自噬作用的過程：

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1 Effects of Interval and Continuous Exercise Regimens on CD4 lymphocyte Apoptotic and Autophagic Responses to Hypoxic Stress Tzu-Pin Weng, Jong-Shyan Wang Graduate Institute of Rehabilitation Science, Chang Gung University, Tao-Yuan, Taiwan Abstract Results Abstract No. 552 Background: This study investigates how interval and continuous exercise regimens affect CD4 lymphocyte apoptotic and autophagic responses to hypoxic stress. Methods and Results: Twenty sedentary males were randomly divided into moderate continuous exercise training group (MCT; 60% VO 2max, n=10) and aerobic interval exercise training group (AIT; 3-minute intervals at 80% and 40% of VO 2max, n=10) for 30 minutes per day, 5 days per week for 5 weeks. The results demonstrated that acute 12%O 2 exercise enhanced apoptosis (phosphotidyl serine exposure) by promoting phosphorylation of Bcl-2 and activations of caspase-9 and -3, as well as, suppressed autophagy (acridin orange staining) by down-regulating expressions of m-tor, Atg-1, Atg- 12, and LAMP-2 in CD4 lymphocytes. However, 5 weeks of MCT and AIT decreased levels of phosphorylated Bcl-2 and active-form caspase-9 and -3 in CD4 lymphocytes, consequently suppressing the cell apoptosis induced by the 12%O 2 exercise. Simultaneously, the two regimens promoted autophagy of CD4 lymphocytes at rest or following the 12%O 2 exercise, which responses were accompanied by increased cellular Beclin, Atg-1, Atg-12, LC3B, or LAMP-2 level. Conclusions: Therefore, we conclude that both MCT and AIT regimens alleviate apoptosis and promote autophagy of CD4 lymphocytes during hypoxic exercise, which may, in turn, reduce the risk of immune suppression evoked by hypoxic stress. Table 1. Anthropometric and maximal exercise performance Fig 1. Initiation Autophagy Fig 3. Maturation and Fusion Autophagy Fig 4. Mitochondria Function Introduction Fig 5. mtor This study investigates how interval and continuous exercise regimens affect CD4 lymphocyte apoptotic and autophagic responses to hypoxic stress. Methods Fig 6. Caspase Activation Subjects Twenty sedentary males were randomly divided into moderate continuous exercise training group (MCT; 60% VO 2max, n=10) and aerobic interval exercise training group (AIT; 3- minute intervals at 80% and 40% of VO 2max, n=10) for 30 minutes per day, 5 days per week for 5 weeks. Materials Isolated blood cells CD4 + T lymphocytes Blood cell counts Various subtypes of WBC- Sysmax SF-3000 cell counter Circulation parameters SaO 2, BP, HR - Oximetry Autophagy marker mtor, Beclin, Atg-1, Atg-12, LC3B, LAMP-2, AO Apoptosis marker phosphorylated Bcl-2, Caspase-9, Caspase-3 Data collection and analysis: Flow cytometry (FACSCalibur) Fig 2. Elongation Autophagy Conclusion we conclude that both MCT and AIT regimens alleviate apoptosis and promote autophagy of CD4 lymphocytes during hypoxic exercise, which may, in turn, reduce the risk of immune suppression evoked by hypoxic stress. Fig 7. Apoptosis

2 長庚大學復健科學研究所 間隔性和連續性運動對 CD4 淋巴球細胞凋亡及自體 吞噬在低氧反應的影響 Effects of Interval and Continuous Exercise Regimens on CD4 lymphocyte Apoptotic and Autophagic Resposes to Hypoxic Stresss 指導老師 : 王鐘賢教授 研究生 : 翁滋嬪 中華民國九十九年六月 1

3 中文摘要 間隔性和連續性運動對 CD4 淋巴球細胞凋亡及自體吞噬在低氧反應的影響背景與目的 : 慢性心衰竭有漸進性的症狀且為不同心血管疾病所產的結果, 不同的神經賀爾蒙和促發炎細胞激素會導致左心室的再塑也會使細胞死亡產生免疫壓抑, 近年的研究證實有氧間隔性運動訓練比傳統的有氧運動訓練可以進步更多的最大耗氧量, 本研究在於探討有氧間隔性運動和連續性運動是否會影響 CD4 淋巴球遇到低氧壓力時產生細胞凋亡和自體吞噬的反應 方法及初步結果 :60 位坐式生活健康男性隨機分配至中度連續性運動訓練組 (MCT; 60% 最大作工量, n=20) 有氧間隔性運動訓練組 (AIT; 80% 和 40% 最大作工量各三分鐘間隔, n=20) 以及控制組 (C; 沒有任何介入, n=20), 運動訓練每天 30 分鐘, 一週五天連續五週 本實驗結果發現急性 12% 氧濃度的運動會經由促進磷酸化 Bcl-2 的表現以及凋亡蛋白酶 9 和 3 最後增加細胞凋亡的表現 ( 磷脂質絲胺酸的暴露 ), 另外會經由向下調節 CD4 淋巴球的 m-tor Atg1 Atg12 和 LAMP-2 表現使自體吞噬被壓抑 ( 經吖啶橙染色 ) 然而經由五週的有氧間隔性和連續性運動訓練過後會降低 CD4 淋巴球的 Bcl-2 磷酸化以及活化態的凋亡蛋白酶 9 和 3, 進而壓抑 12% 氧濃度運動所引起的細 2

4 胞凋亡狀況, 同時, 兩種運動都會促進 CD4 淋巴球在休息狀態以及經過 12% 氧氣濃度運動過後的自體吞噬狀態, 這種現象是藉由 Beclin Atg1 Atg12 LC3B 或 LAMP2 增加的關係 因此, 本實驗初步結論為中度連續性運動和有氧間隔性運動訓練會降低 CD4 淋巴球在低氧運動時的細胞凋亡以及促使自體吞噬表現增加, 這可能可以降低因面臨低氧壓力時產生免疫壓抑的危險 3

5 英文摘要 Effects of Interval and Continuous Exercise Regimens on CD4 lymphocyte Apoptotic and Autophagic Responses to Hypoxic Stress Background and Purpose: Chronic heart failure is a progressive syndrome and the outcome of a variety of cardiovascular disease. The variety neurohormone and pro-inflammatory cytokine could lead to remodeling of the left ventricular as well as immuno-suppression by cell death. Recent reports have demonstrated that aerobic interval training (AIT) is more effective than traditional aerobic exercise training by producing superior improvements in VO 2 max. This study investigates how interval and continuous exercise regimens affect CD4 lymphocyte apoptotic and autophagic responses to hypoxic stress. Methods and preliminary results: Sixty sedentary males were randomly divided into moderate continuous exercise training group (MCT; 60% Workload max, n=20), aerobic interval exercise training group (AIT; 3-minute intervals at 80% and 40% of Workload max, n=20) and Control group (C; no intervention, n=20) for 30 minutes per day, 5 days per week for 5 weeks. The results demonstrated that acute 12%O 2 exercise enhanced apoptosis (phosphotidyl serine exposure) by promoting phosphorylation of Bcl-2 and activations of caspase-9 and -3, as well as, suppressed autophagy (acridin orange staining) by down-regulating expressions of m-tor, Atg-1, Atg-12, and LAMP-2 in CD4 lymphocytes. However, 5 weeks of MCT and AIT decreased levels of phosphorylated Bcl-2 and active-form caspase-9 and -3 in CD4 lymphocytes, 4

6 consequently suppressing the cell apoptosis induced by the 12%O 2 exercise. Simultaneously, the two regimens promoted autophagy of CD4 lymphocytes at rest or following the 12%O 2 exercise, which responses were accompanied by increased cellular Beclin, Atg-1, Atg-12, LC3B, or LAMP-2 level. Therefore, we conclude that both MCT and AIT regimens alleviate apoptosis and promote autophagy of CD4 lymphocytes during hypoxic exercise, which may, in turn, reduce the risk of immune suppression evoked by hypoxic stress. 5

7 目錄 中文摘要... 2 英文摘要... 4 第一章文獻回顧 (Literature Review) 前言 神經系統及神經賀爾蒙對心臟衰竭的影響 慢性心衰竭與 T 輔助型淋巴球 (T-helper; Th)- 細胞激素調節角色 心臟衰竭病人的淋巴球表現 細胞死亡介紹 - 自體吞噬 (autophagy) 細胞凋亡 (apoptosis) 和壞死 (necrosis) 運動對神經賀爾蒙及細胞激素之影響 運動對 T 淋巴球死亡的影響 運動對自體吞噬影響 有氧間隔性運動 實驗假說 第二章材料與方法 材料 試劑藥品 抗體 (Antibody) 耗材 儀器 方法 RPMI 培養液配置 Rapamycin 配置 抗凝血劑 Sodium Citrate (0.106M) 配置 x Permeabilization Wash Buffer 稀釋 淋巴球萃取 偵測輔助型 T 細胞自體吞噬狀態

8 2-2-7 觀察自體吞噬標記 觀察細胞凋亡標記 實驗方法 受試者選取 受試者限制因子 最大運動測試 低氧運動測試 運動強度設定 實驗組別 實驗流程 第三章結果 (Results) 受試者基本資料 身體狀況和活動情形調查 兩組於訓練前後之體能表現 有氧間隔性及中度連續性運動訓練對 CD4 淋巴球在低氧運動時細胞凋亡及自體吞噬的影響 第四章初步結論 參考文獻 附錄

9 第一章文獻回顧 (Literature Review) 1-1 前言根據行政院衛生署於民國 98 年的統計當中顯示, 心臟疾病排名十大死因中的第二位 ( 圖一 ), 由此可知心臟疾病為僅次於癌症的高死亡率疾病 [1], 是國人不得不重視的問題 其中心臟衰竭為多個心血管疾病導致的結果, 影響的層面甚廣包括神經系統 神經賀爾蒙 肌肉結構 發炎反應 心臟本身的功能 血管功能及血管的反射接受器等等 [2] 於近年的文獻當中針對心臟衰竭病人在第一次住院後的長短期致死率進行研究 [3], 結果於 28 天致死率當中顯示男性 <55 歲致死率為 7.5%, 女性為 6.9%; 男性 >55 歲為 32.9%, 女性為 27.2%, 而於一年致死率當中顯示男性 <55 歲為 17.2%, 女性為 14.9%; 男性 >55 歲為 58.6%, 女性為 49.9%, 在五年致死率當中顯示男性 <55 歲為 34.2%, 女性為 27.6%; 而男性 >55 歲為 58.6%, 女性為 49.9%, 此研究結果顯示男性的致死率高於女性且隨著年齡越大致死率會隨著增加, 長期來說致死率只會越來越高, 就現今的醫療藥物來說雖然進步快速但仍然無法改變心衰的高死亡率, 而心衰後期所導致的慢性失能 降低身體活動的耐受性 生活品質受影響等等對社會成本的增加是一極大負擔 8

10 1-2 神經系統及神經賀爾蒙對心臟衰竭的影響當身體有壓力 (stress) 產生的時候, 大腦是主要被影響到的器官 [4], 而心血管的功能會受到腦和心臟交互作用的影響, 短期的壓力可以促使不同的器官產生功能上的適應例如心臟, 使其改善心血管的功能, 但長期的壓力反而會對體內的衡定造成傷害, 文獻指出壓力會使心血管功能不正常, 例如發展成缺血性心臟病 心肌梗塞 心臟衰竭 心律不整甚至是猝死等等 [5], 另外自主免疫疾病及免疫壓抑都跟壓力有關 [6] 在不同的壓力刺激下, 交感腎上腺髓質系統 (sympathetic adrenal medullary system) 和下視丘 - 腦垂腺 - 腎上腺軸 (hypothalamic pituitary adrenal; HPA) 會被活化, 當下視丘感應到壓力的時候, 會使交感腎上腺分泌出來, 這是屬於中樞神經系統刺激交感神經所誘發出來的結果, 此刺激路徑會使腎上腺髓質和交感神經末端釋出大量的腎上腺素 (epinephrine) 從和正腎上腺素 (norepinephrine) 至血液循環當中進而導致心肌細胞的損傷 [7] 另外壓力刺激也可以經由腦部傳至下視丘 - 腦垂腺 - 腎上腺軸來產生反應, 此路徑會經腎上腺皮質釋出腎上腺糖皮質素 (glucocorticoids), 而腎上腺糖皮質素同樣的也會對心肌造成保護及傷害一體兩面的影響 ( 圖二 ) 當兒茶酚胺釋出到血液當中同時會活化 α- 和 β-adrenoceptors 並刺 9

11 激心臟的功能, 於正常的心臟當中會同時存在著 α- 和 β-adrenoceptors, 但是 α- adrenoceptors 於調節心臟功能方面所扮演的角色較低於 β-adrenoceptors, 文獻指出若改變 β-adrenoceptors 的訊息傳遞路徑會導致各種不同的心臟失能, 像是心肌梗塞 [8] 高血壓性心臟衰竭 [9] 和心臟肥厚 [10] 等等, 另外在心臟衰竭進展的過程中, 左右心室的 β-adrenergic 訊息傳遞路徑也會產生改變且在接受器的密度上也會有下降的情形 [11], 因此在面臨不同的壓力刺激時, 兒茶酚胺在血液循環中的量會上升, 所以它在心血管疾病當中的發展扮演很重要的角色 [12], 當心臟長期暴露於高量的兒茶酚胺狀態時可能會導致嚴重的損傷, 最常見的因兒茶酚胺在心臟所引起的改變包括心臟肥厚 收縮帶 (contraction band) 壞死以及發炎反應 [13] 等等 除了中樞神經系統所產生的影響之外, 下視丘 - 腦垂腺 - 腎上腺軸也是另一個會因為各種不同壓力而活化的重要調節系統, 當在面臨壓力時, 血液循環當中的腎上腺糖皮質素量會向上調節, 這會使心臟處於感染和發炎的狀態進而加速心臟疾病的進展 [14] 由以上可得知當心臟功能異常時, 也就是對人體產生一個壓力警訊時, 會刺激大腦的中樞神經系統活化和神經賀爾蒙釋出以調節維持衡定, 就短期來說對人體為一保護機制但長期來說反而是種傷害, 不但會使心臟產生再塑 (remodeling) 也會產生一連串的發炎反應最後 10

12 加速病程的進展 1-3 慢性心衰竭與 T 輔助型淋巴球 (T-helper; Th)- 細胞激素調節角色 T 淋巴球 (CD3 + ) 屬於人體免疫系統當中的後天免疫, 又可分為 CD4 + (Helper T cell; 輔助型 T 細胞 ) 和 CD8 + (Cytotoxic/suppressor T cell; 毒殺型 T 細胞 ) 兩種子群 (subgroup), 此兩種細胞分別執行了不一樣的功能, 毒殺型 T 細胞主要負責辨識並清除已經被改變的自我細胞, 如遭病毒感染的細胞或是腫瘤細胞時, 而輔助型 T 細胞主要為釋出細胞激素 (cytokine) 調控或 輔助 其它淋巴細胞的發揮功能, 於發炎的環境中輔助型 T 細胞扮演重要的角色 目前已知細胞激素為溝通免疫細胞和內皮細胞之分子, 細胞激素主要的功能為調節免疫細胞的功能和協調後天免疫對發炎的反應, 在發炎反應當中細胞激素可以扮演促發炎的細胞激素, 像是介白素 -1 (interleukin-1; IL-1), 介白素 6 (IL-6) 和腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor; TNF) 等等, 另外還有抗發炎的細胞激素像是介白素 4 (IL-4) 介白素 10 (IL-10) 以及介白素 13 (IL-13), 通常細胞激素的放大反應 (cascade) 為, 當初期的細胞激素產生時會引起後期的細胞激素產生, 例如介白素 1 為啟動細胞激素放大反應者, 會誘發介白素 2 介白素 6 和腫瘤壞死因子的釋放 近期的研究顯示神經賀爾蒙和神經調節者在心臟的衰竭的病程 11

13 中扮演重要的角色, 因為這些會影響心臟和循環中某些分子的表現, 包括神經賀爾蒙 ( 正腎上腺素 血管收縮素 II 和內皮素 1) 以及免疫調節者 ( 細胞激素 ), 研究指出在心臟衰竭的病程中許多促發炎細胞激素的量會增加, 包括腫瘤壞死因子 α 介白素 6 介白素 1β 以及介白素 2 等等 [15], 對於心臟衰竭的細胞激素來源有幾個假說 (hypothesis):(1) 當心肌組織受傷的時候會刺激一些免疫細胞活化促使釋放細胞激素,(2) 衰竭的心臟本身就會釋出腫瘤壞死因子 -α (TNF-α)[16], 並且次發性的去活化免疫細胞放大周邊免疫的反應,(3) 心臟衰竭會降低心輸出量, 使腫瘤壞死因子 -α 可以在低灌流狀態製造出來 根據以上統合可以得知, 在心衰竭的過程中, 神經賀爾蒙及神經系統會影響受傷的心肌組織, 而這些損傷區域會活化一些促發炎的細胞激素進而去影響免疫細胞 1-4 心臟衰竭病人的淋巴球表現心臟衰竭會使神經內分泌和細胞激素過度表現, 因此成為主要導致慢性心衰竭的機制之一, 其中在神經賀爾蒙當中, 當交感神經活化來面臨心臟所產生的壓力時, 會提高血液中的兒茶酚胺釋放, 另外壓力賀爾蒙可體松 (cortisol) 的量也會被提高, 而這些賀爾蒙是主要影響心臟衰竭免疫系統的成因之一 [17], 可體松目前已經知道會偏移 12

14 (shift) 淋巴球的百分比使其變低 [18], 而兒茶酚胺對免疫細胞的影響當中已知所有的淋巴細胞都會表現出 β-adrenergic receptors[17] 這種腎上腺激素接受器, 此接受器可以在細胞內刺激環腺嘌呤核苷單磷酸 (cyclic AMP) 的合成以對兒茶酚胺 (catecholamine) 產生反應, 早期的前數分鐘作用會使淋巴球產生移行 (mobilization), 但在後期的作用數小時會產生會產生淋巴球缺少 (lymphopenia)[19], 而慢性心臟衰竭的病人就像是暴露於後期的兒茶酚胺作用下, 在他們淋巴球內的 G protein-coupled receptor kinases 2 (GRK2) 表現量會增加兩到三倍 [20], 此激酶會增加 β-adrenergic desensitization 產生一個不正常的訊息傳遞, 使細胞內刺激環腺嘌呤核苷單磷酸 (cyclic AMP) 無法合成, 抑制了對兒茶酚胺的作用而造成淋巴球百分比下降 [21] 除了壓力賀爾蒙的影響之外, 細胞激素也是影響心臟衰竭病人淋巴球數目的因子之一, 衰竭的心臟會有慢性發炎的現象 [22], 其中一些促發炎激素像是腫瘤壞死因子 -α 介白素-1 和 6 會被釋放出來且在影響免疫細胞中都扮演重要角色, 研究顯示 [23] 在慢性心臟衰竭的病人周邊血液當中, 一些促發炎的細胞激素會增加, 包括腫瘤壞死因子 -α 和介白素 6, 雖然整體的白血球數目沒有太大的變化, 但是卻造成了噬中性白血球 (neutrophils) 增加並降低了淋巴球 (CD3 + ) 的百分比 [23], 而輔助型 T 淋巴球 (T-helper cells; CD4 + ) 下降的情形特別明顯 13

15 [23], 由此可知衰竭的心臟會造成發炎的情形而釋出促發炎激素最後導致輔助型 T 淋巴球數目下降 確實, 文獻顯示心臟衰竭病人會有淋巴球下降之情形,Acanfora 等學者的研究當中說明心臟衰竭的病人淋巴球數目會降低, 並且可以當成是一個獨立的標記 (independent marker) 來定義早期的心衰病人是否處在高死亡的危險因子當中 [24], 是一個簡單且便宜的方式, 從他們的實驗當中發現相對性的淋巴球數目 ( 淋巴球整體數目 / 整體白血球數目 )*100 小於 20% 和大於 20% 在三年內的存活比例分別為 63% 和 38%, 另外 Sakatani 等學者的研究當中也指出血液當中的淋巴球數目是一個很有效可以來當作預測心臟衰竭進程的指標 [25] 對於心臟衰竭的病人分別都有文獻指出會有淋巴球數目或是百分比減少的現象, 而淋巴球的下降意味著細胞死亡情形增加或增生減少, 文獻指出細胞激素和神經賀爾蒙的過度增加會導致病理狀態產生大量的活性氧分子 [26], 另外在梗塞的心臟當中會有缺血 / 再灌流的情形也會使活性氧分子量增加, 這會使細胞走向凋亡, 而過度讓細胞暴露於氧化壓力環境當中, 也會讓細胞走向自噬性死亡路徑 [27], 氧化壓力是如何影響自體吞噬作用, 活性氧分子主要會經由 Atg4 的活性來影響自體吞噬的作用,Atg4 除了可以使 Atg8 接上磷脂醯乙醇胺促使自體吞噬體形成之外, 也可以使 Atg8 和磷脂醯乙醇胺解離, 而氧 14

16 化壓力會抑制 Atg4 作用 Atg8 和磷脂醯乙醇胺的解離, 因此可以促使更多的細胞自噬體形成而增加自體吞噬作用的表現 [28] 細胞死亡路徑目前已知可分為自體吞噬 (autophagy) 細胞凋亡 (apoptosis) 及細胞壞死 (necrosis) 三種 1-5 細胞死亡介紹 - 自體吞噬 (autophagy) 細胞凋亡 (apoptosis) 和壞死 (necrosis) 自體吞噬 (autophagy) 現象源自希臘字 auto (self) 和 phagy (eating),christian de Duve 學者因從事研究溶酶體 (lysosome) 而得到諾貝爾獎,autophagy 一字因而在 1963 年被命名出來, 他描述自體吞噬的現象有單層膜或雙層膜泡, 裏頭會有胞器並在不同時期會藉由溶酶體被分解掉 (digestion)[29], 細胞自噬為有核生物在演化上重要且高度保存的機制, 是一種依靠細胞的溶解酶體來分解細胞內的蛋白質或胞器的途徑, 主要的功能是調節蛋白質與胞器的代謝, 另外就是將蛋白質分解成更小的胜肽回收再利用被認為是調控細胞生長 分化 體內平衡 (homeostasis) 的重要機轉 自體吞噬作用直到近幾年研究發現許多疾病與自體吞噬有密切關係, 才漸漸被人們所重視 有關細胞自噬作用的描述最初見於 1963 年, 而依照吞噬方式不同又可分為 macroautophagy microautophagy chaperon-mediate 15

17 autophagy (CMA) 而一般所指的 autophagy 即為 macroautophagy, 最先在哺乳類中被發現, 其主要吞噬一些較大的蛋白質或胞器 ( 如 : 粒線體 內質網等 ), 當細胞缺乏養分時最常被誘導的一種自噬方式 microautophagy 所吞噬的, 為一些小分子蛋白, 其隔離膜 ( 胞內囊泡 ) 主要為溶酶體之胞膜所形成, 其形式類似 macroautophagy 而 chaperon-mediate autophagy 則為細胞藉由 chaperon 攜帶蛋白質至溶酶體消化的一種分解蛋白模式 (Majeski and Dice, 2004;Klionsky, 2005) 自噬作用的過程 : 在酵母菌身上已經有超過 30 種不同的自噬調節基因 (autophagy gene) 被定義, 其中大部分為哺乳類的的同源基因 (orthologs), 這些基因可以成群 (group) 並在不同自噬作用時期當中執行功能, 包括 : 啟動 (initiation) 膜延長 (elongation) 膜成熟 (maturation) 以及融合期 (fusion)[29] 啟動自噬體 (autophagosome) 的形成 : 早期的研究大多認為自噬體的產生是從既存的細胞內前驅分子 (preexisting intracellular precursor molecules) 來的, 但近幾年來的研究大多認為細胞內的膜結構像是內質網 (endoplasmic reticulum) 為主要貢獻自噬體的形成 [30], 在形成新的自噬體之前需要一些訊息的活 16

18 化, 包括活化 class III PI3K (Vps34) 及 class I PI3K, 活化 class III PI3K (Vps34) 會產生 phosphatidylinositol 3-phosphate (PI-3-P), 此過程在活化細胞自噬當中扮演重要角色, 近期的研究發現在飢餓 (starvation) 的狀態下, 富涵 PI-3-P 的結構會形成 [31], 然而對於 PI-3-P 所扮演的實質功能目前仍然無法得知 Vps34 的活性可以被 3-methyladenine (3-MA) 或者是 wortmannin 抑制, 在細胞內有兩個自噬相關調節巨分子複合 (autophagy-regulating macromolecular complex), 第一個除了包含 Vps34 之外還包括了 Beclin 1/ Atg, Atg14/ barkor 以及 p150/vps15 ( 圖三 ),Vps34 的活性會因為與 Beclin 1 產生交互作用而增加 [32], 與 Beclin 1 交互作用後會引起細胞自噬包括有 ambra-1[33] UVRAG[34] 及 bif-1[35], 相反的, 若與抗凋亡蛋白 (anti-apoptotic) Bcl-2 或是 Bcl-X L 結合則會抑制細胞自噬作用的產生 [36], 當處於飢餓狀態時, 會活化 c-jun NH 2 -terminal kinase-1 (JNK1), 進而導致 Bcl-2 及 Bcl-X L 磷酸化 (phosphorylation), 因此釋出與它們相結合的 Beclin 1 並促使細胞自噬形成 [37] 第二個巨分子複合為 FIP200-ULK1/Atg1 複合體 [38], 此路徑會先經活化 class I PI3K 來影響 mtor (mammalian targets of rapamycin) 進而影響此巨分子複合體的作用,mTOR 有兩個複合體, 包括 mtor 複合體 1 (mtorc1) 和 mtor 複合體 2 (mtorc2), 兩者分別扮演著 17

19 彼此上游 (upstream) 和下游 (downstream) 的功能,mTORC1 對雷帕霉素 (rapamycin) 所產生的抑制作用非常敏感, 但是目前對於 mtorc2 的確實影響為何還不是很清楚 mtor 是一個很重要的訊息路徑調節者, 當 mtorc1 處於沒有被抑制的狀態時會活化 S6K1 誘發細胞走增生 (proliferation)[39-42], 倘若 mtorc1 被抑制的時候, 細胞就會走自噬路徑 ( 圖六 ) 此自噬路徑當中 Atg13 會結合到 ULK1 或其同質體 (homolog)ulk2 上, 並驅使兩者與 FIP200 進行交互作用, 在養分被剝奪的狀況下,Atg13 和 ULK1/2 會去磷酸化 (dephosphorylated), 因此 ULK1/2 會形成活化態即可去磷酸化 FIP200 進而引起自噬體的產生 [43] ( 圖四 ) 膜的延長 (elongation) 膜的延長目的為形成一個完整的雙膜結構小泡, 也就是自噬小體 (autophagosomes), 首先要從延長吞噬泡 (phagophores) 開始, 此階段需要從其他的胞器集結膜過來, 在這個過程中有兩個類泛素 (ubiquitin-like) 的反應會參與前自噬體結構的延長, 第一個參與反應的是類泛素蛋白 Atg12,Atg12 首先會受到 Atg7 (E1 ubiquitin activating enzyme-like) 的活化, 接著受到 Atg10 的活化 (E2 ubiquitin activating enzyme-like), 最後 Atg12 的 COOH 端甘胺酸 (COOH-terminal glycine) 18

20 會與 Atg5 內在離胺酸殘端 (internal lysine residue) 相結合形成共價 [44], 接著 Atg12-Atg5 會與 Atg16L1 相結合形成 800-kDa 複合含有 Atg12-Atg5.Atg16L1 的四聚合 (tetramers), 最後藉由 Atg16L1 的螺旋區域 (coiled-coil domain) 連結在吞噬泡上 [45], 此複合體在延長前自噬體膜 (pre-autophagosomal membrane) 的過程中扮演不可或缺的角色, 但是當自噬小體完全形成時, 此複合體會與其解離 第二個參與反應的類泛素蛋白包含了微管相關蛋白 1 輕鏈 3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3; MAP1-LC3/LC3/Atg8),LC3 是一個合成前驅物,Atg4B 蛋白酶會將其 COOH 端切斷形成 LC3-I[46, 47], 接著 LC3-I 經由 Atg7 (E1-like) 和 Atg3 (E3-like) 反應過後會接上磷脂醯乙醇胺 (phosphatidylethanolamine; PE) 形成 LC3-II[48, 49], 而 LC3-II 會特異性的接在正要延長的自噬體膜上, 與 Atg12-Atg5.Atg16L1 複合體不同的是,LC3-II 會停留在自噬體膜上直到自噬體與溶酶體結合再一起為止 膜成熟 (maturation) 及融合 (fusion) 完整的自噬小體會先與胞飲小體 (endosomes) 融合然後再與溶酶體 (lysosome) 結合, 自噬小體與溶酶體融合為同型的液泡膜 (homotypic vacuole membrane) 融合, 在哺乳動物細胞當中, 融合的過 19

21 程需要溶酶體膜蛋白 LAMP-2 的幫忙 [50], 雖然詳細的機制目前仍然不是很清楚, 在這結合的過程中有許多的蛋白質會參與其中, 包括 ESCRT SNAREs Rab7 及 class C Vps 蛋白 [51-53], 另外 UVRAG 為與 Beclin 1 交互作用的蛋白質, 會徵召融合 (fusion) 的結構至自噬小體當中參與最後自噬作用成熟的階段, 當溶酶體與自噬泡融合之後, 可以藉由溶酶體內的酵素消化自噬泡所包裹的胞器或蛋白質, 此時酸性泡內的 ph 質呈酸性, 若由 arcridine orange (AO) 染色會呈現橘紅色螢光的小顆粒, 此即為 AVO (acidic vesicular organelles), 可判定細胞自噬的指標之一 細胞自噬作用的過程可見 ( 圖五 ) 過去的研究認為細胞自噬是細胞用來抵抗不適當的環境尋求生存的反應, 不過越來越多的證據顯示 在細胞誘發過度的細胞自噬反而會促成細胞的死亡, 稱為細胞自噬性死亡 (autophgic cell death) 或第二型的細胞計畫性死亡 (type-ii program cell death)[54] 目前最被熟知的細胞死亡方式為細胞凋亡 (apoptosis)[55], 也是第一型的細胞計畫性死亡 (type-i program cell death), 其特徵為造成細胞縮小 細胞膜外翻 染色體收縮與片段性的細胞核 [56] 細胞凋亡主要會啟動一連串的蛋白酶 (protease), 尤其是 caspase 家族蛋白 目前研究顯示有兩個主要的路徑會啟動 caspase 的活化, 第一為外在路徑, 由細胞表面的死亡訊息接受器 (death-receptor), 例如 TNF (tumor necrosis 20

22 factor) CD95/Fas 或 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 等, 接收訊息後直接活化下游的 caspase-8, 活化 caspase-8 可以活化更下游的 caspase-3 造成細胞凋亡 ; 第二為內在途徑, 主要是造成粒線體外膜通透性增加 (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP), 造成粒線體內的 cytochrome c 釋放到細胞質中與 caspase-9 Apaf1 (apoptosis protease activating factor 1) 構成細胞凋亡小體 (apoptosome), 再由凋亡小體同樣活化更下游的 caspase-3 造成細胞凋亡 粒線體的外膜通透性主要由 BH3 (Bcl2 homology-3) 相關的蛋白控制,Bcl2 與 Bcl-xL 能維持粒線體的外膜通透性, 當細胞處於營養充分的狀況下,Beclin-1 會與 Bcl2 結合在一起, 當細胞處於氧化壓力下的時候 Beclin-1 會與 Bcl2 分離去磷酸化 PI3K, 進而活化下游的細胞自噬過程 [56] 相對於細胞凋亡, 由細胞自噬所造成的細胞死亡沒有染色體收縮與片段性的細胞核的特徵, 通常也沒有 caspase 活化的現象 [57] 然而在這樣死亡的細胞中可以觀察細胞質中有大量的的細胞自噬小體存在, 並包裹許多細胞內的胞器 許多的研究顯示, 細胞自噬與細胞凋亡是相互調控的, 在細胞凋亡機制被抑制時, 細胞就容易走向細胞自噬性死亡 ; 反之, 在細胞自噬受到抑制時, 細胞凋亡則越明顯 [57], 許多分子都被證實同時都參與細胞自噬與細胞凋亡的調控, 像活性氧 21

23 分子 (reactive oxygen species, ROS) p53 Bcl2 等 不同於細胞凋亡和自體吞噬作用, 細胞壞死會導致胞器腫脹 (swelling) 且細胞膜會破裂, 使許多的發炎分子流露出來導致發炎反應, 是為較不好的細胞死亡方式 1-6 運動對神經賀爾蒙及細胞激素之影響如果運動能力下降會使個體活動的能力下降且生活品質降低, 如果有規律性的運動可以降低健康成人的冠心症發生率 [58] 並增加健康人及心血管疾病病人的生存率 [59] 而對於心臟衰竭的病人來說, 運動訓練可以解除他們的症狀 改善運動表現以及生活品質並降低失能 住院時間及死亡率 [60] 運動在心臟衰竭病人各系統的惡性循環扮演了很重要阻斷的角色, 其中包括神經系統和神經賀爾蒙 [2], 運動訓練可以逆轉自主神經的失能, 使較活化的交感神經轉為活化副交感神經, 降低 baroreflex 的敏感性, 另外也可以降低正腎上腺素 血管加壓素 II 醛固酮和血管收縮素 (vasopressin) 等等 [2, 61], 藉以改善心臟功能, 降低血管收縮的情形, 使血液輸送到周邊的效益更好進而改善運動耐受度 運動除了對神經賀爾蒙的影響之外, 還可以降低一些促發炎細胞激素, 例如腫瘤壞死因子 介白素 -6 及介白素-1β[62], 並增加抗發炎細胞激素, 例如介白素 -10[63] 以及調節淋巴球的功能 [64] ( 圖七 ) 22

24 1-7 運動對 T 淋巴球死亡的影響高強度的運動 (>75% 最大耗氧量 ) 會增加氧化壓力而使淋巴細胞凋亡 [65], 造成在運動過後產生淋巴球缺少 (lymphopenia) 而易產生感染, 經由劇烈運動過後血液中的兒茶酚胺和可體松表現量會增加, 這些壓力賀爾蒙會經由抑制 β-adrenergic 進而造成壓抑免疫, 另外長期的運動訓練也可以對淋巴球的死亡情形產生改變, 在老鼠實驗當中經由長時間 (8 個月 ) 的跑步機訓練後, 可以讓 T 淋巴球的磷脂絲胺酸外翻的情形減少 [66], 而根據本實驗室過去的研究結果顯示, 單一次的低氧運動 (12% 氧氣濃度加上 50% 最大耗氧量 ) 反應會讓淋巴球的凋亡蛋白酶 -9 和 -3 的活化態增加, 且磷脂絲胺酸外翻的情形也有向上表現的情形 [67], 然而此情形經由為期一個月的低氧運動訓練後 (15% 氧氣濃度加上 50 最大做工量 ) 可以降低凋亡蛋白酶 -9 和 -3 的活化態並降低淋巴細胞死亡的量 [68], 而心臟病病人的體內為一個病理性低氧狀態, 也會讓正腎上腺素及可體松的表現量增加, 進而壓抑淋巴細胞, 這與環境的系統性低氧有相似的結果 1-8 運動對自體吞噬影響研究指出運動會引起自體吞噬作用的產生 [69], 在阻力型運動之後會經由 Vps34/Vps15 的活化增加自體吞噬作用以分解蛋白質為胺基酸並刺激 mtorc1, 而被活化的 mtorc1 會經由 S6K1 使蛋白質 23

25 合成增加, 此自體吞噬作用增加之目的為分解蛋白質以增加胺基酸的濃度並與蛋白質的合成作用產生平衡, 對人體形成一保護作用, 另外自體吞噬作用對於老化的肌肉系統來說也是一種保護機制, 此作用機制的缺損與細胞損傷和死亡有關, 研究顯示隨著老化的增加, 自體吞噬作用和粒線體氧化壓力所造成的損傷及細胞凋亡會成反比 [70], 而自體吞噬的清除功能可以經由長期的 8% 卡路里限制來增加, 藉以減少因老化而導致的粒線體氧化壓力所產生的損傷及細胞凋亡, 雖然長時間的運動訓練並無法加成此效益, 但卻會有類似的結果 [70], 目前已知運動對於自體吞噬作用以及對淋巴細胞的凋亡調節會有所影響, 但是對於此兩者之間相互作用機制卻仍然不清楚, 因此這也是本實驗想更進一步去探討的部分 1-9 有氧間隔性運動有氧間隔性運動是指短時間的高耗氧量及低耗氧量動態交替的運動過程 [71], 心臟運動復健是一種非藥物性介入可以改善心肺呼吸適能的介入方法, 且對於心血管疾病病人的整體健康來說是有好處的, 目前已經證實連續性的有氧運動訓練可以有效的降低心血管疾病的發生率與致死率 [72], 然而此種訓練方式卻有可能成為體適能表現較好的心血管疾病病人的次要選擇, 文獻指出高強度的間隔性運動訓練是一個很有效的方式可以改善坐式生活男性的最大有氧能力 24

26 [73], 而間隔性有氧運動訓練可以改善冠狀動脈疾病病人的最高耗氧量以及生活品質顯著高於傳統式的連續性運動訓練組 [74], 另外病人在有氧間隔性運動訓練期間可提高運動參與過程的變化性, 增加運動之樂趣與效益 然而目前對於有氧間隔性運動之研究仍十分不足, 因此對於其中會影響的細胞分子機制仍不清楚 1-10 實驗假說根據以上所述, 我們想要了解間隔性運動及連續性運動對 CD4 淋巴球調節細胞凋亡和自體吞噬的影響, 並更深入的探討其機制 所以假設有氧間隔性運動訓練比連續性運動訓練會有更好的體能表現, 且兩者都可以調節 CD4 淋巴球的細胞凋亡及自體吞噬情形 25

27 第二章材料與方法 2-1 材料 試劑藥品 試劑藥品稱 製造公司 DMEM/F12 Sigma Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Penicillin-streptomycin (10000X) GIBCO-BRL Polymorphprep TM Sigma Hanks balanced salt solution Merck (HBSS) Permeabilization Wash Buffer Sigma Fixation Buffer BioLegend DMSO ebioscience NaHCO 3 Serologicals Sodium Citrate BAKER 26

28 2-1-2 抗體 (Antibody) 抗體名稱 製造公司 Beclin 1 (DyLight 549) Novus Biologicals, LLC Atg1 (ULK1; E-20) Snata Cruz Biotechnology, INC Atg12 Cell Signaling LC3A Cell Signaling LC3B Cell Signaling LAMP-2 ebioscience AO BioVision mtor Cell Signaling Phospho-Bcl-2 Cell Signaling Annexin V BioVision Caspase3 BioVision 27

29 Caspase9 Rapamycin BioVision Cell Signaling Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 耗材 耗材名稱 製造公司 AQUAGUARD1 (Storage-20 ) Biological Industries, Sterile 100 mm 20 mm petri dish Corning 5 ml polystyrene Round-Bottom BD falcon Tube 50 ml centrifuge tubes Labcon 15 ml centrifuge tubes Labcon 2 ml Cryogenic vial Corning 500 ml Bottle Top Filter 45 mm Corning 28

30 Neck 500 ml Bottle Top Filter 33 mm Corning Neck 1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 m stripette Corning 儀器 儀器名稱 廠牌 固定式腳踏車 Stationary Ergometer CORIVAL,. V. Co 氧氣分析儀 SensorMedics 呼吸氣流速度偵 Hans Rudolph 測器 脈衝血氧計 model 9500, Nonin Onyx 血液計數器 Sysmex KX-21 Sysmex Co. (Kobe, Japan) 流式細胞螢光分 析儀 FACscan, Becton Dickinson, Immunocytometry system, Mountain View, CA, USA 29

31 離心機 Hettich zentrifugen, Hitach O5P-21 二氧化碳培養箱 Forma Scientific 可調速震盪器 Vortex-Genil 2, Scientific Industries Inc., NY, USA 磁石攪拌器 Thermolyne, Kuoyan 酸鹼度測量儀 Micro computer PH/ mv/temp METER 617, Kuoyan 電子微量天平 冷凍冰箱 a. 4 Sartorius Electronic Seminicro Balance, Explorer/ HAUS b. -20 c. -80 微量吸管 p10, p200, p1000, XL 3000i, Orange Scientific POR-V Mediclub Scientific 氣體控制暨偵測 30

32 面板 氧氣濃縮裝置 二氧化碳清除裝 置 2-2 方法 RPMI 培養液配置 圓底燒瓶加入 3500 ml Mini-Q 純水, 倒入四包 RPMI1640 粉末溶於其中, 並將殘留於包裝袋中的粉末以少量 Mini-Q 純水溶解再加入燒瓶內, 接著加入 8g NaHCO 3 及 40 ml Penicillin-streptomyocin, 使用磁石攪拌器攪拌均勻至完全溶解, 以 Mini-Q 純水將體積補為四公升, 其後以 1 N HCL 或 1 N NaOH 將培養液酸鹼值調整至 ph 7.4 將培養液通過無菌過濾器後儲存於無菌血清瓶, 保存於 4 冰箱, 使用時加入 10% FBS Rapamycin 配置 以 DMSO 將粉末狀 Rapamycin 泡製成 100μM, 最後加入細胞的濃度 為 500ηM 31

33 2-2-3 抗凝血劑 Sodium Citrate (0.106M) 配置 以 200 ml 0.9% 生理食鹽水加入 6.23g Sodium Citrate 粉末, 至 磁石攪拌器上混合均勻約 1 小時, 裝入瓶子中保存於 4 冰箱, 之後以 10:1 比例加入全血及 Sodium Citrate x Permeabilization Wash Buffer 稀釋 取 45ml mini-q 純水至 50 ml 塑膠離心管中, 加入 5 ml 10x Permeabilization Wash Buffer, 最終濃度稀釋為 1x 淋巴球萃取使用 20 號針頭經前臂靜脈血抽出 40 ml 血液各置入 4 管含有檸檬酸鈉 (sodium citrate) 抗凝血劑 (0.106M; 1:10 血液容積 ) 塑膠管內, 與抗凝血劑混合均勻後以 1000 rpm 10 分鐘離心, 去掉富含血小板之血漿 (plasma rich platelet; PRP), 接著加入 0.9% 生理食鹽水等倍稀釋, 混合均勻後平鋪於六管含 5ml 血球離心液 (Polymorphprep ) 的離心管內, 離心 1700 rpm 40 分鐘, 離出 PPP (platelet poor plasma), 之後取出單核細胞置於 2 ml 試管中, 加入 3~4 倍 HBSS 並離心 1700 rpm 5 分鐘沖洗乾淨, 重複兩次後加入 1 ml HBSS 沖起並使用 Sysmax SF-3000 細胞計數器調整細胞數目至 / ml 32

34 2-2-6 偵測輔助型 T 細胞自體吞噬狀態為得知輔助型 T 細胞自體吞噬及細胞凋亡情形, 將純化的淋巴球分為兩部分偵測, 一部分的純化淋巴球立即偵測自體吞噬及細胞凋亡的標記, 另一部分外加刺激物置放於培養箱 24 小時後再觀察一次細胞表面標記, 放置 24 小時的狀態可分為控制組 (Control, C; 不加入任何刺激物 ) Rapamycin 刺激 (R; 最終濃度 500ηM) Rapamycin 結 合 H 2 O 2 (RH; 500ηM Rapamycin 加上 200μM H 2 O 2 ) 以及 H 2 O 2 (200μM), 所有的刺激狀態皆放置在 5%CO 2 37 的培養箱當中, 除了 H 2 O 2 的刺激只觀察 mtor 刺激前後的表現之外, 其餘的刺激狀態皆要觀察所有自體吞噬及細胞凋亡的標記 觀察自體吞噬標記 (Beclin Atg1 Atg12 LC3A LC3B LAMP2 AO mtor Bcl2) 純化過的淋巴球置放在 500μl RPMI 含 10% FBS 培養液中並加入 CD4-APC 的抗體 (1:100)30 分鐘, 接著將未接上抗體的細胞離心掉 (1700 rpm,10 分鐘 4 ), 以 500μl fixation buffer 將細胞沖起並避光 20 分鐘, 離心過後 (1700 rpm,5 分鐘 4 ) 將細胞分為 12 管 (Beclin Atg1 Atg12 LC3A LC3B LAMP2 AO mtor Bcl2 Annexin V Caspase9 Caspased 3), 並離心 1700 rpm 5 分鐘 4, 其中 Beclin Atg1 Atg12 LC3A LC3B LAMP2 AO mtor Bcl2 以 1ml 1X 33

35 Permeabilization Wash Buffer 將細胞沖起, 立即離心 (1700 rpm,5 分 鐘 4 ) 過後再加 100μl 1X Permeabilization Wash, 分別加入 Beclin Atg1 Atg12 LC3A LC3B LAMP2 AO mtor 以及 Bcl2 抗體 (100:1) 避光 30 分鐘, 離心 (1700 rpm,5 分鐘 4 ) 之後,CD4 + Beclin + CD4 + LAMP2 + CD4 + AO + CD4 + mtor + 以及 CD4 + Bcl2 + 以 500μl HBSS 沖起, 經流式細胞儀波長 488nm 激發並各收取 顆細胞數目以 做事後分析 剩下的除了 CD4 + Atg1 + 加入 Donkey Anti-Goat IgG 避光 30 分鐘, 其 餘的 CD4 + Atg12 + CD4 + LC3A + CD4 + LC3B + 加入 Goat Anti-Rabbit IgG 避光 30 分鐘, 之後離心 (1700 rpm,5 分鐘 4 ) 並以 500μl HBSS 沖起, 經流式細胞儀波長 488nm 激發並各收取 顆細胞數目以 做事後分析 觀察細胞凋亡標記 取 / ml 淋巴球數目置放在 500μl RPMI 培養液含 10% FBS 中 並加入 CD4-APC 的抗體 (1:100)30 分鐘, 之後離心 1700rpm,5 分鐘 4, 接著以 500μl fixation buffer 沖起並避光 20 分鐘, 平分三管 (Annexin V Caspase9 及 Caspase3) 後離心 1700rpm,5 分鐘 4, 於 Annexin V 管子加入 500μl Annexin V Binding Buffer, 再加入 5μl Annexin V- PE 於室溫避光 5 分鐘, 即可以流式細胞儀波長 488nm 雷 34

36 射激發並收取 顆細胞進行事後分析 剩下的 Caspase9 及 Caspase3 管子 ( 深色 eppendorf) 以 100μl RPMI 含 10% FBS 培養液沖起, 分別加入 1μl (100:1) 的 Caspas9-FITC 和 Caspas3-FITC 抗體並放置於 5% CO2,37 培養箱當中避光 1 小時, 接著離心 3000rpm,5 分鐘, 以 500μl Washing buffer 沖起並離心 3000rpm,5 分鐘, 重複此步驟兩次之後以 500μl HBSS 沖起並轉移細胞至 flow tube 即可以流式細胞儀波長 488nm 激發收取細胞數目 顆以做事後分析 2-3 實驗方法 受試者選取我們需要收取年輕 (20~28 歲 ) 健康且生活型態為坐式生活 ( 每周運動少於一次 一次少於 20 分鐘並持續一年 ) 的 60 位男性參與本實驗, 受測者需平時無規律運動 無抽菸及喝酒 無服藥 無高山症病史者, 且無心血管相關疾病 免疫疾病 代謝疾病以及危險因子 ( 如糖尿病 高血壓 高血脂 ) 等, 於詳細了解本實驗流程後需簽署受試者同意書 ( 附錄一 ) 並填寫身體狀況與活動調查表 ( 附錄二 ), 才可開始參與本實驗, 若未符合各項條件者則會與以排除 受試者限制因子 每位受試者於 12% 低氧運動測試前皆需禁食 8 小時, 且於 24 小時前禁止執行劇烈運動, 並提醒不熬夜, 受試者需於早上 9 點 35

37 到達實驗室, 進行血壓 休息時心跳量測, 以及基本身體指標參數量測 ( 如身高 體重 ), 於整個低氧運動測試當天結束前皆不可進食, 只能攝取少量蘇打餅乾及開水 而一個月運動訓練後的 12% 低氧運動測試也為同樣標準 兩次最大運動測試 低氧運動測試以及整個運動訓練期間, 倘若受試者有意外傷害或感冒會影響到本實驗參數, 皆會立即終止此受試者的實驗參與 最大運動測試 此測試最大目的為訂定運動訓練之運動處方以及觀察經由運動訓練過後最大體能的進步表現, 首先受試者於半小時休息後, 會戴上面罩收集氣體參數, 運動測試期間全程監控心跳 血壓及血氧 依照一般的最大運動測試流程, 首先受測者於固定式腳踏車上先搜集五分鐘的休息 (resting) 參數, 接著踩兩分鐘無負載的作功量 (0 watt workload), 之後負載量每三分鐘增加 30 瓦, 直到 120 瓦以後, 負載量改由每三分鐘增加 20 瓦, 漸進式的增加直至受試者耗竭為止 低氧運動測試 此測試之目的為觀察經由運動訓練過後, 輔助型 T 淋巴球對低氧 的耐受度改變為何, 此測試在 12% 氧氣濃度的環境下進行中度運動, 36

38 運動模式為踩直立式腳踏車, 運動強度以最大運動測試的 60% 最大作工量連續踩 30 分鐘, 另外各有前後 5 分鐘的暖身期及緩和期, 在急性的低氧運動測試前後分別從前臂靜脈抽取 40ml 的血液並純化淋巴球以進行下一步的血液實驗 運動強度設定每位受測者於運動訓練前須經過一次漸進式最大運動測試 (progressive maximal exercise test), 有氧間隔性運動訓練組以 40% 和 80% 最大作工量 (maximal workload; Workload Max ) 各交替 3 分鐘的方式進行, 而連續性運動訓練以 60% 最大作工量做為運動訓練劑量 ( 圖八 ) 實驗組別 本實驗介入分為三個組別 : 有氧間性運動訓練組 (Aerobic interval exercise training; AIT) 連續性中度運動訓練組 (Moderate continues exercise training; MCT) 以及控制組 (Control; C) - 有氧間性運動訓練組 (20 位受試者 ): 運動強度 :40% 與 80% 最大作工量各 3 分鐘交替, 每次 5 回共 30 分鐘 運動頻率 : 一天 42 分鐘 ( 包含前後各六分鐘暖身期及緩和期 ), 37

39 一週五天, 連續五週 - 連續性中度運動訓練組 (20 位受試者 ): 運動強度 :60% 最大作工量, 連續 30 分鐘 運動頻率 : 一天 42 分鐘 ( 包含前後各六分鐘暖身期及緩和期 ), 一週五天, 連續五週 - 控制組 (20 位受試者 ): 不進行任何運動訓練介入, 只進行五周前後各一次的漸進式運動 測試及急性低氧運動測試 實驗流程 受試者須進行第一次最大運動測試, 以得知最大體能表現, 間隔兩天後再進行一次急性低氧運動測試, 接著隨機分配到三組運動訓練, 每一次的介入皆會量測受試者的血壓 心跳及血氧, 以確保受試者在一個非常安全的環境下進行實驗, 於運動訓練結束後間隔兩天再進行一次急性低氧運動測試以及最大運動測試以得知最大體能表現是否有進步以及對低氧的耐受性改變程度為何, 而在每一次的急性低氧運動測試前 後皆會與以抽血以離出淋巴球作檢測 ( 圖九 ) 38

40 第三章結果 (Results) 3-1 受試者基本資料 身體狀況和活動情形調查 有氧間隔性運動訓練組 訓練前, 平均年齡 22± 1 歲, 平均身高 1.72± 0.02 公尺, 平均體重 64.5± 3.8 公斤, 平均身體質量指數 (BMI)21.9± 1.3 Kg/m 2, 為正常年輕男性範圍內 ( kg/m 2 ) (ACSM, 2000 ) ( 表一 ) 訓練後, 除了年齡和身高不變之外, 平均體重 62.9± 3.3 公斤, 平均身體質量指數 (BMI)21.2± 1.1 Kg/m 2, 為正常年輕男性範圍內 ( kg/m 2 ) (ACSM, 2000 ) ( 表一 ), 訓練前後之基本參數值並無顯著差異 中度連續性運動訓練組 訓練前, 平均年齡 22± 1 歲, 平均身高 1.72± 0.03 公尺, 平均體重 66.2± 3.4 公斤, 平均身體質量指數 (BMI)22.3± 1.1 Kg/m 2, 為正常年輕男性範圍內 ( kg/m 2 ) (ACSM, 2000 ) ( 表一 ) 訓練後, 除了年齡和身高不變之外, 平均體重 66.7± 3.7 公斤, 39

41 平均身體質量指數 (BMI)22.5± 1.1 Kg/m 2, 為正常年輕男性範圍 內 ( kg/m 2 ) (ACSM, 2000 ) ( 表一 ), 訓練前後之基本參數 值並無顯著差異 所有受測者身體狀況和活動情形調查顯示 : 1. 病史 : 受測者皆沒有抽菸 喝酒 服藥 心血管呼吸系統 免疫方面疾病或高山症病史 2. 熬夜習慣 : 受測者除了考試期間大多無熬夜習慣, 因此在 實驗前一周內, 受試者被要求必須回復正常生活周期 3. 運動習慣 : 受測者皆無規律運動習慣, 只有偶而打球 ( 平 均每星期小於一次, 每次少於二小時 ) 3-2 兩組於訓練前後之體能表現 有氧間隔性運動訓練組 訓練前, 平均最大作功量 187± 13 瓦, 平均時間為 24±2 分鐘, 平均最大心跳速率 195± 4 bpm, 平均最大換氣量 110.6± 4.02 L/min, 平均最大耗氧量 42.41± 0.82 ml/min/kg, 平均呼吸商 1.2± 0.01 ( 表二 ) 40

42 訓練後, 平均最大作功量 250± 14 瓦, 平均時間為 33±2 分鐘, 平均最大心跳速率 198± 2 bpm, 平均最大換氣量 128.6± 6.37 L/min, 平均最大耗氧量 54.63± 1.53 ml/min/kg, 平均呼吸商 1.19± 0.01 ( 表二 ) 中度連續性運動訓練組 訓練前, 平均最大作功量 183± 10 瓦, 平均時間為 23±1 分鐘, 平均最大心跳速率 196± 6 bpm, 平均最大換氣量 104.7± 2.71 L/min, 平均最大耗氧量 42.41± 0.45 ml/min/kg, 平均呼吸商 1.22± 0.00 ( 表二 ) 訓練後, 平均最大作功量 223± 13 瓦, 平均時間為 29±2 分鐘, 平均最大心跳速率 198± 5 bpm, 平均最大換氣量 ± 1.2 L/min, 平均最大耗氧量 47.19± 0.13 ml/min/kg, 平均呼吸商 1.2± 0.00 ( 表二 ) 3-3 有氧間隔性及中度連續性運動訓練對 CD4 淋巴球在低氧運動時細胞凋亡及自體吞噬的影響 mtor 第一天的急性低氧測試 mtor 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小 時後, 兩組於控制及 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動前 後都會有下 41

43 降之情形 ( 圖十 ) Beclin 第一天的急性低氧測試 Beclin 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十一 ) Atg1 第一天的急性低氧測試 Atg1 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十二 ) LC3B 第一天的急性低氧測試 LC3B 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十三 ) Atg12 第一天的急性低氧測試 Atg12 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無 42

44 論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十四 ) LAMP2 第一天的急性低氧測試 LAMP2 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十五 ) AO 第一天的急性低氧測試 AO 的表現在運動訓練前都會有下降的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會增加, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有上升之情形 ( 圖十六 ) Bcl2 第一天的急性低氧測試 Bcl2 的表現在運動訓練前都會有上升的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會下降, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下在運動訓練前會增加, 而在運動訓練後表現量都會有下降之情形 ( 圖十七 ) Caspase 9 第一天的急性低氧測試 Caspase 9 的表現在運動訓練前都會有上升的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會下降, 經由置放 24 43

45 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有下降之情形 ( 圖十八 ) Caspase 3 第一天的急性低氧測試 Caspase 3 的表現在運動訓練前都會有上升的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會下降, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下無論是在運動訓練前 後都會有下降之情形 ( 圖十九 ) PS exposure 第一天的急性低氧測試 PS exposure 的表現在運動訓練前都會有上升的情形, 而經由五周的運動訓練後表現量都會下降, 經由置放 24 小時後, 兩組於控制 Rapamycin 及 Rapamycin 加上 H 2 O 2 刺激狀態下在運動訓練前表現量會增加而在運動訓練後表現量會下降 ( 圖二十 ) 44

46 第四章初步結論 目前為止本實驗僅收取有氧間隔性運動訓練及中度連續性運動訓練各六位受試者, 從本實驗初步結果當中可以得知 : 1. 五週後, 無論是有氧間隔性運動訓練還是中度連續性運動訓練都可以增加最大作工量 運動測試時間 最大換氣量及最大耗氧量, 在運動體能的表現上兩組皆有顯著進步, 但有氧間隔性運動訓練組的進步程度比中度連續性運動訓練還要來的大 2. 於兩組運動訓練前,CD4 + 淋巴球在自體吞噬的表現上皆會有下降之情形而細胞凋亡的標記皆會向上表現, 經過 24 小時刺激之後, 自體吞噬的表現相反的皆會有向上表現的情形而細胞凋亡情形會下降, 表示單一次的急性低氧會促使細胞走向凋亡的情形增加, 但是經由一天過後細胞可以以自體吞噬的方式來修正細胞凋亡的情形 3. 於兩組運動訓練後, 單一次的急性低氧後會使 CD4 + 淋巴球在 PS exposure 的表現量會下降, 但在自體吞噬的標記表現增加, 而細胞凋亡的標記表現會下降, 顯示經由五週的運動訓練過後細胞死亡的量會下降, 而其中細胞凋亡情形下降 自體吞噬情形增加 4. 兩組運動訓練前後各自對急性低氧運動的挑戰但其中死亡的表現當中從細胞凋亡表現轉移 (shift) 成自體吞噬的調節方式 45

47 圖一 99 年國人主要十大死亡原因 From: department of health, Executive Yuan in Taiwan 46

48 圖二壓力刺激影響心臟流程圖 47

49 圖三 Beclin 1 與 Bcl2 交互作用情形 48

50 圖四 mtor 與 Atg1 交互作用情形 49

51 圖五自體吞噬過程及其作用分子 50

52 圖六 mtor 調節自體吞噬及細胞增生路徑 51

53 圖七運動訓練對心臟衰竭之益處 52

54 圖八有氧間隔性及連續性運動訓練運動模式 53

55 圖九實驗流程圖 54

56 圖十 mtor 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 H:H 2 O 2 刺激 24 小時 55

57 圖十一 Beclin 1 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 56

58 圖十二 Atg1 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 57

59 圖十三 Atg1 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 58

60 圖十四 Atg12 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 59

61 圖十五 LAMP-2 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 60

62 圖十六 AO 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 61

63 圖十七 Bcl-2 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 62

64 圖十八 Caspase-9 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 63

65 圖十九 Caspase-3 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 64

66 圖二十 PS exposure 於兩組運動訓練組的表現 左圖 : 有氧間隔性運動訓練組右圖 : 連續性運動訓練組藍色 : 訓練前休息狀態紅色 : 訓練前低氧運動後綠色 : 訓練後休息狀態紫色 : 訓練後低氧運動後 C-0: 第一天控制組 C: 置放 24 小時控制組 R:Rapamycin 刺激 24 小時 HR:Rapamycin 加 H 2 O 2 刺激 24 小時 65

67 表一受試者基本資料 AIT:Aerobic interval exercise training-pre-training T-AIT:Aerobic interval exercise training-post-training 66

68 表二兩組運動訓練體能表現情形 AIT:Aerobic interval exercise training-pre-training T-AIT:Aerobic interval exercise training-post-training 67

69 參考文獻 leadin cause of death. department of health, Executive Yuan in Taiwan, Crimi E, I.L., Cacciatore F and Napoli C, Mechanisms by which exercise training benefits patients with heart failure. Nat. Rev. Cardiol, Vaartjes, I., Hoes, AW., Reitsma, JB., Bruin, A de., Grobbee, DE., Mosterd, A., Bots, ML., Age- and gender-specific risk of death after first hospitalization for heart failure. BMC Public Health, : p McEwen, B., Physiology and neurobiology of stress and adaptation: central role of the brain. Physiol. Rev., : p Davis AM, B.N., Brain-heart interactions. The neurocardiology of arrhythmia and sudden cardiac death. Heart Inst. J., : p Pedersen BK, H.-G.L., Exercise and the immune system: regulation, integration, and adaptation. Physiol Rev, : p Dhalla, N.S., Sasaki, H., Mochizuki, S., Dhalla, K.S., Liu, X., and Elimban, V., Catecholamine-induced cardiomyopathy. In Cardiovascular toxicology. 3rd ed. Edited by D. Acosta, Jr. CRC Press, New York., 2001: p Ishigai, Y., Mori, T., Moriyama, S., and Shibano, T., Induction of cardiac beta-adrenergic receptor kinase 1 in rat heart failure caused by coronary ligation. J. Mol. Cell. Cardiol, : p Castellano, M., and Bo hm, M., The cardiac beta-adrenoceptor- mediated signaling pathway and its alterations in hypertensive heart disease. Hypertension, : p Sethi, R., Saini, H.K., Guo, X., Wang, X., Elimban, V., and Dhalla, N.S., Dependence of changes in beta-adrenoceptor signal transduction on type and 68

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71 Catecholamineinduced leukocytosis: early observations, current research, and future directions. Brain Behav Immun, : p Rockman, H., Koch, WJ., Lefkowitz, RJ., Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function. Nature, : p Iaccarino, G., Barbato, E., Cipolletta, E., Amicis, VD., Margulies, KB., Leosco, D., Trimarco, B., Koch3, WJ., Elevated myocardial and lymphocyte GRK2 expression and activity in human heart failure. Eur Heart J, : p Anker, S., von Haehling, S., Inflammatory mediators in chronic heart failure: an overview. Heart, : p Haehling, S., Schefold, JC., Jankowska, E., Doehner, W., Springer, J., Strohschein, K., Genth-Zotz, S., Volk, HD., Poole-Wilson, P., Anker, SD., Leukocyte Redistribution: Effects of Beta Blockers in Patients with Chronic Heart Failure. PLoS ONE, : p. e Domenico, A., Mihai, Gheorghiade., Luigi, Trojano., Giuseppe, Furgi., Evasio, Pasini., Costantino, Picone., Antimo, Papa., Gian Luca, Iannuzzi., Robert O, Bonow., Franco, Rengo., Benevento., Brescia., Naples., Relative lymphocyte count: a prognostic indicator of mortality in elderly patients with congestive heart failure. Am Heart J, : p SAKATANI, T., HADASE, M., KAWASAKI, T., KAMITANI, T., KAWASAKI, S., SUGIHARA, H., Usefulness of the Percentage of Plasma Lymphocytes as a Prognostic Marker in Patients With Congestive Heart Failure. Jpn Heart J, : p Lamarca, B., The role of immune activation in contributing to vascular dysfunction and the pathophysiology of hypertension during preeclampsia. Minerva Ginecol., : p

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73 tumour suppressor activity of a novel Beclin1- binding protein UVRAG. Nat Cell Biol, : p Takahashi Y, C.D., Matsushita N, Cualing HD, Sun M, Sato Y, Liang C, Jung JU, Cheng JQ, Mul JJ, Pledger WJ, Wang HG., Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis. Nat Cell Biol, : p Pattingre S, T.A., Qu X, Garuti R, Liang XH, Mizushima N, Packer M, Schneider MD, Levine B., Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell, : p Wei Y, P.S., Sinha S, Bassik M, Levine B., JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 regulates starvation-induced autophagy. Mol Cell, : p Ganley IG, L.d.H., Wang J, Ding X, Chen S, Jiang X., ULK1.ATG13.FIP200 complex mediates mtor signaling and is essential for autophagy. J Biol Chem, : p Yang Q, G.K., Expanding mtor signaling. Cell Res, : p O Reilly KE, e.a., mtor inhibition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates Akt. Cancer Res, : p Tremblay F, G.A., Veilleux A, Sorisky A, Marette A., Activation of the mammalian target of rapamycin pathway acutely inhibits insulin signaling to Akt and glucose transport in 3T3-L1 and human adipocytes. Endocrinology, : p Sun SY, e.a., Activation of Akt and eif4e survival pathways by rapamycin-mediated mammalian target of rapamycin inhibition. Cancer Res, : p Chang YY, N.T., An Atg1/Atg13 complex with multiple roles in TOR-mediated 72

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75 G., Deletion of the SNARE vti1b in mice results in the loss of a single SNARE partner, syntaxin 8. Mol Cell Biol, : p Gutierrez MG, M.D., Beron W, Colombo MI., Rab7 is required for the normal progression of the autophagic pathway in mammalian cells. J Cell Sci, : p Rusten TE, V.T., Lindmo K, Rodahl LM, Nezis IP, Sem-Jacobsen C, Wendler F, Vincent JP, Brech A, Bilder D, Stenmark H., ESCRTs and Fab1 regulate distinct steps of autophagy. Curr Biol, : p Baehrecke, E., Autophagy: dual roles in life and death?. Nat Rev Mol Cell Biol, : p Lockshin, R. and Z. Zakeri, Programmed cell death and apoptosis: origins of the theory. MNat Rev Mol Cell Biol, : p Danial, N., and Korsmeyer, S., Cell death: critical control points.. Cell, : p Edinger, A., and Thompson, C., Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.. Curr Top Dev Biol, : p Thompson, P.e.a., exercise and physical activity in the prevention and treatment of atherosclerotic cardiovascular disease: a statement from the Council on Clinical Cardiology (subcommittee on exercise, rehabilitation, and Prevention) and the Council on Nutrition, Physical Activity, and Metabolism (subcommittee on Physical Activity). Circulation, : p Myers, J.e.a., exercise capacity and mortality among men referred for exercise testing. N. Engl. J. Med., : p Piepoli, M., Davos, C., Francis, DP. & Coats, AJ., exercise training meta-analysis of trials in patients with chronic heart failure (extramatch). BMJ, : p

76 61. Ferrara, r.e.a., Neurohormonal modulation in chronic heart failure. Eur. Heart J. Supplements, : p. D3 D Adamopoulos, s.e.a., Physical training modulates proinflammatory cytokines and the soluble Fas/soluble Fas ligand system in patients with chronic heart failure. J. Am. Coll. Cardiol., : p Nunes, r.b.e.a., Physical exercise improves plasmatic levels of il-10, left ventricular enddiastolic pressure, and muscle lipid peroxidation in chronic heart failure rats. J. Appl. Physiol., : p Batista, M.L.J.e.a., endurance training modulates lymphocyte function in rats with post-mi CHF. Med. Sci. Sports. Exerc., : p Wang, J., Huang, YH., Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur J Appl Physiol, : p Boudreau, J., and Hoffman-Goetz, L., Long-duration freewheel running and submandibular lymphocyte response to forced exercise in older mice. Can. J. Physiol. Pharmacol, : p Wang, J., Lin, CT., Systemic hypoxia promotes lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress during moderate exercise. Eur J Appl Physiol, : p 陳婉翎, 低氧運動訓練對淋巴球之凋亡與再分佈的影響. 碩士論文, Mackenzie, M., Hamilton, DL., Murray, JT., Baar, K., mvps34 is activated by an acute bout of resistance exercise. Biochemical Society Transactions, : p Wohlgemuth, S., Seo, AY., Marzetti, E., Lees, HA., Leeuwenburgh, C., Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging: Effectsof calorie restriction and life-long exercise. Exp Gero, : p Vogiatzis, I., et al., Dynamic hyperinflation and tolerance to interval exercise 75

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78 附錄一 受試者參與實驗同意書本實驗是在探討間隔性或連續性運動訓練前後, 對於調節輔助行 T 淋巴球細胞凋亡及自噬作用的影響 如果您是年輕健康 年齡為 20~28 歲之間且生活型態為坐式生活 ( 每周運動少於一次 一次少於 20 分鐘並持續一年 ) 的男性同意參與本實驗, 您必須到本實驗室進行每次 42 分鐘的間隔性或連續性運動訓練, 包括前後各六分鐘的暖身期及緩和期, 一周五次持續五周, 運動訓練前後各有一次最大運動測試及環境氣體合併中度運動測試, 每次測試皆會全程監控心跳及血壓, 兩次環境氣體合併中度運動測試前 後均抽取血液以了解內皮前驅細胞凋亡及自噬作用的影響, 每次抽取 40c.c 的血液, 介入前 後共 80c.c, 並於抽血前後給予水分補充, 使血容積快速恢復 另外, 您是否同意本實驗室收集檢體與幫您處理剩餘血液檢體 : 同意 不同意假如同意則血液剩餘檢體用漂白水洗淨銷毀, 廢水與廢試管集體收集並丟置學校滅菌室統一處理 所有受測者須在規定時間內準時抵達接受測驗 受測者需為非吸煙且無心血管相關疾病或危險因子者 ( 如高血壓 糖尿病或氣喘 ), 並在受測前兩星期與受測期間禁服任何藥物 受測者於測驗前 24 小 77

79 時禁止從事任何劇烈運動, 並建議於測驗前 8 小時禁食 此外, 我們為了解您的身體狀況及活動情形, 另訂問卷於後, 請您務必詳實填寫 身體狀況與活動情形調查表 本實驗可能造成的危險及不適如下 : 1. 抽血時可能有點痛, 就像您過去打針的經驗 除此暫時疼痛之外, 應無其他的不適感 十人當中可能會有一人輕微皮下瘀青, 至於更嚴重的併發症 ( 例如感染 ) 發生機率小於千分之一, 安全性相當高 ; 不過瘀青現象並不多見, 假如有, 初期先經冰敷, 再熱敷數天後即可消失 2. 採用最小針頭 (21 號頭皮針 ) 抽血, 抽完血後, 用消毒棉球蓋住穿刺孔, 以 3M 膠帶固定, 壓迫手臂採血部位五分鐘止血, 休息 10~15 分鐘後確定無滲血及流血之疑慮, 則開始運動 ; 運動結束後確定受測者無不適症狀則離開腳踏車, 坐在固定椅子上開始抽血, 並重複以上抽血步驟 穿刺孔部位滲血或出血機率非常低, 如有出血應抬高手臂並繼續壓迫局部 3. 低氧設定屬安全環境, 危險發生率相當低, 但為避免意外, 安全措施如下 : a 隨時監測心跳 血壓 血氧濃度與精神狀態, 若感覺不適, 如頭暈痛 噁心 嘔吐感 呼吸困難, 會請您立即離開低氧 78

80 室 b 室外備有 100% 純氧, 以備可能有較嚴重的高山症症狀發生 c 另有其他任何狀況, 本實驗室有緊急聯絡醫師黃書群, 聯絡電話 : 如果您有任何疑問, 歡迎您提出, 我們很樂意提供進一步解釋 您於研究過程中隨時可退出本研究計畫, 撤回之前的同意 若您完成本實驗, 將可獲得交通營養費 萬一您依研究者之指示而受傷, 我們將免費提供急救, 但無其他補償 若因您隱瞞您的病情而發生意外, 概不負責 實驗結果可能發表於學術性雜誌, 但受試者姓名將不會公佈, 同時受試者隱私將給予絕對之保密 本人已詳閱上述資料, 有關本研究計畫之疑問也經計畫主持人詳細解釋, 本人同意接受為本研究計畫之自願受試者 受試者簽名 : 日期 : 計畫主持人簽名 : 日期 : 證人簽名 : 日期 : 79

81 附錄二 身體狀況與活動情形調查表 日期 : 研究者 : 受測者姓名出生日期年月日性別體重公斤身高公分血型 聯絡地址 電話 下列問卷題目將有助於實驗時受測者之基本資料之瞭解, 務請詳實填 寫 甲 身體狀況及病史是否 1. 您是否有經常服藥的習慣 ( 例如阿斯匹靈 消炎藥或降血脂藥 )? 如有, 請列藥名 2. 最近兩星期是否有服藥? 如有, 請列藥名 3. 您是否曾在運動中休克 暈倒或接受急 80

82 救?. 4. 您是否曾心悸 胸痛或呼吸困難的現象? 5. 您是否有心臟血管疾病 ( 如冠狀動脈疾病 高血壓或心律不整 )? 如有, 請列出 6. 您是否有其他先天或慢性疾病 ( 如糖尿病 肺疾病或血液疾病 )? 如有, 請列出 7. 您是否有氣喘等過敏病史? 8. 您是否曾對藥物或食物過敏? 若有, 請列出 9. 您是否曾開過刀? 如有, 因何而開? 癒後如何? 10. 您是否罹患肝炎?( 如 B 型或 C 型肝炎 )? 11. 您是否曾在登高 ( 爬山 ) 時發生高症? 81

83 12. 您是否抽煙? 13. 您是否有喝酒習慣? 14. 您是否有熬夜習慣? 15. 您是否有服用維他命的習慣? 如有, 請列出 乙 活動情形 1. 您是否喜愛運動? 何種運動? 2. 您目前是否有規律運動習慣? 如有, 時間 頻率與強度如何? 3. 您是否參加過運動比賽? 如有, 比賽種類及最佳成績為何? 4. 您是否能竭盡體力, 完成運動目標? 5. 您是否曾從事登高運 82

84 動? 若有, 頻率為何? 6. 其他? 83