子离子峰 [M+H] +, 该产物相对分子质量与目标产物的相对分子质量 38.4 一致, 结合反应路线, 可以推断合成产物即为所需目标半抗原, 说明该合成路线可以用于氟西汀半抗原的合成同时可见,382.3 的分子离子峰是最强峰, 表明其为反应体系中的主要物质, 说明反应产物具备相对较高的纯度通过活泼酯法将半抗原的羧基与载体蛋白的氨基偶联, 分别制备免疫原和包被原, 产物采用考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量 [4], 采用紫外扫描鉴定抗原是否偶联成功 [5] 2.2. 完全抗原的蛋白质浓度测定将标准蛋白 BSA 用生理盐水配制成浓度分别为 mg/ml 的溶液, 取 0. ml 加入到.0 ml 考马其亮蓝溶液中, 混匀, 静止 0 min, 于 595 nm 波长下测定吸光值, 并根据吸光值与蛋白质浓度绘制标准曲线, 如图 3 所示根据工作曲线计算免疫原 H-FXT-BSA 包被原 H-FXT-OVA 的蛋白质质量浓度分别为 8.3 mg/ml 和 6.4 mg/ml 图 3 蛋白质浓度标准曲线 Fig.3 Standard curve of BSA 完全抗原的鉴定图 4 H-FXT-BSA/OVA 紫外吸收曲线 Fig.4 UV absorption curves of H-FXT-BSA/OVA 图 2 氟西汀半抗原质谱图 Fig.2 MS spectra of the fluoxetine hapten 2.2 完全抗原的制备将载体蛋白偶联物及半抗原均配制成 0.5 mg/ml, 并将上述溶液在 200~400 nm 进行全波长扫描其紫外吸收, 根据扫描图谱判断载体蛋白是否与半抗原偶联成功由图 4 可知, 偶联物与载体蛋白在相同的蛋白质质量浓度下, 吸收曲线发生了改变, 在半抗原 H-FXT 的最大吸收范围内, 吸光度发生了增加, 表明偶联物的紫外吸收峰为蛋白质和半抗原吸收峰的叠加, 说明载体蛋白成功偶联上了一定数目的小分子半抗原采用 2,4,6- 三硝基苯磺酸 (TNBS) 法测定人工抗原的分子偶联比 [6], 计算结果为免疫原 292

4 H-FXT-BSA 和包被原 H-FXT-OVA 的偶联比分别是 4.5: 和.3: 2.3 免疫效果的测定结果用 H-FXT-OVA 作为包被原, 用间接 ELISA 法测定免疫原 H-FXT-BSA 免疫小鼠 3 次后获得的小鼠尾部抗血清, 效价均达到以上, 用 00 ppb 浓度的药物做竞争其抑制率可达 40% 以上, 说明合成的免疫原能够刺激小鼠产生抗体, 该抗体和氟西汀小分子具有一定的亲和力, 氟西汀小分子可以和包被原竞争该抗体, 能够制备间接竞争法测定氟西汀的检测试剂盒, 可以通过细胞融合制备单克隆抗体汀分子中可能的抗原决定簇结构部分, 故此设计合成了本研究所用半抗原 H-FXT 有机合成通常存在副反应反应不充分等问题, 所以对合成的半抗原 H-FXT 进行严格的结构鉴定, 是本研究的关键点通过核磁共振 (NMR) 氢谱分析半抗原 H-FXT 归属合理, 再通过液质谱 (LC-MS) 分析也能直观判断半抗原的离子峰对应且合成杂质少, 纯度较高, 结合以上两种仪器分析手段, 可确认半抗原 H-FXT 合成效果理想, 可为后期抗原的制备以及后期酶标半抗原的研究提供保障后期, 本研究采用了活泼酯法将半抗原与载体蛋白相偶联合成氟西汀抗原, 用 DCC 和 NHS 作为一种脱缩合剂, 使半抗原和载体蛋白的反应效率高, 且缩合效果好免疫原的免疫效果不仅与偶联物的分子及结构性质相关, 还与每个蛋白分子上偶联的小分子的数目密切相关, 因此在免疫前, 测定人工抗原中载体上连接的小分子数目至关重要通常认为每分子载体蛋白上含有 8~25 个半抗原时能得到效价较高的抗体 [9] 本研究用 TNBS 法测得免疫原 H-FXT-BSA 和包图 5 氟西汀抗血清效价测定曲线 Fig.5 Antiserum titer curves of fluoxetine 表氟西汀抗血清抑制率的测定 Table Determination of antiserum inhibition rate of fluoxetine 编号 ppb ppb 抑制率 6.2% 44.% 42.9% 7.7% 64.2% 55.2% 3 讨论免疫分析方法研究中制备高质量抗体是关键, 而抗体质量的优劣在很大程度上取决于半抗原设计是否合理 [7] 因此, 设计合理的半抗原结构及选择合适的蛋白偶联方式非常关键本研究首先发现氟西汀相对分子质量为 309.3, 属小分子物质, 该药物只有反应原性而无免疫原性, 不能直接诱导机体产生抗体, 因而必需要与大分子的载体蛋白偶联, 形成既有反应原性又有免疫原性的人工全抗原后被使用, 才能诱导机体产生对应抗体 [8] 其次, 由于氟西汀的分子结构本身没有可以偶联载体蛋白的活性基团 ( 如 -COOH 或 -NH 2 ), 经过结构分析发现氟西汀分子上有个亚氨基位点可与丙烯酸酯很容易反应, 可以给氟西汀分子接上一个丙酸作为间隔臂, 同时也提供了可接蛋白的活性基团 -COOH, 这个结构设计可以非常完整的保留氟西被原 H-FXT-OVA 偶联比分别为 4.5: 和.3:, 有效控制在了 8:~25: 比值区间范围内最终免疫小鼠的实验结果显示, 三次免疫后小鼠尾部血清效价均可达到以上, 且抗血清与药物的直接竞争效果较好, 也直观的说明了人工抗原合成成功 4 结论本研究首次合成鉴定了氟西汀人工抗原, 也成功获得了氟西汀抗体, 抗血清的效价均达到以上, 半抑制量浓度 IC 50 值为 00 ng/ml 研究可为后期在药物减肥类保健食品中氟西汀成分的免疫快速检测方法的建立和酶联免疫检测试剂盒等相关产品开发奠定了关键技术研究基础参考文献 [] Frazer A. Serotonergic and noradrenergic reuptake inhibitors: prediction of clinical effects fromin vitro potencies [J]. J. Clin. Psychiatry, 200, 62 (Suppl. 2): 6-23 [2] Wong D T, Fuller R W, Robertson D W. Fluoxetine and its two enantiomers as selective serotonin uptake inhibitors [J]. Acta Pharm. Nord., 990, 2(3): 7-80 [3] Robertson D W, Krushinski J H, Fuller R W, et al. Absolute configurations and pharmacological activities of the optical isomers of fluoxetine, a selective serotonin-uptake inhibitor [J]. J. Med. Chem., 988, 3(7): [4] Robertson D W, Jones N D, Swarzendruber J K, et al. 293

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第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功