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1 80 基础研究 南方医科大学学报 J South Med Univ 0;() 沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 李忠玉 吴移谋 黄秋林 粟盛梅 周 洲 陈超群 钟光明 南华大学 微生物学与免疫学教研室 附属第一医院普腹外科 湖南 衡阳 400 美国德洲大学圣安东尼奥 生命科学研究中心微生物学与免疫学系 德州 789 摘要 目的 克隆表达沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白 并在衣原体感染细胞中对其进行定位分析 方法 PCR 法扩增 porf8 基因 并将其定向插入 pgex-6p 载体构建原核表达重组体 pgex-6p/porf8 重组体转化 E.coli XLBlue 后经 IPTG 诱导 表达 porf8 融合蛋白 融合蛋白经 Glutathione Sepharose 亲和层析纯化后免疫 Balb/C 鼠 制备 porf8 多克隆抗体 应用 免疫荧光试验对 porf8 质粒蛋白进行定位 结果 porf8 基因全长为 744 bp 编码 47 个氨基酸残基 pgex-6p/porf8 在大肠杆菌中表达相对分子质量约为 的 GST-pORF8 融合蛋白 间接免疫荧光实验结果显示 porf8 在感染细胞中 的表达模式与主要外膜蛋白基本一致 而与衣原体蛋白酶样活性因子分布模式不同 结论 porf8 质粒蛋白定位于衣原 体菌体上 为衣原体菌体蛋白 该研究为进一步研究该蛋白的结构功能 阐明Ct的致病机制奠定了基础 关键词 沙眼衣原体 porf8质粒蛋白 基因克隆 定位 中图分类号 R74. 文献标志码 文章编号 Cloning and cellular localization of porf8 plasmid protein of Chlamydia trachomatis LI Zhong-yu, WU Yi-mou, HUNG Qiu-lin, SU Sheng-mei, ZHOU Zhou, CHEN Chao-qun, ZHONG Guang-ming Department of Microbiology and Immunology, Department of General Surgery, First ffiliated Hospital, University of South China, Hengyang 400, China; Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Health Science Center at San ntonio, San ntonio, Texas 789, US bstract: Objective To clone the plasmid protein porf8 of Chlamydia trachomatis and localize its expression in Chlamydia-infected cells. Methods porf8 gene was amplified and cloned into pgex-6p vector, and the porf8 fusion protein was expressed in E.coli XL Blue. fter purification with glutathione-conjugated agarose beads, the porf8 fusion protein was used to immunize BLB/c mice to generate polyclonal antibodies against porf8 protein. The antibodies obtained were used to localize the plasmid protein porf8 in Chlamydia-infected cells with immunofluorescence assay (IF). Results The porf8 gene 744 bp in length was successfully cloned and the GST fusion protein with a relative molecular mass of was obtained. The cellular distribution pattern of the plasmid protein porf8 was similar to that of the major outer membrane protein (MOMP), a known C. trachomatis inclusion body protein, but not to that of chlamydial protease-like activity factor (CPF, a secreted protein). Conclusion The plasmid protein porf8 is localized on the bacterial organism as an inclusion body protein in C. trachomatis-infected cells. The cellular location of porf8 protein can potentially provide important insights into the pathogenesis of C. trachomatis. Key words: Chlamydia trachomati; porf8 plasmid protein; gene cloning; localization 沙眼衣原体 chlamydia trachomatis, Ct 属于衣原 体目 衣原体科 衣原体属 共有9个血清型 其中 B Ba C 血清型是引起沙眼的主要病原体 D~K 血清型 则可通过性传播途径 引起人类泌尿生殖道感染 在男 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 湖南省自然科学基 金 09JJ059 湖南省高校科技创新团队 湘教通[00]5号 Supported by National Natural Science Foundation of China (097065; 800). 作者简介 李忠玉 博士 副教授 lzhy0@hotmail.com DOI: CNKI:44-67/R 网络出版时间 :6:08 性主要表现为非淋菌性尿道炎 前列腺炎 附睾炎 直肠 炎 在女性表现为子宫颈炎 输卵管炎 异位妊娠 不孕 - 症等疾病 L~L血清型主要侵犯腹股沟淋巴结 可引 起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿 Ct是世界范围 内流行最常见的性传播疾病病原体之一 由于衣原体感 染患者常表现为无症状或轻微症状 致使该疾病不易被 发现而得不到及时治疗 使得感染反复迁延 造成进行 性 不可逆的病理损伤 因此 阐明 Ct 的致病机制 研 究Ct治疗靶点对保证人类健康具有十分重要的作用 本研究采用基因工程技术克隆并表达pORF8融合 蛋白 融合蛋白免疫小鼠制备 porf8 质粒蛋白特异性 多克隆抗体 用所制备的多克隆抗体用于研究 porf8

2 第 期 李忠玉, 等. 沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 8 质粒蛋白在衣原体感染细胞的定位, 结果证实 porf8 质粒蛋白定位于衣原体菌体上, 为衣原体菌体蛋白 该研究为进一步研究该蛋白的结构功能 阐明 Ct 的致病机制奠定了基础 材料和方法. 材料.. 细胞与菌株 Ct D 标准株 HeLa-9 细胞株为德克萨斯州大学圣安东尼奥医学医学研究中心 (UTHSCS) 钟光明教授实验室提供.. 主要试剂 HRP 标记的羊抗鼠 IgG Cy 或 Cy 标记的羊抗鼠抗体购自美国 Jackson Immuno Research pgex-6p 原核表达载体 Glutathione Sepharose 4B Beads 为美国 GE Healthcare 产品 ; 限制性内切酶 BamH I Not I pfxdn 聚合酶 DN 及蛋白相对分子质量标准等为 Invitrogen 产品 ;QuickClean PCR 纯化试剂盒 质粒提取试剂盒购自美国 Qiagen 公司. 方法.. porf8 基因原核表达载体的构建从 GenBank 中获取 Ct porf8 基因序列并设计引物,P 序列为 5'CGCGGTCCGTGCCTGG C,P 序列为 5'TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCGCT CTTTTGCTTGTT, 在引物的 5' 加上 BamHⅠ 酶 NotⅠ 酶切位点及保护碱基 以 Ct 血清型 D 核酸为模版,PCR 扩增 porf8 基因,PCR 扩增产物经 BamH I Not I 酶切后, 插入经同样酶消化的 pgex-6p 原核表达载体中, 转化感受态大肠杆菌 XLBlue, 在含氨苄青霉素的 LB 培养基上挑取单个菌落, 小量提取质粒,PCR 筛选 BamHⅠ NotⅠ 双酶切及测序鉴定.. porf8 融合蛋白表达与纯化将鉴定后的阳性克隆接种于含 00 μg/ml 氨苄的 LB 培养液中,7 摇床培养过夜 次日以 00 的比例将过夜培养物扩大培养,IPTG 诱导大肠杆菌表达 porf8 融合蛋白 低速离心收集细菌, 重悬于含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中, 超声破菌后高速离心, 上清经 Glutathione Sepharose 4B Beads 纯化得到 porf8 融合蛋白, 纯化的融合蛋白经 % SDS-PGE 电泳分析, 观察其表达情况和纯化效果.. 动物免疫与抗体制备 00 μg porf8 融合蛋白与完全弗氏佐剂超声乳化后, 腹腔免疫 BLB/c 小鼠, 初次免疫后的第 周,50 μg 融合蛋白与不完全弗氏佐剂超声乳化间隔 周以相同的免疫方式进行第 次免疫 第 次免疫后 7~0 d, 小鼠尾静脉采血, 测定抗体滴度, 当抗体滴度较高时, 小鼠眼眶放血, 分离血清,-0 保存备用..4 抗体特异性鉴定 ()Western blot 法鉴定抗 porf8 融合蛋白抗体的特异性 取等量纯化的 GST-pORF8 GST-MOMP( 主要外膜蛋白 ) GST-CPF ( 衣原体蛋白酶样活性因子 ) 蛋白加入 SDS 上样液, 00 加热 5 min 后, 000 r/min 离心后取 0 μl 行 %SDS-PGE 凝胶电泳, 以 00 V 恒电压转至 NC 膜上,5% 脱脂牛奶封闭后, 加入抗 porf8 抗体,4 过夜, 0.05% PBST 洗涤 次, 加入 HRP 标记的抗鼠抗体室温放置 h, 洗涤后加底物 ECL 显色,X 片曝光显影观察结果 ;() 间接免疫荧光鉴定抗 porf8 融合蛋白抗体的特异性 将本室已构建好的 pdsred/porf8 真核表达重组体转染 HeLa 细胞,pORF8 基因在 Hela 细胞中表达 RFP 融合蛋白, 以 porf8 抗体为一抗,Cy 标记的羊抗鼠抗体为二抗进行免疫荧光染色, 分析抗体的特异性..5 porf8 质粒蛋白定位分析间接免疫荧光试验分析 porf8 质粒蛋白在衣原体感染细胞中的定位情况 Ct 血清型 D 标准株感染 Hela 9 细胞并培养至 40 h, 依次经 % 的多聚甲醛 % Saponin 5% BS 处理后进行免疫荧光染色, 分别以兔抗衣原体抗体以及 Cy 标记的羊抗兔抗体染衣原体, 以抗 porf8 融合蛋白抗体和 Cy 标记的羊抗鼠抗体染 porf8 质粒蛋白,Hoechst 染核酸成分, 普通荧光显微镜下观察结果 结果. pgex-6p/porf8 原核表达载体的构建与鉴定以 Ct D 标准株核酸为模板,PCR 扩增 porf8 基因, 将该基因定向克隆至 pgex-6p 原核表达载体中构建 pgex-6p/porf8 重组体 以 pgex-6p/porf8 重组质粒为模板, 用 porf8 特异性引物进行进行 PCR 扩增, 可获得约 800 bp 大小的片段 重组体经 BamHⅠ Not I 双酶切后, 可切出 个大小不同的片段, 大片段约 4900 bp, 为载体片段, 小片段约 800 bp, 为 porf8 质粒基因片段, 与预期值相符合 ( 图 ), 重组质粒测序结果经 Blast 比较分析证实序列正确. porf8 融合蛋白表达与纯化 pgex-6p/porf8 重组质粒转化的 E.coli XLBlue,IPTG 诱导 porf8 融合蛋白的表达, Glutathione Sepharose 4B beads 纯化表达产物, 纯化产物经 % SDS-PGE 电泳分析, 发现重组质粒菌在约 位置处有一明显蛋白条带, 结果与预期 GSTpORF8 融合蛋白相对分子质量相符 (GST 相对分子质量为 6 000,pORF8 相对分子质量约为 8 000)( 图 ). 抗体特异性鉴定 Western blot 分析结果显示在 porf8 融合蛋白相对分子质量约 处出现了一条清晰的条带, 而在 CPF MOMP 蛋白处未出现任何条带 ( 图 ) 免疫荧光

3 8 南方医科大学学报 J South Med Univ 4 5 第 卷 Mr bp 图 pgex-6p/porf8重组质粒鉴定结果 Fig. Identification of the recombinant plasmid pgex-6p/porf8. Lane : kb DN Marker; Lane : mplified fragment from pgex-6p/porf8; Lane : mplified fragment from pgex-6p; Lane 4: pgex-6p/porf8 digested by BamHI and NotI; Lane 5: pgex-6p digested by BamHI and NotI. 4 Mr GST-pORF GST 图 porf8融合蛋白的表达与纯化 Fig. Expression and identification of porf8 fusion protein. Lane : Protein marker; Lane : Purified product from E.coli transformed with pgex-6p/porf8; Lane : Purified product from E.coli transformed with pgex-6p; Lane 4: Purified product from E.coli. 试验结果显示 porf8抗体均能识别 HeLa 细胞胞浆表 达的 RFP-pORF8 融合蛋白 但不识别 RFP 蛋白 图 4 提示pORF8抗体具有高度的特异性.4 porf8质粒蛋白定位分析 Ct 血清性 D 感染 40 h 后 间接免疫荧光观察 porf8在感染细胞中的定位 图4 porf8蛋白在感染 细胞中的表达模式与 MOMP 基本一致 而与 CPF 分 布模式不同 图5 提示pORF8质粒蛋白定位于衣原体 菌体上 图 Western blotting 鉴定 porf8 融合蛋白抗体特 异性鉴定 Fig. Identification of anti-porf8 fusion protein antibody by Western blotting. Lane : porf8 fusion protein; Lane : CPF fusion protein; : MOMP fusion protein. 讨论 Ct 具有独特的双相性发育周期 存在 种不同状 态 即感染性强但缺乏代谢活性的原体 Elementary body EB 和代谢活跃但无感染性的网状体 Reticulate body RB EB 通过肝硫素吸附于易感细胞表面而进 入细胞内形成包涵体 在包涵体内 EB 生长发育成 RB RB以二分裂形式繁殖 形成众多的子代RB 子代RB重 新转化为EB EB通过裂解细胞和胞粒外排两种形式释 放出细胞外 为逃避机体的免疫清除而维持在宿主细 胞包涵体内的正常生长 衣原体不仅从宿主细胞摄入营 4-5 养和代谢中间产物 而且必须分泌效应分子到宿主细 6-9 胞操纵宿主信号通路 已有研究发现Ct通过产生分 泌蛋白CPF降解宿主细胞转录因子RFX5及上游刺激 因子 0- 裂解角蛋白 8 的蛋白水解活性 抑制宿主 细胞 MHCⅠ MHC-Ⅱ类抗原表达 从而为衣原体提供 有利的生存环境 同时产生包涵体膜蛋白 IncG 与宿主 细 胞 4--β 结 合 而 4--β 可 与 Raf- PKC Cdc5C KSR Ca+/CaM 激酶 Bad 和跨膜蛋白受体等 多种信号蛋白结合发挥信号调节作用 因此 探讨衣原 体蛋白的亚细胞定位有助于了解衣原体致病机制 Ct 除了含有高度保守的基因组外 各血清型中均 存在一种约 7500 大小的隐蔽性质粒 该质粒共有 8 个 开放阅读框架(open reading frame ORF) 编码8种质粒 蛋白 分别命名为pORF~pORF8 研究证实质粒并不 是衣原体生长所必须的元件 但是质粒缺失菌可降低生 4-5 殖病变 说明质粒与毒力密切相关 事实上 质粒普 遍存在于衣原体的各个血清型中 而且在各型之间高度 保守 质粒在进化过程中的高度保守性的特性 提示质 粒具有某种重要的生物学功能 由于缺乏基因转移系

4 8 李忠玉,等.沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 第 期 DNHoechst 58 Tri-color overlay B C D E F G H pdsred Transfected with pdsred/porf8 RFP or RFP-pORF8 图 4 IF 鉴定 porf8 质粒蛋白抗体特异性鉴定 Fig.4 Identification of anti-porf8 fusion protein antibody by IF. Red: RFP-pORF8 fusion proein(a) or RFP(b); Green: nti-porf8 antibody staining; Blue: DN. MOMP porf8 Chlamydial proteins CPF B C D E F Overlay 图 5 porf8 质粒蛋白在感染细胞中的定位分析 Fig.5 Localization of porf8 plasmid protein in Chlamydia-infected cells. Red: Chlamydial proteins; Green: Inclusion body of Chlamydia trachomatis; Blue: DN 统 各质粒蛋白在疾病发生 发展中的作用仍不清楚 本研究通过基因重组方法在大肠杆菌中表达 porf8 融合蛋白 融合蛋白经纯化免疫小鼠后制备了 porf8 多克隆抗体 为分析融合蛋白抗体的特异性 用抗融合蛋白抗体进行Western Blot 分析 结果发现尽 管各融合蛋白都存在共同的 GST 序列 但是抗 porf8 融合蛋白抗体只特异性识别pORF8蛋白而不识别其他 衣原体蛋白 提示我们所制备的抗体能特异性识别 porf8 质粒蛋白 间接免疫荧光证实能抗 porf8 融合 蛋白抗体仅识别 RFP- porf8 而不是识别 RFP 蛋白 进一步说明了抗体具有高度特异性 使用特异性抗 porf8 融合蛋白抗体分析 porf8 质粒蛋白亚细胞定 位 我们发现 porf8 质粒蛋白在感染细胞中的表达模 式与定位于Ct菌体上的MOMP 基本一致 而与分泌蛋 白CPF分布模式完全不同 证实pORF8质粒蛋白分布 于衣原体菌体上 为衣原体菌体蛋白 porf8 质粒蛋 白定位之后是否与衣原体其他质粒蛋白发生相互作用 是否参与Ct致病过程 其机制如何 还将有待于我们

5 84 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 卷 更进一步的研究 参考文献 : [] Mabey DC, Solomon W, Foster. Trachoma[J]. Lancet, 00, 69(979): -9. [] Brunham RC, Rey-Ladino J. Immunology of chlamydia infection: implications for a chlamydia trachomatis vaccine[j]. Nat Rev Immunol, 005, 5(): [] Belland R, Ojcius DM, Byrne GI. Chamydia[J]. Nat Rev Microbiol, 004, (7): 50-. [4] Carabeo R, Mead DJ, Hackstadt T. Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion[j]. Proc Natl cad Sci U S, 00, 00(): [5] Su H, Mcclarty G, Dong F, et al. ctivation of Raf/MEK/ERK/ cpl signaling pathway is essential for chlamydial acquisition of host glycerophospholipids[j]. J Biol Chem, 004, 79(0): [6] Zhong G. Chlamydia trachomatis secretion of proteases for manipulating host signaling pathways[j]. Frontiers Microbiol, 0, (): 4. [7] Li Z, Chen D, Zhong Y, et al. The chlamydial plasmid-encoded protein pgp is secreted into the cytosol of Chlamydia-infected cells [J]. Infect Immun, 008, 76(8): [8] Qi M, Gong S, Lei L, et al. chlamydia trachomatis OmcB c-terminal fragment is released into the host cell cytoplasm and is immunogenic in humans[j]. Infect Immun, 0, 79(6): 9-0. [9] Zhong G, Fan P, Ji H, et al. Identification of a chlamydia-secreted protease factor[j]. J Exp Med, 00, 9(8): [0]Fan P, Dong F, Huang Y, et al. Chlamydia pneumoniae secretion of a protease-like activity factor for degrading host cell transcription factors required for [correction of factors is required for] major histocompatibility complex antigen expression[j]. Infect Immun, 00, 70(): []Zhong G, Fan T, Liu L. Chlamydia inhibits interferon gammainducible major histocompatibility complex class II expression by degradation of upstream stimulatory factor [J]. J Exp Med, 999, 89(): 9-8. []Dong F, Su H, Huang Y, et al. Cleavage of host keratin 8 by a Chlamydia-secreted protease[j]. Infect Immun, 004, 7(7): []Scidmore M, Hackstadt T. Mammalian 4--beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG[J]. Mol Microbiol, 00, 9(6): [4]Carlson JH, Whitmire WM, Crane DD, et al. The chlamydia trachomatis plasmid is a transcriptional regulator of chromosomal genes and a virulence factor[j]. Infect Immun, 008, 76(6): 7-8. [5]O'connell CM, Ingalls RR, ndrews CW Jr, et al. Plasmid-deficient Chlamydia muridarum fail to induce immune pathology and protect against oviduct disease[j]. J Immunol, 007, 79(6): ( 编辑 : 吴锦雅 )

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