厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文, 是本人在导师指导下独立完成的研究成果本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果, 均在文中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任声明人 ( 签名 ): 年月日

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燥杨
7 years ago
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1 学校编码 :10384 分类号密级学号 : UDC 厦门大学硕士学位论文农杆菌介导的口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究 Study on Introducing FMDV Epitopes Fused Gene into Carrot mediated by Agrobacterium 李文建指导教师姓名 : 陈亮沈明山教授教授专业名称 : 细胞生物学论文提交日期 : 2005 年 9 月 5 日论文答辩日期 : 2005 年 10 月 3 日学位授予日期 : 2005 年月日答辩委员会主席 : 王鸣刚副教授评阅人 : 肖湘教授王风平教授 2005 年 9 月

2 厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文, 是本人在导师指导下独立完成的研究成果本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果, 均在文中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任声明人 ( 签名 ): 年月日

3 目录中文摘要. 1 英文摘要..3 略缩词..6 1 前言疫苗生产系统的的概述转基因植物疫苗的研究概况口蹄疫转基因植物疫苗的研究概况本研究的目的和意义材料与方法材料方法结果与分析胡萝卜的再生系统农杆菌介导的胡萝卜遗传转化系统组织化学及分子生物学方法检测讨论小结...51 参考文献.52 致谢.59

4 摘要口蹄疫是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus, FMDV) 引起的一种世界性的急性的家畜传染病其特点是传播途径广传染性很强死亡率较高利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点, 具有生产简单成本较低使用安全方便易贮存等优点胡萝卜在我国种植广, 营养丰富, 可以生吃, 是一种理想的研究转基因植物疫苗的载体植物本实验通过农杆菌的介导, 以携带 O 型和 A 型口蹄疫抗原决定簇融合基因 O 21 - O 14 -A 21 -HBcAg 的植物表达载体转化胡萝卜愈伤组织 ; 通过筛选获得潮霉素抗性愈伤组织, 并再生得到抗性植株 ; 对转化后的愈伤组织和抗性植株进行了 GUS 基因活性组织化学染色检测, 并且对抗性植株进行了 PCR PCR-Southern RT-PCR 等分子生物学检测所获得的试验结果如下 : 1. 建立了胡萝卜东大品种再生系统最佳愈伤组织诱导培养基为 MS + 2,4-D 0.1 mg/l, 分化培养基为不加任何激素的 MS 培养基, 生根培养基为 1/2MS +NAA 0.2 mg/l 2. 通过筛选, 再生获得 156 棵抗性植株建立并优化了农杆菌介导的胡萝卜的遗传转化系统实验表明, 干燥预培养和抽真空能明显提高转化效率, 而农杆菌液浓度浸染时间共培养时间的不同和添加 As 均不能明显影响转化效率菌液浓度 OD ~0.8 浸染时间 5~10 min 共培养时间 3 d 对转化有利菌液浓度 OD 对胡萝卜后期筛选抑菌及其再生有利潮霉素和羧苄青霉素对抗性愈伤再生能力具有明显的抑制作用 3. GUS 染色检测和分子生物学检测结果如下 : 1

5 GUS 报告基因在转化的愈伤组织中瞬时表达, 并在抗性植株中稳定表达对抗性植株进行 PCR 检测和 PCR-Southern 杂交检测, 证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中通过 RT-PCR 检测, 扩增出与预期片段一致的条带, 表明目的基因已经正常转录关键词 : 口蹄疫抗原决定簇 ; 遗传转化 ; 胡萝卜 2

6 ABSTRACT Foot-and-mouth disease (FMD) is the world-wide infectious disease induced by Foot-and-mouth disease virus (FMDV). It mainly infects the even-feet domestic animals. And its character is such as more broadly infectious approach, easy infection, high disease-deadly percentage. Vaccines derived by transgenic plants is becoming one focus of plant genetic engineering. And that has such advantages as easy production, low cost, convenient and safe use and easy storage. Carrot plants are broadly growed in china. And its character is abundant nutrition, uncooked eating. So it is considered as an ideal plant for studies of transgenic plants vaccine. The studies mainly presented that Fused gene O 21 -O 14 -A 21 -HBcAg containing both type O and A of FMDV epitopes were introduced into carrot callus mediated by Agrobacterium. Hygromycin-resistant carrot callus were obtained by the medium containing antibiotic. Hygromycin-resistant carrot plants were regenerated from the resistant callus. The correlative detection experiments were finished, such as, GUS expression detection in transformed callus and Hygromycin-resistant carrot plants; PCR, PCR-Southern blotting and RT-PCR for Hygromycin-resistant carrot plants. The mainly important experiment results were as follows: 1. Carrot regeneration system was established. Culture medium for inducing carrot callus was MS + 2,4-D 0.1 mg/l, culture medium for carrot plants regeneration was MS medium without any phytohormone and culture medium for rootage was 1/2MS 3

7 +NAA0.2 mg/l Hygromycin-resistant carrot plant individuals had already been regenerated from transformed callus. We established and optimized the genetic transformation system of carrot mediated by Agrobacterium. Experiment showed that transformation efficiency was increased distinctly by pre-dried cultivation and vacuumizing for carrot callus. Difference of Agrobacterium concentration, infection time and co-cultivation time as well as adding As did not influence remarkably transformation efficiency of carrot callus. Agrobacterium concentration at OD ~0.8, infection time at 5~10 min and co-cultivation time at 3 d,all of these were helpful to increase transformation efficiency. Agrobacterium concentration at OD is in favor of restraining Agrobacterium growth and regeneration of carrot callus. Hygromycin and Carbenicillin restrain evidently carrot plants regenerated from callus. 3. GUS expression and molecular biology detections experiments showed as follows: GUS reported genes were transitorily expressed in transformed callus and were stably expressed in Hygromycin-resistant carrot plants. The results of PCR-Southern blotting indicated that the O 21 - O 14 -A 21 -HBcAg genes were integrated into the genomes of Hygromycin-resistant carrot plants. RT-PCR detection indicated that the O 21 - O 14 -A 21 -HBcAg genes 4

8 were normally transcribed in Hygromycin-resistant carrot plants. Key words: FMDV antigenic determinant; genetic transformation; carrot plants 5

9 略缩词 FMDV(foot-and-mouth disease virus) Hyg (hygromycin B) HPT (hygromycin phosphotransferase) Kan (kanamycin) Cb(Carbenicillin Na 2 ) Npt-II (neomycin phosphotransferase-ii) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 6-BA (6-benzylaminoppurine) NAA (naphthalene acetic acid) IAA(indole-3-acetic acid) AS (3,5-dimethoxy-4-hydroxy acetophenone) GUS (β-glucuronidase) CTAB (cetyltriethylammonium bromide) PCR (polymerase chain reaction) RT-PCR(reverse transcriptase-pcr) X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Hosphate) NBT(nitro-blue tetrazolium) 口蹄疫病毒潮霉素潮霉素磷酸转移酶卡那霉素羧苄青霉素新霉素磷酸转移酶 2,4- 二氯苯氧乙酸 6- 苄氨基嘌呤萘乙酸吲哚乙酸乙酰丁香酮 β- 葡糖醛酸糖苷酶十六烷基三甲基溴化铵聚合酶链式反应反转录聚合酶链式反应 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-d- 葡糖苷酸 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 - 磷酸二钠盐氯化氮蓝四唑 6

10 1. 前言 1.1 疫苗生产系统的的概述 1798 年是生物医学科学史上具有里程碑意义的一年, 人类发明了应用疫苗接种预防天花的新技术在接下来的两个世纪中, 疫苗的研制和应用取得了长足的发展目前, 疫苗已成为人类最成功最有效的防病手段之一 [1] 传统疫苗传统疫苗是指用细菌或病毒培养液或含毒组织制备的疫苗传统的疫苗主要有两大类 : 减毒活病原疫苗和灭活病原疫苗 [2] 减毒活病原疫苗 : 是指通过病原物的连续继代, 毒性会大大衰减, 使其对宿主动物丧失致病力但能使宿主产生免疫应答而制备的疫苗 [3] 此外, 从自然界筛选的自然弱毒株, 同样可以制备减毒疫苗减毒疫苗主要包括鼠化兔化鸡胚化及组织培养细胞驯化毒等, 主要是通过交叉培养致弱 [4] 减毒疫苗具有剂量小保护时间长效果较好价格低等多种优点但是这种疫苗研制周期长, 要使病毒繁殖很多代, 有时甚至需要上百代 ; 减毒疫苗是对于一种动物的减毒, 并不能保证对另一种动物的减毒 ; 经过传代后毒力有可能恢复以及一些病原微生物难于减毒 [5] 灭活病原疫苗 : 以含病原的材料通过物理或化学的方法处理, 使其丧失感染性或毒性而保持有良好的免疫原性而制备的疫苗 [6] 灭活疫苗, 目前主要是采用二乙烯亚胺 (BEI) 灭活剂灭活疫苗比减毒疫苗安全且周期短但灭活疫苗仍存在一些局限性, 效果差并且来源受限制, 化学灭活疫苗的制备需要组织培养大量病毒, 需要大量设备 ; 灭活疫苗产生的抗病原免疫幅度比活病毒感染动物产 7

11 生的抗体要弱 [7] 新型基因工程疫苗新型基因工程疫苗, 利用基因工程技术制备的疫苗随着医药基因工程的快速发展, 疫苗研究领域异常活跃, 不同基因工程疫苗相继出现主要包括重组亚单位疫苗活载体疫苗基因缺失苗及核酸疫苗等 [8] 重组亚单位疫苗是将激发机体免疫反应的病原体基因定位并克隆出相应基因, 重组到其他的生物体内, 在一定的表达系统 ( 如酵母 ) 中表达出具有免疫原性的产物, 而制备出专一性强安全的基因工程疫苗 [9] 重组亚单位疫苗克服了减毒疫苗灭活疫苗等传统疫苗的局限性, 特别是无需利用活病原, 只含有病原体的一种或几种抗原, 不含有病原体的其他遗传信息, 因而有安全性好稳定性强和无需灭活的优点 [10] 重组亚单位疫苗主要是在微生物和动物细胞内表达并应用生产的, 如细菌系统, 酵母系统和动物细胞系统但是其制备过程中费用高纯化技术复杂需注射使用可能导致交叉感染以及免疫期效短 [11] 活病毒载体疫苗是指将病原体目的基因片段构建在病毒载体 ( 弱毒或无毒株 ) 中, 重组后的病毒载体导入机体后可表达目的蛋白, 进而刺激机体产生特异性免疫反应 [12] 目前所用的病毒载体主要包括逆转录病毒载体腺病毒载体疱疹病毒载体痘病毒载体等活病毒载体疫苗具有稳定性好生产成本低可制多价疫苗等优点, 但重复应用于同一宿主可能诱发对载体的自身免疫 [13] 基因缺失苗 : 应用基因操作, 将病原菌或病毒中与致病性有关的基因序列除去或失活, 使之成为无毒株或弱毒株, 但仍能保持免疫原性而制备的疫苗这是使野毒株发生定向缺失性突变的活苗 8

12 这类疫苗保持了比较完全的免疫原性, 但因其缺少相关毒力基因, 对敏感动物致病力低 ; 另外由于缺少病原的某些相关成分, 相应免疫群体也没有对应的抗体, 但可通过一定的检测技术来识别免疫群和自然感染群 [14] 核酸疫苗, 又称 DNA 疫苗, 是近年发现并形成的一种新疫苗是将编码病原体抗原基因置于真核表达元件中, 并将其导入动物机体内, 通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白, 从而诱导宿主产生特异性的免疫应答 [15] Wolff 等 [16] 在实验中给小鼠的肌肉细胞注射未加任何化学试剂的质粒 DNA 时, 意外的发现肌肉细胞吸收了质粒并高水平地表达了外源基因 Tang 等 [17] 将表达人生长激素基因的质粒 DNA 导入小鼠表皮细胞, 在小鼠血中检测到了特异的抗体, 并且在给予加强剂量质粒后可使免疫反应增强此外, 在其他动物中也观察到了外源基因的表达而激发的免疫应答核酸疫苗具有安全免疫时间长生产成本低等优点核酸疫苗的最大优点是可以在同一时间, 通过质粒携带的不同编码的抗原基因进行免疫 [15] 1.2 转基因植物疫苗的研究概况随着分子生物学和植物遗传工程技术的快速发展和日趋成熟, 转基因植物正成为具有经济价值的药用蛋白疫苗等药物的生物反应器利用该途径生产的药物主要有 : 人血清蛋白表皮生长因子脑菲肽干扰素疫苗促红细胞生成素生长激素单克隆抗体等 [18-21] 这方面的研究逐渐成为植物基因工程研究的一个重要研究领域转基因植物疫苗的提出 1992 年, 美国研究人员 Arntzen 在泰国受到一位母亲喂食婴孩香蕉的启示, 萌发了研制植物性口服疫苗的想法 [22] 转基因植物 9

13 疫苗, 即利用转基因植物生产口服疫苗, 是指将病原体抗原基因导入植物使其在植物中表达, 人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质后, 产生对此抗原的免疫应答 [23] 利用转基因植物生产口服疫苗已成为医学和植物研究人员关注的热点和工作重心 [19,22] 由于该疫苗具有生产途径简单成本低使用安全方便易贮存可食性等优点 [24], 展现出极为诱人的应用开发价值, 因而越来越受到人们的青睐, 有关研究蓬勃发展起来转基因植物疫苗的优点和缺点利用转基因植物生产疫苗是植物基因工程和医学分子生物学快速发展相互交叉而产生的一个全新的研究领域 [19] 利用植物表达系统生产疫苗, 与现行利用微生物动物细胞及转基因动物等系统生产疫苗相比, 具有得天独厚的优势 [22-24] :(1) 植物细胞培养条件简单, 易于遗传操作 ; 植物细胞具有全能性, 能再生成完整的植株 (2) 由于植物属于真核生物, 具有真核蛋白的修饰机制, 可对表达产物进行正确的糖基化酰胺化磷酸化等翻译后加工, 使之具有良好的免疫原性和生物活性 (3) 生产成本低, 不需要昂贵的发酵底物培养基及专用生产设备, 所需要的条件仅仅是阳光水份土壤 ; 易进行大规模生产, 通过筛选获得的高表达量的转基因植株, 通过快速繁殖, 再在大田扩大生产 (4) 将含有不同病原基因的转基因植物通过传统的杂交方法进行重组, 从而能在转基因植物体中积累多个病原基因, 可获得多价疫苗 (5) 使用更安全植物细胞中不会含有潜在的动物或人类病毒, 且植物病毒不会感染人和动物因此安全性高 (6) 易储存和运输, 使用简便不像传统疫苗那样在运输保存过程中需要低温冷藏, 它只需在常温下就能长期稳定的储存于植物器官或组织 ; 而且在使用时不涉及注射器 10

14 的消毒与重复使用然而转基因植物生产口服疫苗也存在一些问题 [19,22] :(1) 疫苗在转基因植物中的表达量低目前已发展了多种策略增强抗原蛋白基因在转基因植物中的表达量改进表达调控系统, 可采用强启动子, 增强子或某些特定的调控序列, 人工将抗原基因改造成植物偏爱的密码子提高外源基因的表达量 (2) 转基因植物口服疫苗的免疫原性问题研究表明, 确有部分抗原经过消化系统会被消化降解针对这种情况, 可以通过在抗原基因旁加上修饰基因或吸附基因序列, 也可以通过将抗原组装成病毒颗粒样的有序结构来保护抗原不被迅速消化, 以增强抗消化作用 (3) 模式植物的选择问题烟草含有大量生物碱不能直接食用, 人类不能生食马铃薯, 熟食会部分破坏疫苗蛋白, 胡萝卜番茄香蕉是人用疫苗更实用的受体系统 (4) 口服免疫中的免疫耐受问题一个称为免疫耐受的研究现象显示 : 几次食用某些蛋白后, 可导致机体对这些蛋白的免疫应答停止必须研究口服疫苗有效剂量和服用时间表, 必须确定口服疫苗起刺激作用还是抑制作用转基因植物疫苗的研究进展上世纪 90 年代以来, 用转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗研究新策略被提出后, 以其独特的优越性迅猛发展, 其研究和应用开辟了植物生物技术的新天地转基因植物口服疫苗将成为今后生物制药的重要发展方向之一 [19,23] 第一例利用植物表达系统生产疫苗的报道是 Curtiss 和 Cardineau 在 1990 年以专利形式发表的 [25] 将变异链球菌表面蛋白抗原基因 (SpaA) 转入烟草获得表达, 用转基因烟草配入饲料免疫小鼠后, 诱导了抗 SpaA 的粘膜免疫应答, 并证明所诱导的抗体具 11

15 有生物活性 [26] 1992 年,Mason HS 等利用转基因植物生产乙型肝炎疫苗的研究结果, 提出了转基因植物生产疫苗的概念他们将 HBsAg 基因转入烟草, 转基因烟草 HBsAg 的表达水平占总可溶蛋白的 0.01%, 从转基因烟草的叶子中提取的 HBsAg 组成平均为 22 nm 的颗粒, 其浮力密度和免疫原性与人和酵母来源的 HBsAg 都相似, 表明在植物中成功的保持了蛋白质翻译后加工的特性转基因烟草的提取物免疫小鼠, 诱导产生了特异性抗体 1997 年美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准了 Arntzen 领导的研究小组进行首例转基因植物口服疫苗的临床试验 [27] 在 ⅠⅡ / 期的临床试验中, 健康的志愿人群口服含热敏肠毒素 B 亚单位 (LT-B) 免疫原的转基因马铃薯不同的转基因马铃薯样品中所含的免疫原经计算后确定了马铃薯的剂量每个志愿者从包括转基因和非转基因马铃薯的样品中随机取一份样品食用 11 个志愿者得到 50~100 g 生转基因马铃薯,3 个对照者得到 50 g 的生非转基因马铃薯试验前和食用后分别收集志愿者和对照者的血清和排泄物, 检测 LT-B 特异性抗体 11 个志愿者中有 10 人产生了抗 LT-B 特异性抗体, 而对照组未见一人有任何的 LT-B 特异性抗体, 说明转基因马铃薯生产的 LT-B 免疫原经人体口服后能抵抗或至少部分抵抗消化液的消化, 并可诱导人体的免疫应答目前, 已有多种病原基因在转基因植物中表达成功, 且在动物实验中获得了较好的结果其中用于人的病原基因主要有 : 乙肝表面抗原 (HBsAg) 基因大肠杆菌热敏肠毒素 B 亚单位 (LT-B) 基因霍乱弧菌毒素 B 亚单位 (CT-B) 基因诺沃克病毒外壳蛋白 (NVCP) 基因狂犬病病毒 G 蛋白基因人巨细胞病毒 (HCMV) 糖蛋白 12

16 B(UL55) 基因麻疹病素蛋白基因等用于动物的病原基因主要有 : 猪传染性胃肠炎病毒 S 糖蛋白 (TGEV-S) 基因口蹄疫病毒 VP1 蛋白 (FMDV-VP1) 基因兔出血病病毒 (RHDV)VP60 蛋白基因和犬细小病毒蛋白基因等 [28] 以上这些疫苗抗原基因所涉及的宿主植物主要有 : 烟草马铃薯拟南芥胡萝卜玉米苜蓿菠菜西红柿香蕉等, 其中, 以转化烟草和马铃薯最多 [28] 转基因植物疫苗的表达系统抗原基因必须通过适当的方法转移到植物中才能表达目前在转基因植物中表达疫苗抗原有两种系统 : 稳定整合表达系统和暂态表达系统 [29] 稳定整合表达系统将抗原基因构建在植物表达载体上, 利用农杆菌介导或基因枪等方法, 转化到植物细胞中并与植物基因组整合, 获得稳定表达的转基因植株 [30] 其优点是能产生大量的转基因植物后代, 能够产生多基因复合疫苗, 通过特异性启动子能使抗原基因在特定的组织器官中表达暂态表达系统该系统是用植物病毒作为载体, 将抗原基因插入病毒基因组中, 然后将重组病毒接种到植物叶片上, 抗原基因随病毒的复制得到高产量的表达产物目前用作载体的主要是烟草花叶病毒 (TMV), 豇豆花叶病毒 (CMPV) 和椰菜花叶病毒 (CaMV) 等 [31] 该系统又分为两种方式 : 一种是将抗原基因置于病毒基因组启动子控制之下, 另一种是将抗原基因与病毒外壳蛋白基因融合在一起 [32] 值得指出的是, 抗原基因融合于病毒外壳蛋白基因的表达方式更具免疫原性, 因为抗原组装成特殊形状 ( 如病毒颗粒状 ) 有更 13

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