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1 蛋鸡脂肪肝出血综合征 发病机理的研究 胡国良

2 蛋鸡脂肪肝出血综合征 发病机理的研究 第一部分 : 研究背景 第二部分 : 试验研究 第三部分 : 结论与展望

3 研究背景 脂肪肝出血综合征 (Fatty Liver Hemorrhagic Syndrome,FLHS ) 又名脂肪肝综合征 (Fatty Liver Syndrome,FLS) 是一种营养代谢性疾病 主要导致蛋鸡不明原因的产蛋率下降和死亡率上升, 引起鸡肝脏发生脂肪变性 出血, 有时导致急性死亡为特征的营养代谢性疾病

4 大部分报道认为是由于机体脂类代谢紊 乱, 内源性甘油三酯 (TG) 在肝脏的 大量沉积造成 (why? how?)

5 脂蛋白都由载脂蛋白 甘油三脂 磷脂和胆固醇及其酯类物质组成 载脂蛋白除与脂类亲和外, 还是 (1) 某些酶的激活剂或抑制剂 ; (2) 细胞受体识别脂蛋白的标志 ; (3) 参与血清脂蛋白的分泌 故当载脂蛋白的结构 合成或分泌发生障碍时可导致疾病的发生

6 大量文献指出, 由于血脂含量随着人们饮食的变化, 其含量波动很大, 因此测定其蛋白部分即载脂蛋白及其亚类更为精确, 被称为测定人体内脂蛋白变化的第三个里程碑

7 1992 年研究鸡脂肪肝综合征中发现, 发生脂肪肝的病鸡其 HDL-Ch 含量降低, 而 LDL-Ch 含量升高, 且 HDL-Ch/LDL-Ch 比值越小, 其发生脂肪肝的危险性越大 这与人冠心病和动脉粥样硬化的 HDL-Ch 和 LDL-Ch 的变化有相似规律

8 卫生部北京老年医学研究所研究发现, 北京鸭不易患脂肪肝, 其烤鸭虽肥, 但人食用后, 不易产生冠心病和动脉硬化, 反而能防止该病的发生, 主要原因是由于该品种鸭的 HDL-Ch 含量较高, 而 LDL-Ch 含量较低

9 另外, 蛋鸡容易通过人工实验制造各种不同的高脂血症, 是研究人类动脉粥样硬化等心血管系统疾病的很好的模型 国外曾有人用高胆固醇的鸡作为研究 HDL 氧化状况的体内模型, 认为有以下优点 : (1) 容易产生高胆固醇血症 只需在日粮中添加 ; (2) 可进行动脉粥样硬化人工造病研究 ; (3) 与人 apoaⅠ 在体外分离研究时易形成 apoaⅠ 低聚体比较, 鸡的 apoaⅠ 可形成单体 因此认为鸡是进行人 HDL apo 胆固醇等脂类代谢紊乱性疾病的良好模型

10 因此, 无论对蛋鸡 FLHS 本身的发病机理, 如脂类代谢 肝损伤 自由基 载脂蛋白与脂肪肝的关系, 还是为人类相关疾病的基础研究, 都有必要进行该病的研究

11 试验研究 FLHS 人工病理模型的建立 FLHS 发病机理的研究 ( 一 ) FLHS 发病机理的研究 ( 二 ) 鸡血清 apoaⅠ AⅡ 的分离纯化及其抗血清的制备 ApoAⅠ ApoAⅡ 浓度测定方法的建立及其浓度的测定 高能低蛋白饲料对鸡肝脏 apoaⅠ 基因 mrna 表达的影响

12 实验一 FLHS 人工病理模 型的建立

13 实验鸡的选择 分组及管理 选择 14 周龄体重 1.4~1.5kg 的艾维因鸡 120 羽, 随机分成四组, 每组 30 羽 Ⅰ 组 : 为对照组, 喂基础日粮 Ⅱ 组 : 为菜籽饼中毒组 Ⅲ 组 : 为高能低蛋白组 Ⅳ 组 : 为高能高蛋白组

14 实验进程 预试期 : 历时 33 天 实验期 : 历时 50 天 调整期 : 历时 20 天

15 临床观察及指标测定 临床观察采食 饮水 精神状态 体况等血液常规测定 RBC Hb PCV 等血液临床生化指标的测定钙 无机磷 总蛋白 白蛋白 葡萄糖等病理剖检及组织学观察肝 肾 心等的脂肪变性程度

16 实验结果 临床表现 FLHS 发病鸡精神萎靡, 嗜睡喜卧, 鸡冠苍白, 腹部软绵 肥大 采食减少, 产蛋率和平均蛋种均有所下降

17 生产性能的变化 各组体重变化 1.75 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1.7 体重 (kg) 时间 (d) 实验的第 30 天后, 除 Ⅱ 组的体重与对照 Ⅰ 组有极显著差异外 (P<0.01), 其它均无统计学意义的差异 (P>0.05) Ⅲ Ⅳ 组与 Ⅰ 组比较, 其体重呈现上升趋势, 而 Ⅱ 组则有所下降

18 各组产蛋率变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 产蛋率 (%) 时间 (d) 对照组相比较,Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组其产蛋率显著下 降, 其中以 Ⅱ 组下降最早

19 各组蛋重变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 蛋重 (g) 时间 (d) 蛋重在第 20 天检测时,Ⅲ 组蛋重增加, 有显著差异 (P<0.05), 在第 40 天时表现为 Ⅲ 组 Ⅱ 组 >Ⅰ 组 Ⅳ 组, 其它均无统计学上差异 (P>0.05)

20 各组肝重, 腹脂及肝脏等级评分 时组间 ( 天 ) 别 数量 (n) 胴体重 (g) 肝重 (g) 肝重 / 胴体重 (%) 腹脂重 (g) 肝长 (cm) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 评分

21 血清钙浓度变化 血清无机磷浓度变化 10 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 4.3 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清钙浓度 (mmol/l) 血清无机磷浓度 (mmol/l) 时间 (d) 时间 (d) 三个试验组鸡钙 无机磷水平与对照组比较, 在第 10 天以后, 其含量均升高, 差异极显著 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其钙 无机磷含量恢复到正常水平 说明了 FLHS 患鸡其钙 无机磷代谢的紊乱

22 血清总蛋白变化 血清总蛋白 (g/l) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 总蛋白, 除 Ⅳ 组在正常范围内偏高以外, 其它各组均无统计学上的差异

23 血清白蛋白变化 血清白蛋白 (g/l) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 白蛋白在第 20 天以后, 含量下降, 与对照相比,Ⅱ 组 Ⅲ 组 Ⅳ 组均差异极显著 (P<0.01), 其含量由小 到大为 :Ⅲ<Ⅱ<Ⅳ<Ⅰ

24 血清 A/G 值的变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0.78 A/G 值 时间 (d) A/G 比例下降, 并随着病程加重而逐渐减少, 各试验组与 对照组比较差异均极显著 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其 白蛋白, 球蛋白质含量以及 A/G 比例均有所改善

25 血糖的变化 16 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 15 血糖含量 (mmol/l) 时间 (d) 第 20 天开始, 试验组与第 Ⅰ 组比较,Ⅲ Ⅳ 组血糖升高 (P<0.05);Ⅱ 组血糖下降, 与 Ⅰ Ⅲ Ⅳ 组相比有极显著差异 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其血糖含量能得到较好恢复

26 血液红细胞压积 32 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 31 血液红细胞压积 (%) 时间 (d) PCV 在第 40 天后,Ⅱ Ⅲ 组含量降低, 与第 Ⅰ Ⅳ 组比较有显著差异 (P<0.05),PCV 由大到小的排列为 Ⅰ Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ

27 小 结 从生产性能 血液部分指标变化以及肝脏 病理组织切片观察等证明 : 用含 8% 菜籽饼 ( Ⅱ 组 ), 高能低蛋白 (3.02Mcal/kg( 14.3%, Ⅲ 组 ) 和高能高蛋白 (3.09Mcal/kg 17.4%,Ⅳ 组 ) 日粮均引起 FLHS 的发生 其中以 Ⅲ 组量严重,Ⅱ, 组次 之,Ⅳ, 组较轻

28 各试验发病组均有不同程度的肝肿大 增 重和出血, 产蛋率下降明显, 但体重增加可 能不明显 病理组织学检查表明,Ⅲ, Ⅳ 组 以脂肪变性为主, 肝细胞浆内充满脂肪滴, 严重时肝腺泡结构解体呈分散状态, 同时见 有一定程度的出血, 其中以 Ⅲ 组较严重,Ⅳ, 组次之 ;Ⅱ; 组则主要以肝出血为主, 并伴有 肝细胞的脂肪变性

29 根据本实验的结果, 结合生产中发病的实 际情况, 在今后的研究中可选用高能低蛋白高能低蛋白日 粮复制人工病理模型

30 实验二 蛋鸡 FLHS 中 脂类变化 肝酶变化

31 血清脂类测定 TG T-Ch F-Ch,ChE HDL-Ch LDL- Ch 血清肝酶的测定 AST ALT AKP γ-gt OCT

32 实验结果 血清 T-Ch 含量变化 血清 ChE 含量变化 血清 T-Ch(mmol/L) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 血清 ChE(mmol/L) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组其 T-Ch 在第 10 天后,ChE 在第 20 天后, 其含量升高, 与对照组 (Ⅰ 组 ) 比较有极显著差异 (P<0.01), 并随着病程的变化, 含量逐渐升高 在实验的第 20 天以后,Ⅱ Ⅲ 的 T-Ch 和 ChE 含量与 Ⅳ 组比较差异显著 (P<0.05); 但 Ⅱ Ⅲ 组之间无统计学差异 其中大到小的顺序为 Ⅲ Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ

33 血清 F-Ch 含量变化 血清 ChE/T-Ch 变化 4.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 70 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 F-Ch(mmol/L) ChE 与 F-Ch 比值 时间 (d) 时间 (d) F-Ch 含量与 T-Ch 和 ChE 有相似的规律性,Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组与 Ⅰ 组比较, 含量升高, 差异极显著 (P<0.01), 在实验的第 30 天后,Ⅱ Ⅲ 组的 F-Ch 含量与 Ⅳ 组比较差异极显著 (P<0.01); 在各试验组中,ChE/T-Ch 的比值下降

34 血清 TG 含量变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 6.00 血清 TG(mmol/L) 时间 (d) TG 含量, 各组各阶段均无统计学差异, 但在实验 中, 其含量有升高的趋势, 特别是 Ⅱ Ⅲ 组

35 血清 HDL-Ch 浓度的变化 血清 LDL-Ch 浓度的变化 血清 HDL-Ch(mmol/L) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 LDL-Ch(mmol/L) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 时间 (d) 在第 10 天时, 试验组 与对照组差异显著 ( p<0.05 ), 在第 20 天后, 差异极显著 (p<0.01) 在第 10 天时, 试验组与对 照组差异显著 (p<0.01), 之 后, 试验组与对照组比较, 差异极显著 (p<0.01)

36 血清 AKP 变化 血清 肝酶的变化 105 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 95 血清 AKP(IU/I) 时间 (d) AKP 在 20 天后, 发病组与对照组差异极显著 (p<0.01); 改正饲养日粮 20 天后, 除 Ⅱ 组恢复正常水平 外, 其它 Ⅲ Ⅳ 两组 AKP 值仍然升高

37 血清 ALT 变化 血清 AST 变化 血清 ALT(IU/I) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 AST(IU/I) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 时间 (d) ALT 各组间无差异 (P>0.01) AST 变化敏感, 各试验组与对照组差异显著 (P<0.05);Ⅱ 组与 Ⅲ Ⅳ 组比较, 第 10~30 天差异极显著 (P<0.01) 改正日粮 20 天后, 各试验组恢复到正常水平

38 血清 γ-gt 变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 γ-gt(iu/dl) 时间 (d) Ⅲ 组 γ-gt 上升最早, 差异极显著 (P<0.01) 第 Ⅱ Ⅳ 组在第 20 天后, 也有较快上升, 与 Ⅰ 组比较差异极显著 (P<0.01) 在 30 天后, 第 Ⅱ 与第 Ⅳ 组之间比较差异显著 (P<0.05) 改正饲养日粮 20 天后, 试验 Ⅱ 组恢复正常范围

39 血清 OCT 变化 血清 OCT(IU/LY 分 ) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 时间 (d) 试验 Ⅱ 组有一个较快的升高, 与其他三组比较, 差异极显著 (P<0.01); 而实验 Ⅲ Ⅳ 组在后阶段才有升高, 在 30 天时与对照组比较差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01) 改正饲养日粮 20 天后, 其 OCT 值恢复到正常水平

40 小 结 血清中 TG 含量正常或稍升高 T-Ch 和 ChE 升高, 但 ChE/T-Ch 比例下降 ( 低于 60%), 并随着病情的加重而日趋严重 血清中 HDL-Ch 含量下降,LDL-Ch 含量上升, 两者呈负相关性

41 肝酶活力变化除 ALT 外, 其它酶类 AST AKP γ-gt OCT 含量均升高, 是诊断 FLHS 的较敏感指标 在早期,AST 变化于所有组的 FLHS 都有比较敏感 ;OCT 对菜籽饼中毒引起的 FLHS 更敏感 ; 而 AKP 和 γ-gt 对高能低蛋白引起的 FLHS 较为敏感, 且两酶呈平行性关系

42 实验三 FLHS 与自由基关系研究 和探讨

43 实验方法与步骤 实验分组对照组 : 正常日粮 ; 试验组 : 高能低蛋白日粮饲养实验日龄相同 (140 天 ) 体重相近 (1.5~1.7kg) 的海兰褐壳蛋鸡 102 羽, 随机分成两组, 每组设三个重复, 每个重复 17 羽, 正试期 55 天 实验蛋鸡实行一鸡一笼, 自由采食和饮水

44 样品的测定 肝脂率的测定 索氏抽提法 血清中生化指标测定 ( 试剂盒 ) MDA SOD GSH-Px CAT LPS LPL TG HDL- Ch LDL-Ch 肝脏中生化指标测定 ( 试剂盒 ) NEFA MDA SOD CAT GSH-Px LPS LPL 病理切片观察 病理切片的制作按常规方法

45 腹脂变化 腹脂 (g) 试验组 对照组 时间 (d) 试验组和对照组腹脂重在前 15 天测定结果差异不显著 (P>0.05), 从 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异 极显著 (P<0.01)

46 肝湿重变化 肝脂率变化 试验组 对照组 60 试验组 对照组 肝湿重 (g) 肝脂率 (%) 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 肝湿重在实验期第 15 天差异不显著 ( P>0.05 ), 其他差异显著 (P<0.05); 试验组肝湿重在整个实验期呈增重趋势 ; 试验组和对照组比较, 肝脂率在实验期第 15 天差异不显著 ( P>0.05 ), 其他差异极显著 (P<0.01); 试验组肝脂率整个实验期呈逐渐递增趋势

47 肝脏匀浆蛋白质含量变化 1.20 试验组 对照组 肝脏匀浆蛋白质 (g/l) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆蛋白质浓度在第 35 天 第 45 天和第 55 天测定结果差异显著 (P<0.05); 试验组肝 脏匀浆蛋白质浓度呈现下降趋势

48 血清 TG 含量变化 试验组 对照组 血清 TG(mmol/L) 时间 (d) 血清中 TG 试验组和对照组比较, 在第 35 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01); 试验组在实验期的第 35 天前 TG 变化不明显, 从第 35 天后含量升高 对照组在实验过程中变化不明显

49 血清 LPS 活力变化 肝脏匀浆 LPS 活力变化 血清脂肪酶活力 (U/L) 试验组 对照组 肝脏匀浆脂肪酶 (U/gprot) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中脂肪酶活力从第 25 天起差异极显著 (P<0.01), 肝脏匀浆中脂肪酶活力从第 35 天起差异极显著 (P<0.01); 实验期内试验组血清和肝脏匀浆中脂肪酶活力呈增高趋势

50 血清 LPL 活力变化 肝脏匀浆 LPL 活力变化 血清 LPL(U/L) 试验组 对照组 肝脏匀浆 LPL(U/gprot) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 实验期内试验组血清和肝脏匀浆 LPL 活力呈增高趋势

51 血清 HDL-Ch 含量变化 血清 LDL-Ch 含量变化 血清 HDL-Ch (mmol/l) 试验组 对照组 血清 LDL-Ch(mmol/L) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 实验期内试验组血清中 HDL-Ch 含量逐渐降低, 血 清中 LDL-Ch 含量逐渐升高, 两者呈负相关

52 血清 SOD 活力变化 肝脏匀浆 SOD 活力变化 血清 SOD 活力 (U/ml) 试验组 对照组 时间 (d) 肝脏匀浆 SOD 活力 (U/mgprot) 试验组 对照组 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血 清中 SOD 活力从第 45 天起, 其 测定结果差异极显著 (P<0.01), 其他差异不显著 ( P>0.05 ); 试验组血清中 SOD 活力逐渐递减 ; 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆中 SOD 活力在第 25 天差异显著 (P<0.05), 其他差异不显著 (P>0.05); 试验组匀浆中超氧化物歧化酶活力变化有下降的趋势

53 血清 GSH-Px 活力变化 肝匀浆中 GSH-Px 活力变化 试验组 对照组 试验组 对照组 血清 GSH-Px(U/ml) 肝脏匀浆 GSH-Px(U/mgprot) 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中 GSH-Px 活力第 15 天时差异显著 (P<0.05), 其他差异极显著 (P<0.01); 试验组血清中 GSH-Px 活力逐渐降低 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆中 GSH-Px 活力在 15 天至 35 天时差异极显著 (P<0.01), 其他差异不显著 (P>0.05)

54 血清 CAT 活力变化 肝脏匀浆 CAT 活力变化 血清 CAT(U/ml) 试验组 对照组 肝脏匀浆 CAT(U/mgprot) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 血清中 : 试验组和对照组 CAT 活力差异不显著 ; 试验组 CAT 在整个实验过程中呈递减 试验组和对照组比较, 在 25 天 45 天和 55 天的三次采样测定结果差异显著 (P<0.05), 其他差异不显著 (P>0.05); 试验组呈先增高后降低的趋势

55 血清 MDA 含量变化 肝脏匀浆 MDA 含量变化 血清 MDA(nmol/ml) 试验组 对照组 肝脏匀浆 MDA(nmol/mgprotl) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中丙二醛含量在 45 天时差异显著 (P<0.05), 在 55 天时差异极显著 (P<0.01); 肝匀浆中丙二醛含量在 15 天 25 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01); 试验组血清和匀浆中丙二醛含量呈升高趋势

56 血清 NEFA 含量变化 肝脏匀浆 NEFA 含量变化 试验组 对照组 试验组 对照组 血清 NEFA(μmol/L) 肝脏匀浆 NEFA(μmol/gprot) 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清和肝脏匀浆中游离脂肪酸含 量从 25 天起差异极显著 (P<0.01); 实验期内试验组血清和 肝脏匀浆中游离脂肪酸含量增高

57 试验组病理解剖学变化 脂肪稀少 肝色正常 第 0 天剖解图片 第 15 天剖解图片

58 变黄趋势 变黄 边缘钝圆 脂肪增多 第 25 天剖解变化 第 35 天剖解变化

59 脂肪肥厚 质脆如泥 第 45 天剖解变化 出血点斑 第 55 天剖解变化 脂肪沉积

60 试验组肝脏组织学变化 肝窦清晰 肝窦模糊出现空泡 第 0 天肝脏组织学变化 第 15 天肝脏组织学变化

61 结缔肿胀 空泡增多 第 25 天肝脏组织学变化 第 35 天肝脏组织学变化

62 空泡增大 空泡充盈 第 45 天肝脏组织学变化 第 55 天肝脏组织学变化

63 小 结 采用高能低蛋白日粮饲喂蛋鸡再一次成功的建立蛋鸡 FLHS 病理模型 实验蛋鸡表现为生产性能下降 肝脂蓄积, 血清 TG 和 LDL-Ch 升高,HDL-Ch 下降, 并出现典型 FLHS 病变

64 蛋鸡发生 FLHS 时, 血清和肝脏匀浆中脂 肪酶 脂蛋白脂酶活力升高

65 蛋鸡 FLHS 发展过程中, 机体 NEFA 和 MDA 含量升高, 对机体产生损伤 ; 机体抗氧化酶 SOD GSH-Px CAT 活力降低, 表明机体抗氧化能力降低 证明自由基在 FLHS 的发生 发展过程中起重要作用

66 实验四 鸡血清 apoaⅠ AⅡ 的分离纯化及其抗血清的制备

67 ApoAⅠ 的分离纯化步骤 实验动物的选取 血清的收集 HDL 的制备 磷钨酸沉淀法 脱脂 HDL 溶液 的透析和浓缩 脱脂 HDL 的溶解 HDL 的脱脂 丙酮 / 乙醇 (1:1( ) apoai 的提取 纯度的鉴定 分子量测定

68 鸡 apoaⅠ AⅡ 是血清 HDL 的主要成分, 约占其蛋白成分的 90% 为了更好探讨 FLHS 形成的内在机制, 对鸡血清 apoaⅠ apoaⅡ 进行分离纯化及其抗血清的制备, 为后续研究的进行做好准备

69 ApoAⅠ 的分离纯化步骤 实验动物的选取 血清的收集 HDL 的制备 磷钨酸沉淀法 脱脂 HDL 溶液 的透析和浓缩 脱脂 HDL 的溶解 HDL 的脱脂 丙酮 / 乙醇 (1:1( ) apoai 的提取 纯度的鉴定 分子量测定

70 实验结果 apoai 的提取 sephadex G-150 柱层析图 吸光值 280nm (Absorbance) I II III 收集管数 (Fraction Number) 脱脂后的 HDL 过 sephadex G-150 凝胶层析 柱蛋白吸收峰形图

71 apoai 纯度的鉴定 Rabbit Phosphorylase B Bovine Serum Albumin Rabbit Actin Bovine Carbonic Anhydrase apo AI Trypsin Inhibitor Hen Egg White Lysozyme 1 2 低分子量标准蛋白分子与纯化后 apo AI 的电泳对照图

72 apoai 分子量测定 logm.w 兔磷酸化酶 B (97400Da) 牛血清白蛋白 (66200Da) 兔肌动蛋白 (43000Da) 牛碳酸酐酶 (31000Da) apoa-1 胰蛋白酶抑制剂 (20100Da) 鸡蛋清溶菌酶 (14400 Da) Rf 蛋白分子量与电泳迁移率的关系 y = x R 2 = 纯化后 apo AI 的分子量测定的标准曲线

73 ApoAⅡ 的分离纯化步骤 脱脂 HDL 溶液 apoaii 的提取 apoaii 纯度的鉴定 二次层析分离 apoaⅡ 分子量测定

74 实验结果 一次层析蛋白吸收峰形图 DEAE sepharose-6b 柱层析图 0.2 吸光值 280 nm (Absorbance) I Ⅱ Ⅲ 收集管数 (Fraction Number) HDL 经 DEAE Sepharose CL-6B 柱层析后出现三个 主要紫外线吸收峰, 经 Urea-SDS-PAGE 电泳检测得知 apoaⅡ 在峰 Ⅱ 中

75 二次层析蛋白吸收峰形图 吸光值 280nm (Absorbance) Ⅱ I III Ⅲ I II 收集管数 (Fraction Number) 过 DEAE Sepharose CL-6B 柱第 Ⅱ 峰收集蛋白过 sephadex G-150, 峰 Ⅲ 是 apoaⅡ 纯品 峰 Ⅱ 是 apoaⅠ, 峰 Ⅰ 主要是清蛋白和未解聚的 apoaⅠ

76 apoaii 纯度的鉴定 Rabbit Phosphorylase B Bovine Serum Albumin Rabbit Actin Bovine Carbonic Anhydrase Trypsin Inhibitor Hen Egg White Lysozyme apoai apoaii 低分子量标准蛋白分子与纯化后 apo AII 的电泳对照图

77 apoaii 分子量测定 y = x logm.w 兔磷酸化酶 B (97400Da) 牛血清白蛋白 (66200Da) 兔肌动蛋白 (43000Da) 牛碳酸酐酶 (31000Da) 胰蛋白酶抑制剂 (20100Da) 鸡蛋清溶菌酶 (14400 Da) R 2 = apoaii Rf 蛋白分子量与电泳迁移率的关系 纯化后 apo AII 的分子量测定的标准曲线

78 apoai 抗血清的制备 用 apoai 制品免疫新西兰雄兔 ( 体重 2.5kg 左右 ), 分四次进行, 每两周加强免疫一次 第一次用 apoai 0.5mg 与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化成油包水状 ( 即乳化后的白色混合物滴在水面上不散开为合格 ), 分多次多点注入每侧脚掌皮下 以后逐次增用蛋白质 0.25mg, 并改用不完全弗氏佐剂, 于两腿内侧肿大淋巴结注入 最后一次免疫后第十天检测抗体效价达 1 16 即颈动脉放血, 分离血清, 加 NaN 3 后 -20 保存

79 兔抗鸡 apoai 血清的效价测定 兔抗鸡 apoai 抗血清的效价测定. 中间孔为 apoai 制品,1~6 孔为抗血清的稀释倍数, 依次分别为 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64

80 apoai 抗血清纯度鉴定 apoai 对兔抗鸡全血清的免疫电泳 兔抗鸡 apoai 抗血清与本实验制备的 apoai 和鸡混合血清的双向免疫扩散试验

81 ApoAⅡ 抗血清的制备 采用 apoaii 制品免疫新西兰雄兔 ( 体重 2.5Kg 左右 ), 每两周加强免疫 1 次 第 1 次用 apoaii 蛋白 1.0mg 与等体积的完全弗氏佐剂 ( 适当增加卡介苗的用量 ) 充分乳化成油包水状 ( 即乳化后的白色混合物滴在水面上不散开为合格 ), 多次多点皮内或皮下微量注射 以后逐次增用蛋白质 0.25mg, 于两腿内侧肿大淋巴结注入 最后 1 次免疫后第 10d 检测抗体效价达 1 8, 即颈动脉放血, 分离血清, 加 NaN 3 后 -20 保存备用

82 兔抗鸡 apoaii 抗血清的效价测定 兔抗鸡 apoaii 抗血清的效价测定 中间孔为 apoaii 制品,1~6 孔为抗血清的稀释倍数, 依 次为 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64

83 apoaii 抗血清纯度鉴定 鸡混合血清对兔抗鸡 apoaii 血清的免疫电泳 兔抗鸡 apoaii 抗血清与本实验制备的 apoaii 和鸡混合血清的双向免疫扩散试验

84 apoai 标准参考血清的制备 鸡空腹 12~24h, 采集血液, 按常规方法分离血清 Bradford 法标定的 apoai 蛋白 (3.156mg/ml) 为第一标准, 用免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳法标定的鸡混合血清平均值 (3.425mg/ml) 为标准参考血清 加 0.02% NaN 3, 分装,-20 保存, 作为参考标准血清

85 apoaii 标准参考血清的制备 鸡空腹 12~24h, 采集血液, 按常规方法分离血清 Bradford 法标定的 apoaii 蛋白 (1.102mg/ml) 为第一标准, 用免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳法标定的鸡混合血清平均值 (1.112mg/ml) 为标准参考血清 加 0.02% NaN 3, 分装,-20 保存, 作为参考标准血清

86 小 结 本实验研究表明, 采用本实验介绍的方法能很好的分离纯化 apoaⅠ apoaⅡ, 方法简单, 不需特殊仪器, 在一般实验室条件下就能进行, 且回收率较高, 均能达到电泳纯和免疫纯, 很好的满足了后续实验工作的需要

87 对 apoaⅠ apoaⅡ 的分子量进行了测 定, 标准曲线相关性良好

88 弗氏佐剂充分乳化的鸡血清 apoaⅠ apoaⅡ 对新西兰雄兔进行每七天一次的皮下免疫, 所制得的高免血清效价好, 特异性高, 符合接下来建立其浓度免疫测定法研究的需要

89 ApoAⅠ ApoAⅡ 浓度 测定方法的建立及其浓度的测定

90 选用和比较 : 单向免疫扩散 免疫透射比浊 火箭免疫电泳作为本研究的实验方法 常用的免疫分析法有单向免疫扩散法 火箭免疫电泳法 放射免疫分析 酶标记免疫分析 荧光标记免疫分析及免疫比浊法等

91 单向免疫扩散测定法 抗体凝胶板的制做 加样与扩散 数据的测量及处理

92 透射免疫比浊测定法 抗血清预处理 血清样品稀释 样品自身浊度测定 终点浊度测定 计 算

93 火箭免疫电泳测定法 血清标本的稀释 火箭电泳测定 标准曲线的绘制 计 算

94 方法的选取 以上实验研究表明, 免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳三种方法都能较准确的对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定 虽然在前期准备比较充分的情况下, 免疫透射比浊法速度最快, 但样品和抗血清预处理花费的时间较长, 且不易保存 火箭免疫电泳同样花费的时间也较长, 且电泳受时间和温度等因素的影响, 所以为了今后临床中更方便, 简洁的检测, 本实验选用单向免疫扩散法对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定

95 实验结果 单向免疫扩散效果图 单向免疫扩散效果图, 从左到右稀释倍数分别是 : , 最右孔是样品 1 2 稀释孔

96 标准曲线 扩散环的半径 (cm) y = x R 2 = 扩散环的半径 (cm) y = x R 2 = apoai 的稀释浓度 (mg/ml) apoaii 的稀释浓度 (mg/ml) apoaⅠ 浓度测量的标准曲线 apoaⅡ 浓度测量的标准曲线

97 血清 apoaⅠ 含量变化 血清 apoaⅡ 含量变化 血清 apoaⅠ 含量 (mg/ml) 试验组 对照组 血清 apoaⅡ 含量 (mg/ml) 试验组 对照组 时间 (d) 时间 (d) 实验期第 35 天起试验组血清中 apoaⅠ 和 apoaⅡ 含量比对照组低 (P<0.05)

98 小 结 使用单向免疫扩散法对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定, 标准曲线相关性良好 (apoaⅠ:r2= apoaⅡ:r2= ), 回归方程为 :apoaⅠ: y=0.1882x apoaⅡ:y=0.3625x

99 高能低蛋白饲料诱发的 FLHS 蛋鸡血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量随着病情的严重逐渐下降 分别从 (mg/ml ) 2.42± ±0.12 下降到 1.64± ±0.04

100 高能低蛋白饲料对鸡肝脏 apoaⅠ 基因 mrna 表达的影响 --- 半定量 PCR 方法

101 实验步骤与方法 样品的采集总 RNA 的提取总 RNA 的电泳 PCR 反应 反转录 (RT) PCR 引物设计 DNA 片段回收及测序 PCR 条件的优化 PCR 扩增 电泳及灰度分析 数据处理

102 实验结果 RT-PCR 扩增结果 M A M B 344 bp 204 bp 目的基因 RT-PCR 产物电泳图谱 Marker 泳道从上到下依次是 (bp): 左图是 apoaⅠ 基因扩增产物, 右图是 β-actin 基因扩增产物

103 肝脏 apoaⅠmrna 表达变化 试验组和对照组 apoaⅠ mrna 的 RT-PCR 产物电泳图 (n=6) 泳道 1: Mark,DL2000; 泳道 2~7,8~13 分别为 对照组和试验组

104 小 结 试验组和对照组肝脏组织中 apoaⅠ β- actin mrna 的表达情况结果表明, 扩增出的目的条带为 204bp 和 344bp 的基因片断, 测序报告所得的结果和参照基因的同源性分别达到 98% 和 100%,PCR 成功扩增出了目的片断

105 半定量 RT-PCR 表明试验组肝脏中 apoaⅠmrna 对 β-actin mrna 的相对丰度均显著低于对照组, 说明高能低蛋白饲料可降低鸡肝脏的 apoaⅠ mrna 的表达 返回

106 结论 根据实验的结果, 结合生产中发病的实际情况, 在今后的 FLHS 研究中可选用高能低蛋白日粮复制病理模型 FLHS 能导致机体脂类代谢障碍和肝特异酶活性变化, 引起肝脏病理损伤

107 高能低蛋白日粮引起的 FLHS 病鸡血清和肝脏匀浆中 NEFA 和 MDA 含量升高, 抗氧化酶 :SOD GSH-Px CAT 活力降低, 表明机体抗氧化能力降低 证明自由基在 FLHS 的发生 发展过程中起重要作用

108 首次在国内通过磷钨酸沉淀, 经 sephadex G-150 凝胶柱反复层析或 DEAE Sepharose CL-6B 离子交换层析进行鸡血清 apoaⅠ 和 apoaⅡ 的分离纯化 测定了分子量, 制备兔抗鸡 apoaⅠ 和 apoaⅡ 血清, 并自行标定标准血清

109 首次在国内建立了单向免疫扩散 免疫透射比浊和火箭免疫电泳三种测定鸡血清 apoaⅠ 和 apoaⅡ 的方法 对高能低蛋白饲料诱发的 FLHS 血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量测定结果表明, 随着病情的发展, 血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量逐渐下降

110 应用半定量 RT-PCR 方法测定了 FLHS 患鸡肝脏 apoaⅠ mrna 的表达, 结果说明高能低蛋白饲料可降低鸡肝脏 apoaⅠ mrna 的表达

111 今后可能研究的方向 ApoA 与 FLHS 关系的进一步研究 ; ApoB 及其他载脂蛋白在 FLHS 发病中的作 用及关系研究 ; ApoA 和 apob 在正常机体及 FLHS 中的基因 表达与调控 ; ApoA 和 apob 与相关受体关系及其调节 ; 利用蛋鸡进行人类脂肪代谢障碍病为研究 模型的研究

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