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- 庭 扶
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1 中国科学技术大学 博士学位论文 特异性抗 TRAIL 受体单链抗体多 聚化策略及在肿瘤治疗中的应用 作者姓名 : 学科专业 : 导师姓名 : 完成时间 : 王伟细胞生物学高斌研究员二 一二年四月二十日 1
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3 University of Science and Technology of China A dissertation for doctor s degree Multivalent scfv against TRAIL Receptor for Tumor Therapy Author s Name: speciality: Supervisor: Wei Wang cell biology Prof. Bin Gao Finished time: April 20 th,
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5 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文, 是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果 除已特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果 与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明 作者签名 : 签字日期 : 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一, 学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权, 即 : 学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅, 可以将学位论文编入 中国学位论文全文数据库 等有关数据库进行检索, 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 公开 保密 ( 年 ) 作者签名 : 导师签名 : 签字日期 : 签字日期 : 5
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7 摘要 摘要 单链抗体 (Single chain variable fragment) 具有分子量小, 容易穿透组织等优点 但是, 单链抗体亲和力较低, 在血清中容易被清除, 这些不足限制了单链抗体在临床上的应用 本研究利用人软骨多聚基质蛋白的超卷曲螺旋结构域 (coiled coil domain,comp48) 可以形成五聚体的特点, 将 TRAIL 死亡受体 4 (death receptor 4,DR4) 和死亡受体 5(death receptor 5,DR5) 的单链抗体进行五聚化, 以期延长单链抗体在体内的半衰期, 提高单链抗体的亲合力和生物学效应, 诱导肿瘤细胞发生凋亡, 达到治疗肿瘤的目的 单链抗体可以利用 COMP48 结构域进行多聚化 单链抗体转化成五聚体后, 亲和力得到加大增强 通过 BIAcore 仪器测量, 单链抗体五聚体的亲合力常数 K D 值可达 M, 而对应单链抗体的约为 10-7 M, 亲和力提高近一千倍 ELISA 分析结果表明, 五聚体抗体分别特异识别其对应的受体, 未见交叉反应 体外诱导凋亡和细胞抑制实验结果均表明, 五聚体抗体与单链抗体相比具有更明显的肿瘤细胞 (A549 colo205 HCT-116) 杀伤效果, 但是对正常细胞如 PBMC 及人慢性白血病细胞系 K562 没有杀伤作用, 表明正常细胞及部分肿瘤细胞对抗体具有不敏感性 裸鼠荷瘤模型 ( 人结肠癌 colo205) 结果显示, 单链抗体和五聚体抗体均有不同程度的抑瘤效果 针对 DR5 的五聚体抗体 8fcomp 治疗效果最好, 与其单链抗体形式相比具有显著性差异, 但针对 DR4 的单链抗体 4cmono 的抑瘤效果好于其五聚体 4ccomp, 其原因还有待于进一步探讨 关键词单链抗体, 超卷曲螺旋,TRAIL, 死亡受体 4, 死亡受体 5, 多价抗体 combody I
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9 Abstract ABSTRACT Single chain variable fragment (scfv) antibody has relativly small molecular size and is easy to penetrate into solid tumor. However, due to its low affinity and rapid clearance in blood, the usage of scfv is limited. In this study, we utilized COMP48, a coiled coil domain of human cartilage oligomerization protein, to pentamerize a group of agonistic scfv to TRAIL receptors DR4 and DR5. As expected, the affinity of scfv increased, half life extended, and finally, efficacy to kill tumor greatly improved. After fusion with COMP48, pentavelant scfv has been successfully formed. The pentavalent scfvs (combody), 4ccomp and 8fcomp have great improvement in affinity in BIAcore assay. The K D value of 4ccomp and 8fcomp is about M, while that of the monomeric scfv, 4cmono and 8fmono is about 10-7 M. ELISA data showed that 4ccomp and 8fcomp specifically bind to respective receptor without showing apparent cross reactivity. In apoptosis and cell inhibition assays it is indicated that pentavalent scfvs have stronger toxicity on tumor cell lines, such as A549, colo205 and HCT-116. In the xenograft tumor model, 8fcomp showed best efficacy, but 4cmono was better than 4ccomp in therapy, which demonstrates that both affinity and penetration efficiency are important for a protein agonist drug against tumor. Keywords scfv, coiled-coil, TRAIL, death receptor, multivalent antibody, combody III
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11 目录 目录 摘要... I ABSTRACT... III 第 1 章绪论 ( 治疗性抗体药物研究进展 )... 1 抗体药物研究发展历程... 1 小分子抗体... 3 单克隆抗体药物作用机制... 4 抗体药物在临床上的应用... 6 作为病毒治疗的单克隆抗体药物... 6 作为肿瘤治疗药物的单克隆抗体... 7 自身免疫性疾病抗体药物... 9 基因工程抗体命名规则 抗体药物研究发展趋势 参考文献 第 2 章 TNF 和 TNF 受体超家族成员药用研究进展 TNFSF/TNFRSF 成员概况 TNFSF/TNFRSF 与自身免疫性疾病和癌症治疗 TRAIL/TRAIL-R 激动型抗体临床试验研究 TRAIL 临床试验研究 TRAIL-R1 抗体的临床试验研究 TRAIL-R2 抗体的临床试验研究 CD40L/anti-CD40 抗体与治疗肿瘤 BAFF/APRIL 抗体与治疗 RANK/RANKL 抗体与治疗 存在问题 结语 V
12 特异性抗 TRAIL 受体单链抗体多聚化策略及在肿瘤治疗中的应用参考文献 第 3 章抗人 DR-4 DR-5 单链抗体及其五聚体在肿瘤抑制方面的效果研究 引言 材料和方法 质粒 菌株和细胞 试剂 实验材料及仪器 常用溶液及试剂的配制 实验方法 单链抗体核酸序列及蛋白序列分析 单链抗体和单链抗体五聚体 (combody) 的构建 单链抗体和单链抗体五聚体的表达 纯化 单链抗体和单链抗体五聚体的分析 荧光激活细胞分选 (FACS) 分析 细胞凋亡及细胞毒性测定 体内抑瘤 结果 抗 DR 单链抗体的氨基酸序列分子特征 单链抗体和单链抗体五聚体表达载体的构建 单链抗体和单链抗体五聚体的表达及鉴定 单链抗体及单链抗体五聚体与 DR 的亲和力分析 单链抗体和五聚体的生物学活性 肿瘤治疗 讨论 结论 参考文献 附录 VI
13 目录缩写表 致谢 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 VII
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15 第 1 章绪论 第 1 章绪论 ( 治疗性抗体药物研究进展 ) 抗体是机体应对抗原刺激, 由 B 细胞产生的一类蛋白质分子, 它能够特异性识别相应的抗原, 从而发挥预防和治疗的作用 抗体在分子结构上属于球蛋白, 因此也被称为免疫球蛋白 抗体由两条重链和轻链通过二硫键连接而成, 呈 Y 状结构 根据重链的区别, 人体内的抗体可分为 IgA IgD IgE IgG 和 IgM 五种亚型 由于 IgG1 能有效地通过 Fc 介导各种免疫功能以及拥有较长的半衰期, 因此, 目前用于治疗的市售抗体均属于 IgG 类 近年来, 各种基因工程抗体的成功制备和应用将抗体药物的研发带入了一个快速发展的新阶段 目前已有近 30 种治疗性抗体用于临床, 主要用于肿瘤 自身免疫性疾病 慢性炎症反应 器官移植排斥反应以及病毒感染的治疗 ( 详见本章附录 ) 抗体药物研究发展历程 最早用于疾病治疗的抗体是白喉抗毒素 [1] 1890 年, 贝林格 (Behring) 和北里柴三郎 (Kitasato Shibasaburo) 发现, 患过白喉的老鼠血清注射到新患白喉的老鼠体内, 新感染的老鼠能够痊愈, 他们将血清中的这种物质称为白喉抗毒素 [2] 德国科学家埃利希(Ehrlich) 为提纯这种抗血清做出了大量贡献 从此, 血清疗法开始登上历史舞台, 贝林格本人也因此获得 1901 年的诺贝尔生理和医学奖 [2] 但由于人体对异源蛋白的免疫排斥反应, 以及多克隆抗体组分的复杂性和不均一性, 其在临床上的应用受到极大限制 1975 年,Köhler 和 Milstein 创建了杂交瘤技术 [3] 他们将分泌抗体的小鼠 B 细胞和鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞, 这种细胞能够稳定而大量产生针对特定抗原的 有高度特异性和良好均一性的单克隆抗体 由于单克隆抗体对靶点识别具有高度的亲和力和特异性, 它们在基础和临床研究中得到了广泛应用 世界上第一个治疗性抗体药物 鼠源抗 CD3 单克隆抗体 Muromonab-CD3 (OKT3) 于 1986 年被美国食品和药品监督管理局 (FDA) 批准上市, 用于抑制器官移植发生的免疫排斥反应 [4] 但是, 鼠源性抗体作为一种异源蛋白, 在人体内会产生人抗鼠抗体反应 (HAMA), 从而无法引发足够的免疫效应而降低疗 1
16 特异性抗 TRAIL 受体单链抗体多聚化策略及在肿瘤治疗中的应用效, 而且会导致因免疫复合物造成的非特异性毒性 [5] 随着分子生物学技术的发展以及对抗体基因结构的深入了解, 抗体药物的发展进入了基因工程抗体阶段 通过基因工程改造, 人们可以获得免疫原性更低的单克隆抗体, 主要有嵌合抗体 人源化抗体以及全人源抗体等 嵌合抗体保留了小鼠抗体可变区序列, 但是小鼠抗体恒定区被人抗体恒定区所取代 嵌合抗体的鼠源序列在抗体分子中的比例仅占 30% 左右,HAMA 反应风险降低 人源化抗体如重构抗体 (reshaped antibody,rab, 改型抗体 ) 是将小鼠抗体分子的互补决定区 (CDR) 保留, 其它结构如框架区 (FR, framework) 和恒定区 [6, (Fc) 均替换成人抗体结构 7] ; 表面重塑 (VDR, variable domain resurfacing) 抗体则是另一类人源化抗体, 它从抗体空间结构出发, 将鼠源抗体表面氨基酸残基 (SAR, surface amino acid residues) 替换与人抗体 SAR 差别明显的区域, [8, 尽量减少异源性并保持抗体活性 9] 全人源抗体通过转基因小鼠, 或者通过核糖体展示 噬菌体展示等技术而获得 第一个嵌合抗体阿昔单抗 Abciximab( 这是 Fab 片段, 第一个嵌合单抗其实是 Rituximab) 于 1994 年被批准上市, 可抑制纤维蛋白原与血小板的结合, 被批准用于抑制血栓形成 [10] ; 第一个人源化抗体达利株单抗 (Daclizumab) 也于 1997 年被批准上市, 用于治疗急性肾移植排斥反应 [11] ; 而第一个全人抗体药物阿达木单抗 (Adalimumab) 则于 2001 年上市, 用于治疗风湿性关节炎 [12] 近年来, 抗体偶联技术也取得了较大的进展 同位素标记抗体 化学药物偶联抗体均已被批准用于临床治疗 同位素标记物常使用 131 I 90 Y 和 111 In [13] 利卡汀 唯美生 等国产药物均是碘 [ 131 I] 抗体交联物 [14-17] 此外, 还有部分融合蛋白也被批准上市 通过基因工程手段将抗体分子片段与其它蛋白融合, 可得到多样性生物功能的融合蛋白 如将 scfv 或 Fab 段与其它生物活性蛋白融合可将特定的生物学活性导向靶部位 ; 将非 Ig 蛋白与抗体分子的 Fc 段融合, 可改善其药物动力学特性, 并可使某些生物学活性与抗体的生物学效应功能联结在一起 ( 详见本章附录表 1) 2
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~ 1 ~ ~ 2 ~ 1-1 UHPLC-SEC 法对治疗性抗体的分析 TSKgel UP-SW3 UHPLC HPLC A TSKgel UP-SW3 2 μm (4.6 mm ID. 15 cm B UHPLC-SEC 1.7 μm (4.6 mm ID. 15 cm mmol/l (ph 6.7 + 2SO4 mmol/l Na +.5 % NaN3.35 ml/ 25 UV 28 nm 5
材料 方法
生物技术通报 姜燕 采用鼠抗人血红蛋白 单克隆抗体 和胶体金标记鼠抗人血红蛋白 单克隆抗体 及对照抗体羊抗鼠 利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原 在 内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克 隆一步法胶体金检测试卡 用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病 应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白 抗 体 方法检测 效价 免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡 法检测 效价的结果显示 鼠抗人
(2) (3) 1.3 (1) (2) (3) (4) (5) (6)
(GB/T -1987) 771 (GB/T 1.1 2000---- ) GB/T 7714-2005 ( ) 1 (1) (2) (3) (4) (5) (6) abstract (7) 1.2 (1) 1 (2) (3) 1.3 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 2.1 1. 25 1 2. 15 2 3. 4. 300 4 8 2 3 5. abstract 6. : 5 2.2
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33 4 2014 467 478 Studies in the History of Natural Sciences Vol. 33 No. 4 2014 030006 20 20 N092 O6-092 A 1000-1224 2014 04-0467-12 200 13 Roger Bacon 1214 ~ 1292 14 Berthold Schwarz 20 Luther Carrington
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考生编号政治政治分外语外语分科目 1 科目 1 分科目 2 科目 2 分总分专业代码专业名称考试方式报名号 思想政治理论缺考英语一 45 生物综合 38 生理学缺考 药理学全国统考 思想政治理论
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浙 江 药 品 检 验
二 OO 六 年 第 五 期 ( 总 第 13 期 ) 本 期 导 读 二 OO 六 年 三 月 二 十 日 他 山 之 石 赴 山 东 上 海 两 省 市 药 检 所 考 察 报 告 药 检 动 态 我 所 参 加 全 省 药 品 安 监 注 册 工 作 会 议 金 华 所 延 胡 索 单 味 浓 缩 ( 配 方 ) 颗 粒 临 床 前 研 究 通 过 成 果 鉴 定 经 验 交 流 溶 血 试
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2389 30 1 14A 0.1%5% 14A 14A.52 1 2 3 30 2 (a) (b) (c) (d) (e) 3 (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (vii) 4 (1) (2) (3) (4) (5) 400,000 (a) 400,000300,000 100,000 5 (b) 30% (i)(ii) 200,000 400,000 400,000 30,000,000
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苏州大学硕士学位论文叶酸靶向紫杉醇纳米脂质体的制备及其生物学效应的研究姓名 : 汪梅花申请学位级别 : 硕士专业 : 放射医学指导教师 : 许玉杰 20080501 叶酸靶向紫杉醇纳米脂质体的制备及其生物学效应的研究 作者 : 汪梅花 学位授予单位 : 苏州大学 本文链接 :http://d.g.wanfangdata.com.cn/thesis_y1296729.aspx
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6 7.... 9.. 11.. 12... 14.. 15.... 3 .. 17 18.. 20... 25... 27... 29 30.. 4 31 32 34-35 36-38 39 40 5 6 : 1. 2. 1. 55 (2) 2. : 2.1 2.2 2.3 3. 4. ( ) 5. 6. ( ) 7. ( ) 8. ( ) 9. ( ) 10. 7 ( ) 1. 2. 3. 4.
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第四章免疫球蛋白 抗体 (antibody,ab) 是介导体液免疫的重要效应分子, 是 B 细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白, 主要存在于血清等体液中, 能与相应抗原特异性地结合, 显示免疫功能 早在十九世纪后期,von Behring 及其同事 Kitasato 就发现白喉或破伤风毒素免疫动物后可产生具有中和毒素作用的物质, 称之为抗毒素 (antitoxin), 随后引入抗体一词来泛指抗毒素类物质
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2 32,,,, 211, 1980,, (implosion, ),, : (lowest - low fertil2 ity), 1. 3 TFR ( Kohler, Billari and Ortega, 2002) ; (very low fertility), 1. 5 TFR (Cald
32 4 2008 7 Vol1 32, No1 4 July 2008 1 Population Research 3,,,,, : ;,,, : ; ; ; ;, :100871 2004 (,2004a,b),, 1. 8,, 1990,,,,,,, 4,,, 1,,, ( TFR) 2. 1, 1 TFR 1990, (low fertility, be2 low2replacement fertility),,
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发展党员工作手册
发 展 党 员 工 作 问 答 目 录 一 总 论...9 1. 发 展 党 员 工 作 的 方 针 是 什 么? 如 何 正 确 理 解 这 个 方 针?... 9 2. 为 什 么 强 调 发 展 党 员 必 须 保 证 质 量?... 9 3. 如 何 做 到 慎 重 发 展?... 10 4. 如 何 处 理 好 发 展 党 员 工 作 中 的 重 点 与 一 般 的 关 系?...11 5.
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SINOCHEM HONG KONG HOLDINGS LIMITED i ii iii iv 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54