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尉书姜
7 years ago
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2 让凝胶电泳变得更快更漂亮中国农业大学赵春青背景 : 电泳的原理就是通过电流对 DNA/RNA 片段产生的推动力的大小不同从而将不同片段大小的 DNA/RNA 进行分离, 凝胶电泳的时候一般都是恒压电泳, 要么速度慢, 影响实验效率 ; 要么条带跑出来的很难看, 分的不清楚, 分不开方法改进 : 将电泳电压进行定时变化, 例如可以在开始时将电泳电压调节至 100V, 大约 15min, 使条带的确可以因为自身片段大小不同而产生较大差别的泳动速度, 从而将片段分离, 然而现在的分离或许会间距较小, 从而图片很不漂亮, 或者不易观察可以紧接着进行 120V-130V 的电压进行较小差异电泳, 但是由于电泳电压较大, 可以避免过大的片段残存在胶孔不易泳动的情况结果 : 这样两个电压进行配合电泳, 便可以得到非常漂亮的电泳条带, 并且可以节省 1/5-2/5 左右的时间 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 2 页, 共 20 页下一页返回

3 RNA 电泳如何得出漂亮的条带福建医科大学张小林背景 :RNA 电泳是分子生物实验中一个常用的实验方法, 但 RNase 无处不在, 所以常见的 RNA 电泳条带比较弥散, 甚至检测不到, 下面 RNA 电泳中的一些改进方法有助于你得到清晰可见的 RNA 条带方法改进 :1. 电泳槽制胶器梳子等的清洗 : 去污剂浸泡过夜 > 自来水冲洗干净 >ddh20 冲洗 >3%H2O2 灌满浸泡过夜 > 灭活的 0.1%DEPC 水冲洗干净 > 超净台内紫外线照射过夜 2. 烧瓶烧杯药匙量筒等制胶器械的清洗 :0.1%DEPC 水浸泡过夜后高压消毒灭活, 烘箱烘干或者 ddh20 清洗干净, 超净台内紫外线照射过夜 3. 电泳缓冲液必须是 RNase free( 最好买试剂公司的 ) 4. 预电泳 5-10min 减少了非特异 RNA 条带的出现, 有利于分离和纯化, 同时可根据电泳仪是否冒泡判断电泳仪装置是否有误 5. 样品是在电泳缓冲液液略低于胶表面而不是在高过胶面时加进齿槽, 避免了加样时 RNA 的扩散加样后 RNA 从齿槽逸出造成 RNA 的弥散及定位不良等现象 6. 电泳 3-5min 让 RNA 进入凝胶后再加电泳缓冲液液高过表面, 确保了加到每个槽中的 RNA 量及定位的准确性, 从而有利于 DNA 的鉴定和纯化结果 : 第 3 页, 共 20 页下一页返回

4 如何提高 SDS-PAGE 的分辨率山东理工大学康寿凯背景 :SDS-PAGE 是一种经常用到的实验手段, 提高凝胶分辨率, 更好地呈现实验结果, 是我们追求的目标方法改进 : 借鉴 Tricine-SDS-PAGE 中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验, 在普通的 SDS-PAGE 中加入约 13% 的甘油, 同样可以提高分辨率, 有效防止小分子量蛋白的弥散只要把原来配方中的水换成 60% 的甘油, 就可以了结果 : 加入甘油之后, 条带较细, 分得更开 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 4 页, 共 20 页下一页返回

5 SDS-PAGE 的两点改进江苏大学 403 实验室江苏大学的 403 实验室提出改进一点点, 我们能得到更加美观的 SDS-PAGE 胶他们就 SDS-PAGE 凝胶电泳提出两点改进 : 改进一 : 配胶背景 : 在配制 SDS-PAGE 胶的时候, 加入分离胶的过程中常常会带入气泡, 即使用双蒸水来压平界面也有可能因为力度不匀而导致胶面不够齐平, 最后使跑出来的相同大小的蛋白条带不在同一个水平面上方法改进 : 所做的改进很简单却很有效, 加完分离胶后, 用移液枪吸取酒精 ( 浓度没有特别要求, 干净无污染就好 ) 加到分离胶上至覆盖界面, 静置片刻后放到 37 恒温箱中可加速胶的凝固待到分离胶完全凝固之后倒去上层的酒精, 就可以看到齐平漂亮的界面啦! 改进二 : 脱色背景 : 给染色结束的 SDS-PAGE 胶脱色往往需要比较长的时间, 否则会由于脱色不完全而导致条带不清晰, 影响到拍照的效果方法改进 : 改进的方法很简单易行取一张我们常常随身携带的面巾纸, 打个结放入盛有脱色液的大培养皿里放到脱色摇床上, 这样一来, 原来过夜脱色达到的效果现在只需要短短的 3 4 个小时就可以轻松实现了 PS: 希望大家这个时候用的面巾纸是质量比较好不容易掉屑的... 第 5 页, 共 20 页下一页返回

6 一种配置满孔 SDS-PAGE 胶的方法复旦大学杨辉背景 : 在配制 SDS-PAGE 胶时, 由于梳子两边的小的密封条很容易断掉, 之后, 这些断掉角的梳子, 配出来的 SDS-PAGE 胶, 大多时候, 两边的几个孔总是坏掉了, 比如 15 孔的胶, 一般就得到 13 孔或者更少的可以用的孔这样, 如果自己刚好有 13 个样或者 14,15 个的话, 满孔的胶就很方便了, 一块胶就可以搞定! 方法改进 : 配置好的上层胶后用琼脂糖密封配置好上层胶, 加好, 同时配制一些 1% 左右的琼脂糖, 微波炉溶解, 放在冷水里冷一下, 用移液器加在梳子的两头, 起到密封作用 ( 注意 : 切忌用刚热好的琼脂糖直接加在两头, 琼脂糖冷一点但还没有凝固时这样最好 ) 这样配出来的 SDS-PAGE 胶一般是满孔的, 大家可以试试! 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 6 页, 共 20 页下一页返回

7 如何方便地取出 SDS-PAGE 胶燕山大学刘志伟背景 : 在跑完 SDS-PAGE 后, 取胶通常是一个问题, 由于胶和玻璃贴的比较紧, 一不小心就可能把玻璃板弄坏将胶从玻板上取下的时候胶也很容易碎掉方法改进 : 用流水冲玻璃板的缝隙处 ( 也就是凝胶部分 ), 一边冲一边轻轻掀起玻板, 用水去充满玻板和胶之间的缝隙, 很容易能把玻板掀开接下来把玻板反过来, 让胶面朝下, 使其一端浸入到一个盛着水的大平皿中, 轻轻晃动, 胶很快就会被水带到平皿中了, 丝毫不会损伤胶这个方法非常简单, 下次你也可以试试哦第 7 页, 共 20 页下一页返回

8 GC 含量高的片段或者超长片段的克隆宝船生物医药科技有限公司赵玉莲背景 : 一般的连接反应是指利用经过限制性内切酶消化的线形载体与目的基因两端暴露出的平末端或相同的粘性末端, 使用 T4 DNA 聚合酶将二者连接起来形成重组载体但是有时 PCR 难以扩增高 GC 含量或者大片段的插入片段方法改进 : 我们可以把一个长片段或者 GC 含量高的插入片段设计成几个有重叠部分 ( 大约 20-30bp) 的片段如 F1,F1,F3 等, 然后通过 PCR 扩增, 片段需要酶切处理按比例 F1:F2:F3:linear Vector= n1:n2:n3:n4 ( 参考 insert:vector=(9-3):1) 连接到载体中去我们叫这种方法为 muti-ligation 具体说来是把长片段或者 GC 含量高的片段分成 F1,F2,F3 等 ( 中间有 15-30bp 的重复序列 ), 设计引物和合适的酶切位点,PCR 分别扩增出 F1,F2,F3 等然后纯化 PCR 产物 F1-3 等并酶切, 把载体用对应的合适酶切位点酶切, 然后把酶切过的片段 F1-3 等和线性化的载体 16 度连接过夜, 比例按 F1:F2:F3:linear Vector= n1:n2:n3:n4 ( 参考 insert:vector=(9:1) 然后转化到感受态细胞, 第二天挑阳性克隆如果你为了更保险, 可以用连接子当模板做 PCR 来扩增全长然后再连接到载体上结果 : 经过几个实验的验证, 此方法很有效 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 8 页, 共 20 页下一页返回

9 构建含有复杂结构片段的重组质粒南方医科大学 Maggie 背景 : 最近在对一个抑癌基因进行启动子活性分析, 由于这个基因的启动子序列结构十分复杂, GC 含量高多个甲基化位点可能还具有回文结构从基因组中扩增获得这个基因的启动子难度很大为此我们也尝试了众多的引物方法经过一段时间的努力之后, 我们只能利用没有引入酶切位点的引物扩增获得了这个基因的启动子序列, 但是我们利用引入酶切位点的引物尝试扩增获得此基因的启动子, 结果都以失败告终但是由于成功扩增获得的启动子没有引入酶切位点, 无法连入目的载体中, 只能利用 TA 克隆, 连入 T 载体中将目的片段连入 T 载体后, 我们曾经尝试以此重构质粒作为模板进行 PCR 扩增, 以在目的片段的两端引入酶切位点, 将其连入目的载体中, 但是由于其复杂的结构,GC 含量高高甲基化等等, 尝试采用很多引物都不能将其从重组质粒中扩增出来, 本来这种从质粒中扩增获得目的片段是一件很容易的事情我们只能采取酶切的方法将其从 T 载体中卸下来这时我们又碰到了一个空前的难题, 由于目的片段和载体的大小十分接近, 目的片段大小为 2.6kp, 载体的大小为 2.7kp, 在进行割胶回收的时候很难将其分开 PCR 和割胶回收都很难将其分开所以我们就只能在割胶时将 T 载体的片段和目的片段都切割下来, 胶回收获得的是两条片段, 若直接这样与目的载体进行连接, 通过克隆转化出来的重组质粒就存在着两种可能一个是将 T 载体的片段连入了目的载体中, 另一种可能才是将目的片段连入了克隆载体中, 并且获得它们克隆的概率各是 50% 若直接采取这种方法的话, 最后挑取的克隆只有将近一半是正确的克隆 ( 或者更少 ), 不走运的话, 可能挑取的克隆都没有正确的这样即浪费了试剂又浪费了时间方法改进 : 针对这种情况, 我们在割胶回收到 T 载体的片段和目的片段后, 采用限制性内切酶 EcoRI 进行酶切, 由于 T 载体中含有此酶切位点, 而我们的目的片段中不含这个酶切位点, 所以就可以将 T 载体的片段打断, 我们此时再进行割胶回收, 获得的就只是目的片段了然后再将其与目的载体进行连接结果 : 成功构建了含有目的片段的重组质粒第 9 页, 共 20 页下一页返回

10 如何提高 DNA 的酶切质量中山大学医学院陈家杰背景 :DNA 的酶切主要应用于载体的构建和重组载体的鉴定, 还有些线性 DNA 的制备等我们时常会碰见因载体的双酶切效率低下而连接失败, 还有双酶切切不开重组载体但测序正确影响实验进度, 等 DNA 的酶切效率的影响因素主要在于质粒载体本身, 如市场上大多使用碱裂解法提取质粒 DNA, 这一方法容易导致质粒 DNA 上部分酶切位点 (Nhe I, Hind III 等 ) 容易隐蔽, 或者 -20 度保存质粒 DNA 容易形成高级结构, 质粒 DNA 在某些宿主 (E coli JM109,DH5a 等 ) 中部分位点的甲基化等方法改进 :(1) 加热处理, 将要进行酶切的质粒 DNA 直接放于 95 度水浴 10 sec 后取出自然放冷, 继续进行加样酶切 ;(2) 可采用市场上胶回收试剂处理质粒 DNA( 如 OMEGA 公司的胶回收试剂中 Binding Buffer 能使质粒的高级结构减少 ), 回收质粒 DNA, 之后进行酶切 ;(3) 对于一些高 GC 含量的酶切位如 Not I 等应当用甲基化缺陷的宿主菌如 E coli Top 10 等结果 : 提高 DNA 酶切效率和基因克隆的成功率, 节省实验经费 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 10 页, 共 20 页下一页返回

11 高通量菌液 PCR 的改进中科院武汉植物园黄文俊据中科院武汉植物园的黄博士推荐, 高通量菌液 PCR 可作如下改进项目 : 高通量菌液 PCR 的改进背景 : 一般阳性克隆的检测有三种方法 : 菌液或质粒 PCR, 质粒酶切鉴定和测序鉴定但是最常用的是菌液 PCR, 方便快捷然而常规菌液 PCR 操作中, 是将一定体积的培养菌液, 煮沸 5min, 然后离心取上清液作为 PCR 模板在大量菌液 PCR 鉴定时, 显得尤为耗时方法改进 : 菌液 PCR 改进之处在于模板处理, 具体操作 : 直接用无菌牙签放到培养菌液中, 蘸有少许菌液即可, 然后将此牙签直接转移到 PCR 混合液中蘸一下, 再直接运行 PCR 即可 PCR 程序中的第一步预变性, 设置时间为 5min, 以破裂细胞, 释放出 DNA 作为 PCR 的模板此方法适合大量克隆的 PCR 检测, 如 48,96 孔平行进行结果 : 利用 M13 引物, 菌液 PCR 检测阳性克隆,pMD18-T 载体, 插入片段 2.2 KB (Fig A) and 0.8Kb (Fig B) Marker 为 DL2000, 大小分别为 2000,1000, 750, 500, 250, 100bp 第 11 页, 共 20 页下一页返回

12 验证重组质粒的方法改进江苏大学毛浪勇背景 : 通常实验室中挑斑进行菌液 PCR 验证重组质粒时是将单菌落挑到含培养基的试管中培养七八个小时后, 再用菌液作为模板进行菌液 PCR 验证这样挑一个单菌落就需要用一支试管, 而且还需要等至少七八个小时才可以进行菌液 PCR 验证, 这不仅浪费时间也浪费了大量的实验材料方法改进 : 挑斑时可以多用一个含筛选标记的平板, 在平板的底部用记号笔将其分为小方格, 并依次编号挑斑之前配好 PCR 的反应液, 并分装在 PCR 管中, 然后用牙签挑单菌落在 PCR 反应液中稍微蘸一下, 接着用该牙签在新的平板中的一个小方格中扎一下挑斑结束后就可以进行 PCR 验证, 同时新的平板也可以放在培养箱中进行培养结果 : 用该方法无论挑多少个单菌落都可以非常方便快速的完成, 过程中不仅节省了培养细菌的时间, 也不再需要用到大量试管和培养基, 节省宝贵的时间和实验材料 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 12 页, 共 20 页下一页返回

13 96 孔板气泡的快速消除 Helen Diller 癌症中心 changjiang weng 来自美国 Helen Diller 癌症中心的翁博士向我们介绍了一种快速消除 96 孔板气泡的好办法参选项目 :96 孔板气泡的快速消除背景 : 如果您在 96 孔板做蛋白质浓度和 luciferase 活性测定时, 经常会产生许多气泡这些气泡会在一定程度上影响了您的试验结果, 令人烦不胜烦不同人会采用不同的方法, 如用 tip 吸走, 但效果还不是很理想方法改进 : 一般的实验室都有一个吹风机 ( 理发店吹头发带加热的那种 ), 将吹风机打开, 并调节到最高温度, 对 96 孔板吹 1-2 秒就可以了该方法简单迅速, 不影响你的实验结果希望能对您有帮助第 13 页, 共 20 页下一页返回

14 核酸快速干燥方法的改进上海康成生物公司杨淼背景 :DNA 和 RNA 经过 70% 乙醇清洗之后, 需要晾干再加 TE 或者水溶解, 一般方法是 air-dry, 空气中自然晾干, 但是这种方法一般需要 15-30min 才能吹干, 比较费时方法改进 : 两种改进方法 : 一是瞬时离心, 用枪直接吸取乙醇残留液, 然后可以直接加 TE 或者水二是, 经过 70% 乙醇清洗过之后, 再加 100% 乙醇清洗 DNA 和 RNA 沉淀, 可以直接吸取 100% 乙醇或者离心后倒掉 100% 乙醇, 然后 air-dry 由于 100% 乙醇容易挥发, 一般 5min 即可注意事项 : 在整个清洗过程中, 避免破坏沉淀, 方便乙醇吸出! 结果 : 经验之谈, 个人经常这样操作, 不影响 DNA 和 RNA 后期分析 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 14 页, 共 20 页下一页返回

15 固体培养基平板如何减少水汽中国农业大学赵春青背景 : 在倒制培养基平板时, 很容易在培养皿的上盖产生一层水蒸气, 长时间难以清除, 既影响操作效率, 又影响实验结果的质量和后期的观察方法改进 : 在倒制培养基平板时, 将倒制的平板迅速的摞在一起 ; 如果条件允许, 可以在最上面的培养皿内倒上半培养皿的热水, 静置至平板培养基凝固完全结果 : 除了第一个平板以外 ( 如果最上面放置半培养皿的热水, 则所有的培养皿平板都不会出现水蒸气附着在皿盖上的情况 ), 所有的平板盖上面都没有水蒸气产生, 非常利于后续试验的进行, 大大提高了实验效率下次倒平板的时候, 您也可以试试看哦! 第 15 页, 共 20 页下一页返回

16 western blot 中 Marker 上样位置的选择四川大学蔡哲背景 : 普通 western blot 试验中, 人们常常将预染的 Marker 点上样在两端, 这样不但要做好切角标记, 有时还需要点两个 Marker 泳道因此对于一个实验中需要检测的蛋白条带多时则无法在同一块胶上进行实验比较, 相对于做两块胶进行的电泳来说, 同一块胶上的结果由于条件相同, 更能说明问题些方法改进 : 因此为了解决这一问题, 我们在实验中进行两组重复实验时可考虑将 Marker 的位置点在上样空的中间位置, 然后在左右两边同样的位置点上相对应的蛋白结果 : 电泳, 转膜后, 只用将膜沿 Marker 的中线剪开一分为二, 同时 Marker 也被分成两份这样就能得到两个完全一样的结果对于做平行重复实验省去很多力气既加速实验进度又经济, 还减少重复实验对实验员身体的二次毒害 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 16 页, 共 20 页下一页返回

17 弹匀混合物时避免气泡小技巧上海交通大学朱后保背景 : 实验中我们会经常用到 ep 管和 PCR 管, 在配制反应混合液时, 通常是用手指弹匀, 稍微用力过大就会很容易产生气泡, 不得不在离心机里甩一下, 浪费时间这里向大家介绍一个小技巧, 可以轻松的混匀反应液又不容易产生气泡方法改进 : 在这一过程中, 手指夹持管子的方式力度很重要通常我们会用一只手的拇指结合食指和中指捏住管口 ( 或把管帽也一起捏住 ), 用另一只手的食指轻弹管壁这里只需要改变一下夹持方式及力度就能很好的避免气泡产生, 用一只手的拇指和中指捏住管口处, 注意不要捏太紧, 使管子稍微可以绕接触点摆动, 再用这只手的食指稍微顶住管帽的边缘当用另一只手弹匀时, 管子会顺着弹的方向摆动, 帽子的边缘也会碰到紧靠它的食指, 指肚较柔软, 就会有个缓冲过程, 再用大点力弹也不会产生气泡第 17 页, 共 20 页下一页返回

18 拟南芥转化的简易操作热带农科院热带生物所庞永奇背景 : 拟南芥转化大体分为浸花喷洒及滴染几种, 主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染, 使用中各有优缺本人在研究中感觉滴染效果较好, 并在实践中做了些简略与细化方法改进 : 摇菌 3~5mL 过夜,1.5mL 管集 3mL 菌, 以 1mL 渗入缓冲液 (1/2 MS 大量 5%(W/V) 蔗糖 0.02~0.05% silwet L-77) 重悬, 吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处做好标记后直接放回光照培养一周内对所转植株进行二次重复侵染转化约两三周会有第一批几个荚成熟, 直接取了进行筛选, 效果好的话一般可以筛到几株至十几株阳性苗后续的种子当然也要收着结果 : 一般情况下只需转化 2~8 株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系单株可以分不同侧枝进行, 效果也还不错一定要注意苗的生长状况, 温度失控虫害以及打药都可能造成不利影响新配的悬浮液浸润效果要好些, 浸花时要保证溶液浸入 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 18 页, 共 20 页下一页返回

19 一种高效简易大量制备植物原生质体的方法中国农业大学马磊背景 : 植物原生质体在基因表达调控基因定位细胞融合新品种培育等方面有重要用途, 尤其在现如今植物分子生物学领域, 拟南芥叶肉细胞原生质体在蛋白亚细胞定位, 启动子活性研究以及蛋白间体内互作方面有着广泛的应用但是, 诸多因素影响植物原生质体的制备和活力, 传统的方法 : 利用刀片快速地将叶片切成非常细的小条来收集原生质体, 不但会造成细胞死亡, 并且效率很低方法改进 : 寻找市面上粘力较强的胶布, 经过比较, 电工用的那种塑料胶布效果较好首先将叶片上表面依次逐一粘在胶布上, 再取相同大小的一块胶布粘在叶片下表面上轻轻按压, 使它们紧紧粘合然后用手揭起胶布一角, 快速使两个粘合的胶布分离, 这时会发现叶片的下表皮已被胶布顺带揭下最后将带有叶肉细胞的胶布放入酶液中酶解分离原生质体结果 : 由于叶肉细胞都在叶片表面, 并且未收到什么机械损伤, 在酶解液中很容易分离产量大, 效率高第 19 页, 共 20 页下一页返回

20 利用嫩芽叶尖制片确认甜瓜染色体数目西南大学易鼎杰背景 : 甜瓜为藤蔓植物, 染色体小, 细胞质浓厚, 过去一直是以根尖作为染色体计数的材料, 随着甜瓜多倍体育种方法的多样化, 根尖染色体计数已经不能满足于育种的需要, 所以急需更快更好的染色体计数方法方法改进 : 本实验采用去壁低渗火焰干燥法用甜瓜的幼嫩叶尖为材料, 对甜瓜染色体进行计数实现了材料易得, 结果更好的目的改方法还能用于对甜瓜茎蔓的倍性变化进行跟踪监测取样前一天, 给甜瓜植株叶面喷足水, 以刺激嫩芽旺盛生长, 随机选取并标记 22 个嫩芽上午 8 点左右, 每个芽取 1-2mm 的嫩芽叶尖, 用作实验材料将叶尖置于敞口的 Ep 管中, 室温下, 用现配的 0.002mol/L-1 的 8- 羟基喹啉完全浸没材料, 暗处放置 2.5h 3.0h 和 3.5h, 中间每隔一小时摇动一次 Ep 管用卡诺固定液 ( 甲醇和冰醋酸体积比 3:1) 固定 1h 以上固定后, 三级水冲洗 3 遍, 用纤维素酶 - 果胶酶混合酶液处理叶尖 2h 2.5h 和 3h 吸去酶液, 用三级水浸泡 0.5h 吸干水, 加入卡诺固定液, 放置 1h 后, 涂片火焰干燥用 Giemsa 染色液扣染 3-4min 后, 冲洗掉染液, 电吹风吹干后进行镜检并摄像实验过程大约 8h, 加上镜检所需时间, 一天就能得到甜瓜的染色体数目鉴定结果结果 : 2010 年 10 月 27 日实验室创新技术精选 ( 上 ) 第 20 页, 共 20 页下一页返回

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽