673 结 核 病是严重的全 球性健 康问题 据 WHO 报 告 2011 年全球有 870 万新发结核病例 其中 140 万 非 PNB TCH 均 ( ) 为牛结核分枝 杆菌 PNB( ) TCH() 为 ( 表 1) [1] 死亡病例 引起结核病的病原菌分枝杆菌种类繁 表1 多 其中包括复合群

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1 672 doi: j.issn 论 著 两种多位点聚合酶链反应技术在复合群 鉴定中的价值 李晓迎 黄延风 潘 云 朱朝敏 刘芮汐 黎梅花 苏 薇 重庆医科大学附属儿童医院感染消化科 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点 实验室 重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地 ( 重庆 摘要 目的 ) 评价多位点聚合酶链反应 (PCR) 在儿童复合群鉴定中的临床价值 方法 收集经初 步鉴定为结核病分支杆菌的临床分离株 分别经传统 PNB/TCH 鉴定 以及选择 7 基因位点 16SrRNA Rv0577 IS1561 Rv1510 Rv1970 Rv3877/8 及 Rv3120 及 4 基因位点 ropb RD1 RD8(present) RD8(deleted) 采用聚合酶链反应 (PCR) 对其进行扩增和鉴定 结果 共收集 204 株临床分离菌株 传统 PNB/TCH 鉴定结果为 199 株 牛结核 分枝杆菌 3 株 非 2 株 4 位点 PCR 鉴定结果为 196 株 牛 2 株 卡介苗 3 株 非 3 株 7 位点 PCR 鉴定结果为 191 株 牛 2 株 卡介苗 3 株 非洲分枝 杆菌Ⅰ型 4 株 山羊分枝杆菌和田鼠分枝杆菌各 1 株 非 2 株 结论 两种 PCR 方法均较传统方法简便快 捷 且均可较快的鉴定复合群更多的亚种 7 位点能鉴定出除非洲分枝杆菌Ⅱ型以外的所有儿童结核分枝杆 菌复合群的亚种 4 位点在鉴定卡介苗菌株中更加迅速简便 关键词 菌种鉴定 分枝杆菌 多位点聚合酶链反应 儿童 The value of rapid species identif ication of Mycobacterium tuberculosis by t wo k inds of multi-locus polymerase chain reaction in children LI Xiaoying, HUANG Yanfeng, PAN Yun, ZHU Chaomin, LIU Ruixi, LI Meihua, SU Wei (Department of Infection and Gastroenterology, Children s Hospital of Chongqing Medical University, Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood Ministry of Education, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Chongqing , China) Abstract: Objective To evaluate the clinical value of multi-locus polymerase chain reaction (PCR) for identifying Mycobacterium tuberculosis complex isolated in children. Methods The isolates were collected and were f irst determined by PNB/TCH medium. 7-point PCR sites including 16SrRNA, Rv0577, IS1561, Rv1510, Rv1970, Rv3877/8 and Rv3120, and 4-point PCR sites including ropb, RD1, RD8 (present), RD8 (deleted) were used to amplify them by PCR. Results Total of 204 isolates were collected, in which 199 were Mycobacterium tuberculosis, 3 were Mycobacterium bovis, and 2 were non-tuberculous mycobacteria by the PNB/TCH method. 4-point PCR analysis showed that 196 were Mycobacterium tuberculosis, 2 were Mycobacterium bovis, 3 were BCG species and 3 were non-tuberculous mycobacteria. 7-point PCR analysis showed that 191 were Mycobacterium tuberculosis, 2 were Mycobacterium bovis, 3 were BCG species, 4 were African Mycobacterium type I, 1 was Mycobacterium caprae, 1 was Mycobacterium microti and 2 were non-tuberculous mycobacteria. Conclusion Compared with the conventional method, the PCR identification in 4-point PCR method and 7-point PCR method could rapidly identify the BCG among the complex group in children tuberculosis. 7-point PCR method was able to identify all the subspecies of Mycobacterium, except Africa Mycobacterium. 4-point PCR method would be more rapid and easier in the identification of BCG strains. Key words: 通信作者 黄延风 species identification; Mycobacterium; multi-locus polymerase chain reaction; child 电子信箱 ymhykq@126.com

2 673 结 核 病是严重的全 球性健 康问题 据 WHO 报 告 2011 年全球有 870 万新发结核病例 其中 140 万 非 PNB TCH 均 ( ) 为牛结核分枝 杆菌 PNB( ) TCH() 为 ( 表 1) [1] 死亡病例 引起结核病的病原菌分枝杆菌种类繁 表1 多 其中包括复合群 ( 牛 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌等 ) 非 麻风分枝杆菌等 其中结核分枝杆 菌是最常见且最重要的致病菌 [2] 快速 准确鉴定分 枝杆菌菌种对于患者的治疗 公共卫生及分子流行病 学研究具 有重要意义 多位点聚合酶 链反应 (PCR) 是近年来发展起来的鉴定的新方法 其 中 7 位点 PCR 是应用较多 也被证实为准确可靠的 菌种鉴定方法 本研究采用的 4 位点 PCR 方法在国 内首次应用 其对牛结合分枝杆菌及卡介苗鉴别有较 大优势 本研究评价和比较两种 PCR 方法与传统表 型鉴定方法 以指导临床诊断和治疗儿童结核病 1 医院 标准菌株 (H37Rv) 由重庆市疾病预防控制中心 提供 临床分离株按照结核病诊断实验室操作规程进 行初步鉴定 根据其在罗氏培养液 对硝基苯甲酸及 噻酚 -2- 羧酸肼生长情况 鉴定是否为 及排除污染菌株 [3] 的分离培养 取二氧化碳温箱 取约 1 环 放入盛有 5% tween3 ml 生理盐水的磨菌 瓶中 震荡研磨 取上述震荡液约 200 μl 放于中性 罗氏培养液中 37 培养箱培养 4~8 周 传统表型鉴定 参照文献 [3] 方法 对临床结 核分枝杆菌分离株采用对硝基苯甲酸 (p-nitrobenzoic acid PNB)/ 噻酚 -2- 羧酸肼 (thiophene-2-carboxylicacid hydrazide TCH) 培养液鉴定 PNB TCH 均 () 为 表2 TCH 非 牛 多 位 点 PCR 鉴 定 主 要 PCR 试 剂 (2 Taq PCR Master Mix 100 bp DNA ladder) 购于天根生物 技术有限公司 引物由上海生物工程有限公司合成 全 基因组提取试剂盒购于上海生工生物有限公司 全基 因组 DNA 提取参照文献 [4] 的标准方法 参照文献 [5] 方法 选择在复合群中分布具有差异的 基因 合成 7 对引物分别扩增分枝杆菌的 16SrRNA 基 因 Rv0577 基 因 IS1561 基 因 Rv1510 基 因 Rv1970 菌基因库 合成 4 对引物 ropb 基因 RD1 基因 RD8(present) 基因 RD8(deleted) 基因 ( 引物序列合成应用 Primer 3 软件 表 3) ③ PCR 扩增体系及条件 7 位点 PCR 反应体系为 20 μl 其中前后引物各 1 μl 2 Taq PCR Master Mix 10 μl DNA 模板 1 μl ddh 2O 7 μl PCR 反应条件为 94 预变性 5 min 方法 中酸性罗氏培养液培养阳性的 每株菌 PNB [6] 的方法 选择 4 个基因 ( 基因序列来自结核分枝杆 菌株及来源 204 株临床分离菌株来自重庆医科大学附属儿童 1.2 基因 Rv3877/8 基因及 Rv3120( 表 2) 同时参照文献 材料和方法 1.1 分枝杆菌鉴定培养基表型鉴定参照标准 94 变性 1 min 60 退火 1 min 72 延伸 1 min 30 个 循 环 最 后 72 延 伸 10 min 阳 性 标 准 对 照 H37Rv 同时设置阴性对照 ddh 2O 4 位点 PCR 反应 体系 20 μl 其中前后引物各 1 μl 2 Taq PCR Master Mix 10 μl DNA 模板 1 μl ddh 2O 7 μl PCR 反应条 件为 94 预变性 5 min 94 变性 30 s 64 退火 30 s 72 延伸 30 s 30 个循环 最后 72 延伸 10 min 扩 增阳性标准对照 H37Rv 同时设置阴性对照 ddh 2O PCR 产物经 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳 EB 染色 凝胶 7位点 PCR 方法菌种鉴定参照标准 16SrRNA Rv0577 IS1561 Rv1510 Rv1970 Rv3877/8 Rv3120 非洲分枝杆菌Ⅱ型 肯尼迪分枝杆菌 非洲分枝杆菌Ⅰ型 山羊分枝杆菌 牛 卡介苗 田鼠分枝杆菌 非

3 674 表3 4 点 PCR 方法菌种鉴定参考结果 ropb RD1 牛 卡介苗 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 非 其他细菌 present RD8 deleted RD8 成像仪下拍照记录结果 结果 传统 PNB/TCH 鉴定结果 传统 PNB/TCH 鉴定结果显示 204 株临床分离 株 有 199 株 3 株牛 2 株非 位点 PCR 鉴定结果 4 位 点 PCR 鉴定 结果显 示 结 核分枝 杆 菌 196 株 2 株牛 3 株卡介苗 非结核分枝杆 菌有 3 株 ( 图 1) 与传统 PNB/TCH 鉴定结果比较 两者间的符合率达 99.0%(199/201) 位点 PCR 鉴定结果 7 位点 PCR 鉴定结果显示 有 190 株 2 株牛 3 株卡介苗 4 株非洲分枝 杆菌Ⅰ型 山羊分枝杆菌和田鼠分枝杆菌各 1 株 非结 核分枝杆菌有 3 株 ( 图 2) 与传统 PNB/TCH 鉴定结 M.caprae 为 山 羊 分 枝 杆 菌 500 bp 1500 bp 为 100 bp DNA lander 片 段 长 度 land1-7 分 别 为 16SrRNA Rv0577 IS1561 Rv1510 Rv1970 Rv3877 /8 Rv3120 非结核分枝 杆菌只有 land1 为阳性 而 BCG 则 land1 2 3 均为阳性 图2 果比较 两者间的符合率达 96.01%(193/201) 7 位点与 4 位点 PCR 鉴定结果比较 两者间的符 7 位点 PCR 方法临床分离株鉴定结果 合率达 96.98%(193/199) 7 位点与 4 位点的差异在于 鉴别出 4 株非洲分枝杆菌 及田鼠分枝杆菌和山羊分 枝杆菌各 1 株 3 讨论 本研究采用多位点 PCR 方法对儿童结核分枝杆 菌进行菌种鉴定 目前临床实验室菌种鉴定使用的传 统方 法是 PNB/TCH 该方 法报告时间为 4 周 阴性 报告时间需要 8 周 对儿 童结核病的早期诊断和治 疗非常不利 且只能鉴定 牛结核分枝 杆菌 非 还受细菌生长速度的影响 在全国耐药基线调查中评价 株 的 PNB/TCH 鉴定显示 TCH 鉴别牛的 效率特别低 难以作为牛鉴定的有效依 500 bp 1500 bp 为 100 bpdna lander 片段长度 land1~4 分别为 ropb RD1 RD8 present RD8 deleted 非结核分枝 杆菌只有 land1 为阳性条带 BCG 则 land1 4 为阳性条带 图1 4 位点 PCR 方法临床分离株鉴定结果 据 [7] 为了找到更快 更准确的方法来代替传统方法 PCR 鉴定方法逐渐得到发展 [8] 多位点 PCR 是近年来发展起来的鉴定结核分枝

4 临床儿科杂志第 32 卷第 7 期 2014 年 7 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.7 Jul 杆菌的新方法 4 位点 PCR 方法在国内首次用于结核 分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定 研究证明,ropB 基 因可以在所有中表达, 但是在其他菌种中不能表达 [9] ;RD1 只出现在及非洲分枝杆菌中 [10,11], 而复合群中的其他菌种中都不表达 ;RD8 在及非洲分枝杆菌中表达, 在牛及卡介苗中有部分缺失 [12] 因此这 4 个位点的组合可以应用于临床复合群的菌种鉴定中 同样 7 位点 PCR 方法也采用相同原理, 选择在复合群中分布具有差异的基因, 合成 7 对引物分别扩增分枝杆菌的 7 个基因, 对进行鉴定 本研究采用 4 位点和 7 位点两种 PCR 方法进行鉴定, 结果显示两种多位点 PCR 方法与 PNB/TCH 方法的符合率均 >90%,7 位点 PCR 方法与传统 PNB/ [13, TCH 的符合率与国内相关文献报道一致 14] 研究显示, 当 7 位点 PCR 方法与传统方法鉴定结果不一致时, 采用基因测序法进一步进行鉴定, 证实 7 位点 PCR 结果与基因测序结果一致, 说明 7 位点 PCR 方法结果更为准确可靠, 且 PCR 方法耗时短, 易于建立标准化操作程序, 便于在临床推广使用 [13] 而两种 PCR 方法相比,4 位点与传统方法有更高的符合率, 且该方法可以将牛与卡介苗区别开, 对复合群及非鉴定比 7 位点更加简便快捷, 且对于复合群中的亚种 ( 卡介苗及牛 ) 的鉴别较为快速, 其缺点在于不能将非与田鼠分枝杆菌 与非洲分枝杆菌区别开 本研究中两种 PCR 之间的差异在于 7 位点鉴别出 4 株非洲分枝杆菌, 及田鼠分枝杆菌和山羊分枝杆菌各 1 株 即 7 位点 PCR 方法对于儿童复合群各亚种的鉴定更加细致, 除不能将非洲分枝杆菌 Ⅱ 型鉴别出以外, 其他亚种均可鉴别 两种 PCR 方法对儿童复合群的鉴定均较传统方法简便 快捷, 且可鉴定出更多的亚种 本研究所鉴定的 3 株卡介苗均为接种卡介苗后至儿童卡介苗病而分离获得的菌株 卡介苗作为减毒活疫苗用于儿童结核病的预防 [15], 不良反应时有发生, 尤其对免疫缺陷的患儿 [16] 近年来卡介苗接种导致的儿童卡介苗病时有报道 [17] 目前对于卡介苗病的诊断只是靠临床表现及流行病学资料, 缺乏实验室证据支持 [18] 研究显示, 多位点 PCR 方法对儿童卡介苗病的诊断及 BCG 用于膀胱癌治疗所导致的卡介苗病的诊断都有重要的流行病学意义 [19] 本研究 4 位点和 7 位点都可以比较好的快速准确的用于此类患儿的诊断及鉴别诊断 本研究还分离到牛 2 株, 山羊分枝杆菌和田鼠分枝杆菌各 1 株 而在全国 株耐药基线调查的菌株中仅鉴别出 1 株牛, 其比例相差悬殊可能与儿童各个系统发育不够完善, 对于弱毒力的更易感有关 [7] 牛和山羊分枝杆菌都以与人密切接触的家畜为天然宿主 [20], 这些导致儿童结核病的分枝杆菌病原应当引起足够重视 田鼠分枝杆菌在免疫学上与和牛密切相关, 被认为是介于两者之间的中间型 田鼠分枝杆菌在儿童中的存在可能与儿童的免疫机制不完善有关 本研究对儿童结核病病原鉴定结果有助于进一步了解儿童结核病的特殊临床特征, 进一步认识及研究这些菌株的致病性 毒力及其在儿童中的致病特点 综上所述, 本研究所采用的两种多位点 PCR 菌种鉴定的方法用于儿童菌种鉴定, 比传统的 PNB/TCH 方法简便 快捷, 且准确可靠, 可鉴别常见复合群致亚种, 尤其是 7 位点 PCR 方法能鉴别出更多的亚种 参考文献 : [1] WHO (2011) Global tuberculosis control. [EB/OL] [ ]: index.html. [2] 王亚娟, 冯萍, 熊礼宽. 分枝杆菌鉴定的分子生物学方法研究进展 [J]. 临床肺科杂志,2009,14(3): [3] 中国防痨协会. 结核病细菌学检验规程 [J]. 中国防痨杂志, 1996,18(1): [4] van Soolingen D,Hermans PW,de Haas PE,et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains:evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis [J]. J Clin Microbiol,1991, 29(11): [5] Huard RC,Lazzarini LC,Butler WR,et al. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions [J]. J Clin Microbiol,2003,41(4): [6] Kim Y,Choi Y,Jeon BY,et al. A simple and efficient multiplex PCR assay for the identification of Mycobacterium genus and Mycobacterium tuberculosis complex to the species level [J]. Yonsei Med J,2013,54(5): [7] 姜广路, 梁倩, 付育红, 等. 以噻吩二羧酸肼实验结果作为鉴定牛依据的可靠性研究 [J]. 中华结核和呼

5 676 临床儿科杂志第 32 卷第 7 期 2014 年 7 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.7 Jul.2014 吸杂志,2013,36(5): [8] Kjeldsen MK,Bek D,Rasmussen EM,et al. Line probe assay for differentiation within Mycobacterium tuberculosis complex. Evaluation on clinical specimens and isolates including Mycobacterium pinnipedii [J]. Scand J Infect Dis, 2009,41(9): [9] Lee H,Park HJ,Cho SN,et al. Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpob gene [J]. J Clin Microbiol,2000, 38(8): [10] Halse TA,Escuyer VE,Musser KA. Evaluation of a singletube multiplex real-time PCR for differentiation of members of the Mycobacterium tuberculosis complex in clinical specimens [J]. J Clin Microbiol,2011,49(7): [11] Pinsky BA,Banaei N. Multiplex real-time PCR assay for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex members to the species level [J]. J Clin Microbiol,2008, 46(7): [12] Gordon SV,Eiglmeier K,Garnier T,et al. Genomics of Mycobacterium bovis [J]. Tuberculosis (Edinb), 2001,81(1-2): [13] 包训迪, 连璐璐, 徐东芳, 等. 多位点 PCR 用于安徽 391 株分枝杆菌临床分离株的快速鉴定 [J]. 中国人兽共患病学报, 2012,28(7): [14] 邓建平, 董海燕, 李群, 等. 多位点 PCR 技术用于四川 267 株分枝杆菌临床分离株的鉴定 [J]. 疾病监测,2012,27(4): [15] Lamm DL,Stogdill VD,Stogdill BJ,et al. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy in 1,278 patients with bladder cancer [J]. J Urol,1986,135(2): [16] 吴逢波, 徐埏, 陈泽莲, 等. 136 例卡介苗接种致不良反应文献分析 [J]. 中国药房,2007,18(23): [17] Toida I,Nakata S. Severe adverse reactions after vaccination with Japanese BCG vaccine:a review [J]. Kekkaku,2007, 82(11): [18] 张媛媛, 黄明翔, 赵秀芹, 等. Spoligotyping 结合多位点 PCR 用于牛卡介苗的快速鉴定 [J]. 中国人兽共患病学报,2011,27(8): [19] Jouanguy E,Altare F,Lamhamedi S,et al. Interferon-gamma-receptor deficiency in an infant with fatal bacille Calmette- Guérin infection [J]. N Engl J Med,1996,335(26): [20] Aranaz A,Liébana E,Gómez-Mampaso E,et al. Mycobacterium tuberculosis subsp caprae subsp nov:a taxonomic study of a new member of the Mycobacterium tuberculosis complex isolated from goats in Spain [J]. Int J Syst Bacteriol,1999,49Pt3: ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 梁华 ) 新生儿颅脑超声诊断学习班通知 为提高对围生期新生儿脑损伤及其他中枢神经系统疾病的诊断水平, 充分利用已有的医疗资源, 推广颅脑超声检查诊断技术, 北京大学第一医院儿科将于 2014 年 8 月 26 日至 8 月 30 日举办为期 5 天的新生儿颅脑超声诊断学习班 授课教师为本科及北京市著名专家教授 学习结束授予国家级继续医学教育 Ⅰ 类学分 10 分 主要授课内容包括 : 中枢神经系统解剖 ; 新生儿不同颅脑疾病超声诊断 ; 胎儿中枢神经系统的超声诊断 招收学员对象 : 儿科新生儿专业医师, 超声专业医师及技师 学费 元 报名截止日期 2014 年 8 月 8 日 ( 上课前 2 周 ) 欲参加者请联系 : 北京大学第一医院儿科 ( 邮编 :100034) 联系人 : 王红梅, 刘黎黎 电话 : 或 电子信箱 : bdyy2002@163.com 北京大学第一医院儿科

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