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1 第 43 卷增刊吉林大学学报 ( 工学版 ) Vol. 43 Sup. 3 年 3 月 Journal of Jilin University (Engineering and Technology Edition) Mar. 3 响应曲面法优化羊肚菌富硒深层发酵条件丁健峰, 孙永海, 付天宇, 谢高鹏 ( 吉林大学生物与农业工程学院, 长春 3) 摘要 : 以亚硒酸钠为无机硒源, 对羊肚菌菌丝体的富硒深层发酵条件进行了优化研究选择培养温度发酵时间和硒浓度作为优化因素, 研究各因素的不同水平对富硒羊肚菌菌丝生物量和硒含量的影响通过单因素试验和响应曲面法得出了羊肚菌菌丝体富硒深层发酵的最佳条件条件 : 发酵时间 5. d 培养温度硒质量浓度 μg / ml; 预测菌丝生物量的达到. 5g / L 硒含量达到 8. 8μg / ml, 实际菌丝生物量的达到. 339g / L 硒含量达到 8. 6μg / ml 研究结果表明, 响应曲面法可对羊肚菌富硒深层发酵条件进行优化关键词 : 食品科学技术 ; 羊肚菌 ; 深层发酵 ; 富硒 ; 响应曲面法中图分类号 :S 文献标志码 :A 文章编号 : (3)Sup Response surface methodology optimization of Morchella mycelium selenium enriched fermentation DING Jian-feng,SUN Yong-hai,Fu Tian-yu,Xie Gao-peng ( College of Biological and Agricultural Engineering,Jilin University,Changchun 3,China) Abstract:Sodium selenite was used as inorganic selenium source in Morchella mycelium enriched selenium submerged fermentation. The optimal fermentation parameters were researched. Selected culture temperature, fermentation time and selenium concentration as the optimized factors. Influence of levels of the factors on enriched selenium Morchella mycelium biomass and the selenium content were studied. Through the single factor tests and response surface method the optimal processing conditions of Morchella mycelium enriched selenium submerged fermentation was concluded. They are fermentation time 5. d, culture temperature 5. 73, selenium concentration μg / ml; Prediction of mycelium biomass is. 5 g / L, selenium content 8. 8 μg / ml. Actual mycelium biomass is up to. 339 g / L, selenium content 8. 6 μg / ml. The results show that the response surface method is a most useful tool in Morchella selenium-rich submerged fermentation conditions optimization. Key words: food science and technology; morchella; submerged fermentation; Se-accumulating; response surface methodology 临床医学证明, 威胁人类健康和生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关 [-4] 硒不能在人体收稿日期 :--8. 基金项目 : 吉林省科技发展计划重点项目 (47); 国家自然科学基金项目 (3786). 作者简介 : 丁健峰 (986 ), 男, 硕士研究生. 研究方向 : 功能食品. samdjf@ 63. com 通信作者 : 孙永海 (956 ), 男, 教授, 博士生导师. 研究方向 : 功能食品. sunyh@ jlu. edu. cn

2 558 吉林大学学报 ( 工学版 ) 第 43 卷内生物合成, 必需从体外摄入我国东北西北西南等所属的 5 个省 ( 市区 ) 土壤含硒量低于临界值的. 7mg / kg, 其不同程度缺硒的县 ( 市 ) 占全国县 ( 市 ) 总数的 7% [5] 目前, 补硒剂主要有两类, 一类是无机硒, 如亚硒酸钠硒酸钠 ; 另一类是有机硒, 如有机硒制剂富硒地区出产的食物而无机硒均有剧毒, 一般仅用于医药品而不用于食品, 其使用范围和剂量都受到限制研究表明, 有机硒化合物毒性远低于无机硒化合物, 且生物利用率更高 [6] 所以, 只有将无机硒转化为有机硒, 才具有普遍的食用和保健价值食用菌富集的有机态微量元素易于人体的吸收利用 ; 且富集的微量元素稳定性良好, 便于贮存运输, 可以避免其中的某些营养成分损失 ; 摄取的微量元素在限制范围内, 亦对人体无毒副作用 [7] 目前人们已利用食用菌为载体培育出富硒灵芝富硒金针菇富硒平菇富硒香菇和富硒猴头菌等但国内未见有关富硒羊肚菌菌丝深层发酵的报道羊肚菌的子实体和菌丝体均含有丰富的营养成分, 其氨基酸含量为食用菌之首, 共含有 9 种氨基酸, 是一种高营养低热量的高级营养滋补佳品 [8] 鉴于无机硒转化为有机硒的必要性及羊肚菌的药用保健价值, 本文采用羊肚菌菌丝体作为载体进行富硒培养, 采用响应曲面法建立富硒羊肚菌深层发酵条件的数学模型, 优化富硒羊肚菌菌丝的深层发酵条件材料和方法. 试验材料.. 供试菌种粗柄羊肚菌 96 号 : 购于四川绵阳食用菌研究所.. 药品及试剂土豆酵母膏蛋白胨亚硒酸钠葡萄糖硫酸镁磷酸氢二钾盐酸甲苯硫酸琼脂粉硝酸高氯酸 EDTA 邻苯二胺硒标准溶液( 浓度为 μg / ml 购于天津市风船化学试剂科技有限公司 ).. 3 培养基斜面培养基 : 马铃薯 g / L, 葡萄糖 g / L, 琼脂 5 g / L, KH PO 4 3g / L, MgSO 4. 5 g / L, 水 ml,ph 值自然将土豆切成小块煮沸约 3 min 煮至熟而不烂为止, 四层纱布过滤, 再配以其它药品, 定容混合均匀, 分装后, 灭菌 3 min, 摆斜面放凉备用发酵培养基 : 马铃薯 %, 蔗糖 3%, 蛋白胨. %, 酵母膏. 5%, KH PO 4. 5%, MgSO 4. 5% 将土豆切成小块煮沸约 3 min 煮至熟而不烂为止, 四层纱布过滤, 再配以其它药品, 定容混合均匀, 装料量为 ml / 5mL, 灭菌 3 min, 放凉备用. 试验仪器电子万用炉, 天津市泰斯特仪器有限公司生产 ;GB4 型分析天平, 瑞士 METTLER TOLEDO 公司生产 ;SP-5C 型恒温恒湿箱, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产 ;DSX-8A 型不锈钢手提式灭菌器, 上海市申安医疗器械厂生产 ; PHS-3D 型 ph 计, 上海精密科学仪器有限公司生产 ;HZQ-C 空气浴振荡器, 哈尔滨市东明医疗仪器厂生产 ;CSF-A 型超声波发生器, 上海超声仪器厂生产 ;UV3 分光光度计, 上海天美科学仪器有限公司生产. 3 试验方法. 3. 富硒羊肚菌菌丝生物量的测定菌丝生物量计算公式 X = M () V 式中 : X 为菌丝生物量,g / L; M 为菌丝球干燥后的质量,g; V 为发酵液的体积,L. 3. 硒含量的测定硒含量的检测采用邻苯二胺紫外分光光度法 [9], 邻苯二胺在酸性介质中与亚硒酸盐反应生成 3,4- 苯并 -,,5- 重氮苤硒脑, 用甲苯萃取, 利用紫外分光光度计在 335nm 处测定萃取液的吸光度样品处理 : 精确称取一定量的样品, 研磨后放入磨口三角瓶中, 加入浓硫酸. ml, 润湿样品, 再加入浓硝酸 - 高氯酸 (:) 混合酸. ml, 放置过夜 [] 次日水浴加热至棕黄色的 NO 气体产生, 溶液变为棕黄色后, 继续加热, 到白烟除尽为止, 加入. ml( 浓盐酸 : 蒸馏水 = :9) 的盐酸, 继续加热 5 分钟, 即达到消化终点取. ml 消化液与锥形瓶中, 加水 3. ml, 分别加入 5% EDTA. ml 和 % 邻苯二胺. ml, 用 HCI 调节溶液 ph 至., 混匀后室温避光放置 6 min, 加入. ml 甲苯, 大力振荡 4min, 移入分

3 增刊丁健峰, 等 : 响应曲面法优化羊肚菌富硒深层发酵条件 559 液漏斗中静置 4 min 在 335 nm 波长下测定试液的吸光度, 以空白样做对比, 测定试液的吸光度, 对比标准曲线求出硒浓度硒标准曲线的制作 : 配置浓度为.,3., 6.,9.,.,5.,8.,. μg / ml 的硒标准溶液, 测定各标准溶液的吸光度以硒含量为横坐标, 吸光度为纵坐标绘制标准曲线, 标准曲线见图后开始缓慢生长, 到第五天末开始出现自溶现象, 随着发酵的继续进行, 菌丝体干重略有减少, 如图所示 Fig. 图标准曲线方程为 Y = 硒含量的标准曲线 Calibration curve of selenium x ,R = () 式中 : x 为吸光度,A; Y 为硒含量,μg / ml 硒含量的测定与计算 : 将样品消化后的待测液以适当倍数稀释, 同样条件下测定其吸光度根据标准曲线得出测试液的硒浓度. 4 试验方案. 4. 单因素试验研究发酵时间 ( d) 培养温度 ( ) 硒浓度 ( μg / ml) 以及摇床转速 (6 8 4 r / min)4 个主要因素对富硒羊肚菌菌丝生物量和硒含量的影响情况. 4. 响应面分析法优化发酵条件根据单因素试验结果, 使用 Design-Expert 数据分析软件设计试验, 利用响应面分析法确定富硒羊肚菌的最佳发酵条件, 做出二次回归方程响应面立体图和等高线图, 确定最佳的发酵条件结果与分析. 单因素试验的影响.. 发酵时间对富硒羊肚菌菌丝生物量羊肚菌进行深层发酵培养时, 菌种接入一天图发酵时间对羊肚菌菌丝生物量的影响 Fig. Effect of time speed on Morchella.. 培养温度对富硒羊肚菌菌丝生物量的影响选择 5 个培养温度梯度培养, 富硒羊肚菌菌丝生物量的变化如图 3 所示由图 3 可知, 羊肚菌在 ~ 3 这一较大的温度范围内都可以生长,6 菌丝体生长最好, 但是随着温度的进一步升高, 得到的菌丝生物量明显降低图 3 培养温度对羊肚菌菌丝生物量的影响 Fig. 3 Effect of culture temperature on Morchella.. 3 硒浓度对富硒羊肚菌菌丝生物量的影响本试验中, 对硒的富集情况进行了初步的研究从图 4 可以看出, 硒对羊肚菌菌丝体的生长影响比较大, 低浓度的硒对羊肚菌的生长有促进作用, 但当硒的浓度超过 8 μg / ml 时, 随着培养基中硒浓度的增加, 菌丝生物量是逐渐降低的.. 4 摇床转速对富硒羊肚菌菌丝生物量的影响选择 5 个转速梯度培养, 富硒羊肚菌菌丝生物量的变化如图 5 所示从图 5 中可以看出, 在中等转速 r / min 下所得到的菌丝生物量较高, 且在 8 r / min 到 r / min 之间的转速对羊肚菌菌丝生物量无显著影响因此, 本试验选择

4 56 吉林大学学报 ( 工学版 ) 第 43 卷试验序号 X 发酵时间 / d X 培养温度 / 硒浓度 / (μg / ml) Y 菌丝生物量 / (g / L) Y 硒含量 / (μg / ml) 图 4 硒浓度对羊肚菌菌丝生物量的影响 Fig. 4 Effect of Se concentration on Morchella 摇床转速为 r / min 表 3 回归方程各项的方差分析 Table 3 Coefficients of the model and ANOVA 图 5 摇床转速对羊肚菌菌丝生物量的影响 Fig. 5 Effect of shaking speed on Morchella. 响应面分析法优化发酵条件选取发酵时间 (X ) 培养温度(X ) 硒浓度 ( ) 作为试验因子, 富硒羊肚菌菌丝生物量 (Y ) 硒含量(Y ) 为响应值, 利用响应面分析法优化富硒羊肚菌发酵条件其试验设计因素编码如表所示,Box-Behnken 试验设计与结果如表所示表 3 可见该模型的方差分析, 该模型极显著 (P < ), 一次项中 X 达到了极显著水平 (P <. ); 二次项中 X X 对菌丝生物量的影响都是极显著 (P <. ); 交互项中 X 和表 Box-Behnken 试验设计因素编码 Table Factors and levels of Box-Behnken design 代码水平因素编码值 - + 发酵时间 / d X 培养温度 / X 硒浓度 / (μg / ml) 5 8 表 Box-Behnken 试验设计与结果 Table Results of Box-Behnken design 方差来源平方和自由度均方 F 值 P 值模型 <. X <. X <. X X X X X X < < <. 剩余失拟项误差项总误差. 3 6 表 4 模型可信度分析 Table 4 Reliability of the model 拟合度均值校正拟合度变异系数 % 预测拟合度信噪比 X 和对菌丝生物量有显著性 (R <. 5) 影响, 而 X 和 X 交互作用不显著建立二次响应面模型, 以菌丝生物量为响应值 Y(g / L), 经二次回归拟合后得到响应函数, 即

5 增刊丁健峰, 等 : 响应曲面法优化羊肚菌富硒深层发酵条件 56 回归方程为 : Y(g / L) = X X X X X X -. X -. 3X X 3 (3) 通过模型可信度分析表可以看出, 在用公式 (3) 描述各个因素与响应值之间的关系时, 线性关系显著 (R =. 999) 由模型的方差分析表可以得到, 模型的显著水平 P <., 此时回归方差模型是极其显著的, 这种试验方法是可靠的通过表 4 的模型可信度分析可以看出各个因素值和响应值之间的关系可以用此模型来函数化, 可以用此回归方程来对试验结果进行分析预测通过回归方程来绘制分析图, 以考察所拟合响应曲面的形状, 响应曲面立体分析图和相应等高线图见图 6 量的影响都不太显著, 两个曲面都比较平缓等高线图表明沿时间轴线等高线密集, 说明时间对响应值的影响比温度显著等高线成椭圆形说明两者交互作用显著图 7 显示, 硒浓度对菌丝生物量的影响显著, 曲面较陡, 随着硒浓度高于 8μg / ml 后曲面相对变缓, 可能已经达到羊肚菌的富集能力极限, 时间对于菌丝生物量的影响不显著, 曲面平缓, 等高线呈现出椭圆形, 说明交互作用较强, 影响显著 (a) (a) Fig. 6 (b) 图 6 Y =f(x,x ) 响应面立体图和等高线图 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y =f(x,x ) 从图 6 中可以看出, 温度和时间对菌丝生物 Fig. 7 图 7 (b) Y =f(x, ) 响应面立体图和等高线图 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y =f(x, ) 从图 8 中可以看出, 硒浓度对菌丝生物量的影响显著, 曲面较陡, 温度对菌丝生物量的影响不太显著, 曲面相对缓和由温度和硒浓度的交互作用等高线可知, 沿硒浓度轴线等高线密集, 而温度轴向等高线较稀疏, 说明硒浓度对响应值峰值影响比温度大, 等高线呈椭圆形说明, 两者交互作用显著, 影响显著为了进一步验证试验结果, 在优化的反应条件下进行重复试验三次, 得到菌丝生物量为. 339 g / L, 得到验证值与实际值的相对误差仅为.

6 56 吉林大学学报 ( 工学版 ) 第 43 卷参考文献 : (a) (b) 图 8 Y =f(x, ) 响应面立体图和等高线图 Fig. 8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y =f(x, ) 6% 回归方程所得硒产量的预测值与验证试验的平均值相接近, 说明回归方程能够较真实地反映筛选因素对富硒羊肚菌菌丝生物量的影响, 应用响应面法可以达到优化富硒羊肚菌深层发酵条件的目的 3 结论本试验利用单因素试验, 研究了发酵时间硒浓度培养温度摇床转速对富硒羊肚菌菌丝生物量的影响, 利用响应曲面法对富硒羊肚菌菌丝深层发酵的条件进行了优化, 确定最佳发酵条件为培养温度发酵时间为 5. d 硒浓度为 μg / ml 在此条件下富硒羊肚菌菌丝生物量的理论值达. 5 g / L, 硒含量达到 8. 8 μg / ml, 实际菌丝生物量的达到. 339 g / L 硒含量达到 8. 6 μg / ml [ ] Mahan D C. Effects of seleniumr enriched yeast and sodium selenite on tissue selenium retentin and serum glutathione peroxidase activity in grower and finisher swine[ J]. J Anim Sci,999, 74: [ ] John Weldon Finley. The absorption and tissue distribution of selenium from high-selenium broccoli are different from selenium sodium selenite,sodium selenate and selenomethionine as determined in selenium-deficient rats[ J]. J Agic Food Chem,998,46: [ 3 ] 姚莉, 段玉峰. 微量元素硒与人体健康 [J]. 中国食物与营养,4,7:5-5. Yao Li,Duan Yu-feng. Selenium and health [ J]. Food and Nutrition In China,4,7:5-5. [ 4 ] 常海波, 孙凤春, 楚玉彪. 微量元素硒与人体健康的研究 [J]. 世界元素医学,6,3():- 3. Chang Hai-bo,Sun Feng-chun,Chu Yu-biao. Study on the relationship between Se and human health [ J ]. World Elemental Medlcine,6,3():- 3. [ 5 ] 宫丽, 马光. 硒元素与健康 [ J]. 环境科学与管理, 7, 3(9): Gong Li,Ma Guang. The selenium elemental and health [ J]. Environmental Science and Management, 7, 3(9): [ 6 ] Rayman M. The importance of selenium to human health [ J]. Lancet,,356:33-4. [ 7 ] 暴增海, 马桂珍, 徐晓红. 微量元素对食用菌产量和品质的影响 [J]. 世界农业,,7:38-4. Bao Zeng-hai, Ma Gui-zhen, Xu Xiao-hong. Effects of microelement on the yield and quality of edible fungi [ J]. World Agriculture,,7:38-4. [ 8 ] 魏芸, 张天佑, 张姝, 等. 羊肚菌多糖的分离纯化及组成结构分析 [ J]. 植物资源与环境学报,, 4 (4): Wei Yun,Zhang Tian-you,Zhang Shu, et al. Isolation, purification and characterization of polysaccharides from Morchella essulenta L. [ J]. Journal of plant resources and Environment,,4(4): [ 9 ] 张月, 钟鸣, 林景卫, 等. 紫外分光光度法测定蛹虫草菌丝体中硒的含量 [J]. 微量元素与健康研究,, 5:-3. Zhang Yue,Zhong Ming,Lin Jing-Wei,et al. Ultraviolet spectrophotometry determine selenium content in cordyceps militaris mycelium[ J]. Studies of Trace Ele-

7 增刊丁健峰, 等 : 响应曲面法优化羊肚菌富硒深层发酵条件 563 ments and Health,,5:-3. [] 周跃花, 杨菊香, 张娜. 紫外分光光度法测定紫阳富硒茶中的硒 [ J]. 西北农业学报,9,8 (4);9-3. Zhou Yue-hua, Yang Ju-xiang, Zhang Na. Determination of selenium of enriched tea in ziyang by UV spectrophotometry [ J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 9,8(4);9-3. [] 张润楚, 邓海涛, 兰燕, 等. 试验设计与分析及参数优化 [M]. 北京 : 中国统计出版社,3:

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖