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1 國立台東大學生命科學系所 碩士論文 證實小鼠動情週期子宮腔液中 zeta and epsilon Identification of the zeta and epsilon isoforms in mouse estrous uterine fluid 研究生 : 田莉雪撰指導老師 : 李炎博士中華民國九十七年十二月

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4 Identification of the zeta and epsilon isoforms in mouse estrous uterine fluid 作者 田莉雪 國立台東大學 生命科學系所 摘 要 在 小 鼠 的 動 情 週 期 時 子 宮 內 膜 細 胞 在 動 情 前 期 時 增 生 相 當 明顯 而動情期時會顯著性的死亡 從死去的子宮內膜細胞 所釋放的某些蛋白不僅有助於充當監測其死亡的生物指 標 或許可以經由這些蛋白的足跡 拼湊出子宮內膜死亡的 輪廓 而這些釋出的蛋白最有可能會存於子宮腔液中 因此 我 們 透 過 研 究 動 情 期 與 動 情 前 期 腔 液 中 明 顯 差 異 的 蛋 白 作 為 尋 找 這 些 指 標 蛋 白 的 方 法 利 用 SDS-PAGE 比 較 兩 個 不 同 時 期 子 宮 腔 液 的 蛋 白 形 態 進 而 找 到 一 個 約 30 kda 的 蛋 白 具有動情期腔液內之含量顯著大於動情前期的特性 將此蛋 白 帶 protein band 切 開 並 以 胰 蛋 白 酶 作 用 再 利 用 LC/MS/MS 分 析 經 由 Peptides 片 段 的 分 析 證 實 內 含 i

5 epsilon 與 zeta 免疫分析的結果證實 zeta 在動情期腔液內之含量遠大於動情前期 將動情期的子宮腔 液以分子篩 Sepharcyl S-200 進行分離後, 經由決定收集管 中 zeta 與 epsilon 的分佈形態並比對, 得 知它們呈現 dimer form 形式但卻無同收集管 (Co-fractionation) 之特性 而且 epsilon 並無法 與 zeta 抗體產生共同沈殿作用 總之 這個研究認 定, 透過動情期腔液中 zeta 量的分析, 可以充當小 鼠子宮內膜破壞的生物指標 (biomarker) 關鍵字 : endometrial damage epsilon zeta LC/MC/MS 生物指標 ii

6 Identification of the zeta and epsilon isoforms in mouse estrous uterine fluid Li-Hsueh Tien Abstract During the mouse estrous cycle, the endometrium prominently proliferates in proestrus and dramatically degenerates in estrus. Proteins released from the degenerating endometrial cells may not only serve as surrogate markers for endometrial damage potentially measurable in accessible luminal fluids, but the profiles of protein efflux may reflect the underlying mechanisms for exclusion of endometrial cells. To determine the potential biomarker of degenerating endometrial cells, we studied the differential proteins of uterine luminal fluid (ULF) between estrus and proestrus. In comparison of two patterns of ULF constituents resolved by SDS-PAGE, an approximately 30 kda proteins was predominately shown in estrous ULF distinct from proestrous ULF. The protein band from SDS-PAGE was subjected to tryptic digestion, followed by LC/MS/MS sequences analysis and identified as epsilon and zeta from peptide fragments analysis. Immunoblot analysis revealed that zeta forms were specifically increased in ULF at estrus distinct from proestrus. After separation of mouse estrous ULF from Sephacryl S-200 chromatography, two isoforms were predicted to be a dimmer form, but not co-fractionated in the gel filtration fractions. In addition, the epsilon was not co-immunoprecipitated with anti zeta antibody from the same fraction. Taken together, this study has determined that the analysis of zeta levels from the estrous ULF could be useful as a biomarker for mouse endometrial damage. Keywords : endometrial damage epsilon zeta LC/MC/MS biomarker iii

7 目 錄 中文摘要 i Abstract iii 目 錄...iv 表 目 錄 vii 圖 目 錄 viii 第一章 緒 論...1 第一節 前 第二節 實驗動機 3 第二章 言...1 文獻回顧...4 第一節 子宮之構造與生理變化...4 第二節 動情素在子宮的作用 7 第三節 動情週期 9 第四節 細胞凋亡 apoptosis 15 第五節 s 蛋白質 18 iv

8 第六節 第三章 蛋白質表現...20 實驗材料與方法...22 第一節 實驗材料...22 一 藥品與材料...22 二 動 第二節 物...23 實驗方法 23 一 蛋白質純化...23 一 還原性電泳分析...23 二 分子篩膠體分析法...25 三 免疫沈澱 zeta...25 四 西方墨點法...26 二 epsilon 基因選殖...26 一 epsilon 全長基因製備...26 二 epsilon 片段基因製備...29 三 epsilon Protein 的表現 四 DNA 定序...34 五 Proteomics...34 第四章 實驗結果...35 v

9 第一節 由子宮腔液中尋找動情前期與動情期間具差異的蛋 白 35 第二節 蛋白質定序 37 第三節 zeta 和 epsilon 具有動情前期與動情期表現 差異的特性...40 第四節 zeta 和 epsilon isoform 的特性...42 一 分子篩分析的結果...42 二 免疫沈澱的分析結果...44 第五節 部分 epsilon 蛋白的表現...46 一 epsilon 基因選殖與部分 epsilon 蛋白的表現...46 第五章 討論...51 參 考 文 獻...56 vi

10 表 目 錄 表一 zeta 引子對設計表 全長...27 表二 zeta 引子對設計表 片段...30 表三 限制酶 EcoRI BamHI 及其切位...32 表四 Mascot 軟體分析結果...38 表五 BLAST 程式分析比對結果...39 vii

11 圖 目 錄 圖一 小鼠子宮構造圖...6 圖二 小鼠動情週期...10 圖三 小鼠動情週期的不同時段 血液中雌二醇 E2 與助孕酮 P 的濃度圖...13 圖四 小鼠動情週期子宮抹片圖...14 圖五 細胞凋亡的三種路徑圖...17 圖六 蛋白質參與細胞凋亡機制途徑...19 圖七 pgem-t 質體之結構圖...28 圖八 pmal-2x 質體之結構圖...31 圖九 動情前期與動情期子宮分泌液 SDS-PAGE分析...36 圖十 動情前期與動情期 zeta 和 epsilon西方墨漬法分 析...41 圖十一 zeta 和 epsilon 分子篩分析 偶數管...43 圖十二 zeta 免疫沈澱物之西方墨漬法分析...45 圖十三 epsilon PCR 產物基因片段洋菜膠電泳表現..47 圖十四 epsilon 蛋白表現以 SDS-PAGE 分析...49 圖十五 zeta 和 epsilon 分子篩分析 21-31管...50 viii

12 第一章 緒論 第一節 前言 動情期 estrus 是雌性哺乳動物 人類除外 確保排卵時期與 雄性交配的一種策略 此時雌性更能吸引雄性接受異性示好並主動與 其交往 依 Heape 所述 雌性性需求的特殊時期 Heap W, 1900 第一個時期為動情前期 proestrus 動物會出現發情症狀 接下來為 動情期 estrus 雌性哺乳動物會與雄性動物交配 而若未能受孕則 會進入一個短的恢復期稱為動情後期 diestrus 將因受動情期改變 的生殖道恢復到原來的狀況 再來是一個較長的時期稱為休止期 但 會因動物不同而有異 以白鼠而言 其為多次動情週期的哺乳動物 卵巢週期可以持續整年且不需神經刺激 每 4 天至 5 天自然排卵一次 Long and Evans, 1922 哺乳動物的子宮內膜會隨著動情週期產生劇烈的改變 這種週期 1

13 性的改變是因為組成細胞週期性的增生與死亡交替的結果 此過程會受到卵巢分泌的激素 動情素 與 黃體素 的影響 Quarmby et al., 1984; Finn et al., 1981, 在成熟齧齒期動物的動情前期 (proestrus), 因動情激素的刺激而使子宮上皮細胞大量分泌而造成子宮腔液 (uterine fluid) 的累積, 此子宮液中含有一些蛋白質成份, 且此些蛋白質不同於血漿 (plasma) 蛋白 Alber et al., 1961, 但其子宮分泌性之蛋白質的構造及功能所知有限 本研究是利用 SDS-PAGE 分析小鼠動情期與動情前期的子宮腔液蛋白, 並比對出動情期表現量大於動情前期的蛋白 在此我們找出一個約 30 kda 的蛋白帶 (protein band) 符合此種特性, 經証實內含 epsilon 與 zeta, 而且 zeta 具表現量的差異 同時我們也証實這兩個蛋白在動情期的子宮腔液中不會形成 heterodimer form, 但可成為小鼠子宮內膜細胞死亡的生物指標分子 2

14 第二節 實驗動機 根據之前研究結果顯示動情素 estrogen 會誘發子宮上皮細胞 (endometrial epithelium)增生 Martin et al., 1976 而動情素 的消退會導致其細胞凋亡 Lai et al., 2000 類似上述的動情素 濃度變化 也發生在小鼠的動情週期 Walmer et al., 1992 在動 情前期血液中的動情素濃度逐漸升高 子宮的上皮細胞大量地增生 而在動情期時 血液中的動情素濃度逐漸減少 導致子宮上皮細胞死 亡相當明顯 Vinatier and Subtil, 1996; Sato et al., 1997 而成熟的小鼠在動情前期與動情期時 子宮上皮細胞大量的分泌而造 成子宮腔液的累積 Vinatier,Dufour and Subtil, 1996 在動情 期時由於大量的子宮上皮細胞死亡而脫落 而這些死亡細胞所釋出的 子宮腔液蛋白會進入子宮腔液中 因此如何在子宮腔液中找出這些蛋 白便是一大課題 此外 至今發生在子宮內膜細胞死亡的分子機制所 知甚少 然而透過偵測這些細胞死亡後釋出的蛋白 不但可以找到一 些可以監測子宮內膜死亡的生物指標 (biomarker) 或許經由瞭解這 些蛋白的足跡 拼湊出子宮內膜死亡的輪廓 3

15 第二章 文獻回顧 第一節 子宮之構造與生理變化 就人類子宮而言其構造為一個空腔組織 子宮可分爲底 體 峽 及頸四部分 一 子宮底 兩側輸卵管入口以上的部分 二 子宮體 介於子宮底與峽部之間 前後略扁 又分爲前後兩面 左右兩緣 前 與膀胱 後與直腸相鄰 三 子宮峽部是體與頸之間的狹窄部 長約 1 釐米 在妊娠期間子宮峽部逐漸擴展 拉長 四 子宮頸占子宮的下 1/3 長約 2-4 釐米 呈圓柱狀 插入陰道 而子宮體的構造其分為三層 最外層為子宮外膜 perimetrium 覆蓋於子宮外壁的外膜 第二層為子宮肌 myometrium 主要由一層 厚厚的平滑肌所構成 最內層則為子宮內膜 endometrium 其為子 宮內壁的黏膜 屬於上皮組織含有豐富的腺體及基層細胞 隨著卵巢 週期而有所變化 其中內膜層又稱粘膜層 內膜由上皮和固有膜構成 4

16 上皮是單層柱狀上皮, 由兩種細胞構成 : 一種是有纖毛的細胞 ; 一種無纖毛, 可以分泌粘液 固有膜爲較密的結締組織構成, 含有各種細胞成分 血管 淋巴管和神經 此外, 子宮內膜分爲基底層和功能層, 功能層又分爲緻密層和海綿層 表面部分是功能層, 約占子宮內膜厚度的 2/3, 受卵巢激素的影響, 呈週期性變化並剝脫, 産生月經 靠近子宮肌層的子宮內膜, 稱爲基底層, 無周期性變化 小鼠子宮構造, 具有 Y 字型的子宮, 分成側角和內側子宮體 子宮頸有一體腔, 子宮頸前部則有二個體腔 如圖 ( 一 ) 雌鼠發情的表徵為陰門張開, 以及陰道表皮黏膜抹片呈現角化現象 生育力在 75 日和 300 日齡間達到最高峰 小鼠為多次發情動物 (polyestrous) 而且整年皆可繁衍 平均發情週期為 4-5 天, 平均夜晚發情期為 12 個小時 小鼠發情後自發排卵 8 至 11 小時 產後發情約在分娩後 24 小時內發生 排卵發生約介於產後 12 至 18 個鐘頭間 在整窩仔鼠斷乳前, 不會發情 ( 乳泌期間不會發情 ) 為縮短離乳間距, 允許產後發情 一般陰道若產生陰道栓子即可確定小鼠交配成功 栓子從子宮頸至陰脣填滿整個陰道, 一般持續約 小時, 可持續至 48 小時 www1.ndmctsgh.edu.tw/animal/ch/ 周網 / 實驗用小鼠解剖生理 5

17 Female Anatomy Ovary Fallopian Tube Uterus Urinary Bladder Urethra 圖一小鼠子宮構造圖 From:www3.niaid.nih.gov/.../step5Urogenital.htm 6

18 第二節 動情素在子宮的作用 子宮內膜在雌性動物生殖年齡時會隨著一定的週期而有所改變 一般認為它是受到卵巢所分泌的激素 動情素 β-estradiol E2 以及黃體素 progesterone 所影響 而子宮內膜細胞的增生被認為 與這兩種卵巢類固醇激素有關 其中動情素 Estrogens 是一群脊椎動物所有的固醇類荷爾蒙 是一種主要的荷爾蒙 其在卵巢與胎盤中合成 具有對於生長於維持 雌性第二性徵與雌性生殖器官發育的功能 Martin et al., 1995 也有研究指出動情素亦會促進乳癌細胞的生長與擴增 此外 動情素 是子宮主要的增生因子 mitogen 然而它並不會直接刺激細胞的增 生 目前已知動情素刺激細胞增長的機制是經由刺激基質細胞分泌生 長因子 進而自泌 autocrine 或旁泌 paracrine 作用影響其他 子宮內膜細胞的成長 Cooke et al., 1997 依大白鼠而言 其子宮主要構造含內膜上皮細胞 edometrial epithelial cells 基層細胞 stromal cells 與肌層細胞 7

19 (myometrial cells) 其動情素的作用所引發子宮的反應相當複雜, 在未成熟子宮會造成不同形式細胞的增殖 (proliferation) 而動情素引起子宮細胞增殖的機轉不適合以 in vitro 模式研究, 這矛盾可能是分離的細胞缺乏細胞之間的交互作用所造成的 黃, 1999 因此將子宮或陰道的上皮細胞培養或將其植入腎被膜 (renalcapsule) 內, 加入動情素後並沒發現細胞增生, 若在子宮或陰道上皮細胞培養時加入基質細胞, 則動情素會促進上皮細胞增生 Uchima et al., 1986 由此可知上皮細胞與基質細胞的相互作用可能是維持動情素的作用與子宮分化所必需 因動情激素的刺激, 會造成子宮腔液 (uterine fluid) 的累積, 其中含有一些蛋白質成份但構造與功能所知有限 8

20 第三節 動情週期 對於在雌性哺乳動物的動情週期 estrous cycle 和人類月經週 期 menstrual cycle 中 子宮內膜層會隨體內卵巢激素之週期性變 化 進行著周而復始的有絲分裂 分化及細胞死亡 Vinatier et al., 1996;Andres et al., 1996 動物的動情週期其荷爾蒙變化與人類月 經期相似 但子宮生長卻有別於月經週期 其子宮的生長也有其週期 性的消長 卻未有子宮內膜剝離時的經期故無月經的形成 而子宮上 皮細胞增生與死亡的變化卻相似於人類的子宮 West et al., 1978 以小鼠為例 其動情週期主要分為 proestrus estrus metestrus diestrus 四個階段 如圖 二 所示 在發情前期(proestrus) 陰 道抹片有含核上皮細胞以及一些角化上皮細胞 發情時角化上皮細胞 佔大多數 稍後的發情後期(metestrus)和乏情期(diestrus) 角化現 象減低 且白血球增多 www1.ndmctsgh.edu.tw/animal/ch/周網/實 驗用小鼠解剖生理 9

21 圖二 依 Heape 所述哺乳動物 雌性性需求的特殊時期, 第一個時期稱為動情前期 (proestrus), 接下來為動情期 (estrus), 若未能受孕則會進入一個短的恢復期稱為動情後期 (diestrus) 此為小鼠動情週期 10

22 由於血液中動情素的量會隨生殖週期 (reproductive cycle) 的各個時段而波動 (fluctuation), 依據 Walmer(1992) 的研究, 以放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 測量小白鼠動情週期期間, 血液中卵巢類固醇激素的含量得知 : 動情週期時血液中雌二醇 (estradiol) 與助孕酮 (progesterone) 分別會在 pg/ml 及 2-16 ng/ml 的濃度之間波動, 兩者均具兩個起伏的波形 如圖 ( 三 ) 從圖中得知由休止期 (diestrus) 後段延續至動情期 (estrus) 末段, 雌二醇 (estradiol) 出現一個寬且振幅較大的波型, 最大的濃度出現在動情前期 (proestrus), 另一個較小的波形則出現在動情後期 (metestrus) 後段 而助孕酮 (progesterone) 的濃度在動情期前段具有一個小波峰, 另一個寬且振幅較大的波型, 出現在動情後期與休止期之間 因此動情週期中卵巢激素的分泌與濾泡的生長, 黃體之生成過程有著秘切關係 而子宮上皮細胞在 proestrus 階段, 體內雌性素含量最高, 死亡程度最低且可見到細胞增生現象最顯著 於 estrus 階段時, 雌激素最低, 子宮內膜上皮細胞未見增生的情形, 而細胞死亡程度最高, 緊接著動情週期進入 metestrus 與 diestrus, 此時雌激素濃度又開始上升, 同時刺激上皮細胞的生長 Sato et al., 1997 子宮的上皮細胞為單層柱狀上皮, 而陰道上皮組織則為複層鱗狀 11

23 上皮 雌二醇 (estradiol) 除了可促進陰道上皮細胞增生外, 亦可使陰道上皮細胞進行分層狀態 (stratification) 或稱 (squamous differentiation) 及角質化 (cornification), 但在雌二醇 (estradiol) 作用下子宮上皮細胞則無角質化與分層狀態的現象出現 Carlborg, 1966 在雌性動物的動情週期中, 陰道上皮細胞也會進行週期性的增生與凋亡的現象 在 proestrus 及 estrus 時期, 陰道上皮的細胞層數有 層, 同時最外層有角質層出現 (cornified layer) Proestrus 時期, 陰道上皮細胞的 mitotic index 最低, 而進入 estrus 時期陰道上皮細胞的 mitotic index 最高, 此時有些凋亡的細胞會出現在陰道的 superficial layer 進入 metestrus 時期凋亡的細胞數目最多, 並且出現在此時有些凋亡的細胞數目最多, 並且出現於陰道 basal layer, 最外層的角質層會脫落到管腔內 而陰道的上皮細胞層數減少, 於 diestrus 時期上皮細胞層萎縮後僅剩 4-5 層 這些不同時期的時間長短是可以經由陰道抹片來確認 (Harmtma, 1944;Mandl, 1951), 如圖 ( 四 ) 所示 12

24 圖三 小鼠動情週期的不同時段, 血液中雌二醇 (E2) 與助孕酮 (P) 的濃度圖 E2 表示 pg/ml,(p) 表示 ng/ml E,early; L,late:Pro,proestrus:Est,estrus;Di,diestrus 三角實心代表雌二醇 (E2), 四角實心代表 (P) 參考自 Walmer et al.,

25 a b c d 圖四 上皮細胞的增生與凋亡會隨著動情週期而有所變化, 在動情前期的抹片特徵是出現大量具有圓核的上皮細胞, 動情期的特徵是大量出現角質化之鱗狀上皮細胞 此角質化的細胞核並不明顯, 形狀也不規則, 在動情後期抹片上大出現大量的白血球, 休止期時抹片上具有黏稠物, 細胞數目大量減少 參考自黃,

26 第四節 細胞凋亡 apoptosis 細胞凋亡即 apoptosis apo-ptosis 主要是強調此過程是一種 自然的生理學過程 細胞凋亡是主動且經由基因決定的自動結束生命 的過程 其受到遺傳機制決定的程序性調控 因此也被稱為程序性細 胞死亡 programmed cell death PCD 細胞凋亡是有機體正常調節機制之一 為主動的生理反應 為一 種主動的由基因決定的細胞自我破壞的過程 且不會引起發炎反應 Hengartner, 2000 目前已知誘發細胞凋亡的途徑有以下三種 第 一為經由細胞表面死亡受體的外在路徑 第二為藉由粒腺體調控的內 在路徑 第三為近幾年發現的內質網路徑 其中第一及第二種途徑到 最後都會活化 capspases 而引起細胞凋亡反應如圖 五 而 capspases cysteinyl aspartate-specific proteinases 為一群 能分解細胞內重要結構如 DNA 與細胞結構體之水解酶總稱 在細胞凋 亡中扮演起起始與執行的角色 其中細胞凋亡反應相關的一群 包括 capspase-2,-3,-6,-7,-8,-9,-10 Zimmermann et al., 2001; 15

27 Nicholson and Thornberry, 1997 然 capspase-8 在死亡受體調控路徑中扮演活化角色, 可直接活化其下游其他的 capspases, 進而調控細胞凋亡的機制 Herr and Debatin, 2001 此外, 與細胞凋亡反應相關的因子, 例如 : Bcl 家族也是促進或抑制細胞凋亡的重要調控者 包括 Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2),bax,bcl-xl,bad 等 如 :Bcl-2 是此家族中第一個由 B 細胞淋巴瘤中被發現, 可阻斷細胞凋亡引發腫瘤, 是因其家族成員均具 BH( Bcl homology ) 結構, 透過 BH 四個 domain 的排列組合, 而被認為是一種原癌基因 另外 Bcl-2 Bcl-xl Mcl-1 Nr13 和 A1 等, 皆是凋亡的抑制者 還有一些基因, 如 Bad, Bak, Bax, Bik, Bid 和 Bcl-Xs 等, 可以引起細胞凋亡, 並藉由彼此間相互結合 作用與協調, 以作為決定是否進行細胞凋亡的重要關鍵 Borner et al., 1994;Chittenden et al., 1995;Reed,

28 圖五 細胞凋亡的三種路徑 包括細胞表面死亡受體的外在路徑 粒腺體調控的內在路徑 內質網路徑 From: 17

29 第五節 s 蛋白質 約莫在 30 年以前 Moore and Perez 在母牛的腦蛋白中利用二 維電泳發現了 並命名之 Moore and Perez, s 蛋白質在所有的有機體或細胞中都可以發現其蹤跡 家族成員 其分子量大約在 30 kda 左右 可溶性 由兩個主要組成份 ε 和 non-ε 形成 dimeric 蛋白 Ferl et al., s 蛋白質 在良好細胞中是以 dimeric 的形式存在 目前已知自然界中在哺乳動 物有 7 種 isoform β ε γ η τ ζ 與σ Boston et al., 1982; Ichimura et al., 蛋白質可以結合多元細胞蛋白 且亦有超過 100 種以上 的組成蛋白會因 之影響而死亡 而這些組成蛋白是因 蛋白質於其細胞磷酸化 Yaffe et al., 1997; Rittinger et al., 1999 影響 對於 蛋白質連結蛋白質的數量及其差異性推想而知其 參與許多不同的細胞變化 包括有訊息的傳達 細胞週期的調控 細 胞凋亡 壓力反應 細胞架構 致癌因子轉形 Van et al.,

30 儘管對於 在抗細胞凋亡的功能及機制仍不清楚, 但對於抗細胞凋亡訊息的初細胞凋亡分子如 Bad, FKHRL1, ASK1, and Nur77 是有牽連的 Won et al., 2003 研究指出目前已有論點證實 蛋白質參與細胞凋亡的途徑, 圖 ( 六 ) 為 蛋白質在細胞凋亡機制中參與的角色 Rosenquist, 2003 圖六. 這是完整的細胞凋亡機制途徑, 在圖中可以看到細胞磷酸化過程中 蛋白質的參與 它在細胞凋亡機制中扮演著重要的抑制角色 19

31 第六節 蛋白質表現 蛋白質體學是一種研究蛋白質表現量不同的方法 藉由細胞或組 織在不同環境下的蛋白質表現差異 來研究生物如何應付環境 如何 抵抗刺激 所以我們運用基因選殖 抽取質體 基因轉形 gene transformation 等蛋白質體學的方法來呈現 基因選殖部份所利用的藍白選殖 其所謂即是在 agar plate 加入 X-gal 其全名是 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside 是 beta-galactosidase 這個酵素的反應受質 當 beta-galactosidase 水解 X-gal 後會造成藍色的沉澱物出現 因此通常在做分子選殖時 加入的 IPTG 會和 laci 結合 因而造成 laci 這個抑制物 (repressor)的結構改變 laci 進而無法抑制 lacz 的表現 是因 lacz 基因表現的產物就是 beta-galactosidase 所以當 lacz 不受 到抑制而能表現出 beta-galactosidase 後 就會分解 X-gal 而產生 藍色的菌落 故在挑選轉殖質體的菌株時 原來的菌株本身不具有 lacz 基因 可以利用轉殖的質體上帶有的 lacz 基因來分解 X-gal 所以 20

32 在培養基上加入 IPTG 抑制掉 laci 後, 就可以產生藍色的菌落 如果當插入的基因破壞掉質體上原來那部份 lacz 的轉錄的序列 (reading frame) 則會使的 lacz 的基因受到破壞, 無法做出互補的 lacz 產物, 則無法分解 X-gal, 形成白色的菌落 等待菌體長成從中挑選數個白色菌落藉由 PCR 來鑑定菌體內 DNA 是否正確 限制酶處理 (Restriction enzyme digestion) 是利用所謂的限制酶 (restriction enzyme), 而其是在一些對噬菌體有抗性的細菌中所分離出的 DNase, 因為它會切斷侵入的噬菌體 DNA, 限制噬菌體的生長, 所以稱之為 限制酵素 它之所以不會切斷細菌自己的 DNA, 是因為細菌 DNA 上的切割位置已被甲基化 因為它只切在特定的序列附近, 而不同的細菌中可純畫出具不同專一性的限制酵素 所以在有限制酶切位的引子, 在經限制酶處理後接合也經過限制酶處理的質體 其因目的基因和載體 ( 質體 ) 都是用同樣兩種限制酶性內切酶酶切時, 再將二者連接起來, 那麼外源 DNA 將按一定方向和載體 ( 質體 ) 分子重組, 亦所謂的位向選殖 (Direction Cloning) 鄂征,

33 第三章 實驗材料與方法 第一節 實驗材料 一 藥品與材料 抗小鼠 epsilon 與 zeta 的兔子抗體購自 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA). Goat anti-rabbit IGG conjugated HRP Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)與 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)購自 Sigma 公司(Sigma, St. Louis, MO, USA) Sephacryl S-200 Amersham Hybond ECL 與 Ameraham ECL Western Blotting System 購自 GE Healthcare 同時所有使用的藥品均屬試藥級 (reagent grade) 22

34 二 動物 成熟的 CD-1 (ICR)小鼠 (六週大)購自樂斯科生物科技公司 小 鼠被養在光照 12 小時 黑暗 12 小時的動物房中 並依實驗動物的 照顧準則飼養 動情期與動情前期是以陰道抹片試驗來判定 已決定 時期的小鼠隨後被犧牲並抽其子宮腔液 然後將子宮腔液加入 EDTA 至 5 mm 儲存至 -70 後待用 第二節 實驗方法 一 蛋白質純化 一 還原性電泳分析法 SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate 採用 Laemmli 的電泳系統 所使用的試劑如下 Acrylamide slab gel Running slab gel 12% Acrylamide mix 29 % acrylamide 1% bisacrylamide

35 M Tris-HCL(pH 8.8) 0.1% SDS 0.1% ammonium persulfate 0.04% TEMED Stacking gel 6% Acrylamide mix(29% acrylamide,1% bisacrylamide) M Tris-HCL(pH 8.8) 0.1% SDS 0.1% ammonium persulfate 0.1% TEMED 5X sample buffur:tris g SDS 0.20 g DTT 0.77g Glycerol 5ml Bromophenolblue 10 mg 5X running buffer:tris 60.6 g SDS 20 g Glycine g ddh2 O.4L,pH 8.3 方法 : 將樣品溶於 running buffur 中然後進行電泳分析 在 stacking gel 時電壓固定為 90 伏特, 電流設定為做大值, 時間 60 分鐘 進入 running gel 時, 電壓固定為 100 伏特 電泳結束後, 可依不同的實驗目的進行染色, 或進行西方墨點法 (Western blotting) 24

36 ( 二 ) 分子篩膠體層析法將 Sepharcyl S-200 膠粒填充至 16 mm 100 cm 的管柱 (column) 中, 隨後以內含 2 mm EDTA 的 PBS 清洗平衡 再將小鼠動情期的子宮分泌液置入管柱內, 流速控制在每小時 6 ml, 每支收集管 (fraction) 收集 3.6 ml 溶液 收集完成後, 每支收集管分別量測其 280 nm 波長的吸光值, 將含有蛋白收集透析 冷凍後, 乾燥濃縮, 並置於 -20 保存 另外以相同條件下, 將 4 個標準品蛋白樣本 包含 lysozyme ( 19 kda) ovalbumin ( 45 kda) BSA ( 66 kda) 與 Aldolase (158 kda) 同時置入管柱中, 然後量測各收集管的 280 nm 的吸光值, 將各吸收峰的收集管作為標準品分子量的位置 ( 三 ) 免疫沈澱 zeta 取第 26 支收集管中的 1/4 體積的蛋白溶於 50 μl 的 PBS, 隨後以 rpm 離心 5 分鐘 取上清液後, 再加入 5 μg 的 anti-mouse zeta 兔子抗體 (25 μl), 均勻混合後在室溫反應 1 小時 隨後再加入 20 μl 的 protein A (Calbiochem, Nottingham, UK) 混合均勻, 在室溫反應 1 小時, 然後離下沈殿物 將上清液除去後, 以 PBS 清洗沈殿物四次, 然後再將沈殿物以西方墨 25

37 漬法分析鑑定 ( 四 ) 西方墨點法(Western blotting) 利用 Amersham 公司所出品的 ECL 系統進行西方墨點法 將電泳後的 SDS-PAGE 取下膠進行蛋白轉漬並平鋪在浸濕的 Whatman 3M 濾紙上, 將膠片轉漬至 Hybond ECL 膜上裝入 Transfer Holder 置入 Electrotransfer buffer 以 100 伏特 90 分鐘進行轉漬, 先以含 5% 的脫脂奶粉 PBS 溶液 blocking 過夜, 分別以 Anti-mouse zeta 或 Anti-mouse epsilon 的兔子抗體的作用一小時, 稀釋比例皆為千分之一 隨後再以 PBS 含 0.1% 的 Tween 20 清洗四次, 每次至少 20 分鐘 再以 Goat anti-rabbit IGG conjugated HRP 含稀釋比例為 2 千分之一的 PBS 溶液作用一小時 再重複上述的清洗步驟, 然後利用 ECL 冷光偵測系統呈像 二 epsilon 基因選殖 ( 一 ) epsilon 全長基因製備 1. cdnas 由黃老師實驗室經抽取小鼠子宮腔液的 RNA 後經由反 轉錄酶作用後所提供 26

38 根據 Entrez Nucleotide database 中含全長 epsilon cdna 基因序列來設計 primer 對 以小白鼠完整 cdna sample 當作 template 經由(Polymerase Chain Reaction PCR)大量複製 epsilon 基因 完成後 PCR 產物經由洋菜膠体電泳 (agarose gel electrophoresis)以分子量分離 DNA 跑完電泳以後 洋菜膠體浸泡 於溴化乙錠 Ethidium bromide EtBr 之中 反應後膠體在紫外光 下呈色確定 epsilon 有被大量複製 PCR 產物純化法(PCR product purification) 進行 DNA 純化得到 epsilon 全長基 因 (853 bps) (表一) zeta 引子對設計表(全長) 5 'ctgccggagccgctgccgc 3 ' 5' cttccagggggagggggga 3 ' 2.Ligation 抽取純化好的 epsilon sample 及 pgemt plasmid 混合 後以 T4 DNA ligase 進行接合反應(Ligation reaction) ( epsilon sample 5μ) (plasmid sample 3μ) (buffer 1μ) (T4 27

39 DNA ligase 1μ) 置於 16, 反應 4 小時 其中 pgemt plasmid 因其質體上有一段 sequence 可使 colonies 產生淡藍色, 所以將 pgemt 放入後會改變 sequence, 失去藍色的基因 相反的如果 self ligation 則會有藍色表現, 因此要挑 plate 上白色的 colony, 應該就是有 insert 的 plasmid 圖七 pgem-t 質體之結構圖 From: /bec2004/Lessons/Lesson08-0.htm 28

40 3.Transformation 拿取勝任細胞 (competent cell:e. cloi) 與接合完成的 DNA 在低溫下進行轉形 (transformation), 完成基因之建構 (competent cell)100μ,dna sample 7μ) 置於冰浴 45 分鐘 4.Clone selection PCR Transformation 完成之 competent cell(e. coli) 放置於 agar plate( 其中加入 Ampicillin IPTG X-gal), 藉由藍白選殖進行篩選 5. DNA 定序根據 SDS-Page 結果從中挑選正確表現 protein 的菌體, 接菌至新的 LB agar, 送至生技公司作基因鑑定, 在確定菌體內 DNA 無誤後即完成 epsilon 全長基因製備 ( 二 ) 片段基因製備 1. cdnas 一樣利用由黃老師實驗室經抽取小鼠子宮腔液的 RNA 後經由反轉錄酶作用後所提供 設計 primer 具有限制酶切位 ( 表二 ), 來建構 epsilon 片段基因 以先前純化好的

41 epsilon 全長基因當 template 經由 PCR 複製後以洋菜膠体電泳作 DNA 分離 完成後膠體浸泡於溴化乙錠(EtBr 之中 反應後膠體在紫 外光下呈色確定 epsilon 片段 DNA 有被大量複製 確定無誤 後再次用 PCR 產物純化法(PCR product purification) 進行 DNA 純 化得到 epsilon 片段基因 (502 bps) (表二) zeta 引子對設計表(片段) 5 'ctcgaattcgcagctaacactggcgag 3 ' 5 'ctcggatccggggtagtcagagatggttc 3 ' 2. Restriction enzyme digestion 純化完成的 epsilon 片段基因 sample 用 EcoRI BamHI 酵素進行限制脢處理(Restriction enzyme digestion)反應 1 小時後 用 PCR 產物純化法(PCR product purification)純化出乾淨的 epsilon 片段基因 30

42 3. Plasmid: plasmid (PMAL/2X, 限制酶 EcoRI BamHI) Plasmid (PMAL/2X( 圖八 )) 用 EcoRI BamHI 酵素進行限制脢處理, 表 ( 三 ) 為所用的限制酶及其切位 反應 Over night 打開限制脢切位, 完成後也用 PCR product purification 純化 圖八 pmal-2x 質體之結構圖 From: 31

43 表三 為限制酶 EcoRI BamHI 及其切位 酵素名稱 EcoRI 來源 辯識序列 切法 5'GAATTC 5'---G 3'CTTAAG 3'---CTTAA 5'GGATCC 5'---G AATTC---3' Escherichia coli Bacillus G---5' GATCC---3' BamHI amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5' 4.Ligation 抽取純化好的 epsilon sample 及 plasmid sample 混 合後以 T4 DNA ligase 進行接合反應(Ligation reaction) ( epsilon sample 5μ) (plasmid sample 3μ) (buffer 1μ) (T4 DNA ligase 1μ)置於 16 反應 4 小時 5.Transformation 拿取勝任細胞 competent cell E. coli 與接合完成的 DNA 在 低溫下進行轉形(transformation) 完成基因之建構 competent cell E. coli 100μ DNA sample 6. Clony selection PCR 32 7μ 條件為置於 冰浴 45 分鐘

44 Trans-fection 完成之 competent cell(e. coli) 放置於 LB agar(ampicillin) 塗乾, 藉由 Ampicillin 進行篩選 等待菌體長成從 LB agar 中挑選數個 clony 藉由 PCR 來鑑定菌體內 DNA 是否正確 ( 三 ) epsilon Protein 的表現根據 PCR selection 結果從中選擇 DNA 位置正確的菌體, 在 LB broth( Ampicillin ) 中培養 Over night, 後加入 (isopropyl-β- D-galactopyranoside IPTG), 反應 4 小時誘導 protein 表現 之後便可開始破菌純化 protein 破菌純化 protein 步驟如下 : 1. 菌液以 5,000 rmp 離心 5 分鐘去除上清液留下菌落 2. 菌落加入溶菌酶 (Lysozyme) 反應 1 小時後, 用低溫 -80 凍結再以 37 回溫重複 3 次 3. 菌液再以 5,000 rmp 離心 5 分鐘後抽取上清液的 protein 4. 取得 epsilon 表現的 protein, 用 SDS-PAGE 以分子量作 protein 分離 ( 電壓 100 伏特 120 分鐘 ) 完成後 PAGE 以 coomassie blue 處理後以水退去染劑, 觀看 protein 所表現的位 33

45 置是否正確 ( 四 ) DNA 定序根據 SDS-Page 結果從中挑選正確表現 protein 的菌體, 接菌至新的 LB agar, 送至生技公司作基因鑑定, 在確定菌體內 DNA 無誤後即完成 epsilon 基因建構 ( 五 )Proteomics 為了確定小白鼠子宮分泌液中是否有 zeta 的存在, 用小白鼠子宮分泌液作為 sample 經由 SDS-PAGE 以分子量分離 protein,page 以 coomassie blue 處理後以水退去染劑, 在 zeta 位置 (30 KDa) 割下蛋白帶 (protein band) 經由 proteomics 的鑑定, 是送至明欣生物技術公司作 proteomics 鑑定 Proteomics 鑑定是將此具有差異性的蛋白帶, 經胰蛋白酶作用後, 將其溶出的 peptides 進行 LC/MS/MS 分析 所得的數據經由 Mascot 軟體分析, 此外再利用 Blast 程式比對序列相同或類似的序列而找出相對之蛋白質 34

46 第四章實驗結果 第一節 由子宮腔液中尋找動情前期與動情期間 具差異的蛋白 因於動情前期至動情期時, 動情素濃度下降, 上皮細胞死亡程度高, 而子宮腔液大量累積, 為了研究小鼠子宮內膜細胞死亡所釋出的蛋白, 我們利用 SDS-PAGE 分析比對動情期與動情前期時子宮腔液蛋白的差異 如圖顯示, 動情前期的子宮腔液蛋白型式 ( 圖九 lane 1) 大致與動情期的腔液蛋白 ( 圖九 lane 2) 相似 經由仔細比對後顯示有一個約 30 kda 的蛋白帶 (protein band) 在動情期明顯多於動情前期 35

47 圖九 8μl 的子宮腔液以 12% 聚丙烯醯胺膠片進行 SDS-PAGE 分析, 經 coomassie blue 染色後, 觀察到一個約 30 kda 的蛋白帶 ( 箭頭指示 ) 在動情期腔液 (lane 2) 的量明顯高於動情前期 (lane 1) 左邊為標準品所對應的分子量 36

48 第二節 蛋白質定序 我們將經由比對後具有差異性的蛋白帶切出 經胰蛋白酶作用 後 將其溶出的 peptides 進行 LC/MS/MS 分析 所得的數據經由 Mascot 軟體分析 其結果顯示於 表四 有 10 個 peptides 完美吻 合小鼠的 epsilon 另外也有 8 個 peptides 與小鼠的 zeta 一致 且將由 BLAST 程式比對 表五 是為 protein family 因此我們確認在此約 30 kda 的蛋白帶 (protein band)中為 zeta 和 epsilon 37

49 表四 經胰蛋白酶作用後, 其溶出的 peptides 進行 LC/MS/MS 分 析 所得的數據經由 Mascot 軟體分析, 結果整理顯示如下表 : 38

50 表五 經由 BLAST 程式分析比對 其結果顯示因其 peptide 序列 與 protein family 相同 所以認為結果為 protein protein family,因此推論此具差異性之蛋白質為 protein Form: =R7UNBPV1015&mode=all 39

51 第三節 zeta 和 epsilon 具有動情前期 與動情期表現差異的特性 動情前期至動情期時動情素濃度下降 而上皮細胞死亡程度高 此時子宮腔液大量累積 因此我們希望透過動情期和動情後期子宮腔 液中豐富的蛋白質 利用其在兩時期之顯著的差異 尋找細胞凋亡的 相關性 而為了確立這 zeta 和 epsilon 是否在不同的時期的子 宮腔液具有差異性 我們以西方墨漬法分來確認 如圖 十 所示 動情期腔液蛋白 (圖十 lane 2)內含的 zeta 的量顯著大於動 情前期 (圖十 lane 1) 而在動情期時 epsilon 也有所表現 且其下方有隱約可見的蛋白帶 40

52 A B epsilon 圖十 子宮腔液中的 zeta 和 epsilon 之西方墨漬法分析 8 μl 的子宮腔液以 12% 膠片進行 SDS-PAGE 完成後 將膠內蛋白轉印至 ECL Hybond 膜上, 隨後使用 anti-mouse zeta 及 epsilon 抗體進行西方墨漬法分析, 其過程描述於 材料與方法 中 抗體特異的認出圖 A 一個約 30 kda 的蛋白帶及圖 B 一個約 33 kda A: anti-mouse zeta,lane 1 為動情前期,Lane 2 為動情期 B: anti-mouse epsilonm,Lane 1 為動情前期,Lane 2 為動情期 41

53 第四節 zeta 和 epsilon isoform 的特 性 一 分子篩的分析結果 之前的研究 Chaudhri et al., 2003 顯示將完整 epsilon 與 zeta 編碼的 ＤＮＡ 一起短暫表現於 Ｐ12 細胞時 兩個 蛋白會形成 heterodimer form 為了確立在生理的情境下 這兩個蛋 白是否具有此特性 首先我們分子篩的分析這兩種蛋白是否具有同收 集管出現 (Co-fractionation)的特性 西方墨漬法的分析顯示 zeta 與 epsilon 具有 dimer form 特性 同時出現 zeta 的收集管形式 (圖十一 upper panel)與 epsilon 的分佈 形式 (圖十一 lower panel)稍有不同 42

54 圖十一 同收集管 (Co-fractionation) 分析 2 ml 的動情期的子宮腔液以 Sepharcyl S-200 管柱進行分離, 其過程描述於 材料與方法 中 蛋白質於第 21 根收集管開始流出 將收集管中相同體積之蛋白以 SDS-PAGE 分離, 然後分別使用 zeta 抗體 (upper panel) 與 epsilon 抗體 (lower panel) 進行西方墨漬法分析 底部的數字代表收集管的號數 上面的箭頭顯示為各種標準品不同分子量 Aldolase(158 kda) Bovine albumin(66 kda) Ovalbumin(45 kda) Lysozyme(19 kda) 43

55 二 免疫沉澱的分析結果為了確立 epsilon 與 zeta 是否會形成 heterodimer 時 form 我們將含有 epsilon 與 zeta 的第 26 收集管拿來進行 zeta 的免疫沈澱, 隨後再將 zeta 的免疫沈澱物進行西方墨漬法分析 所得的結果顯示於圖 ( 十二 ) 如圖十二. A. lane 1 所示 zeta 沈澱物可以偵測出 zeta 存在, 相反地 控制組的 caspase 1 的沈澱物則偵測不到 ( 圖十二. A. lane 1) 然而 zeta 的沈澱物中卻無法偵測出 epsilon 的存在 ( 圖十二. B. lane 2) 與 caspase 1 的免疫沈澱物的結果相同 ( 圖十二. B. lane 1) 由以上的結果透露出 epsilon 與 zeta 在生理狀態下是以 homodimer form 形式存在 44

56 epsilon 圖十二 zeta 免疫沈澱物之西方墨漬法分析 取第 26 支收集管內 1/4 量的蛋白與 anti-mouse zeta 的抗體進行免疫沈澱 過程描述於 材料與方法 中 再將 zeta 免疫沈澱物分別使用 zeta 抗體 ( 圖十二 A) 與 epsilon( 圖十二 B) 抗體進行西方墨漬法分析 45

57 第五節 部分 epsilon 蛋白的表現 一 epsilon 基因選殖與部分 epsilon 蛋白的表現 1.基因建構 為了建構 epsilon 基因與表現其部分蛋白 我們利用 polymerase chain reaction (PCR)的方法(述於材料與方法) 於小鼠 子宮的 cdnas 中放大含 epsilon 編碼基因全長(full-length) 的 DNA 序列 (圖十三 lane 1) 再以此全長序列當作模板 (template) 放大出一段作為表現蛋白使用的部分 epsilon DNA 片段 圖十三 lane 2 46

58 bps 503 bps 圖十三 epsilon PCR 產物基因片段 Lane 1 為 epsilon 全長基因,Lane 2 為 epsilon 片段基因 47

59 2. 蛋白質表現將 PCR 放大的部分 epsilon 列序嵌入 pmal-2x 的表現質體中, 製成 maltose binding protein 融合蛋白 (fusion protein) 以 IPTG 誘發重組基因大量轉錄並導致融合蛋白大量表現 利用溶菌酶處理, 隨後進行物理性破菌法將蛋白釋出, 再利用 amylose 親合性管柱加以純化, 並以 SDS-PAGE 進行分析 ( 圖十四 ) 48

60 圖十四 表現出的 epsilon 部分蛋白 (8 μg) 之 SDS-PAGE 分析 箭頭指出的為融合蛋白位置 49

61 epsilon zeta 管數 圖十五 以 Sepharcyl S-200 管柱進行分離 蛋白質於第 21 根收集管開始流出 將收集管中相同體積之蛋白以 SDS-PAGE 分離, 然後分別使用 zeta 抗體 (upperpanel) 與 epsilon 抗體 (lower panel) 進行西方墨漬法分析 底部的數字代表收集管的號數 50

62 第五章討論 為了研究小鼠子宮內膜細胞死亡所釋出的蛋白, 我們利用 SDS-PAGE 分析比對動情期與動情前期時子宮腔液蛋白的差異 如圖 ( 九 ) 顯示, 動情前期的子宮腔液蛋白型式 ( 圖九 lane 1) 大致與動情期的腔液蛋白 ( 圖九 lane 2) 相似 經由仔細比對後顯示有一個約 30 kda 的蛋白帶 (protein band) 在動情期明顯多於動情前期 因此我們將這一個蛋白帶 (protein band) 切出, 經胰蛋白酶作用後, 將其溶出的 peptides 進行 LC/MS/MS 分析 所得的數據經由 Mascot 軟體分析, 其結果顯示於表 ( 四 ), 有 10 個 peptides 完美吻合小鼠的 epsilon 另外也有 8 個 peptides 與小鼠的 zeta 一致 為了確立這兩個蛋白是否在不同的時期的子宮腔液具有差異性, 我們以西方墨漬法分來確認 如圖十所示, 動情期腔液蛋白 ( 圖十 lane 2) 內含的 zeta 的量顯著大於動情前期 ( 圖十 lane 1) 之前的研究 Chaudhri et al., 2003 顯示將完整 epsilon 與 zeta 編碼的 DNA 一起短暫表現於 P12 細胞時, 兩個蛋白會形成 heterodimer form 為了確立在生理的情境下, 這兩個蛋白是 51

63 否具有此特性 首先我們分子篩的分析這兩種蛋白是否具有同收集管出現 (Co-fractionation) 的特性 西方墨漬法的分析顯示 zeta 與 epsilon 具有 dimer form 特性, 同時出現 zeta 的收集管形式 ( 圖十一 upper panel) 與 epsilon 的分佈形式 ( 圖十一 lower panel) 稍有不同 為了確立 epsilon 與 zeta 是否會形成 heterodimer 時 form 我們將含有 epsilon 與 zeta 的第 26 收集管拿來進行 zeta 的免疫沈澱, 隨後再將 zeta 的免疫沈澱物進行西方墨漬法分析 所得的結果顯示於圖 ( 十二 ) 如圖十二 A. lane 1 所示 zeta 沈澱物可以偵測出 zeta 存在, 相反地 控制組的的 caspase 1 的沈澱物則偵測不到 ( 圖十二 A. lane 1) 然而 zeta 的沈澱物中卻無法偵測出 epsilon 的存在 ( 圖十二 B. lane 2) 與 caspase 1 的免疫沈澱物的結果相同 ( 圖十二 B. lane 1) 由以上的結果透露出 epsilon 與 zeta 在生理狀態下是以 homodimer form 形式存在 成熟的小鼠在動情前期與動情期時, 子宮上皮細胞大量的分泌而造成子宮腔液的累積 Beck et al., 1973, 此研究中, 我們證實小 52

64 鼠的子宮腔液中含有 zeta 與 epsilon, 且 zeta 具有子宮內膜細胞死亡的生物標物 (biomarker) 的潛力 同時在子宮腔液中 zeta 與 epsilon 並無法形成 heterodimer form 蛋白是一族位於細胞內的蛋白, 目前在哺乳類成員已知有 (β ε γ η τ ζ 與 σ)7 種 Boston et al., 1982 ; Ichumura et al., 1988, 若以 cdna 序列換算成蛋白分子量, epsilon 約為 33 kda, 其餘的成員的分子量約為 30 kda Toker et al., 1990; Leffers et al., 1993 最近一些研究報告 Shiga et al., 2006; Van Everbroecd et al., 2005 顯示退化的神經細胞釋出的 蛋白可以從腦脊髓液偵測出, 且這些蛋白具有開發成為診斷退化性神經疾病的指標蛋白之潛力 子宮內膜的上皮細胞死亡會發生在大鼠與小鼠的動情週期中 細胞凋亡的指數在動情期較高, 但在動情前期較低 Sato et al., 1997; Dharma et al., 2001 因為腔液中 zeta, 在動情期的量顯著大於動情前期的量, 可能 zeta 是細胞死亡後從細胞漏出的 此結果顯示, 內膜細胞死亡與子宮腔液之 zeta 的量具有正相關性 因此推論 zeta 是子宮內膜死亡相當適合的指標分子 53

65 與之前的研究 Won et al., 2003 相同, 在分子篩的分析中顯示, zeta 與 epsilon 呈現出 dimer form 的特性 各收集管中 zeta 的分佈形態與 epsilon 分佈形態並不一致, 且 epsilon 的天然分子量是大於 zeta 由於 epsilon 的分子量約 33 kda 大於 zeta ( 約 30 kda), 由於即可推論兩者可能並不具 heterodimer form 的形式 另外以 zeta 的免疫沈澱物進行西方墨漬法的方析所得的結果更有力的證實兩個蛋白並無法形成 heterodimer form 由於 zeta 與 epsilon 的分子量明顯不同, 但我們在 30 kda 的蛋白帶中卻定序出 zeta 與 epsilon 透過西方墨漬法分析, 及分子篩膠體層析法確認, 在動情期時的子宮分泌液中的 epsilon 是否在細胞凋亡時會形成斷裂, 以致於在 30 kda 的蛋白帶中質譜儀定序出 zeta 與 epsilon, 如圖 ( 十一 )B 及圖 ( 十五 ) 所示 動情前期至動情期時因動情素濃度快速下降及上皮細胞大量凋亡, 造成子宮腔液累積, 經由抽取此時期的子宮腔液研究發現, 得知 zeta 與 epsilon 在動情前期與動情期時子宮腔液具有差異性, 也間接獲得 epsilon 會於動情期時形成斷裂的訊息 54

66 事實上 蛋白質在訊息的複合物中依接合 連結 支架 協調的功能會有 heterodimer 或 homodimer 的形式 (Wilker et al., 2004; Tzivion et al., 2001; Shen et al., 2003) 而 蛋白質結合了不同的訊息蛋白包括 MEKK 1 和 PI-3 kinase 及細胞凋亡機制中的調控蛋白 ASK-1 和抑制腫瘤因子 p53 等 (Powell et al., 2003; Jin et al., 2004; Porter et al., 2006), 除此之外有研究指出在口腔上皮癌細胞中 epsilon 會結合 Bcl-2 進而阻斷細胞凋亡的機制, 而為潛在的致癌因子 (Ajay et al., 2007) 而 epsilon 被認為在細胞凋亡訊息傳遞中形成斷裂 Widmann et al., 1998 另依 Won J et al. 的研究結果, epsilon 是 caspase 3 的受質 (substrate) 於細胞凋亡時會活化 caspase 3, 造成部分的 epsilon 的蛋白斷裂, 有利於 Bad 從 epsilon 結合中釋出, 而造成 Bad 與 BCL-x(L) 結合促進了細胞的凋亡 近來研究指出, 胚胎中被發現且是與細胞凋亡因子 Tunel 有關聯的是一些 caspase 3 初始蛻膜細胞 而其似乎同樣地在子宮內膜上皮細胞的增生與凋亡也是依循 caspase 3 對於 TNF 1 接受器造成影響所形成的 Anike et al., 2003 而此種細胞死亡的反應機轉是否與子宮內膜細胞的死亡相關連, 實在需要更多的佐證才能下定論 55

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