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1 1648 doi: / j. issn 鄄 484X B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护淤作用初步研究 李开铭摇谢梅花摇余敏君摇唐双阳摇张璐思摇邓苏宏摇胡四海 ( 南华大学病原生物学研究所, 衡阳 ) 摇摇中图分类号摇 R392 郾 12 摇摇文献标志码摇 A 摇摇文章编号摇 1000 鄄 484X(2015)12 鄄 1648 鄄 07 [ 摘摇要 ] 摇目的 : 构建 B 群脑膜炎奈瑟菌 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 真核表达重组质粒, 检测其诱导小鼠产生的特异性 体液免疫和细胞免疫应答水平 免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用, 初步探讨 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护 效果, 为研制一种新的预防 B 群流脑的核酸疫苗提供实验依据 方法 : 以 B 群脑膜炎奈瑟菌标准株 MC58 基因组 DNA 为模板 设计引物,PCR 扩增 NMB0315 基因, 克隆至 pcdna3 郾 1( +) 真核表达载体中, 经 BamH 玉和 Xho 玉双酶切及测序鉴定重组质粒 构建成功的 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 重组质粒转染 COS 鄄 7 细胞和 RAW264 郾 7 细胞, 免疫细胞化学染色法和 Western blot 法检 测重组蛋白在真核细胞中的表达 大量提取重组质粒, 肌注免疫 BALB / c 小鼠, 检测小鼠体内抗 NMB0315 的特异性体液免疫 和细胞免疫水平 ; 测定免疫血清体外杀菌滴度, 观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果 结果 : 构建的核酸疫苗 pcdna3 郾 1 (+) / NMB0315 能够在真核细胞中有效转录和表达 ; 免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答 在疫苗免 疫后的 周,pcDNA3 郾 1( +) / NMB0315 组和 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315+CpG 组血清总 IgG 及 IgG1 IgG2a IgG2b 和 IgG3 亚 类抗体水平呈递增趋势, 均明显高于 PBS pcdna3 郾 1( +) CpG 对照组 (P<0 郾 001); 小鼠血清 IgG2a / IgG1 比值均小于 1; 生殖道 灌洗液中特异性 siga 水平均明显高于 PBS pcdna3 郾 1( +) CpG 对照组 (P<0 郾 01) 免疫第 6 周, 脾淋巴细胞刺激指数 ( SI) 均 明显高于对照组 (P<0 郾 01,P<0 郾 01,P<0 郾 05) pcdna3 郾 1( +) / NMB0315+CpG pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 疫苗组免疫血清补体 介导的体外杀菌效价分别为 1 颐 128 和 1 颐 64; 在致死量 B 群脑膜炎奈瑟菌 MC58 攻击后 72 h 存活率分别为 70% 和 65%, 对照组 [PBS,pcDNA3 郾 1( +),CpG]72 h 存活率为 0 结论 :NMB0315 核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫 ( 包括黏膜免 疫 ) 和细胞免疫应答 ; 免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高 ;NMB0315 核酸疫苗对感染 B 群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的 免疫保护作用 [ 关键词 ] 摇 B 群脑膜炎奈瑟菌 ;B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 0315; 核酸疫苗 ; 免疫活性 ; 免疫保护 Immunocompetence and Immunoprotection of a DNA vaccine NMB0315 against N 郾 meningitidis serogroup B in mice LI Kai 鄄 Ming,XIE Mei 鄄 Hua,YU Min 鄄 Jun,TANG Shuang 鄄 Yang,ZHANG Lu 鄄 Si,DENG Su 鄄 Hong,HU Si 鄄 Hai 郾 Institute of Pathogenic Biology,University of South China,Hengyang ,China [Abstract] 摇 Objective:To construct NMB0315 eukaryotic expression recombinant vector,detect specific humoral and cellular immune response induced by the recombint DNA vaccine intramuscularly in female BALB / c mice,evaluate the immunocompetence and immunoprotection of the vaccine, so as to provide experimental basis for the development of a novel nucleic acid vaccine against N 郾 meningitidis serogroup B 郾 Methods: The whole NMB0315 gene was amplified by PCR from the standard strains MC58 genomic DNA,cloned into a plasmid pcdna3 郾 1( +),identified by double digestion of the recombinant plasmid with restriction enzymes and se 鄄 quencing 郾 The recombinant vector pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 was transfected into eukaryotic COS 鄄 7 cells and RAW264 郾 7 cells,the NMB0315 protein was detected by immunocytochemical method and Western blot respectively 郾 The levels of specific humoral and cellular immune response were detected after inoculating in female BALB / c mice intramuscularly with the recombinant plasmid 郾 The immune protective effect was investigated with the DNA vaccine and the bactericidal titer of the immune serum was deter mined by serum bactericidal assay ( SBA ) in vitro 郾 Results: The recombinant pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 was effectively transcripted and expressed in eukaryotic cells and the specific humoral and cellular immune responses were induced in the inoculated mice 郾 In the re 鄄 淤本文为国家自然科学基金 (No 郾 ) 特殊病原体防控湖南省重点实验室( 湘科计字 2014 鄄 5 号 ; 湘教通 2012 鄄 312 号 ) 及湖南省重点学科建设项目资助 作者简介 : 李开铭 (1985 年 -), 女, 主要从事 B 群流脑核酸疫苗研究, 现就职于衡阳市中心医院, E 鄄 mail: @ qq 郾 com 通讯作者及指导教师 : 胡四海 (1957 年 -), 男, 教授, 硕士生导师, 主要从事抗感染免疫方面研究,E 鄄 mail:hhsshh_518@ 163 郾 com

2 李开铭等摇 B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究摇第 12 期 1649 combinant pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 group, the levels of serum IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 and genital tract siga were significantly higher than in controls ( P < 0 郾 001) 郾 The stimulation index in the culture supernatant of the spleen lymphocytes of the vaccine group was higher than that of the control group(p<0 郾 05) 郾 The ratios of serum IgG2a / IgG1 in the DNA vaccine group were less than 1 郾 The bactericidal titer of the NMB CpG group reached 1 颐 128 following three immunizations,the protection rate of the vaccine group was 70% against the N 郾 meningitidis strain MC58 郾 Conclusion: The NMB0315 nucleic acid vaccine could induce higher levels of humoral immunity and cellular immunity and showed effective protection against N 郾 meningitidis serogroup B, the immune serum had strong bactericidal activity in vitro 郾 [Key words] 摇 Neisseria meningitides;outer membrane protein NMB0315;DNA vaccine;immunocompetence;immunoprotection 摇摇脑膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitides,nm), 通 常被称为脑膜炎球菌, 是流行性脑脊髓膜炎 ( 简称 流脑 ) 的病原体 该菌经呼吸道传播且以人类为其 唯一宿主, 曾经多次引起世界爆发性流行 [1], 该菌 可侵袭脑部和脊髓, 引起化脓性脑膜炎, 导致脑和神 经系统的永久性损害 ; 还可引起败血症 肺炎 心包 炎和关节炎等, 又称侵袭性脑膜炎球菌疾病, 根据荚 膜多糖的抗原性和分子结构, 将 Nm 分为 13 个血清 群 其中 B C W135 和 Y 是引起侵袭性脑膜炎最 常见的血清群 [2,3] 目前, 以荚膜多糖为基础的脑 膜炎球菌主要致病血清群 A C Y 和 W135 群 ( 除 B 血清群外 ) 的疫苗已相继研发成功 [4 鄄 6] B 血清群的 荚膜多糖免疫原性低, 且与人类神经组织细胞的 N 鄄 乙酰神经氨酸成分结构类似, 可能引起自身免疫性 疾病 [7,8] 故荚膜多糖不适合作为 B 群流脑疫苗候 选抗原 [9,10] NMB0315 ( Serogroup B N 郾 meningitidis 0315, NMB0315) 为 B 群脑膜炎球菌的外膜蛋白, 是由 个核苷酸组成的阅读框所编码的 430 个氨基 [11] 酸组成的多肽, 分子量为 46 kd Wang 等研究了 NMB0315 的晶体结构, 发现该外膜蛋白属于 M23 金 属肽酶家族成员中的溶葡萄球菌型肽酶, 其抗原性 高度保守 ;Blast 序列分析 NMB0315 与脑膜炎奈瑟 菌的不同血清群以及淋病奈瑟菌之间有 98% 的同 源性 该外膜蛋白是否具有良好的免疫活性和免疫 保护作用而作为一种新的 B 群流脑疫苗候选抗原, 以及 NMB0315 核酸疫苗的免疫效果如何, 国内外尚 未见报道 本研究通过构建 B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 NMB0315 核酸疫苗, 诱导小鼠产生特异性体液免疫 和细胞免疫应答, 检测免疫血清体外杀菌效果及免 疫保护作用, 初步评价 NMB0315 核酸疫苗的免疫效 果, 为研制一种新型核酸疫苗用于 B 群流脑的预防 提供实验依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料 1 郾 1 郾 1 摇细菌菌株 质粒和动物摇标准菌株 ( MenB MC58) 购自美国菌种保存中心 ( ATCC) 大肠杆菌 JM109 和真核表达载体 pcdna3 郾 1 ( +) 由本研究所保存 健康新西兰兔和新生乳兔由南华大学实验动物部提供 健康雌性 BALB / c 小鼠 (3 ~ 4 周 ) 购自国家啮齿类实验动物种子中心 ( 上海分中心 ) 1 郾 1 郾 2 摇试剂摇抗 NMB0315 免疫血清, 由重组 NMB0315 蛋白免疫新西兰兔获得 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体, 限制性内切酶 ( BamH 玉和 Xho 玉 ), T4 连接酶蛋白标记均购自 fermentas( Burlington, 加拿大 ) 引物由上海生工公司合成 质粒提取试剂盒购自欧米茄 ( 美国 ) 佐剂 CpG 购自上海华大基因公司 ELISA 试剂盒购自 ebioscience 公司 ( 美国 ) 1 郾 2 摇方法 1 郾 2 郾 1 摇真核表达载体 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 的构建及鉴定摇从 GenBank 获得 NMB0315 的 DNA 序列 (GI: ), 选择 BamH 玉和 Xho 玉分别为上游和下游引物的限制性酶切位点 以 NMB MC58 为模板通过 PCR 扩增获得 NMB0315 基因, 其上游引物为 (CGCGGATCCATGGCTGTCTTCCCACTTTC), 下游引物为 ( CCGCTCGAGTCAATCCGATTGCGAC 鄄 AC) 将获得的目的基因克隆到真核表达载体 pcdna3 郾 1( +) 中, 构建包含有 BamH 玉 ( forward) 和 Xho 玉 ( reverse ) 限制性酶切位点的重组质粒 pcdna3 郾 1( +) 鄄 NMB0315, 酶切和测序鉴定 使用 Blast 软件将测序结果与 GenBank 登录的序列比较, 符合率为 100% 1 郾 2 郾 2 摇 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 真核重组载体在真核细胞中的表达摇将 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 重组质粒转染至 RAW264 郾 7 和 COS 鄄 7 细胞, 用抗 NMB0315 兔免疫血清为一抗,HRP 标记的羊抗兔 IgG 为二抗, 采用免疫组织化学染色法和 Western blot 法检测 NMB0315 基因的表达,RT 鄄 PCR 法检测 NMB0315 mrna 水平 1 郾 2 郾 3 摇 NMB0315 核酸疫苗和空质粒的大量制备摇从 - 80 益冰箱取出构建好的 pcdna3 郾 1 ( + ) /

3 1650 NMB0315 含有重组质粒和空质粒的菌液接种平板, 37 益培养过夜, 挑取单个菌落接种于 3 ~ 5 ml 氨苄阳性液体培养基中,37 益水浴箱振荡培养 12 ~ 16 h 将过夜培养的菌液加入 200 ml 氨苄阳性培养基中, 37 益水浴箱振荡培养 12 ~ 16 h 按照康为世纪公司提供的去内毒素质粒大提试剂盒说明书进行质粒大量提取, 核酸蛋白仪检测提取的质粒浓度以确定免疫小鼠的剂量 1 郾 2 郾 4 摇佐剂 CpG 的合成摇由深圳华大基因公司合成, 序列为 5 忆鄄 TCCATGACGTTCCTGACGTT 鄄 3 忆,1826 型, 全链硫化磷酸修饰 1 郾 2 郾 5 摇免疫小鼠和收集血清摇 3 ~ 4 周 BALB / c 雌性小鼠 100 只, 分为 5 组, 即 : pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB CpG 组 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 组 pcdna3 郾 1( +) 和 PBS CpG 组, 每组 20 只, 适应性饲养一周后进行疫苗接种 方法 : 将大量提取的 pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 重组质粒和 pcdna3 郾 1 ( +) 空质粒用无菌 PBS 稀释成 1 mg / ml, 将 50 滋 g 重组质粒和 10 滋 g CpG 混匀后肌注免疫重组质粒 + CpG 组小鼠 其余组用同剂量 pcdna3 郾 1( +) CpG 及 PBS 肌注免疫, 用 1 ml 注射器接种于小鼠两侧股四头肌, 每只接种 100 滋 l 隔两周免疫 1 次, 共免疫 3 次 于每次免疫当日和末次免疫的第 14 天用无菌刀片割取小鼠尾静脉收集小鼠血液, 每次约 30 ~ 50 滋 l, 于 4 益静置过夜,3 000 r / min 离心 15 min, 收集血清于 -80 益保存备用 1 郾 2 郾 6 摇 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性评价摇用纯化后的重组蛋白 NMB0315 为抗原包被酶标板, 小鼠血清或生殖道灌洗液作为第一抗体, 间接 ELISA 法检测小鼠血清总 IgG 及亚类 生殖道灌洗液 siga 水平 ;CCK8 法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应 : 将培养好的小鼠脾淋巴细胞加入重组 NMB0315 蛋白刺激, SI( 刺激指数 )= 刺激组 A570 值 / 阴性对照组 A570 值, 用刺激指 数评价小鼠脾淋巴细胞的增殖程度 1 郾 2 郾 7 摇脑膜炎奈瑟菌感染动物模型的建立摇根据本课题组前期研究方法建立 MC58 感染小鼠模型 [12], 脑膜炎奈瑟菌 MC58 采用 T 鄄 M ( Thayer 鄄 martin) 液体培养基增菌培养, 取不同浓度对数生长期细菌经腹腔注射于 9 ~ 10 周雌性 BALB / c 小鼠 ( 菌液需 37 益保温, 以保持菌株活性 ), 菌株攻击后 72 h 内, 观察小鼠发病及死亡情况 ; 通过反复摸索, 确定对小鼠最小致死剂量的菌液浓度为 CFU / ml 1 郾 2 郾 8 摇免疫血清体外杀菌活性测定摇将生长至对数时期的 MC58 菌液与乳兔补体 1 颐 1 混合, 再以 1 颐 2 比例加入到待测血清 (56 益灭活 ), 充分混匀后 37 益培养 1 h, 加入巧克力琼脂培养基, 混匀后置 37 益培养过夜 同时设置阳性血清 ( 诊断血清 ) 对照和阴性对照, 其中阴性对照包括菌液加补体, 菌液加热失活补体, 血清加菌液加热失活补体三孔 判定结果时, 以补体阴性对照为参照, 对于杀菌率达 50% 以上的血清, 其最高稀释度的倒数为其血清抗体杀菌滴度 1 郾 3 摇统计学处理摇运用 SPSS16 郾 0 软件分析实验数据 抗体水平 脾细胞刺激指数及细胞因子水平以 x 依 s 表示, 组间均数的比较采用方差分析, 以 P < 0 郾 05 表示差异有统计学意义 2 摇结果 2 郾 1 摇真核表达载体 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 的构建及鉴定摇真核重组质粒 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 经 Xho 玉 BamH 玉双酶切后, 得到 2 个片段, 大片段约 bp, 小片段约为 bp( 图 1) 2 郾 2 摇 NMB0315 基因在真核细胞中的表达 2 郾 2 郾 1 摇 NMB0315 基因在 COS 鄄 7 和 RAW264 郾 7 细胞中的瞬时转染摇重组质粒 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 和空质粒 pcdna3 郾 1 ( +) 分别瞬时转染 COS 鄄 7 和 RAW264 郾 7 细胞, 间接免疫荧光法结果显示, pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 和 pcdna3 郾 1( +) 的 COS 鄄 7 和 RAW264 郾 7 细胞分别有黄绿色和蓝色荧光 见图 2 2 郾 2 郾 2 摇免疫组织化学法检测 NMB0315 基因在真核细胞中的表达摇免疫组化结果显示 : COS 鄄 7 细胞转染 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 重组质粒后, 检测图 1 摇真核重组质粒的酶切鉴定 Fig. 1 摇 Identification of recombinant pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 digested with BamH 玉 and Xho 玉 Note: M 郾 DNA marker; 1 郾 Digestion of recombinant pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 with BamH 玉 and Xho 玉 [pcdna3 郾 1( +):5 428 bp; NMB0315:1 293 bp] 郾

4 李开铭等摇 B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究摇 第 12 期 1651 NMB0315 蛋 白 的 表 达, 转 染 了 pcdna3郾 1 ( + ) / 间点,IgG IgG1 IgG2a IgG2b 和 IgG3 水平呈逐渐上 色,细胞呈棕红色,对照组细胞无棕红色( 图 3) pcdna3郾 1( +) CpG 组相比较具有显著性差异( P < NMB0315 的 COS鄄7 细胞,通过免疫组织细胞化学染 2郾 2郾 3摇 Western blot 法检测 NMB0315 基因在真核 升的 趋 势, 第 6 周 抗 体 效 价 均 达 峰 值, 与 PBS 0郾 001) 见图 5 细胞中的表达,见图 4 2郾 3郾 1郾 2摇 免疫小鼠血清中特异性 IgG2a / IgG1 的比 2郾 3郾 1摇 免疫小鼠体液免疫水平 疫组小鼠血清 IgG2a / IgG1 比值分别为 0郾 595 0郾 723 2郾 3摇 核酸疫苗 NMB0315 免疫活性研究 2郾 3郾 1郾 1摇 血清特异性抗体 IgG 及其亚类的水平摇 收集小鼠 周的血清标本,采用间接 ELISA 法检测特异性抗体 IgG 及其亚类 IgG1 IgG2a IgG2b 和 IgG3 结 果 表 明: pcdna3郾 1 ( + ) / NMB 值摇 免疫 周时,pcDNA3郾 1 ( +) / NMB0315 免 和 0郾 565;pcDNA3郾 1 ( +) / NMB0315 +CPG 免疫组小 鼠血 清 IgG2a / IgG1 比 值 分 别 为 0郾 775 0郾 744 和 0郾 614,其比值均小于 1 CpG pcdna3郾 1 ( +) / NMB0315 组在不同的免疫时 图 4摇 Western blot 检测 NMB0315 基因在真核细胞中的蛋 白表达 Fig. 4摇 Eukaryotic expression of NMB0315 protein detect鄄 ed by Western blot 图 2摇 重组质粒和空质粒在 COS鄄7 和 RAW264郾 7 细胞中 瞬时转染结果( 伊40) Fig. 2 摇 Transfection of pcdna3郾 1 ( + ) / NMB0315 and pcdna3郾 1 ( + ) in COS鄄7 and RAW264郾 7 cells ( 伊40) Note: A郾 pcdna3郾 1 ( + ) / NMB0315 transfection in COS鄄7 cells; B郾 pcdna3郾 1 ( + ) transfection in COS鄄7 cells; C郾 pcdna3郾 1 ( +) / NMB0315 transfection in RAW264郾 7 cells;d郾 pcdna3郾 1 ( +) transfection in RAW264郾 7 cells郾 图 5摇 免疫小鼠血清特异性 IgG 及其亚类抗体水平 图 3摇 NMB0315 蛋白在 COS鄄7 细胞中的表达( 伊400) Fig. 3 摇 Expression of NMB0315 protein in eukaryotic COS鄄7 cells( 伊400) Note: A郾 COS鄄7 cells transfected with pcdna3郾 1 ( + ) / NMB0315; B郾 COS鄄7 cells transfected with pcdna3郾 1 ( + ) ; C郾 COS鄄7 cells transfected with PBS;D郾 Normal COS鄄7 cells郾 Fig. 5摇 A450 of special IgG and IgG subclasses antibodies in serun of immunized mice Note: A郾 IgG; B郾 IgG1; C郾 IgG2a; D郾 IgG2b; E郾 IgG3郾 **郾 Express that the comparison with PBS,CpG,pcDNA3郾 1( +) control group,p < 0郾 001;# #郾 Express that comparison with the pcdna3郾 1 ( + ) / NMB0315,P<0郾 05郾

5 1652 图 6 摇 小鼠生殖道黏膜特异性 siga 抗体水平 Fig. 6 摇 A450 of special siga antibody in vaginal secretions of immunized mice Note: ** 郾 Express that the comparison with PBS,CpG,pcDNA3 郾 1( +) control group, P < 0 郾 001; # # 郾 Express that comparison with the pcdna3 郾 1( +) / NMB0315,P<0 郾 05 郾 表 1 摇 NMB0315 核酸疫苗的免疫保护作用及免疫血清体外 杀菌活性 Tab. 1 摇 Immunoprotection evaluation of BALB / c mice after pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 immunization Groups SBA Surviving mice 24 h 48 h 逸 72 h % of survial PBS - 10 / 20 0 / 20 0 / 20 0 CpG - 13 / 20 2 / 20 0 / 20 0 pcdna3 郾 1( +) - 15 / 20 5 / 20 0 / 20 0 pcdna3 郾 1( +) / NMB / / / pcdna3 郾 1( +) / NMB0315+CpG / / / 郾 3 郾 1 郾 3 摇免疫小鼠生殖道黏膜 siga 摇收集免疫小鼠生殖道分泌物进行特异性 siga 检测 :pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 组 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315+ CpG 组小鼠在免疫后 周可检测到特异性 siga 抗体并呈现递增趋势, 第 6 周抗体效价为 1 颐 , pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 +CpG 组 周生殖道灌洗液特异性 siga OD A450 分别为 0 郾 066 依 0 郾 郾 096 依 0 郾 郾 167 依 0 郾 021, 与对照组 PBS pcdna3 郾 1( +) CpG 组相比有明显差异 ( P<0 郾 01), 见图 6 2 郾 3 郾 2 摇免疫小鼠细胞免疫水平摇用重组蛋白 NMB0315 抗原刺激小鼠脾淋巴细胞,CCK8 法检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数 ( SI) pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 组和 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315+CpG 的 SI 分别为 (1 郾 62 依 0 郾 149 ) 和 ( 1 郾 87 依 0 郾 12 ) 显著高于 PBS CpG pcdna3 郾 1( +) 对照组 (0 郾 38 依 0 郾 13 0 郾 41 依 0 郾 14 0 郾 46 依 0 郾 16)(P<0 郾 05), 见图 7 2 郾 4 摇 NMB0315 核酸疫苗的免疫保护效果和免疫血 图 7 摇免疫小鼠脾淋巴细胞刺激指数 (SI) Fig. 7 摇 SI of spleen lymphocyte of immunized mice Note: ** 郾 Express that the comparison with PBS,CpG,pcDNA3 郾 1( +) control group, P < 0 郾 001; # # 郾 Express that comparison with the pcdna3 郾 1( +) / NMB0315,P<0 郾 05 郾清体外杀菌活性摇用致死剂量的脑膜炎奈瑟菌 MC58 攻击实验小鼠,72 h 内观察实验小鼠的存活率,pcDNA3 郾 1( +) / NMB0315 组和 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 +CpG 组小鼠存活率分别为 65% 和 70%, 明显高于 PBS CpG 和 pcdna3 郾 1 ( + ) 组 pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 组和 pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315+ CpG 组免疫血清稀释到 1 颐 64 和 1 颐 128 时, 在补体介导下, 导致 50% 以上的实验菌 MC58 死亡, 即免疫血清体外杀菌抗体滴度分别为 1 颐 64 和 1 颐 128, 对照组血清在补体介导下无杀菌活性 ( 表 1) 3 摇讨论核酸疫苗是近年来在分子生物学和免疫学的基础上迅速发展出现的一种全新疫苗 当核酸疫苗导入宿主体内后, 被组织细胞 抗原递呈细胞或其他炎性细胞摄取, 并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原, 刺激机体产生细胞免疫和体液免疫 [13] 与传统的灭活疫苗 亚单位疫苗相比, 核酸疫苗具有明显的优势 [14,15], 包括免疫保护力增强, 制备简单 贮存运输方便, 同种异株间具有交叉保护作用, 应用较安全, [16 鄄能激发机体产生全面 持久免疫应答等 18] 因此, 核酸疫苗以其独有的优点成为近年来疫苗研究领域中的热点之一 核酸疫苗在真核细胞中的有效转染直接影响疫苗的免疫效果 本研究中 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 核酸疫苗能在真核细胞 COS 鄄 7 RAW264 郾 7 中进行有效地转录和表达, 目的基因的转录水平明显高于对照组, 这为核酸疫苗下一步进行哺乳动物实验提供了实验基础 脑膜炎奈瑟菌 (Nm) 为胞外寄生菌, 抗 Nm 感染

6 李开铭等摇 B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白 NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究摇第 12 期 1653 主要靠体液免疫 本研究发现 pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB0315 核酸疫苗具有良好的免疫原性, 能有效诱导小鼠产生体液免疫应答 在疫苗免疫的 周,pcDNA3 郾 1( +) / NMB0315+CpG 实验组诱导的血清特异性 IgG IgG IgG2a IgG3 和 IgG2b 水平随免疫时间的增加明显上升, 第 6 周抗体效价分别为 1 颐 颐 颐 颐 颐 , 明显高于 PBS CpG pcdna3 郾 1 ( + ) 对照组 ( P < 0 郾 001) IgG 类抗体是体内抗胞外菌感染的重要抗体, 小鼠体内的 IgG1 IgG2 和 IgG3 具有较强的活化补体的能力, 其中 IgG3 活化补体的能力最强,IgG2 次之 [19,20],IgG 类抗体与相应抗原结合后暴露抗体的 Fc 段的补体结合位点, 与补体 Clq 发生结合, 发挥杀菌作用 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 +CpG 疫苗组诱导了较高水平的 IgG1 IgG2 和 IgG3 亚类抗体, 通过活化补体, 增强杀菌作用, 本研究中免疫血清在补体介导下的体外杀菌效价高达 1 颐 128 可能与此有关 研究表明, 血清中的 IgG 亚类, 可以大致反映机体免疫应答类型的变化 IgG2a 可反映 Th1 倾向性细胞免疫应答,IgG1 可反映 Th2 倾向性体液免疫应答 通过分析免疫小鼠血清中特异性 IgG2a / IgG1 的比值, 发现在免疫的 周时,pcDNA3 郾 1( +) / NMB0315+CpG 免疫组血清 IgG2a / IgG1 的比值分别为 0 郾 775 ( 0 郾 152 / 0 郾 196 ) 0 郾 744 ( 0 郾 253 / 0 郾 340 ) 和 0 郾 614(0 郾 309 / 0 郾 503), 比值均小于 1, 提示 NMB0315 核酸疫苗诱导小鼠的免疫应答倾向于 Th2 型体液免疫应答 [21] 脑膜炎奈瑟菌经呼吸道黏膜侵入机体, 黏膜局部的抗感染尤为重要 [22], 主要依靠 siga 基于黏膜淋巴归巢的理论, 机体各部分的黏膜组织 ( 鼻黏膜 生殖道黏膜 胃肠道黏膜 ) 可作为一个完整的免疫系统, 即当局部黏膜受到抗原刺激时, 其刺激作用可引起机体整个黏膜系统的免疫应答效应 我们取免疫小鼠 周生殖道灌洗液检测 siga, 发现 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315+CpG 组 siga 水平随免疫时间增加呈升高趋势, 第 6 周抗体效价为 1 颐 , 与对照组 PBS pcdna3 郾 1 ( +) CpG 组相比有明显差异 (P<0 郾 01) 合适的免疫佐剂可以有效增强 DNA 疫苗的免疫效果, 本实验选择了近年来国内外备受关注的一种黏膜佐剂 CpG ODN, 它是一种由非甲基化的寡核苷酸序列合成的佐剂, 可辅佐疫苗抗原诱导小鼠体内 B 细胞增殖和分泌免疫球蛋白, 同时通过促进抗原受体的信号传递增强 B 细胞增殖分化, 刺激 B 细 胞分泌 IL 鄄 6 IL 鄄 10 等细胞因子 本研究中加佐剂组 pcdna3 郾 1 ( + ) / NMB CpG 与未加佐剂组 pcdna3 郾 1( +) / NMB0315 比较, 产生的抗体水平无显著性差异 ( P > 0 郾 05 ), 这可能与真核质粒 pcdna3 郾 1( +) 本身所携带的氨苄青霉素抗性基因中含有 CpG 序列, 因而佐剂的免疫增强作用不明显有关 [23] 本研究成功构建了 pcdna3 郾 1 ( +) / NMB0315 核酸疫苗, 能够在真核细胞中有效表达 ; 通过肌注途径免疫雌性 BALB / c 小鼠后可诱导其产生特异性体液免疫和细胞免疫, 对实验小鼠具有良好的免疫保护作用 ; 免疫血清体外杀菌活性较高, 初步证明 NMB0315 外膜蛋白具有作为预防 B 群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力, 可为进一步研制有效的 B 群脑膜炎球菌核酸疫苗提供一定的实验基础 参考文献 : [1] 摇 Rosenstein NE, Perkins BA, Stephens DS, et al. Meningococcal disease [J]. N Engl J Med,2001,344(18):1378 鄄 1388 郾 [2] 摇 Raymond J 郾 Neisseria meningitidis: characterisation and epidemiology[j]. Arch Pediatr,2012,19(Suppl 2):S55 鄄 60 郾 [3] 摇 Ferguson LE, Hormann MD, Parks DK, et al. Neisseria meningitidis:presentation,treatment,and prevention[ J]. Pediatr Health Care,2002,16(3):119 鄄 124 郾 [4] 摇 Jackson LA,Jacobson RM,Reisinger KS,et al. A randomized trial to deter mine the tolerability and immunogenicity of a quadrivalent meningococcal glycoconjugate vaccine in healthy adolescents[ J]. Pediatr Infect Dis J,2009,28(2):86 鄄 91 郾 [5] 摇 van den Dobbelsteen GP, van Dijken HH, Pillai S, et al. Immunogenicity of a combination vaccine containing pneumococcal conjugates and meningococcal PorA OMVs[ J]. Vaccine,2007,25 (13):2491 鄄 2496 郾 [6] 摇 Aaberge IS,Oster P,Helland OS,et al. Combined ad ministration of meningococcal serogroup B outer membrane vesicle vaccine and conjugated serogroup C vaccine indicated for prevention of menin 鄄 gococcal disease is safe and immunogenic [ J]. Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(5):599 鄄 605 郾 [7] 摇 Trotter CL,Ramsay ME 郾 Vaccination against meningococcal disease in Europe:review and recommendations for the use of conjugate vaccines[j]. FEMS Microbiol Rev,2007,31(1):101 鄄 107 郾 [8] 摇 Holst J, Martin D, Arnold R, et al. Properties and clinical performance of vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis[j]. Vaccine,2009,27(Suppl 2):B3 鄄 12 郾 [9] 摇 Esposito S,Castellazzi L,Bosco A,et al. Use of a multicomponent, recombinant,meningococcal serogroup B vaccine ( 4CMenB) for bacterial meningitis prevention[ J]. Immunotherapy,2014,6(4): 395 鄄 408 郾 [10] 摇 Bruge J,Bouveret 鄄 Le CN,Danve B,et al. Clinical evaluation of a group B meningococcal N 鄄 propionylated polysaccharide conjugate vaccine in adult,male volunteers[ J]. Vaccine,2004,22(9 鄄 10): 1087 鄄 1096 郾 ( 下转第 1658 页 )

7 1658 缺血性心肌病者, 因此在输注 CIK 细胞生物治疗前需对患者行相关心脏疾病筛查, 对高危患者行超前干预, 以便完成治疗 综上所述,CIK 细胞回输后出现的不良反应, 其中全身炎症反应综合征 急性过敏样反应 心绞痛等少见的不良反应需要紧急对症处理, 其余无需特殊治疗, 除急性过敏样反应以外, 其余不良反应并不影响患者的后续治疗, 不良反应发生率远低于放化疗治疗, 说明此疗法较安全, 但是亦存在少见的潜在风险 ; 本回顾性分析未发生肿瘤溶解综合征 感染等不良反应, 但不能除外无该不良反应发生的可能 ; 本文提及的 CIK 细胞治疗后出现的不良反应及处理方法可供参考 ; 为降低常见不良反应的发生, 在 CIK 细胞单采前对患者行风险评估, 在 CIK 细胞回输时可给予个体化的预防措施, 使广大患者群获益 参考文献 : [1] 摇 Couzin FJ 郾 Breakthrough of the year 2013 郾 Cancer immunotherapy [J]. Science,2013,342(6165):1432 鄄 1433 郾 [2] 摇 June CH,Riddell SR,Schumacher TN 郾 Adoptive cellular therapy: a race to the finish line [ J ]. Sci Transl Med, 2015, 7 (280):280ps7 郾 [3] 摇 Wang X,Yu W,Li H,et al 郾 Can the dual 鄄 functional capability of CIK cells be used to improve antitumor effects[j]. Cell Immunol, 2014,287(1):18 鄄 22 郾 [4] 摇吴摇菲, 林国桢, 张晋昕郾我国恶性肿瘤发病现状及趋势 [ J]. 中国肿瘤,2012,21(2):81 鄄 85 郾 [5] 摇庞佳楠, 崔久嵬郾细胞因子诱导的杀伤细胞治疗肿瘤的研究进展 [J]. 中华临床医师杂志,2014,8(15):2889 鄄 2893 郾 [6] 摇马学斌, 马摇聪, 邱摇伟, 等郾 CIK 细胞治疗 90 例肿瘤患者的安全性分析 [J]. 肿瘤学杂志,2014,20(3):230 鄄 233 郾 [7] 摇刘正印郾发热原因待查的诊断思路及处理原则 [ J]. 中国临床医生,2012,40(10):3 鄄 5 郾 [8] 摇 Verneris MR,Karami M,Baker J,et al. Role of NKG2D signaling in the cytotoxicity of activated and expanded CD8 + T cells [ J]. Blood,2004,103(8):3065 鄄 3072 郾 [9] 摇 Kornacker M,Moldenhauer G,Herbst M,et al. Cytokine 鄄 induced killer cells against autologous CLL: direct cytotoxic effects and induction of immune accessory molecules by interferon 鄄 gamma [J]. Int J Cancer,2006,119(6):1377 鄄 1382 郾 [10] 摇 Papa AE 郾 Cytokine levels in Crimean 鄄 Congo hemorrhagic fever [J]. J Clin Virol,2006,36(04):272 鄄 276 郾 [11] 摇 Li A,Xiong J,Chen Z 郾 IL 鄄 6,TNF 鄄琢,and inos is associated with decreased colonic contraction in rats with multiple organ dysfunction syndrome[j]. J Surg Res,2012,178(2):e51 鄄 e57 郾 [12] 摇 Aschina LA, Baranova NI, Kojenkova SV 郾 The comparative characteristic of cytokine production in serum and whole blood in patients with chronic autoimmune nettle rash [ J ]. Klin Lab Diagn,2015,60(3):35 鄄 37 郾 [ 收稿 2015 鄄 09 鄄 16] ( 编辑摇张晓舟 ) ( 上接第 1653 页 ) [11] 摇 Wang X, Yang X, Yang C, et al. Crystal structure of outer membrane protein NMB0315 from Neisseria meningitidis [ J ]. PLoS One,2011,6(10):e26845 郾 [12] 摇 Ying S,He J,Yu M,et al. Recombinant Neisseria surface protein A is a potential vaccine candidate against Neisseria meningitides serogroup B[J]. Mol Med Rep,2014,10(3):1619 鄄 1625 郾 [13] 摇李学荣郾核酸疫苗及其免疫机制研究 [ J]. 中国人兽共患病杂志,2000,16(06):82 鄄 86 郾 [14] 摇 Mandrell RE, Griffiss JM, Macher BA 郾 Lipooligosaccharides ( LOS) of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis have components that are immunochemically similar to precursors of human blood group antigens 郾 Carbohydrate sequence specificity of the mouse monoclonal antibodies that recognize crossreacting antigens on LOS and human erythrocytes[ J]. J Exp Med,1988, 168(1):107 鄄 126 郾 [15] 摇 McGee DJ,Rest RF 郾 Regulation of gonococcal sialyltransferase,li 鄄 pooligosaccharide,and serum resistance by glucose,pyruvate,and lactate[j]. Infect Immun,1996,64(11):4630 鄄 4637 郾 [16] 摇 Gulati S,McQuillen DP,Mandrell RE,et al. Immunogenicity of Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide epitope 2C7, widely expressed in vivo with no immunochemical similarity to human glycosphingolipids[j]. Infect Dis,1996,174(6):1223 鄄 1237 郾 [17] 摇 Gulati S, McQuillen DP, Sharon J, et al. Experimental immunization with a monoclonal anti 鄄 idiotope antibody that mimics the Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide epitope 2C7 [J]. Infect Dis,1996,174(6):1238 鄄 1248 郾 [18] 摇 Martin D,Cadieux N,Hamel J,et al. Highly conserved Neisseria meningitidis surface protein confers protection against experimental infection[j]. Exp Med,1997,185(7):1173 鄄 1183 郾 [19] 摇 Jung DJ,An JH,Kurokawa K,et al. Specific serum Ig recognizing staphylococcal wall teichoic acid induces complement 鄄 mediated opsonophagocytosis against Staphylococcus aureus [ J ]. J Immunol,2012,189(10):4951 鄄 4959 郾 [20] 摇 da HVP, Conceicao FR, Dellagostin OA, et al. Non 鄄 toxic derivatives of LT as potent adjuvants[ J]. Vaccine,2011,29(8): 1538 鄄 1544 郾 [21] 摇 Trotter CL,Yaro S,Njanpop 鄄 Lafourcade BM,et al. Seroprevalence of bactericidal,specific IgG antibodies and incidence of meningitis due to group A Neisseria meningitidis by age in Burkina Faso 2008[J]. PLoS One,2013,8(2):e55486 郾 [22] 摇 Arenas J,Nijland R,Rodriguez FJ,et al. Involvement of three me 鄄 ningococcal surface 鄄 exposed proteins,the heparin 鄄 binding protein NhbA,the alpha 鄄 peptide of IgA protease and the autotransporter protease NalP, in initiation of biofilm formation [ J ]. Mol Microbiol,2013,87(2):254 鄄 268 郾 [23] 摇 Roman M, Martin 鄄 Orozco E, Goodman JS, et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper 鄄 1 鄄 promoting adjuvants[j]. Nat Med,1997,3(8):849 鄄 854 郾 [ 收稿 2015 鄄 06 鄄 15 摇修回 2015 鄄 07 鄄 10] ( 编辑摇倪摇鹏 )

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