孟雯等 : 大鼠谷氨酰胺转运蛋白 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达与鉴定 1249 常表达, 并正确定位于细胞膜上, 为以后研究 SNAT2 的结构功能及其突变体在细胞膜上的定位提供了一种有效工具 1 材料与方法 1.1 材料质粒菌种和细胞株 pbk-cmv(δ[

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沈敢既柯
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(11): 技术与方法大鼠谷氨酰胺转运蛋白 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达与鉴定孟雯王函董晓云李洋张舟 * ( 上海师范大学生命与环境科学学院, 上海 ) 摘要谷氨酰胺转运蛋白是中枢神经系统中一种重要的中性氨基酸转运蛋白, 对谷氨酰胺的跨膜转运十分重要为了更方便地研究大鼠谷氨酰胺转运蛋白 2 (SNAT2) 在细胞膜上的表达与定位, 利用亚克隆技术将增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 构建于 SNAT2 的 C 端, 通过菌液 PCR 酶切和 DNA 测序鉴定重组真核表达质粒 ; 将测序正确的重组质粒瞬时转染人胚胎肾细胞 (HEK293T cells), 用 Western blot 和激光共聚焦电子显微镜荧光检测技术鉴定 SNAT2-EGFP 的表达与亚细胞定位结果表明, SNAT2-EGFP 融合蛋白重组质粒在细胞中表达并正确定位于细胞膜上 SNAT2-EGFP 融合蛋白重组质粒的成功构建为今后深入研究 SNAT2 的结构和功能提供了一个有效的工具关键词谷氨酰胺转运蛋白 ; 增强型绿色荧光蛋白 ; 融合蛋白 ; 表达丙氨酸谷氨酰胺等小的脂肪族类中性氨基酸是人体重要的氮源来源, 其中谷氨酰胺是中枢神经系统中最重要的氨基酸之一, 其直接参与了神经元中谷氨酸谷氨酰胺相互转变的过程, 是刺激性神经 [1-4] 递质谷氨酸合成的底物因此这些氨基酸的跨膜转运对物质代谢十分重要谷氨酰胺等中性氨基酸的跨膜转运由谷氨酰胺转运蛋白 (sodium-coupled neutral amino acid transporter, SNAT) 负责, 其功能紊乱可以引起神经退行性疾病, 如老年痴呆症帕金森 [5-8] 综合征等谷氨酰胺转运蛋白属于 SLC38 家族 (solute carrier 38), 共有 5 个亚型 : SNAT1 SNAT2 和 SNAT4 以丙氨酸 (alanine) 为最佳转运底物, 归于 System A; 而 SNAT3 和 SNAT5 以含 N 侧链的中性氨基酸为转运底物, 归为 System N SNAT2 是家族中在哺乳动物中分布最为广泛的谷氨酰胺转运蛋白, 甚至在心脏中 [6,9-12] 也能检测出其 mrna, 因此目前被广泛研究 SNAT2 被预测含有 11 个跨膜区域, 其 N 端在细胞内, [13] C 端在细胞外 SNAT2 在跨膜转运一个中性氨基酸的同时协同转运 1 个 Na + 进入细胞, 因此转运过程 [9,14] 生成 1 个正电荷而产生电流 SNAT2 能介导阴离子渗漏电流 ; 跨膜区域 1 (TMD1) 的天冬酰胺 N82 和 TMD8 的苏氨酸 T384 与 Na + 的结合有关, 其 C 端通 [15-17] 过电压依赖性过程调节氨基酸的转运由于 SNAT2 是一个内在膜蛋白, 其分离纯化结晶过程既复杂又有难度, 目前还没有关于 SNAT2 晶体结构解析的报道由于检测膜蛋白的有效抗体制备比较困难, 现在越来越多的科学家将膜蛋白与一些标签蛋白如绿色荧光蛋白 (GFP) HA 等构建在一起作为融合蛋白共同表达, 取得了很好的效果在 SNAT2 的 N 末端加上 GFP 蛋白, 用以检测谷氨酰胺转运蛋白 2 的表达 [17] 及定位 ; 在人胆固醇酰基转移酶 1 (ACAT1) 的 C 末端加上 HA 标签, 通过抗 HA 抗体间接地定性和定量 [18] 测定人胆固醇酰基转移酶 1 的表达 ; 在人质子依赖的氨基酸转运蛋白 1 (PAT1) 的 N 末端加上 HA 标签, [19] 用以检测质子依赖的氨基酸转运蛋白 1 的表达 ; 在人多巴胺转运蛋白 (hdat) 的 N 末端加上 FLAG 标签, [20] 用以检测多巴胺转运蛋白的表达商业化的 SNAT2 抗体比较昂贵, 效果并不理想, 基于此, 我们在真核细胞表达载体 pbk-cmv-snat2 的 C 端加入了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 构成融合蛋白共同表达结果表明, SNAT2-EGFP 在内质网中正收稿日期 : 接受日期 : 国家自然基金 (No ) 上海市科学技术委员会 (No ) 上海市教育委员会科研创新项目 (No.09ZZ139) 上海市重点学科建设项目 (No.S30406) 和上海师范大学细胞生物学重点学科建设项目 (No.DZL808) 资助项目通讯作者 Tel: , zzhang@shnu.edu.cn

2 孟雯等 : 大鼠谷氨酰胺转运蛋白 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达与鉴定 1249 常表达, 并正确定位于细胞膜上, 为以后研究 SNAT2 的结构功能及其突变体在细胞膜上的定位提供了一种有效工具 1 材料与方法 1.1 材料质粒菌种和细胞株 pbk-cmv(δ[ ])-SNAT2-myc( 以下简写为 pbk-cmv-δ-snat2- myc) 和 pmd-19t-egfp 载体质粒为上海师范大学动物细胞与分子生物学实验室保存 ; 人胚胎肾细胞 (HEK293T/17, ATCC number CRL 11268) 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库工具酶和生化试剂限制性内切酶 Xba I Blp I Not I T4 DNA 连接酶购自美国 NEB 公司 ; 2 Taq MasterMix 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ; 回收试剂盒和大肠杆菌 DH5α 感受态细胞购自天根生物 ; Lipofectamine TM 2000 Reagent 购自 Invitrogen 公司 ; DMEM 胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ; 兔源抗 GFP 标签多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG (H+L) 抗体购自中科英沐公司 ; Pierce BCA Protein Assay Kit ECL 化学发光试剂盒购自美国 Pierce 公司 ; 常用的化学试剂为国产分析纯本研究所用引物由上海生工生物工程有限公司合成, 杰李测序公司完成测序 1.2 方法 PCR 扩增 EGFP 基因和 SNAT2 基因应用 Taq MasterMix 分别以 pmd-19t-egfp pbk-cmv- Δ-SNAT2-myc 质粒为模板, 利用 Primer Premier 5.0 设计普通 PCR 引物 ( 表 1), 通过 PCR 扩增 EGFP 和 SNAT2 基因扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶 (0.5 μg/ml 溴化乙啶 ) 中电泳检测 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 重组体的构建与转化分别回收纯化 PCR 产物 EGFP 和 SNAT2 SNAT2 进行 Xba I 和 Blp I 双酶切反应 ; EGFP 进行 Blp I 和 Not I 双酶切反应 ; pbk-cmv-δ-snat2-myc 载体质粒进行 Xba I 和 Not I 双酶切反应将酶切回收好的 SNAT2 EGFP 与 pbk-cmv-δ-snat2-myc 载体大片段按照摩尔比为 3:3:1 在 16 ºC 下 T4 DNA 连接酶连接 15 h 后, 转化到 DH5α 感受态细胞中, 铺含 Kan (50 μg/ml) 的 1.5% 琼脂平板, 37 ºC 恒温培养箱中培养 12~16 h, 长出菌落即可 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 重组体的鉴定挑取转化平板上的大肠杆菌单克隆菌斑, 加入含 Kan (50 μg/ml) 的 LB 培养基中 37 ºC 培养 12~16 h 后进行菌液 PCR 初步鉴定 ( 所用引物见表 1); 提取质粒 DNA 后进行酶切测序鉴定用 Western blot 检测重组体的表达将 pbk- CMV-Δ-SNAT2-EGFP 质粒 DNA 以脂质体转染的方法瞬时转染人胚胎肾细胞 (HEK293T/17) 转染前 12 h 常规培养 HEK293T 细胞 (DMEM+10% FBS, 37 ºC, 5% CO 2 ) 转染时细胞密度以 80%~90% 为宜, 质粒 DNA 与脂质体 Lipofectamine TM 2000 的比例为 1:3, 具体转染见脂质体转染说明书分别收集 pbk-cmv-δ- SNAT2-myc 和 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 质粒 DNA 转染 36 h 的 HEK293T 细胞, 用反复冻融法裂解细胞后, 于 4 ºC, r/min, 离心 15 min, 取上清液, 即总蛋白将上清液于 4 ºC, r/min, 离心 30 min, 弃上清, 溶解沉淀即为膜蛋白取蛋白 10 μg 用 10% SDS-PAGE 电泳分离, 将凝胶中蛋白转移至聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜分别用兔源抗 GFP 标签多克隆抗体 (1:6 500) 和羊抗兔 IgG 二抗 (1:5 500) 孵育 1 h, 放射自显影表 1 扩增 EGFP 和 SNAT2 基因片段的引物序列 Table 1 Primers for amplifying EGFP and SNAT2 gene fragments 基因片段引物 (5-3 ) 退火温度 (ºC) Fragments Primers (5-3 ) Tm (ºC) EGFP EF: CAT GGG CTTA GCT GGA GGA GGA ATG GTG ER: AAG GAA AAG CGG CCG CTT ACT TGT ACA GCT CGTC SNAT2 SF: GCT CTA GAG ATC CCT CGA CCT CGA G SR: ATG AGT GCT AAG CCA TGT CCG CCT GCA GAG GCA TC 划线部分为限制性内切酶识别序列, 灰色部分为连接 SNAT2 与 EGFP 的 3 个甘氨酸碱基序列 EF 和 ER 分别为扩增 EGFP 基因片段的上下游引物, SF 和 SR 分别为扩增 SNAT2 基因片段的上下游引物 The underscores were the sites for restriction digestion, the grey-lighted sequence were three glycines linking SNAT2 and EGFP. EF and ER were used as primers for amplifying EGFP gene fragment, SF and SR were used as primers for amplifying SNAT2 gene fragment.

3 1250 技术与方法用激光共聚焦显微镜检测重组体的表达将 pbk-cmv-δ-snat2-myc 和 pbk-cmn-δ-snat2- EGFP 瞬间转染 HEK293T 细胞, 转染 24 h 后, 利用激光共聚焦显微镜观察荧光并拍照 2 结果 2.1 重组质粒 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 的构建重组表达质粒 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 构建图谱见图 1, CMV 启动子启动转录, SNAT2 和 EGFP 基因融合表达, 在 EGFP 基因之前有编码 3 个甘氨酸铰链的基因分别以 pmd-19t-egfp 和 pbk-cmv-δ-snat2- myc 质粒为模板, 用表 1 中的引物进行 PCR, 获得 EGFP 和 SNAT2 基因片段, 经电泳证实其大小正确, 分别约为 750 bp ( 图 2A) 和 bp ( 图 2B), 阴性对照未见任何条带对 pbk-cmv-δ-snat2-myc 质粒进行 Xba I 和 Not I 双酶切, 获得一个大片段为 bp 和一个小片段为 bp, 电泳鉴定与预期大小符合 ( 图 2C) 将相应酶切后的质粒大片段 SNAT2 EGFP 三个 DNA 片段连接转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 我们获得了转化菌落经过用不同引物 ( 表 1) 进行菌液 PCR, 分别获得了 750, 1 870, bp 左右的片段, 分别与 EGFP SNAT2 SNAT2-EGFP 长度符合图 1 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 重组质粒图谱 Fig.1 Map of recombinant plasmid pbk-cmv-δ-snat2-egfp A: 1: DL DNA 分子量标准 ; 2~6: EGFP 基因 ; 7: 阴性对照 ; B: 1: 阴性对照 ; 2~3: SNAT2 基因 ; 4: DL DNA 分子量标准 ; C: 1: pbk- CMV-Δ-SNAT2-myc 大片段 (4 358 bp) 和小片段 (3 360 bp); 2: DL DNA 分子量标准 A: 1: DL DNA marker; 2~6: EGFP gene; 7: negative control; B: 1: negative control; 2~3: SNAT2 gene; 4: DL DNA marker; C: 1: the big fragment (4 358 bp) and the small fragment (3 360 bp) of pbk-cmv-δ-snat2-myc; 2: DL DNA marker. 图 2 EGFP 和 SNAT2 基因的扩增与 pbk-cmv-δ-snat2-myc 质粒的酶切鉴定 Fig.2 Amplification of EGFP and SNAT2 genes and identification of enzyme digestion of plasmid pbk-cmv-δ-snat2-myc

4 孟雯等 : 大鼠谷氨酰胺转运蛋白 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达与鉴定 1251 ( 图 3A, 显示了一个菌落的 PCR 结果 ) 这个结果表明 SNAT2 EGFP 片段已经连接到了 pbk-cmv 载体上用酶切的方法进一步鉴定 pbk-cmv-δ-snat2- EGFP 构建成功, 通过电泳检测出预期大小的条带 ( 图 3B): (1) 三酶切得到三个片段, 长度分别与载体大片段 (4 358 bp) SNAT2 (1 875 bp) EGFP (758 bp) 相符合 ( 图 3B 泳道 2); (2) 三次不同的双酶切分别得到约 bp ( 图 3B 泳道 3) 750 bp ( 图 3B 泳道 4) bp ( 图 3B 泳道 5) 的片段, 与 SNAT2 EGFP SNAT2-EGFP 基因长度相符合泳道 6 显示了酶切前的重组质粒 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 在经过菌落 PCR 和酶切鉴定后, 所获得的 pbk- CMV-Δ-SNAT2-EGFP 经过 DNA 测序, 证明所有序列正确 2.2 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达和鉴定 A: 1: DL DNA 分子量标准 ; 2: PCR 扩增片段 ( 引物 EF, 引物 ER); 3: PCR 扩增片段 ( 引物 SF, 引物 SR); 4: PCR 扩增片段 ( 引物 SF, 引物 ER); 5: DL DNA 分子量标准 ; B: 1: DL DNA 分子量标准 ; 2: Xba I/Blp I/Not I 三酶切 pbk-cmv-δ-snat2-egfp; 3: Xba I/Blp I 双酶切 pbk- CMV-Δ-SNAT2-EGFP; 4: Blp I/Not I 双酶切 pbk-cmv-δ-snat2-egfp; 5: Xba I/Not I 双酶切 pbk-cmv-δ-snat2-egfp; 6: pbk-cmv-δ-snat2- EGFP A: 1: DL DNA Marker; 2: PCR fragment (primer EF and ER); 3: PCR fragment (primer SF and SR); 4: PCR fragment (primer SF and ER); 5: DL DNA marker; B: 1: DL DNA marker; 2: pbk-cmv-δ-snat2-egfp digested with Xba I and Blp I and Not I; 3: pbk-cmv-δ- SNAT2-EGFP digested with Xba I and Blp I; 4: pbk-cmv-δ-snat2-egfp digested with Blp I and Not I; 5: pbk-cmv-δ-snat2-egfp digested with Xba I and Not I; 6: pbk-cmv-δ-snat2-egfp. 图 3 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 阳性克隆的菌液 PCR 与酶切鉴定 Fig.3 Identification of pbk-cmv-δ-snat2-egfp positive clones by bacterium fluid PCR and enzyme digestion 用 Western blot 检测重组体的表达 SNAT2 和 EGFP 蛋白融合表达, 融合蛋白分子量大小为 81 kda 收集 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 质粒 DNA 转染 36 h 的 HEK293T 细胞, 提取总蛋白和膜蛋白, 用 Western blot 检测 EGFP 蛋白标签的表达, 结果见图 4 可以看出检测到的 EGFP 蛋白分子量在 80 kda 左右, 和 SNAT2- EGFP 融合蛋白预期分子量大小相符, 而在 pbk- CMV-Δ-SNAT2-myc 瞬时转染的 HEK293T 细胞中未见任何特异性条带由此可以说明 SNAT2-EGFP 融合蛋白在细胞内已经表达 ( 图 4 泳道 3) 且定位到细胞膜上 ( 图 4 泳道 4) 用激光共聚焦显微镜检测重组体的表达用原始质粒 pbk-cmv-δ-snat2-myc 和重组质粒 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 瞬时转染 HEK293T 细胞, 24 h 后用激光共聚焦显微镜观察荧光, 发现绿色荧光分布于内质网和细胞膜上 ( 图 5B) 可以说明, 重 1: 对照, pbk-cmv-δ-snat2-myc 转染 HEK293T 细胞的总蛋白 ; 2: 对照, pbk-cmv-δ-snat2-myc 转染 HEK293T 细胞的膜蛋白 ; 3: pbk- CMV-Δ-SNAT2-EGFP 转染 HEK293T 细胞的总蛋白 ; 4: pbk-cmv-δ- SNAT2-EGFP 转染 HEK293T 细胞的膜蛋白 1: control, total protein of pbk-cmv-δ-snat2-myc-transfected HEK293T cells; 2: control, membranes protein of pbk-cmv-δ- SNAT2-myc-transfected HEK293T cells; 3: total protein of pbk-cmv- Δ-SNAT2-EGFP-transfected HEK293T cells; 4: membranes protein of pbk-cmv-δ-snat2-egfp-transfected HEK293T cells. 图 4 SNAT2-EGFP 在 HEK293T 细胞中的表达检测 Fig.4 Detection of SNAT2-EGFP expression in HEK293T cells

5 1252 技术与方法 A: 对照 : pbk-cmv-δ-snat2-myc 转染的 HEK293T 细胞 ; B: pbk-cmv-δ-snat2-egfp 转染的 HEK293T 细胞 A: control: HEK293T cells transfected by pbk-cmv-δ-snat2-myc; B: HEK293T cells transfected by pbk-cmv-δ-snat2-egfp. 图 5 SNAT2-EGFP 在 HEK293T 细胞中表达与定位的荧光图像 Fig.5 Laser scanning confocal microscope images for testing cellular expression and localization in HEK293T cells 组质粒 pbk-cmv-δ-snat2-egfp 构建成功, 并可以证明 SNAT2-EGFP 融合蛋白定位于细胞膜上 3 讨论目前, 还没有商业化的有效 SNAT2 特异性抗体, 极大的阻碍了对 SNAT2 结构与功能的研究 EGFP 是一种增强型的绿色荧光蛋白, 与 GFP 相比, 具有更强的荧光信号应用商业化的 GFP 单克隆或多克隆抗体可以很好地检测 EGFP 的表达, 目前已有很多报道将膜蛋白和 EGFP 构建在一起来检测目的蛋白的 [17] 表达和定位 Zhang 等将 SNAT2 的 N 端与 AcGFP (Aequorea coerulescens GFP) 的 C 端连到一起, 构建了 pacgfp-snat2 表达载体运用定点突变技术删除 SNAT2 的 C 端后转染 HEK293T 细胞, 用激光共聚焦显微镜检测 GFP-SNAT2 的表达, 发现在细胞内质网和细胞膜上的绿色荧光与野生型没有区别, 表明 SNAT2 的 C 端对 SNAT2 在细胞膜上的正常表达和定位并不重要, 预示着 SNAT2 的 N 端可能与 SNAT2 在细胞膜上的表达与定位有关与已报道的将 GFP 连接到 SNAT2 的 N 端 (GFP- SNAT2) 不同, 本研究采用三片段连接方法将 EGFP 连接到 SNAT2 的 C 端 (SNAT2-EGFP), 并克隆到真核生物表达载体 pbk-cmv(δ[ ]) 中 SNAT2- EGFP 融合蛋白表达质粒的成功构建为深入研究 SNAT2 位于细胞内的 N- 端在 SNAT2 于细胞膜上的定位中的作用及为通过定点突变技术研究 SNAT2 的结构和功能提供了一个有效的工具参考文献 (References) 1 Haussinger D. Nitrogen metabolism in liver: Structural and functional organization and physiological relevance. Biochem J 1990; 267(2): Daikhin Y, Yudkoff M. Compartmentation of brain glutamate metabolism in neurons and glia. J Nutr 2000; 130(4S Suppl): 1026S-31S. 3 Young VR, Ajami AM. Glutamine: The emperor or his clothes? J Nutr 2001; 131(9 Suppl): 2449S-59S. 4 Rothman DL, Behar KL, Hyder F, Shulman RG. In vivo NMR studies of the neurotransmitter flux and neuroenergetics: Implications for brain function. Annu Rev Physiol 2003; 65: Bode BP. Recent molecular advances in mammalian glutamine transport. J Nutr 2001; 131(9 Suppl): 2475S-85S. 6 Mackenzie B, Erickson JD. Sodium-coupled neutral amino acid (System N/A) transporters of the SLC38 gene family. Eur J Physiol 2004; 447(5): Sidoryk-Wegrzynowicz M, Lee ES, Albrecht J, Aschner M. Manganese disrupts astrocyte glutamine transporter expression and function. J Neurochem 2009; 110(3): 张舟, 章骏, 孙传文. 膜片钳全细胞记录法在研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制中的应用. 上海师范大学学报 : 自然科学版 2009; 38(4): Yao D, Mackenzie B, Ming H, Varoqui H, Zhu H, Hediqer MA, et al. A novel system A isoform mediating Na + /neutral amino acid cotransport. J Biol Chem 2000; 275(30): Sugawara M, Nakanishi T, Fei YJ, Huang W, Ganapathy ME, Leibach FH, et al. Cloning of an amino acid transporter with functional characteristics and issue expression pattern identical to that of system A. J Biol Chem 2000; 275(22):

6 孟雯等 : 大鼠谷氨酰胺转运蛋白 SNAT2-EGFP 融合蛋白的表达与鉴定 Hatanaka T, Huang W, Wang H, Suqawara M, Prasad PD, Leibach FH, et al. Primary structure, functional characteristics and tissue expression pattern of human ATA2, a subtype of amino acid transport system A. Biochim Biophys Acta 2000; 1467(1): Varoqui H, Zhu H, Yao D, Ming H, Erickson JD. Cloning and functional identification of a neuronal glutamine transporter. J Biol Chem 2000; 275(6): Hyde R, Cwiklinski EL, MacAulay K, Taylor PM, Hundal HS. Distinct sensor pathways in the hierarchical control of SNAT2, a putative amino acid transceptor, by amino acid availability. J Biol Chem 2007; 282(27): Chaudhry FA, Schmitz D, Reimer RJ, Larsson P, Gray AT, Nicoll R, et al. Glutamine uptake by neurons: Interaction of protons with system A transporters. J Neurosci 2002; 22(1): Zhang Z, Grewer C. The sodium-coupled neutral amino acid transporter SNAT2 mediates an anion leak conductance that is differentially inhibited by transported substrates. Biophys J 2007; 92(7): Zhang Z, Gameiro A, Grewer C. Highly conserved asparagine 82 controls the interaction of Na + with the sodium-coupled neutral amino acid transporter SNAT2. J Biol Chem 2008; 283(18): Zhang Z, Zander CB, Grewer C. The C-terminal domain of the neutral amino acid transporter SNAT2 regulates transport activity through voltage-dependent processes. Biochem J 2011; 434(2): Guo ZY, Chang CC, Lu X, Chen J, Li BL, Chang TY. The disulfide linkage and the free sulfhydryl accessibility of acylcoenzyme A: Aholesterol acyltransferase 1 as studied by using mpeg5000-maleimide. Biochemistry 2005; 44(17): Dorn M, Weiwad M, Markwardt F, Lauq L, Rudolph R, Brandsch M, et al. Identification of a disulfide bridge essential for transport function of the human proton-coupled amino acid transporter hpat1. J Biol Chem 2009; 284(33): Saunders C, Ferrer JV, Shi L, Chen J, Merrill G, Lamb ME, et al. Amphetamine-induced loss of human dopamine transporter activity: An internalization-dependent and cocaine-sensitive mechanism. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(12): Expression and Identification of Rats Glutamine Transporters SNAT2-EGFP Fusion Protein Meng Wen, Wang Han, Dong Xiaoyun, Li Yang, Zhang Zhou* (College of Life and Environmental Science, Shanghai Normal University, Shanghai , China) Abstract Sodium-coupled neutral amino acid transporters (SNATs) in the central neural system played an important role in transporting small, neutral amino acids, such as glutamine and alanine, across cellular membranes. In order to detect expression and localization of SNAT2 on cell membranes conveniently, an EGFP protein sequence was subcloned into SNAT2 s C-Terminus in the eukaryotic expression vector pbk-cmv-(δ[ ])-SNAT2-myc. After pbk-cmv-(δ[ ])-SNAT2-EGFP was transiently transfected into HEK293T cells, expression of SNAT2-EGFP was detected by laser scanning confocal microscope and Western blot using anti-gfp antibody. The results showed that SNAT2-EGFP was successfully expressed and localized on cell membranes. The eukaryotic expression plasmid pbk-cmv-(δ[ ])-SNAT2-EGFP constructed successfully is an effective tool for studying structure and function of SNAT2 in the future. Key words sodium-coupled neutral amino acid transporter2 (SNAT2); enhanced green fluorescence protein (EGFP); fusion protein; expression Received: July 26, 2011 Accepted: August 11, 2011 This work was supported by the National Nature Science Foundation of China (No ), Shanghai Scientific and Technological Committee (No ), Shanghai Education Committee Scientific Research Innovation (No.09ZZ139), Shanghai Key Discipline Construction Project (No.S30406) and Shanghai Normal University Cell Biology Key Discipline Construction Project (No.DZL808) *Corresponding author. Tel: , zzhang@shnu.edu.cn

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽