698 4 期 1 材料与方法 1.1 样品与培养基原油样品来自于天津渤海石油钻井平台轻质原油. CTAB- 亚甲基蓝平板可以通过菌落周围的深蓝色晕圈来鉴别能够分泌鼠李糖脂的细菌 [11]. 其培养基成分有 (g/ L):KH 2 PO Na 2 HPO NaNO 3 2

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彼陌李
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1 DOI: /SP.J 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2016,22 ( 4 ) : * 张翠坤杨白雪常冬妹杨洪江 ** 天津科技大学, 工业微生物教育部重点实验室, 天津市工业微生物重点实验室天津摘要铜绿假单胞菌是生物表面活性剂鼠李糖脂最主要的生产菌株, 对石油增溶降解有很好的效果. 从轻质原油样品中富集分离获得菌株 D1, 利用 CTAB- 亚甲基蓝平板法初步确定该菌株可以合成鼠李糖脂, 分析其 16S rrna 基因序列确定菌株 D1 属于铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa). 以菜籽油和甘油为碳源, 菌株 D1 能够分别合成 18.4 g/l 和 11.4 g/l 鼠李糖脂. 分析菌株 D1 可利用碳氢化合物种类, 发现在以原油和柴油的培养基中,D1 细胞数量分别增加了 39.2 倍和 33.9 倍. 在 10 d 培养过程内, 菌株 D1 能够分解基本培养基中 33.3% 的原油. 相同时间内, 补加 0.5 g/l 的甘油, 菌株 D1 能够分解培养基中 71.8% 的原油. 上述表明菌株 D1 能够合成鼠李糖脂和有效地降解原油, 在石油污染的生物修复方面具有较好的应用潜力. ( 图 8 表 1 参 30) 关键词铜绿假单胞菌 ; 鼠李糖脂 ; 原油降解 ; 碳氢化合物 ; 菜籽油 ; 甘油 CLC X172 Pseudomonas aeruginosa D1: rhamnolipid production and crude oil degradation* ZHANG Cuikun, YANG Baixue, CHANG Dongmei & YANG Hongjiang ** Ministry of Education Key Laboratory of Industrial Microbiology, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin , China Abstract Pseudomonas aeruginosa is the main rhamnolipid producing strain used in crude oil degradation. Strain D1 was first isolated from light crude oil samples by an enrichment method. It was further confirmed producing rhamnolipid on CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) methylene blue plate. With 16S rrna gene sequence analysis, strain D1 was identified belonging to the species Pseudomonas aeruginosa. Using rapeseed oil and glycerol as carbon sources, strain D1 was able to yield 18.4 g/l and 11.4 g/l rhamnolipid, respectively. Different hydrocarbons were evaluated as carbon source for the growth of strain D1. In the presence of crude oil and diesel, D1 cell concentrations increased by 39.2-fold and 33.9-fold, respectively, in minimal medium cultures. Within 10 d incubation, strain D1 degraded 33.3% crude oil in the complex minimal medium, but 71.8% crude oil under the same condition with supplement of 0.5 g/l glycerol. Our results showed that the isolated strain D1 could synthesize a relatively high level of ramnolipid and efficiently degrade crude oil. It would have a promising potential in bioremediation of crude oil contaminated environments. Keywords Pseudomonas aeruginosa; rhamnolipid; crude oil degradation; hydrocarbon;rapeseed oil;glycerol 在石油的开采运输和使用中, 经常会有石油外泄或排放不当的情况发生, 环境修复特别是生物修复对于保护生态环境具有重要意义 [1]. 生物修复是利用微生物把原油降解成低分子量化合物, 并利用其为碳源进行生长. 生物修复方法是一种绿色的烃类污染治理方法, 不会恶化环境. 到目前为止, 已发现分别来源于 70 个属的 200 余种微生物具有原油降解能力 [2]. 然而, 由于非水溶性的石油烃类生物可利用性较低, 生物降解石油的效率普遍不高 [3]. 有研究发现, 生物表面活性剂能够显著促进石油的降解效率, 这是由于生物表面活性剂从细胞表面吸附脂多糖, 使细胞表面疏水性增加, 促进细胞与原油液滴直接接触, 从而有利于对其的利用 [4]. 生物表面活性剂是指由微生物分泌的同时具有亲水收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 国家自然科学基金项目 ( ) 资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China ( ) ** 通讯作者 Corresponding author ( hongjiangyang@tust.edu.cn) 性基团和疏水性基团的化合物, 鼠李糖脂是最常见的一种糖脂类生物表面活性剂 [5]. 在生物降解过程中添加鼠李糖脂, 能够明显促进总石油烃 (Total petroleum hydrocarbons,tph) 的降解 [6]. 鼠李糖脂生产菌株一般为假单胞菌属, 尤其是铜绿假单胞菌 [7]. Mercadé 等人发现, 铜绿假单胞菌 JAMM NCIB 能够以橄榄油工厂废水为唯一碳源生长 [8]. Abalos 等利用大豆炼油厂废弃物为底物, 铜绿假单胞菌 AT10 可产生鼠李糖脂 [9]. 产鼠李糖脂微生物在治理石油烃污染过程中, 通过鼠李糖脂促进难溶有机物的分散和吸收. Urum 等人曾研究通过喷洒鼠李糖脂和十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate,sds) 两种表面活性剂来去除土壤中掺杂的原油 [10]. 本研究直接从原油中筛选产鼠李糖脂的细菌, 对其产鼠李糖脂水平和对原油等碳氢化合物的降解效率进行分析, 并探讨甘油对原油降解效率的影响, 为生物法治理石油污染环境提供了理论基础和技术支持.

从轻质原油样品中富集分离获得菌株 D1, 利用 CTAB- 亚甲基蓝平板法初步确定该菌株可以合成鼠李糖脂, 分析其 16S rrna 基因序列确定菌株 D1 属于铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa). 以菜籽油和甘油为碳源, 菌株 D1 能够分别合成 18.4 g/l 和 11.4 g/l 鼠李糖脂.

2 698 4 期 1 材料与方法 1.1 样品与培养基原油样品来自于天津渤海石油钻井平台轻质原油. CTAB- 亚甲基蓝平板可以通过菌落周围的深蓝色晕圈来鉴别能够分泌鼠李糖脂的细菌 [11]. 其培养基成分有 (g/ L):KH 2 PO Na 2 HPO NaNO 3 2 MgSO CaCl 甘油 20 CTAB 0.2 亚甲基蓝微量元素母液 1 ml/ L 琼脂粉 15, 培养基 ph 为 6.8. 无机盐培养基配方为 (g/l):nacl 1 KCl 1 NaNO 3 6 KH 2 PO 4 3 Na 2 HPO MgSO CaCl 2 1 微量元素溶液 1 ml/l, 培养基的 ph 为 6.8. 微量元素溶液配方为 (g/l):fecl ZnSO CuSO MnSO H 3 BO 产鼠李糖脂培养基和原油降解培养基为在无机盐培养基中添加一定量的碳源, 包括甘油菜籽油原油等. 1.2 轻质原油中微生物的分离向无菌无机盐培养基中添加 5 ml 原油,37 摇床振荡培养. 摇瓶内培养基变浑浊后取样用生理盐水 (0.9% NaCl) 稀释后涂布在 LB 平板上. 选择生长出的单菌落点接在 CTAB- 亚甲基蓝琼脂平板上 [12], 将菌落周围出现深蓝色晕圈的菌株, 三区划线纯化后保存. 1.3 分离菌株分子生物学鉴定提取分离菌株基因组 DNA [13], 以其基因组 DNA 为模板, 使用通用引物 27F 和 1492R 对 16S rrna 基因进行扩增. PCR 程序包括预变性 94,5 min; 变性 95,1 min, 退火 53,1 min, 延伸 72,1.5 min,30 个循环 ; 终延伸 72,10 min [14]. 采用引物 27F 和 1492R 对扩增产物进行测序, 序列同源性在 NCBI 网站上的 BLAST 工具进行比对. 采用软件 MEGA5.0 中的 Neighbor-joining 计算方法,Bootstrap 选择次重复, 模型选择核酸 p-distance, 构建系统发育树 [15]. 1.4 鼠李糖脂产量的测定鼠李糖基团在强酸下被水解生成甲基糠醛, 然后与蒽酮生成蓝绿色化合物, 其在 625 nm 波长处的吸光度与浓度呈线性关系. 根据鼠李糖与鼠李糖脂分子量, 鼠李糖脂浓度 = 3.4 鼠李糖浓度 [16]. 配制 mg/l 的鼠李糖标准溶液, 分别取 1.25 ml 标准溶液与 2.5 ml 蒽酮硫酸溶液冰浴中混合, 混匀后沸水浴中反应 15 min 充分显色. 待反应液温度下降到室温, 测定 625 nm 波长下的吸光度值 [17], 绘制吸光度值与鼠李糖浓度的标准曲线. 得到吸光度值与鼠李糖浓度之间的关系 :y = x ,y 为吸光度值,x 为 L- 鼠李糖 (mg/l), 线性相关系数为 , 线性关系很强, 可以用来计算鼠李糖浓度. 将分离到的菌株接种到 LB 培养基中振荡培养过夜, 按照 3% 接种量转接到发酵培养基中, r/min 振荡培养 72 h. 发酵液 r/min 离心 10 min, 上清液稀释合适的倍数后取 1.25 ml 稀释液与 2.5 ml 蒽酮硫酸溶液于冰浴中混合, 并沸水浴 15 min 使反应完全, 待温度降到室温左右测定反应液在 625 nm 下的吸光度值. 将吸光度值代入标准曲线公式后计算出鼠李糖的浓度并乘以换算指数 3.4 算出鼠李糖脂含量 [16]. 1.5 鼠李糖脂的分离纯化及性质分析将发酵液 r/min 离心 10 min 后, 取上清液对鼠李糖脂进行纯化. 首先, 使用 6 mol/l 的 HCl 将上清液 ph 调至 2.0 左右, 然后与等体积的氯仿甲醇溶液 (2:1,V/V) 混合, 在分液漏斗中充分振荡后静置 15 min 分层, 取上层溶液再重复萃取一次, 合并下层有机相溶液. 45 水浴旋转蒸发去掉有机溶剂后, 用 0.05 mol/l 的 NaHCO 3 溶液重悬即得纯化的鼠李糖脂溶液 [18]. 对纯化后的鼠李糖脂溶液进行薄层色谱分析 (Thin layer chromatography,tlc), 展开剂为氯仿甲醇乙酸溶液 (65:15:2,V/V /V) [19], 显色剂为苯酚硫酸溶液 ( 苯酚 : 硫酸 : 酒精 = 3 g : 10 ml : 25 ml), 喷洒显色剂后烘烤显色. 迁移率 (R f ) 计算公式为 :R f = 样品迁移距离 / 溶剂迁移距离. 红外光谱 (Fourier Transform Infrared Spectrometer, FTIR) 可以通过鉴定化学键和功能基团, 从而确定混合物中的某种组分. 将冷冻干燥的表面活性剂粉末与 KBr( 样品 :KBr = 1: )10 MPa 压片 1 min 形成半透明薄片, 进行红外吸收光谱扫描. 1.6 分离菌株对碳氢化合物的利用能力分析以细菌的增长数量表征分离菌株对碳氢化合物的利用能力. 将分离菌株 D1 分别接种到含 5 g/l 不同碳氢化合物 ( 柴油正己烷液体石蜡原油菜籽油甘油 ) 的发酵培养基中, r/min 振荡培养. 每 24 h 取样, 用生理盐水稀释合适倍数后涂布在 LB 平板上培养并计数, 计算出发酵液中细菌的浓度 (cfu/ml). 1.7 原油降解效率的测定将原油溶解在石油醚 ( 沸程 ) 中, 其在紫外波长处的吸光度与原油浓度成正比, 可以根据其吸光度值定量分析石油的浓度 [20]. 在 nm 范围下对 100 mg/l 的原油溶液进行吸光度值扫描 ( 图 1A). 由图可见, 原油溶液在 225 nm 处有最高吸光度值, 且具有典型性峰形, 因此确定 225 nm 为图 1 原油溶液浓度标准曲线. A: 原油溶液波长扫描 ;B: 原油溶液标准曲线. Fig. 1 Standard curve of crude oil solution. A: wavelength scanning of crude oil solution; B: a standard curve of crude oil solution. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

5 CuSO 4 0.15 MnSO 4 1.5 H 3 BO 3 1.5. 产鼠李糖脂培养基和原油降解培养基为在无机盐培养基中添加一定量的碳源, 包括甘油菜籽油原油等. 1.2 轻质原油中微生物的分离向无菌无机盐培养基中添加 5 ml 原油,37 摇床振荡培养. 摇瓶内培养基变浑浊后取样用生理盐水 (0.9% NaCl) 稀释后涂布在 LB 平板上.

3 22 卷张翠坤等 699 原油浓度检测波长. 配制和 50 mg/l 原油溶液, 分别测定其在 225 nm 波长下的吸光度值, 以吸光度值为纵坐标, 原油浓度为纵坐标, 获得原油标准曲线 ( 图 1B). 将分离菌株 D1 接种在原油培养基中振荡培养, 每 2 d 取出样品分析培养基中剩余原油浓度. 测定方法为在培养基中加入等体积石油醚充分振荡, 使原油溶解在石油醚中, 测定溶液的吸光度值, 根据标准曲线计算原油浓度. 采用此方法测定原油的降解曲线, 进一步在原油培养基中添加 0.5 g/l 甘油, 分析甘油对原油降解的作用. 2 结果与分析 2.1 产鼠李糖脂菌株的筛选与鉴定轻质原油中微生物的富集分离取 5 ml 轻质原油加入 60 ml 无机盐培养基中, 黑色原油浮在上层, 下层为无色. 振荡培养约一周, 下层培养基浑浊且呈棕色, 可看到原油液滴悬浮在无机盐培养基中, 静置后原油液滴即汇集到上层. 培养基变浑浊说明存在细菌大量生长, 由于培养基中只含有原油一种碳源, 因此细菌能够利用原油生长 ; 原油变成小液滴, 说明细菌可能能够分泌表面活性剂等类似物质, 将疏水性的原油包埋在培养基中供细菌利用. 培养 1 周后取 1 ml 培养液, 用生理盐水分别稀释和 10 6 倍, 然后分别取 100 μl 稀释液涂布在 LB 平板上. 37 培养 24 h 后, 平板上长出了形态大致相似的菌落分离菌株产鼠李糖脂能力的鉴定随机挑取 30 个菌落, 分别点接在 CTAB- 亚甲基蓝平板上. 37 培养 3 d 后, 所有菌落周围出现深蓝色晕圈. 图 2 所示为菌株 D1 的菌落, 周围有较大且明显的深蓝色晕圈. 鼠李糖脂与 CTAB- 亚甲基蓝平板中的溴化盐生成不溶性复合物, 通过亚甲基蓝显色, 在菌落周围出现一个深蓝色晕圈 [21]. 图 2 菌株 D1 的菌落形态及深蓝色晕圈. Fig. 2 Colony morphology and dark blue halo of Strain D 分离菌株的鉴定以菌株的基因组 DNA 为模板, 利用引物 27F 和 1492R 对 16S rrna 基因进行扩增并测序. 将测序得到的基因序列提交到 GenBank 网站上, 获得登录号 KM 将 16S rrna 基因序列使用 NCBI 网站数据库中的 BLAST 工具进行比对, 发现其与 Pseudomonas aeruginosa GF (KM259920) 的同源性为 100%, 确定分离菌株 D1 为铜绿假单胞菌. 采用 MEGA5.0 软件构建系统发育树 ( 图 3), 菌株 D1 与 5 株铜绿假单胞菌位于同一个进化枝 (Clade) 上, 其中 P. aeruginosa FR2 是泰国南部温泉中分离的产生物表面活性剂的菌株, 而菌株 P. aeruginosa ASW-2 具有石油降解能力, 可以用来治理海洋石油污染, 菌株 P. aeruginosa JS-11 最初分离于小麦根际土壤, 能够降解苯脲类除草剂异丙隆 [22]. 图 3 P. aeruginosa D1 系统发育树. Fig. 3 Phylogenetic tree of P. aeruginosa D 碳源种类对菌株 D1 鼠李糖脂合成的影响在摇瓶水平分别以甘油菜籽油花生饼粉和葵花籽饼粉为碳源对菌株 D1 进行发酵产鼠李糖脂分析. 将 P. aeruginosa D1 接种到含 30 g/l 碳源的无机盐培养基中,37 发酵 72 h 后分别测定鼠李糖脂产量, 以每种碳源为底物的发酵进行 3 次平行实验. 结果如表 1 所示, 以葵花籽饼粉为碳源获得了 8.2 g/l 鼠李糖脂, 花生饼粉为碳源获得鼠李糖脂 14.1g/ L, 甘油为碳源发酵得到 11.5 g/l 鼠李糖脂, 而以菜籽油为碳源, 鼠李糖脂产量最高, 为 18.4 g/l. 其中花生饼粉价格低廉, 能够降低鼠李糖脂发酵生产的成本. 表 1 碳源种类对鼠李糖脂合成的影响 Table 1 Effect of carbon sources on rhamnolipid production 性质 Property 甘油 Glycerol 菜籽油 Rapeseed oil 碳源 Carbon source 花生饼粉 Peanut cake powder 葵花籽饼粉 Sunflower seeds cake powder 鼠李糖脂 (ρ/g L -1 ) Rhamnolipid 11.5 ± ± ± ± 0.8 ph 7.2 ± ± ± ± 鼠李糖脂的纯化及薄层色谱分析离心菌株 P. aeruginosa D1 发酵液, 取上清液进行有机溶剂萃取和旋转蒸发浓缩, 得到初步纯化的鼠李糖脂溶液. 对鼠李糖脂样品进行薄层层析展开, 喷洒显色剂后烘烤 ( 图 4). 层析板上得到一个棕黄色斑点, 证明了产物糖脂类性质. 经测量计算, 斑点的迁移率 R f 为在薄层色谱分析中, 硅胶吸附剂对样品中各成分的吸附能力不同, 展开剂对各成分的吸附能力也不同, 从而使混合物品得以分离. 铜绿假单胞菌生产的鼠李糖脂可能含有一个或两个鼠李糖分子, 也可能是二者的混合物, 一般双鼠李糖脂占主要部分 [23]. 图 4 中只有一个斑点存在, 菌株 D1 合成的鼠李糖脂只有一种. 图 4 薄层色谱分析菌株 D1 合成的鼠李糖脂. 1: 起始线 ;2: 鼠李糖脂 ;3: 溶剂. Fig. 4 TLC analysis of the extracted rhamnolipid produced by P. aeruginosa D1. 1: starting line; 2: rhamnolipid; 3: solvent. 2.4 鼠李糖脂的红外光谱分析将纯化的鼠李糖脂样品进行红外光谱扫描, 得到其红 Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

振荡培养约一周, 下层培养基浑浊且呈棕色, 可看到原油液滴悬浮在无机盐培养基中, 静置后原油液滴即汇集到上层. 培养基变浑浊说明存在细菌大量生长, 由于培养基中只含有原油一种碳源, 因此细菌能够利用原油生长 ; 原油变成小液滴, 说明细菌可能能够分泌表面活性剂等类似物质, 将疏水性的原油包埋在培养基中供细菌利用.

4 700 4 期外图谱 ( 图 5). 在 cm -1 之间出现了较宽的峰, 为大量的 OH 和 CH X 不对称伸缩振动, 与链烷烃的结构相符 ; cm -1 之间的峰是 C O C 醚键伸缩振动峰 ;1 629 cm -1 的峰可能是是酰胺 Ⅰ 带, 即 C= O 伸缩振动吸收峰, 也可能是酰胺 N H 面内弯曲振动吸收带即酰胺 Ⅱ 带缔合态, 或二者重叠. 具有鼠李糖脂特征官能团的吸收峰, 与文献中鼠 [9, 24] 李糖脂的红外光谱图相似. 环境治理方面的应用潜力. 2.6 菌株 D1 降解原油能力的测定将 P. aeruginosa D1 接种到含原油的无机盐培养中,35,200 r/min 培养, 每 2 d 测定培养基中剩余原油的浓度, 测定 3 次取其平均值. 以残余原油浓度为纵坐标, 分解时间为横坐标作得图 7. 结果显示, 经过 10 d 的培养, 培养基中的原油浓度从 0.78 g/l 下降到了 0.52 g/l, 原油降解率为 33.3%. 图 7 菌株 D1 降解原油分析. Fig. 7 Degradation of crude oil by P. aeruginosa D1. 图 5 纯化鼠李糖脂的红外光谱分析. Fig. 5 FTIR spectrum of the extracted rhamnolipid. 2.5 菌株 D1 降解不同碳氢化合物的分析过夜培养菌株 D1, 将培养物转接到含不同碳氢化合物的无机盐培养基中, 每种培养基做 3 次平行实验,35 振荡培养 5 d. 每天取样稀释后涂布 LB 平板, 通过菌落计数法计算培养液中细菌的浓度. 以细菌数 (cfu/ml) 为纵坐标, 时间为横坐标获得细菌生长曲线 ( 图 6). 可以看出,P. aeruginosa D1 对原油柴油具有较强的利用能力, 经过 5 d 的培养, 细菌浓度分别增加到了原来的 39.2 倍和 33.9 倍, 为和 cfu/ml, 显著高于正己烷和液体石蜡, 其细菌数值甚至低于对照. 对照实验中细菌数也有一定的增加, 是因为种子培养基为 LB 液体, 转接后, 发酵培养基中也存在少量的营养成分. 图 6 菌株 P. aeruginosa D1 生长曲线. Fig. 6 Growth curve of P. aeruginosa D1. 石油由于本身具有疏水性很难被微生物利用, 只有与细胞接触, 通过细胞壁才能被胞内的烃降解酶利用. P. aeruginosa D1 利用原油柴油为碳源, 自身的细菌浓度显著增加, 说明菌株具有分解这两种石油烃的能力, 预示着其在 2.7 甘油促进菌株 D1 对原油的降解原油培养基中添加 0.5 g/l 的甘油, 不添加甘油的原油培养基作为对照. 每 24 h 取样涂板计数, 同时每 2 d 测定培养基中剩余原油浓度. 由图 8 可见, 添加甘油的培养基明显更加浑浊, 而对照培养基中黑色原油形成小团, 显示不能被细菌充分利用 ( 图 8A); 添加甘油后, 细菌生长速度明显提高, 且最终细菌浓度也高于对照组 ( 图 8B); 添加甘油的培养基其原油浓度下降速度明显加快, 且最终剩余原油浓度只有 0.22 g/ L, 原油降解效率增加到了 71.8%( 图 8C). 3 讨论与结论目前已经发现数百种能够降解原油的微生物, 包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌. 分离自印度东北部石油污染土壤中的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)dm-04 和铜绿假单胞菌 M 和 NM, 能够显著降低土壤中的总石油烃 (Total petroleum hydrocarbon,tph) [24]. 利用柴油为唯一碳源, 在富含原油的沉积物样品中筛选到能够利用碳氢化合物的铜绿假单胞菌和费格森埃希氏菌 (Escherichia fergusonii) 菌株, 对正构烷烃有较强的降解能力 [11]. 分离自冀东油田油井污水的 8 株原油降解细菌, 包括铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 沙芬芽孢杆菌 (Bacillus safensis) 短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) 嗜冷杆菌 (Psychrobacter pulmonis) 鲁氏不动杆菌 (Acinetobacter lwoffii) 纺锤芽孢杆菌 (Bacillus fusiformis) 和洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia cepacia), 其原油降解能力为 30.4%- 67.1% [25]. 本研究从轻质原油中筛选到的铜绿假单胞菌 D1, 能够合成较高水平的鼠李糖脂, 并能够有效地降解轻质原油. 生物表面活性剂的增溶作用提高了生物修复的范围及效率, 其中, 鼠李糖脂被认为是最能促进碳氢化合物降解的一种 [26]. 分离自原油的不动杆菌属细菌 XM-2 能够利用原油生应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

具有鼠李糖脂特征官能团的吸收峰, 与文献中鼠 [9, 24] 李糖脂的红外光谱图相似. 环境治理方面的应用潜力. 2.6 菌株 D1 降解原油能力的测定将 P. aeruginosa D1 接种到含原油的无机盐培养中,35,200 r/min 培养, 每 2 d 测定培养基中剩余原油的浓度, 测定 3 次取其平均值. 以残余原油浓度为纵坐标, 分解时间为横坐标作得图 7.

5 22 卷张翠坤等 701 的降解效率从 33.3% 增加到了 71.8%. 研究直接从原油中筛选到 1 株铜绿假单胞菌 P. aeruginosa D1, 该菌株能够利用多种碳源合成鼠李糖脂, 并能利用原油和柴油等碳氢化合物为唯一碳源进行生长. 添加少量甘油, 菌株 D1 能够有效地降解原油, 可以用于石油污染的生物修复. 参考文献 [References] 1 Liang YT, Nostrand JV, Deng Y, He ZL, Wu LY, Zhang X, Li GH, Zhou JZ. Functional gene diversity of soil microbial communities from five oil-contaminated fields in China [J]. Intern Soc Microb Ecol J, 2011, 5 (3): 周宁一. 石油降解微生物 [J]. 微生物学通报, 2013, 40 (12): 2335 [Zhou NY. Petroleum-degrading microorganisms [J]. Microbiol China, 2013, 40 (12): 2335] 3 George S, Jayachandran K. Production and characterization of rhamnolipid biosurfactant from waste frying coconut oil using a novel Pseudomonas aeruginosa D [J]. J Appl Microbiol, 2013, 114 (2): Martínez TÁ, Rodríguez VR. In situ biosurfactant production and hydrocarbon removal by Pseudomonas putida CB-100 in bioaugmented and biostimulated oil-contaminated soil [J]. Brazilian J Microbiol, 2013, 44 (2): 吴虹, 汪薇, 韩双艳. 鼠李糖脂生物表面活性剂的研究进展 [J]. 微图 8 甘油对 P. aeruginosa D1 生长和降解原油效率的影响. A: 试管培养物外观 ;B: 甘油对菌株生长的影响 ;C: 甘油对原油降解效率的影响. Fig. 8 Effect of glycerol on growth and crude oil degradation efficiency of P. aeruginosa D1. A: Cultures in test tubes; B: Effect of glycerol on bacterial growth; C: Effect of glycerol on degradation efficiency of crude oil. 长, 相同来源的假单胞菌属细菌 XM-1 能够利用甘油合成鼠李糖脂, 混合培养菌株 XM-2 和 XM-1, 显著地提高了原油的利用效率, 将原油降解率从 74.3% 提高到 87.3% [27]. 鼠李糖脂从细胞表面吸附脂多糖, 使细胞表面疏水性增加, 促进细胞与碳氢化合物液滴直接接触, 从而有利于对碳氢化合物的利用. 本研究中, 菌株 D1 能够利用多种底物合成鼠李糖脂, 能够利用原油柴油为唯一碳源生长, 经过 5 d 的培养, 其细菌浓度分别增加到原来的 39.2 和 33.9 倍. Zhang 等人分析了铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的能力, 以甘油为碳源能够生产 15.4 g/l 鼠李糖脂, 而以 0.7 g/l 原油为唯一碳源时, 细菌不能生长, 向原油培养基中添加 1 g/l 甘油, 细菌能够生长, 且在 200 h 内分解了培养基中 58.0% 的原油 [28]. 分离自原油污染环境的假单胞菌属 BP10 和红球菌属 NJ2 (Rhodococcus sp.), 在 30 d 内该菌株降解 TPH 的效率分别为 60.6% 和 49.5%, 推测菌株 BP10 生产生物表面活性剂的能力促进了原油的利用及降解 [29]. 枯草芽孢杆菌 JK-1 在利用原油为唯一碳源时, 培养基的乳化效果优于一些化学表面活性剂如吐温 20 和 SDS(Sodium dodecyl sulfate), 且原油中碳链长度为 C1-C29 的组分在 48 h 内几乎被消耗完全 [30]. 本文中, 菌株 D1 能够利用原油生长,10 d 内将原油浓度从 0.78 g/l 下降到了 0.52 g/l. 在原油培养基中另添加 0.5 g/l 甘油后, 细菌的生长速率和菌浓度都增加, 且将原油浓度下降到 0.22 g/l, 将原油生物学通报, 2007, 34 (1): [Wu H, Wang W, Han SY. Recent Progress on rhamnolipid biosurfactant [J]. Microbiol China, 2007, 34 (1): ] 6 Pacwa M, Plaza G, Piotrowska Z, Singh S. Environmental applications of biosurfactants: recent advances [J]. Intern J Mol Sci, 2011, 12 (1): Benincasa M, Accorsini FR. Pseudomonas aeruginosa LBI production as an integrated process using the wastes from sunflower-oil refining as a substrate [J]. Bioresour Technol, 2008, 99 (9): Mercadé ME, Manresa MA, Robert M, Espuny MJ. Olive oil mill effluent (OOME). New substrates for biosurfactant production [J]. Bioresour Technol, 1993, 43 (1): Abalos A, Pinazo A, Infante MR, Casals M, Garcia F, Manresa A. Physicochemical and antimicrobial properties of new rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 from soybean oil refinery wastes [J]. Langmuir, 2001, 17 (5): Urum K, Pekdemir T, Ross D, Grigson S. Crude oil contaminated soil washing in air sparging assisted stirred tank reactor using biosurfactants [J]. Chemosphere, 2005, 60 (3): Benincasa M. Rhamnolipid produced from agroindustrial wastes enhances hydrocarbon biodegradation in contaminated soil [J]. Curr Microbiol, 2007, 54 (6): Noh NA, Abdullah AA, Ibrahim MN. Rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa USM-AR2 facilitates crude oil distillation [J]. J General Appl Microbiol, 2012, 58 (2): Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

Intern Soc Microb Ecol J, 2011, 5 (3): 403-413 2 周宁一. 石油降解微生物 [J]. 微生物学通报, 2013, 40 (12): 2335 [Zhou NY. Petroleum-degrading microorganisms [J].

6 702 4 期 1989: Kutter E. Bacteriophages: Biology and Applications [M]. Boca Raton: CRC Press, 2004: Rajesh P, Sivaraman C, Srikanth M. Biodegradation of crude oil by Pseudomonas aeruginosa and Escherichia fergusonii isolated from the Goan coast [J]. Mar Pollution Bull, 2013, 76 (9): Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol, 2011, 28 (10): Neissa M, Pinzon L, Kwang J. Analysis of rhamnolipid biosurfactants by methylene blue complexation [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82 (5): Wadekar SD, Kale SB, Lali AM, Bhowmick DN, Pratap AP. Microbial synthesis of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) on waste frying oil as low cost carbon source [J]. Preparative Biochem Biotechnol, 2012, 42 (3): 吴小红, 曾光明, 袁兴中, 黄国和, 戴芳, 李建兵, 席北斗, 刘鸿亮. 生物表面活性剂鼠李糖脂对水体中石油烃降解的促进作用 [J]. 应用与环境生物学报, 2006, 12 (4): [Wu XH, Zeng GM, Yuan XZ, Yuan GH, Dai F, Li JB, Xi BD, Liu HL. Enhancement of rhamnolipid biosurfactant for biodegradation of petroleum hydrocarbons in water [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12 (4): ] 20 张秀霞, 秦丽姣, 吴伟林, 赵朝成. 固定化原油降解菌的制备及其性能研究 [J]. 环境工程学报, 2010, 4 (3): [Zhang XX, Qin LJ, Wu WL Zhao CC. Preparation of immobilized crude oil degrading strain and research of its property [J]. Chin J Environ Eng, 2012, 4 (3): ] 21 Pinzon N, Ju LK. Improved detection of rhamnolipid production using agar plates containing methylene blue and cetyl trimethylammonium bromide [J]. Biotechnol Lett, 2009, 31 (10): Dwivedi S, Singh BR, Khedhairy AA, Musarrat J. Biodegradation of isoproturon using a novel Pseudomonas aeruginosa strain JS-11 as a multi-functional bioinoculant of environmental significance [J]. J Hazardous Mat, 2011, 185 (2-3): Thavasi R, Nambaru VRMS, Jayalakshmi S, Balasubramanian T, Banat IM. Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa from renewable resources [J]. Indian J Microbiol, 2011, 51 (1): Sahoo S, Datta S, Biswas D, Banik CR. Biosurfactant production from n-paraffins by an air isolate Pseudomonas aeruginosa OCD1 [J]. J Oleo Sci, 2010, 59 (11): 王福强, 李凤超, 李彦芹, 何炜, 康现江. 原油降解菌的筛选鉴定及降解特性的研究 [J]. 环境科学技术, 2010, 33 (12): [Wang FQ, Li FC, Li YQ, He W, Kang XJ. Crude oil-degrading bacteria: screening, identification and degradation characteristics [J]. Environ Sci Technol, 2010, 33 (12): 38-42] 26 Müller MM, Hörmann B, Kugel M, Syldatk C, Hausmann R. Evaluation of rhamnolipid production capacity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in comparison to the rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874 [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89 (3): Chen YL, Li C, Zhou Z, Wen JP, You XY, Mao YZ, Lu CZ, Huo GX, Jia XQ. Enhanced biodegradation of alkane hydrocarbons and crude oil by mixed strains and bacterial community analysis [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2014,172 (7): Zhang GL, Wu YT, Qian XP, Meng Q. Biodegradation of crude oil by Pseudomonas aeruginosa in the presence of rhamnolipids [J]. J Zhejiang Univ Sci, 2005, 6B (8): Kumari B, Singh SN, Singh DP. Characterization of two biosurfactant producing strains in crude oil degradation [J]. Process Biochem, 2012, 47 (10): Joo MH, Kim JY. Characteristics of crude oil biodegradation by biosurfactant-producing bacterium Bacillus subtilis JK-1 [J]. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2013, 56 (2): 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

Mar Pollution Bull, 2013, 76 (9): 276-282 16 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S.

178 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 215,Vol.31,No.1 类包括糖脂类脂肽类磷脂类和脂肪酸类等其中, 细菌生产的表面活性剂一般都是糖脂类 [2] 鼠李糖脂是糖脂类

178 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 215,Vol.31,No.1 类包括糖脂类脂肽类磷脂类和脂肪酸类等其中, 细菌生产的表面活性剂一般都是糖脂类 [2] 鼠李糖脂是糖脂类研究报告生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 215, 31(1):177-183 铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选张翠坤常冬妹杨洪江 ( 天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室, 天津 3457)

698 4 期 1 材料与方法 1.1 样品与培养基原油样品来自于天津渤海石油钻井平台轻质原油. CTAB- 亚甲基蓝平板可以通过菌落周围的深蓝色晕圈 来鉴别能够分泌鼠李糖脂的细菌 [11]. 其培养基成分有 (g/ L):KH 2 PO Na 2 HPO NaNO 3 2

698 4 期 1 材料与方法 1.1 样品与培养基原油样品来自于天津渤海石油钻井平台轻质原油. CTAB- 亚甲基蓝平板可以通过菌落周围的深蓝色晕圈来鉴别能够分泌鼠李糖脂的细菌 [11]. 其培养基成分有 (g/ L):KH 2 PO Na 2 HPO NaNO 3 2