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1 江苏农业学报 (Jiangsu J. of Agr. Sci. ),2014,30(5):1003 ~ 1009 h ttp: / / www. jsn y x b. com 1003 张海丹, 叶蕊芳, 毛全贵, 等. 丙氨酸和三甲胺对林可霉素发酵的影响及部分相关基因的转录水平 [J]. 江苏农业学报,2014,30 (5):1003 鄄 doi: / j. issn 鄄丙氨酸和三甲胺对林可霉素发酵的影响及部分相关基因的转录水平张海丹 1, 摇叶蕊芳 1, 摇毛全贵 2, 摇吕和平 2, 摇刘学威 2 2, 摇冯摇汇 (1. 华东理工大学生物工程学院, 上海 ; 2. 河南天方药业有限公司, 河南驻马店 ) 摇摇摘要 : 摇为了研究添加丙氨酸和三甲胺对林可霉素工业生产菌株 Streptomyce lincolnensis 发酵过程中的工艺参数和相关基因转录的影响, 对发酵液和菌体分别进行生物效价测定以及 lmbg PK 和 ASA 基因的表达量测定结果表明 :15 L 罐发酵水平, 在发酵培养 24 h 时添加 0 郾 1 g / L 的丙氨酸处理与对照相比效价提高了 23%, 林肯链霉菌生物合成基因簇中的基因 lmbg 的转录水平远高于对照, 丙酮酸激酶 ( PK) 的基因表达量明显降低 ; 在发酵培养 24 h 时添加 0 郾 02% 的三甲胺处理与对照相比效价提高了 30%,lmbG 的转录水平明显提高, 邻氨基苯甲酸合成酶 ( ASA) 的基因转录水平降低说明添加丙氨酸和三甲胺可以明显提高林可霉素产量, 且对其生物合成基因可能具有正向调控作用关键词 : 摇林可霉素 ; 丙氨酸 ; 三甲胺 ; 丙酮酸激酶 ; 邻氨基苯甲酸合成酶 ; lmbg 基因中图分类号 : 摇 TQ 摇摇摇文献标识码 : 摇 A 摇摇摇文章编号 : 摇 1000 鄄 4440(2014)05 鄄 1003 鄄 07 Lincomycin fermentation in response to alanine and trimethylamine appli 鄄 cation and transcription level of related gene ZHANG Hai 鄄 dan 1, 摇 YE Rui 鄄 fang 1, 摇 MAO Quan 鄄 gui 2, 摇 L 譈 He 鄄 ping 2, 摇 LIU Xue 鄄 wei 2, 摇 FENG Hui 2 (1. College of Bioscience Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai , China; 2. Henan Topfond Pharmaceutical Co. Ltd., Zhumadian , China) 摇摇 Abstract: 摇 The study mainly focused on the influence on Streptomyces lincolnensis fermentation and related gene tran 鄄 scription level by adding alanine or trimethylamine. The fermentation broth and the thalli were measured by biological po 鄄 tency and the transcription levels of gene lmbg and genes encoding pyruvate kinase ( PK) and anthranilate synthase( ASA) were identified. 15 鄄 L tank fermentation broth of S. lincolnensis, the potency of lincomycin was increased by 23% by adding 0. 1 g / L alanine at 24 鄄 h fermentation, the transcription level of gene lmbg of the S. lincolnensis biosynthesis gene cluster was elevated, and the expression level of the gene encoding PK decreased significantly. Adding 0. 02% trimethylamine in 鄄 creased, the yield of lincomycin by 30% and gene lmbg expression, however, the expression of the gene encoding ASA dropped. Adding alanine or trimethylamine during S. lincolnensis fermentation can increase lincomycin production, and may play a positive role in lincomycin biosynthesis gene 收稿日期 :2014 鄄 05 鄄 08 作者简介 : 张海丹 (1987 鄄 ), 女, 陕西咸阳人, 硕士, 主要从事微生物发 regulation. Key words: 摇 lincomycin; alanine; trimethylamine; 酵研究 ( Tel) ;( E 鄄 mail) 126. pyruvate kinase; anthranilate synthase; lmbg gene com 通讯作者 : 叶蕊芳,(Tel) ;(E 鄄 mail)rfye@ ecust. edu. cn 摇摇林可霉素 ( Lincomycin, 简称 LCM) 是首先被

2 1004 江苏农业学报摇 2014 年第 30 卷第 5 期发现的 2 个林可酰胺类抗生素之一 Lewis [ 1] 等证明林可霉素能够抑制革兰氏阳性菌且副 [ 2] 作用小 Hoeksema 等研究了林可霉素的化学结构林可霉素是由一分子的古柯叶液碱 PHA( 反式鄄 N 鄄甲基鄄 4 鄄正丙基脯氨酸 ) 和一分子的甲基硫林可糖胺 MTL( 6 鄄氨基鄄 6,8 鄄二脱氧鄄 1 鄄硫代鄄 O 鄄赤式鄄 2 鄄 D 鄄半乳糖吡喃糖苷 ) 通过一个肽键连接而成的, 属于糖苷类抗生素氨基部分是由糖酵解 ( EMP) 和磷酸戊糖途径 ( HMP) 结合生成的赤藓糖鄄 4 鄄磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸 ( PEP) 缩合生成 3 鄄脱氧鄄琢鄄阿拉伯庚酮糖鄄 7 鄄磷酸 ( DAHP), 经过磷酸环化形成苯环后再脱水加氢, 进入莽草酸途径生成预苯酸, 预苯酸通过对羟苯丙酮酸继而得到酪氨酸, 进而形成 L 鄄多巴, 生成 PHA 与 MTL 结合形成林可霉素预苯酸在邻氨基苯甲酸合成酶 ( ASA) 作用下可以生成邻氨基苯甲酸, 最终得到色氨酸 [ 3] 在初级代谢中糖酵解的最后一步是磷酸基团由磷酸烯醇式丙酮酸转移到 ADP 上同时形成丙酮酸, 是一个高度放能且不可逆反应丙酮酸激酶 ( PK) 是 EMP 途径中的一个重要变构调节酶 [ 4] ATP 长链脂肪酸乙酰鄄 CoA 丙氨酸都对该酶有抑制作用丙酮酸通过 4 步反应进入柠檬酸循环, 为菌体生长提供所需的各种氨基酸和能量 [ 5], 丙氨酸能够抑制 PK 的活性, 使 PEP 更多流向产物合成方面, 进一步提高林可霉素的效价三甲胺可以抑制 ASA 的活性, 侧面增强酪氨酸途径的物质流, 提高林可霉素的效价研究发现在林可霉素的合成基因簇中, 推测有 3 个甲基化步骤, 分别对 C 鄄 S 鄄和 N 鄄进行甲基化, 甲基化过程推测是与基因 lmbg 有关 [ 6 鄄 7] 本试验通过分别添加丙氨酸和三甲胺来提高林可霉素的效价, 并通过测定其相关基因的表达量来探究添加丙氨酸和三甲胺对生成林可霉素过程中基因转录水平的影响, 为后期基因工程菌的构建提供参考 1 摇材料与方法 1. 1 摇菌种林肯链霉菌 (Streptomyce lincolnensis) 藤黄八叠球菌 28001(Sarcina lutea 28001) 均来自华东理工大学生物反应器实验室保藏菌种 1. 2 摇培养基斜面和分离培养基 :KNO 3 1 郾 0 g / L,NaCl 0 郾 6 g / L,K 2 HPO 4 0 郾 4 g / L,MgSO 4 0 郾 3 g / L, 可溶性淀粉 20 郾 0 g / L, 黄豆饼粉 5 郾 0 g / L,FeSO 4 0 郾 01 g / L, 琼脂 10 郾 0 g / L,pH 7 郾 0 ~ 7 郾 5 一级种子培养基 : 生黄豆饼粉 20 郾 0 g / L, 葡萄糖 17 郾 0 g / L, 玉米浆 22 郾 0 g / L, ( NH 4 ) 2 SO 4 1 郾 5 g / L, CaCO 3 4 郾 0 g / L, ph 6 郾 8 ~ 6 郾 9 二级种子培养基 : 淀粉 8 郾 0 g / L, 生黄豆饼粉 15 郾 0 g / L, 葡萄糖 25 郾 0 g / L, 玉米浆 115 郾 0 g / L,( NH 4 ) 2 SO 4 3 郾 5 g / L, NaCl 6 郾 0 g / L, KH 2 PO 4 0 郾 3 g / L, ( NH 4 ) NO 3 4 郾 0 g / L, NaNO 3 5 郾 0 g / L, CaCO 3 6 郾 5 g / L, 泡敌 0 郾 5 g / L, 硅油 0 郾 7 g / L 发酵培养基 : 淀粉 6 郾 4 g / L, 生黄豆饼粉 18 g / L, 葡萄糖 60 g / L, 玉米浆 154 g / L,( NH 4 ) 2 SO 4 4 郾 3 g / L,NaCl 6 郾 5 g / L, KH 2 PO 4 0 郾 3 g / L, ( NH 4 ) NO 3 5 郾 7 g / L, NaNO 3 4 郾 8 g / L,CaCO 3 7 郾 7 g / L, 泡敌 0 郾 5 g / L, 硅油 0 郾 7 g / L 流加培养基 : 淤葡萄糖 300 郾 0 g / L; 于硫酸铵 200 郾 0 g / L; 盂稀料 ( 生黄豆粉 90 郾 0 g / L, 玉米浆 130 郾 0 g / L,CaCO 3 1 郾 5 g / L, 泡敌 1 郾 0 g / L, 硅油 1 郾 0 g / L) 生物鉴定培养基 : 牛肉膏 1 郾 5 g / L, 蛋白胨 6 郾 0 g / L, 酵母膏 6 郾 0 g / L, 葡萄糖 1 郾 0 g / L, ph 7 郾 8 ~ 8 郾摇仪器和试剂仪器 : BSW 鄄 A 型 15L 发酵罐 Rio 鄄 bad PCR 仪 ; 试剂 : 林可霉素标准品 ( 购自上海食品药品检验所 ) 丙氨酸 ( 购自上海源叶科学有限公司 ) 和三甲胺 ( 购自上海润成有限公司 ) 1. 4 摇培养方法在林可霉素的发酵过程中, 发现摇瓶水平上发酵培养 24 h 时分别添加 0 郾 1 g / L 的丙氨酸和 0 郾 02% 的三甲胺能够明显提高林可霉素的效价基于此条件, 本试验对该两种添加工艺分别在 15 L 的发酵罐上进行放大摇种子扩培摇选择长势较好的斜面, 挖块到一级种子培养液中,30 益 230 r / min 振荡培养 46 ~ 48 h 再进行扩培,30 益 230 r / min 振荡培养 22 ~ 24 h 摇二级种子培养摇将一级种子液以 10% 的移种量移种到二级种子罐中, 通过控制转速调整合适的溶氧,30 益培养 22 ~ 24 h 摇发酵罐发酵摇将二级种子液通过灭菌管道以 10% 的移种量移种到装有 10 L 发酵培养基

3 张海丹等 : 丙氨酸和三甲胺对林可霉素发酵的影响及部分相关基因的转录水平 1005 的发酵罐中,30 益培养, 通过调节转速来控制合适的溶解氧, 同时流加糖硫酸铵稀料来补充碳源和氮源在发酵罐培养 24 h 时分别添加 0 郾 1 g / L 的丙氨酸和 0 郾 02% 的三甲胺, 分别记为条件罐一和条件罐二, 将不添加任何物质的发酵罐记为对照罐 160 ~ 190 h 时结束发酵 1. 5 摇分析检测方法生物效价测定 [8] : 杯碟法测定效价菌体生长量测定 : 发酵液 10 ml, r / min 离心 10 min, 测量上清液体积, 菌体浓度 = [ ( 10 - 上清液体积 ) / 10 ] 伊 100% 糖和氨基氮含量的测 [9 鄄定 10] : 分别采用费林试剂法和甲醛滴定法有机酸含量测定 : 用 HPLC 法, 色谱柱为 MetaCarb H Plus (300 mm 伊 7 郾 8 mm,5 滋 m), 流动相是 0 郾 01 mol / L 硫酸溶液, 柱温 50 益, 进样量 10 滋 l, 等梯度洗脱, 流速为 0 郾 4 ml / min, DVD 检测波长 210 nm 1. 6 摇基因转录水平测定方法通过液氮研磨法提取林可霉素生产菌株总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳或核酸定量仪测定 RNA 的纯度和浓度加入 DNA 酶将残留的 DNA 去除, 再次测定 RNA 的浓度和纯度转为 cdna 之后进行荧光定量 PCR 由于荧光染料能特异性地结合 DNA 双链并能发射出荧光信号, 随着反应的进行, 荧光信号也随着 PCR 产物的积累等比例地增加每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数记为 Ct 值, 再根据处理所致倍数变化 ( Fold) 表征基因转录水平 :Fold = 2 -[ ( Ct 目的基因 -Ct 内参基因 ) ] 处理组 -[ ( Ct 目的基因 -Ct 内参基因 ) ] 对照组荧光定量 PCR 反应体系 (20 郾 0 滋 l):2 伊 Super Real PreMix 10 郾 0 滋 l, 引物 0 郾 6 滋 l,cdna 3 郾 0 滋 l, 补充 ddh 2 O 至滋 l RT 鄄 PCR 反应程序 : 预变性 95 益 15 min; 95 益 10 s,55 益 20 s,72 益 30 s, 循环次数为 40 试验使用的 4 种引物 : 淤内参基因引物, 正向为 5 忆鄄 GCATCTGTGGTGGTTGAAAG 鄄 3 忆, 反向为 5 忆鄄 CGTGTCTCAGTCCCAGTGTG 鄄 3 忆 ; 于 lmbg 基因引物, 正向为 5 忆鄄 GGAGGTTCACGATGTGCTC 鄄 3 忆, 反向为 5 忆鄄 CCCTGGAACACCTCTACGTC 鄄 3 忆 ; 盂 PK 基因引物, 正向为 5 忆鄄 CTTGTGGTCGGAGATGACG 鄄 3 忆, 反向为 5 忆鄄 AACGTCGAGCTGAAGGTCA 鄄 3 忆 ; 榆 ASA 基因引物, 正向为 5 忆鄄 GTCGAGACGGAGCAGGTACA 鄄 3 忆, 反向为 5 忆鄄 CGTCGAGGACATCAAGGAG 鄄 3 忆 2 摇结果与分析 2. 1 摇添加丙氨酸和三甲胺对林可霉素发酵工艺的影响摇摇在发酵初期菌体浓度呈快速上升趋势, 发酵培养 20 h 时, 三罐菌体浓度都达到 30% 左右对照罐条件罐一和条件罐二的菌体浓度分别在 75 h 86 h 和 50 h 之后进入稳定期 ( 图 1) 对照罐和条件罐一的菌体浓度中后期都在 48% 至 51% 之间浮动, 条件罐二菌体浓度保持在 53% 左右两个条件罐都与对照罐稳定期菌体浓度相差较小条件罐一较对照罐到达稳定期的耗时长, 可能是丙氨酸加入之后, 控制了菌体生长的趋势 ; 条件罐二的稳定期较对照罐更长一些, 可能是条件罐二产量高的一个原因图 1 摇发酵过程中菌体浓度变化 Fig. 1 摇 Bacteria concentration curve during fermentation 摇摇基础培养基里存在大量的可快速利用碳源, 发酵初期菌体生长迅速随着葡萄糖的消耗, 罐内会 [10 鄄积累大量的丙酮酸和乙酸等有机酸 11], 补充碳源后,pH 值呈现先下降再回升的趋势由图 2 可以看出, 在前期 (0 ~ 50 h) 三罐 ph 值变化趋势一致 ; 对照罐 ph 值回升耗时较长, 在 80 h 以后稳定在 6 郾 8 左右 ; 条件罐一 ph 值回升较快,40 h 以后稳定在 6. 7 至 7 郾 0 之间, 中期波动较大 ; 条件罐二 ph 值在 90 h 之后维持在 6. 9 ~ 7 郾 0 范围内三罐的 ph 值都能稳定在一定的小范围内, 条件罐一 ph 值能迅速达到稳定状态, 条件罐二 ph 值明显高于对照罐, 可能是在外界条件有微小变化时, 菌体内部代谢也会发生改变, 有利于产物合成摇摇碳是构成微生物细胞结构和代谢产物中碳架

4 1006 江苏农业学报摇 2014 年第 30 卷第 5 期图 2 摇发酵过程添加丙氨酸和三甲胺后 ph 值变化 Fig. 2 摇 The ph tendency after alanine or trimethylamine addi 鄄 tion during fermentation 的主要物质, 林可霉素糖基部分主要来自于碳源 [12] 考虑到快速利用碳源对发酵的影响, 试验采取流加的方式补充碳源, 起始补糖速率为 0 郾 23 ml / min, 中后期主要根据 ph 值和还原糖的变化来调节补糖速率由图 3 可以看出在开始流加葡萄糖至 100 h 之前, 两个条件罐和对照罐的还原糖含量都维持在 4 g / L 左右, 之后对照罐还原糖浓度呈现上升趋势, 条件罐一的还原糖含量在 5 g / L 上下浮动, 条件罐二仍维持在 4 g / L 左右可能是在后期条件罐的菌体能更加合理地控制利用糖的速率, 使菌体生长和产物合成处在动态平衡的状态下, 有效地分配碳流, 说明在较低的还原糖浓度下更有利于林可霉素合成外, 还要补充氮源发酵到 24 h 左右, 基础培养基里的氮源耗尽, 通过补加稀料的方式维持发酵液里的氮源稀料主要成分为玉米浆和黄豆粉, 黄豆粉属于较难分解的有机氮源, 能够缓慢释放氮源从图 4 可以看出, 对照罐的氨基氮含量维持在 300 ~ 450 mg / L, 后期有波动 ; 条件罐一的氨基氮含量维持在 400 ~ 600 mg / L, 其含量整体高于对照罐, 但是镜检发现菌体生长良好, 空泡丰富, 没有明显的自溶现象, 可能是条件罐一对较难分解的氮源利用率不及对照罐 ; 条件罐二的氨基氮含量维持在 300 ~ 700 mg / L, 中期波动较大, 通过镜检发现条件罐二无明显断裂菌丝, 可能是发酵罐中新生菌丝与衰老菌丝的比例发生失调导致氨基氮含量上下起伏图 4 摇添加丙氨酸和三甲胺对发酵过程氨基氮含量的影响 Fig. 4 摇 Effects of alanine or trimethylamine addition during fer 鄄 mentation on amino nitrogen content 图 3 摇添加丙氨酸和三甲胺对发酵过程还原糖浓度的影响 Fig. 3 摇 Effects of alanine or trimethylamine addition on reduc 鄄 ing sugar concentration during fermentation 摇摇在林可霉素发酵过程中, 除了流加碳源之摇摇林可霉素一般发酵时间为 160 ~ 190 h, 每 8 h 取样测定效价效价测定结果 ( 图 5 ) 显示, 发酵前期三罐效价增长趋势一致, 对照罐条件罐一和条件罐二的起始效价分别为 891 U / ml 939 U / ml 和 927 U / ml 对照罐最高效价为 U / ml, 条件罐一的效价在 130 h 之后较对照罐增速明显, 最高效价为 U / ml, 较对照罐提高了 23% ; 条件罐二的效价在 120 h 之后较对照罐增速明显, 其最高效价为 U / ml, 较对照提高了 30% 2. 2 摇添加丙氨酸和三甲胺后相应有机酸含量的变化丙酮酸是 EMP 途径的主要中间产物, 是从 EMP 途径进入 TCA 循环的关键节点 [13] 丙氨酸可以抑制丙酮酸激酶的活性, 从而影响发酵液中的丙酮酸

5 张海丹等 : 丙氨酸和三甲胺对林可霉素发酵的影响及部分相关基因的转录水平 1007 的 L 鄄多巴含量有所上升在整个发酵过程中条件罐二的 L 鄄多巴含量都远高于对照罐, 说明添加三甲胺确实可以提高 L 鄄多巴的含量条件罐二的 L 鄄多巴含量较对照罐高, 这从侧面验证了条件罐二效价高的必然性图 5 摇添加丙氨酸和三甲胺对林可霉素效价的影响 Fig. 5 摇 Effects of alanine or trimethylamine addition on the titer of lincomycin 含量由图 6 可以看出, 对照罐和条件罐一的丙酮酸浓度都有一个积累的过程, 在 80 h 之前对照罐和条件罐一的丙酮酸含量差别较小, 之后对照罐的丙酮酸含量高于条件罐一, 说明丙氨酸确实能够降低发酵液中丙酮酸的含量图 6 摇发酵过程中丙酮酸含量变化 Fig. 6 摇 The pyruvic acid content curve in the fermentation process 摇摇三甲胺在丙基脯氨酸 (PPL) 的合成过程中能够抑制色氨酸途径中邻氨基苯甲酸合成酶的活性, 提高酪氨酸的产量, 酪氨酸经过一系列反应形成 L 鄄多巴,L 鄄多巴进一步形成 PPL, 所以 L 鄄多巴是一个很关键的中间产物由图 7 可以看出, 对照罐和条件罐二的 L 鄄多巴含量整体都是呈上升趋势, 前期两罐 L 鄄多巴的浓度是稳步上升的, 这一点与产生效价的趋势一致, 中期 L 鄄多巴含量维持平稳, 后期条件罐二图 7 摇发酵过程中 L 鄄多巴含量变化 Fig. 7 摇 The changes of the content of L 鄄 dopa in fermentation process 2. 3 摇添加丙氨酸和三甲胺后相关基因转录水平的变化摇摇测定结果显示条件罐一丙酮酸含量低于对照罐再测定 PK 基因的表达量 ( 图 8), 发现条件罐一 PK 基因的表达量与对照罐相比明显偏低,72 h 时表达量最低, 后期差异较小测定林可霉素合成基因簇 lmbg 基因的表达量, 结果 ( 图 8) 表明条件罐一 lmbg 基因表达量明显高于对照罐, 在 150 h 时最高, 达到 25 倍多, 这可能是后期条件罐效价明显高于对照罐的缘故, 说明添加丙氨酸对林可霉素合成有正向调控作用摇摇由图 9 可以看出, 在 50 h 时条件罐二的 ASA 基因转录水平远远低于对照罐, 在 72 h 左右有所回升,96 h 时达到最低值, 中后期一直低于对照罐转录水平的一半可能是因为三甲胺主要是作用于后期丙基脯氨酸 (PPL) 合成部分抑制邻氨基苯甲酸合成环节, 在此时段有明显的效果从效价测定结果可以看出, 条件罐二的效价是在 110 h 之后才明显高于对照的, 图 9 显示在不同时段 lmbg 基因的转录水平波动较大, 在 120 h 和 165 h 时增幅较低,145 h 时增幅最大但是条件罐二 lmbg 基因的表达量在每个时段都明显高于对照, 条件罐二的效价增势较对照罐也非常明显

6 1008 江苏农业学报摇 2014 年第 30 卷第 5 期图 8 摇添加丙氨酸后 PK 基因和 lmbg 基因的表达量 Fig. 8 摇 Gene encoding PK and gene lmbg expressions after alanine addition 图 9 摇添加三甲胺后 ASA 基因和 lmbg 基因的表达量 Fig. 9 摇 Gene encoding ASA and gene lmbg expressions after trimethylamine addition 3 摇讨论本试验是在摇瓶发酵添加丙氨酸和三甲胺效果非常显著的基础上, 在 15 L 罐水平上的一个放大试验两个条件罐和试验罐控罐工艺一致, 在分别添加丙氨酸和三甲胺后, 条件罐一与对照罐的菌体浓度相差无异, 条件罐二菌体浓度稍高于对照罐 ; 条件罐一的 ph 值较对照罐更易控制且稳定期更长, 条件罐二的 ph 值较对照罐的偏高 0 郾 2 左右, 能稳定控制在 6 郾 8 至 7 郾 0 之间 ; 条件罐一和条件罐二的还原糖含量较对照罐都能维持在较低水平, 分别在 5 g / L 和 3 g / L 左右 ; 条件罐一的氨基氮含量较对照罐偏高, 能维持在 400 ~ 600 mg / L 范围内, 条件罐二的氨基氮含量与对照罐相比难以稳定控制 ; 最终效价条件罐一提高了 23%, 条件罐二提高了 30% 条件罐一的丙酮酸含量较对照罐偏低, 条件罐二的 L 鄄多巴含量明显高于对照罐条件罐一的 PK 基因表达量较对照罐在不同时段有不同程度的降低,lmbG 基因的表达量明显高于对照罐 ; 条件罐二的 ASA 基因转录水平低于对照罐,lmbG 基因的表达量远远高于对照罐添加丙氨酸和三甲胺后, 效价都不同程度地升高, 林可霉素生物合成基因 lmbg 的转录水平也明显提高, 这可能是效价升高的原因, 而 PK 基因和 ASA 基因的转录水平有所降低, 促使旁路代谢的合成量减少, 也有利于林可霉素的合成由于菌体代谢是一个很复杂的过程, 在分别添加了丙氨酸和三甲胺之后, 丙酮酸含量的降低和 L 鄄多巴含量的明显增加, 表明添加丙氨酸和三甲胺确实起到了预期的作用添加丙氨酸和三甲胺后, 相关基因表达量也发生变化, 表明对林可霉素生物合成基因明显起到了正向调控作用, 有利于林可霉素的合成参考文献 : [1] 摇 LEWIS C, CLAPP H W, GRADY J E. In vitro and in vivo evalua 鄄 tion of lincomycin, a new antibiotic[ J]. Antimicrob Agents Che 鄄 mother, 1963: 570 鄄 582.

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L 8 0 g L ~0 700 g L % 6 00% 1 50% 1 3 NaCl 0 50% NH 4 2 SO % KH 2 PO % CaCO % 0 03% ~ 0 04% 2 24 h 0 02

L 8 0 g L ~0 700 g L % 6 00% 1 50% 1 3 NaCl 0 50% NH 4 2 SO % KH 2 PO % CaCO % 0 03% ~ 0 04% 2 24 h 0 02 38 5 Vol 38 No 5 2014 9 Journal of Jiangxi Normal UniversityNatural Science Sep 2014 1000-5862201405-0501-05 1 1* 2 2 1 3300222 330052 Streptomyces lincolnensis 13 8 6% 12 4% Q 93 A 0 1 2 Streptomyces