重庆医学年月第卷第期表引物序列基因上游下游片段大小 2/ """* """""" +& """"""" **""*"**""" +& *****""""" """"""" """"" *****"

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炬货荣
7 years ago
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1 重庆医学年月第卷第期论著基础研究金骨莲胶囊对兔膝骨关节炎软骨保护作用的研究王胜民刘毅刘波桑鹏仲鹤鹤孙鹏鹏遵义医学院附属医院骨一科贵州遵义济仁骨科医院关节外科贵州铜仁摘要目的研究中药金骨莲胶囊对兔膝骨关节炎 * 关节软骨中白细胞介素 +& 白细胞介素 +& 肿瘤坏死因子表达水平的影响探讨其可能作用机制方法只家兔分为组空白对照组只模型对照组只金骨莲胶囊组只 $3 : : 氨基葡萄糖组只 $3 : : 除空白对照组外其余均按改良 %' 法复制 * 模型术后当天开始药物灌胃对照组仅灌服等量生理盐水次天连用周周后处死家兔取右膝股骨髁及胫骨平台大体观察采用 3 评分评价关节软骨退变情况采用实时荧光定量 "((;"( 法检测股骨内侧髁负重区关节软骨 +& +& 和的 $(* 相对表达量结果空白对照组金骨莲胶囊组氨基葡萄糖组和模型对照组 3 评分分别为 >>>> 分 3 评分依次升高组间比较差异均有统计学意义金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组种炎性因子 $(* 表达量均明显低于模型对照组差异均有统计学意义中药金骨莲胶囊在下调 +&$(* 方面与氨基葡萄糖作用相当差异无统计学意义 D 金骨莲胶囊在降低 +& 和 $(* 方面优于氨基葡萄糖作用差异均有统计学意义结论中药金骨莲胶囊可不同程度下调关节软骨中 +& +& 和炎症因子的表达使软骨退变的部分因素得到控制从而起到保护关节软骨的作用关键词骨关节炎白细胞介素白细胞介素肿瘤坏死因子金骨莲胶囊中图分类号 ( 文献标识码 * 文章编号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随着社会老龄化骨关节炎 -,',* 的发生率逐渐升高 * 是以关节软骨的退变破坏及骨赘形成为主要特征的慢性关节病西医治疗 * 主要是药物玻璃酸钠注射手术等治疗临床上药物治疗主要以氨基葡萄糖为代表来保护关节软骨 * 在祖国医学中属痹症范畴肝肾亏损风寒湿邪痰淤痹阻为其主要病因民间治疗 * 的药物多为传统中草药组方效果显著因此挖掘传统中草药治疗 * 是目前研究的焦点传统中药金骨莲胶囊是一个经典苗药组方主要由透骨香汉桃叶和金铁锁等制成具有消炎镇痛软骨基质保护等疗效目前对金骨莲胶囊的研究大多为其化基金项目贵州省科技厅社发攻关基金资助项目黔科合 7E 号硕士启动基金项目院字号作者简介王胜民 : 硕士主要从事骨关节炎及关节镜的研究通讯作者 6$%$

复制 * 模型术后当天开始药物灌胃对照组仅灌服等量生理盐水次天连用周周后处死家兔取右膝股骨髁及胫骨平台大体观察采用 3 评分评价关节软骨退变情况采用实时荧光定量 "((;"( 法检测股骨内侧髁负重区关节软骨 +& +& 和的

2 重庆医学年月第卷第期表引物序列基因上游下游片段大小 2/ *"*"**"*** "**""""" +& ""**"""*"**"*** **""*"**"*"*" +& *****""""" """*"""**" **"***""""** *****""*** 学成分药理作用组织培养等关于其对 * 的保护作用少见报道年月笔者观察了中药金骨莲胶囊对兔膝 * 的软骨保护作用并探讨其可能作用机制材料与方法材料动物及仪器健康成年家兔只清洁级体质量 3 雌雄不限由遵义医学院动物实验基地提供 7( 型病理组织切片机德国 &- 公司 %$/ &=* 光学显微镜北京世纪科信科学仪器有限公司 +"(( 型高速冷冻离心机美国 '-,$7- 公司 8 型核酸蛋白测量仪美国,/ 公司 " 型 "( 扩增仪美国 )+(*8 公司 "%-,C 荧光定量 "( 仪美国 )+(*8 公司 ( 主要药物及试离心柱型动物组织细胞总 (* 提取试剂盒北京庄盟国际生物基因科技有限公司逆转录试剂盒,$-7,/ ( (--! 实时荧光定量 "( 试剂盒 7E)(,-$161; 均购于日本!( 公司金骨莲胶囊批号规格粒盒贵州益佰制药股份有限公司盐酸氨基葡萄糖片批号规格片片盒江苏正大清江制药有限公司 68* 脱钙液 / D 北京 7%,2 公司 ( 方法 ( 分组及造模只健康成年家兔适应性喂养后分为组空白对照组模型对照组金骨莲胶囊组氨基葡萄糖组每组只除空白对照组外其余均改良 %' 法造模耳缘静脉注射 9 戊巴比妥钠 $3 术区备皮常规消毒行右膝内侧切口暴露右膝关节腔切除前交叉韧带及内侧半月板行抽屉实验确认前交叉韧带已完全断裂缝合关节腔及皮肤术后每组每天肌肉注射青霉素钠 B3 连用单笼饲养并每日驱赶 ' (( 动物给药及取材按照药理实验方法学体表面积计算方法来折算给药剂量兔等效剂量为人剂量倍金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组对应剂量 $3 : : 总量均为分别于造模当天药液灌胃空白对照组和模型对照组仅灌服等量的生理盐水次天术后周空气栓塞处死家兔并取兔右膝股骨髁及胫骨平台生理盐水冲洗干净大体观察后分别放于液氮 : < 及 9 福尔马林固定备用 () 关节软骨 3 评分标准苏木精伊红 6 染色软骨结构评分关节软骨结构光整如常分软骨结构表面不规则裂隙分软骨血管翳形成分裂隙深达移形层分裂隙深达放射层分裂隙深达钙化层分软骨全层脱落分细胞数量评分软骨细胞数量如常分数量弥漫性增多分出现大量簇集样细胞团分数量逐渐减少分番红染色基质评分关节软骨基质染色正常分染色轻度减退分染色中度减退分染色重度减退分关节软骨基质不着色分潮线评分关节软骨潮线完整分多重潮线分 (* 6 和番红染色 9 福尔马林固定右膝胫骨平台继续用 68* 脱钙液脱钙常规脱水剥离关节软骨石蜡包埋行 $ 厚度切片二甲苯梯度脱蜡乙醇梯度水化 6 染色苏木精染色 $ 盐酸乙醇分化伊红染色 $ 番红染色番红染色 $ 二甲苯透明中性树胶封片镜检根据 3 评分标准评估软骨退变情况 (++& +& 和 $(* 的检测总 (* 的提取液氮环境下剥离及研磨关节软骨严格按照试剂盒说明书操作提取 (* 用 8 型核酸蛋白测量仪测 (* 浓度和纯度 8* 的合成按照,$-7,/)-,,(-% $-&,$-7,/( 64$- 1 &%,$-,&($ $-,& 总 (*&(-,-- & 总反应体系 & 在 < $ < <,-0-, 的条件下逆转录成 8* 基因扩增以 8* 为模板进行实时荧光定量 "((;"( 严格按照 7E)(,--;"( -, 1 试剂盒说明书进行反应体系 (-,-- &7E)(,-$161 ; &8*& 上下游引物上海生工公司合成表各 & 总体积 & 扩增条件 < 预变性 < < 循环次实验数据采用 " 法 " 为荧光达到阈值时所需 "( 的循环数分析 +& +& 和的 $(* 相对表达量 ) 统计学处理,/',$ 软件进行统计分析计量资料以 >, 表示多样本均数比较用单因素方差分析 -5** 两组均数比较使用两独立样本资料的检验检验水准 D 以为差异有统计学意义 ( 结果 ( 膝关节大体情况空白对照组右膝关节无肿大体质量无明显增减关节软骨透明表面光滑平整色泽正常模型对照组右膝关节肿胀明显体质量明显减轻关节软骨表面粗糙部分可见明显骨赘形成色泽灰暗部分软骨剥脱并显露软骨下骨金骨莲胶囊组右膝关节稍肿胀体质量减轻不明显关节软骨表面稍粗糙未见明显骨赘形成色泽稍灰暗氨基葡萄糖组右膝关节肿胀轻于模型对照组体质量稍微减轻关节软骨表面欠光泽部分可见极少量骨赘形成见图 (( 关节软骨退变情况空白对照组关节软骨结构光整细

&=* 光学显微镜北京世纪科信科学仪器有限公司 +"(( 型高速冷冻离心机美国 '-,$7- 公司 8 型核酸蛋白测量仪美国,/ 公司 " 型 "( 扩增仪美国 )+(*8 公司 "%-,C 荧光定量 "( 仪美国 )+(*8 公司 ( 主要药物及试剂 @ 离心柱型动物组织

3 重庆医学 1%$) 年 ( 月第 05 卷第 1) 期 ')$' 胞数量如常基质染色正常潮线完整) 模型对照组软骨表 A! 兔膝关节软骨中 $"* )* & 的 6@[B 相对表达较粗糙有不规则裂隙形成细胞数量明显减少基质中度或重量! 所有扩增曲线均无非特异性荧光融解曲线呈单峰产物度失染潮线不完整)金骨莲胶囊组关节软骨表面稍粗糙局特异性好)见表 1)ZB 模型 $"* )* &6@[B 相对部见裂隙细胞数量轻度减少基质染色轻度减退潮线欠完表达量模型对照组 ' 种炎性因子均明显高于空白对照组差整)氨基葡萄糖组软骨表结构欠光整局部见不规则裂隙细异均有统计学意义 $ %说明复制 ZB 模型成功%金骨胞数量减少基质染色轻*中度减退潮线欠完整) 2T*番红染莲胶囊组和氨基葡萄糖组 ' 种炎性因子表达量均明显低于模色见图 1)关节软骨 :L,Q, 评分数据分析显示模型对照组型对照组差异均有统计学意义 $ %说明两种药物均比空白对照组关节软骨退变严重差异有统计学意义 $!$ 有不同程度软骨保护作用%中药金骨莲胶囊在降低 %%金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组分别与模型对照组比较差异均有统计学差异$ %%金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖 $"6@[B 方面作用与氨基葡萄糖相当差异无统计学意义 $ %)中药金骨莲胶囊在降低 ) 和!% &6@[B 方组比较差异有统计学意义$ %见表 1) 面作用优于氨基葡萄糖差异均有统计学意义$ %) A!模型对照组% 4!氨基葡萄糖组% V!金骨莲胶囊组)!!B!空白对照组% 图 $!! 各组兔膝关节大体标本图图 1!! 各组关节软骨 2T 染色(]1%%)和番红染色(]1%%) 表 1!! 关节软骨 :L,Q, $"' )' NbD% 'h$%) & 的 6@[B 的相对表达量( Y?4@ 检测兔组别 :L,Q, 评分$分& $" ) & 空白对照组 '/%b $/' b b b 模型对照组 $ ')%b $/'L /& 01%b -/5L $ )%%b 11)L $ /%%b 51$L 金骨莲胶囊组 5/%b 0)0LPJ 55%b $)(LP %1%b 1$)LPJ 5/%b 0)0LPJ 氨基葡萄糖组 15%b $0'LP '5%b %'$LP -& 0'%b $$0LP 15%b $0'LP % $5 0%% )-& 1/% /0 -%% $0)&! P! J! %5与空白对照组比较% %5与模型对照组比较% %5与氨基葡萄糖组比较)!!L! A! 讨!! 论物力学紊乱而引起的病理改变中老年人多发 '$$() 多项研究!! 膝 ZB 是多种生物因素与机械损伤因素相互作用所致生表明成功造模后的膝 ZB 炎症变化包括关节液渗出及滑膜增

组差整)氨基葡萄糖组软骨表结构欠光整局部见不规则裂隙细异均有统计学意义 $ %说明复制 ZB 模型成功%金骨胞数量减少基质染色轻*中度减退潮线欠完整) 2T*番红染莲胶囊组和氨基葡萄糖组 ' 种炎性因子表达量均明显低于模色见图 1)关节软骨 :L,Q, 评分数据分析显示模型对照组

4 重庆医学年月第卷第期生这也许是 * 患者关节疼痛的重要机制之一 * 模型的建立是本实验成功的前提故采用改良 %' 法复制 * 模型关节软骨 3 评分得出模型对照组较空白对照组软骨退变严重提示造模成功研究证实氨基葡萄糖在治疗膝 * 中效果肯定在本实验中作为阳性药物对照从大体标本角度出发得知金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组均比模型对照组的关节软骨表面光整并没有明显骨赘形成中药金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组肉眼观没有明显差别从病理组织学角度得知金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组均比模型对照组的关节软骨结构规则细胞数量多基质轻度失染潮线完整说明两种药物均有不同程度软骨保护作用金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组比较差异有统计学意义说明在病理组织学水平上金骨莲胶囊疗效优于氨基葡萄糖 +& 在 * 病程中均是典型的致炎细胞因子可通过一系列级联反应引起关节软骨的破坏和炎症反应在膝 * 中呈高表达并与病情呈正相关 +& 可调节蛋白水解酶的合成与分泌促进软骨细胞和滑膜细胞分泌基质金属蛋白酶并加速胶原蛋白及聚蛋白多糖的降解近期研究表明金骨莲胶囊能够降低类风湿性关节炎大鼠血清中的 +& 因此推测金骨莲胶囊抑制炎症因子 +& 是治疗类风湿关节炎的机制之一本实验发现金骨莲胶囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下调膝 * 中 +& 炎症因子但是金骨莲胶囊在降低 +&$(* 方面作用与氨基葡萄糖相当差异无统计学意义而在降低 $(* 方面作用优于氨基葡萄糖差异有统计学意义 +& 在 * 中的作用仍存在很大争议有研究认为在 * 中晚期的关节软骨中有过量的 +& 表达进而刺激更多的基质金属蛋白酶表达大量软骨基质被降解软骨进一步加重最新研究表明 +& 可能是和 +& 作用于其他细胞重要的中介物质和 +& 通过 +& 的产生将 * 的疾病进程放大与延续三者的协同作用可加速 * 的进展 +& 在 * 软骨下骨成骨细胞中表达较高并与 * 软骨破坏紧密相关有研究表明 +& 也可以刺激产生金属蛋白酶组织抑制剂 + 从而负反馈抑制因此可认为 +& 在 * 中影响是双向的从分子水平得知中药金骨莲胶囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下调膝 * 中 +& 炎症因子但是中药金骨莲胶囊作用优于氨基葡萄糖差异有统计学意义综上所述中药金骨莲胶囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下调膝 * 中 +& +& 炎症因子而中药金骨莲胶囊在降低 +& 和 $(* 方面作用优于氨基葡萄糖从而达到中药金骨莲胶囊抑制软骨基质破坏和延缓关节软骨退变的目的对关节软骨起保护作用参考文献 5E8*( *8-%10-'- %/',-/0%-,-% -'-,%,,%-A* ('-$ 8 -,*5--,(%-"7-%'-,-%0-, 2$-'%,--$/,-- -,-/--,','- 6 A* ('-$ 8 肖晓金包侠萍陈文列等透骨消痛胶囊对兔膝骨关节炎模型血清与关节液炎症因子的影响 A 风湿病与关节炎汪洪吴昊关节注射联合金骨莲胶囊治疗骶髂关节炎疗效观察 A 中国中医骨伤科杂志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

角度得知金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组均比模型对照组的关节软骨结构规则细胞数量多基质轻度失染潮线完整说明两种药物均有不同程度软骨保护作用金骨莲胶囊组和氨基葡萄糖组比较差异有统计学意义说明在病理组织学水平上

5 重庆医学年月第卷第期,(*,,-%-''--0-%/$- -,',A+A"%61/'% 7,,2-%(6% -%",%-2- $,3-,%$$,3-,-,-- 0%%'--/'-3--, '-$,',,-%%A-,',", %-,3A7!$ 8!7' 8-%*/-(-%-+ -,%-3+-,,1 -%/,- -)''-!--A(,$,"%,-*,%,"',-A)$%'-, 7-% 杜茂端邱德文许建阳金骨莲胶囊对类风湿性关节炎 (* 病理作用的研究模型血清神经递质 +& 6", 等含量调控作用机理 A 世界中医骨科杂志,3 8% &+%$$,3-/, %--'',%$-'--,,, -%$---3--A*,',/ $,/'%A%- E@58AC " -%'-,/-6- "'--1'%*61/-,$-%(22-% -,',A-,+%$$ =E&C&@&-%,-$-'7,','--'-,2%,$%'2,%- $,1-,-,',,$-%A(-0- (- /'+'%7-6-%%- %,'-0-,%----,-,',-0-%/$- /- '-,,,- %$-,A)" %3-%- 8, 73!3''!*4 -%6'--1 /,- -,%-3$,1 $-%/,--,--/,0,3//)%-%-,0-,$-,',2',%2-AA,'/ 7 沈鹏飞关节液中 +&&8 含量与骨关节炎诊断研究 A 长春中医药大学学报 &,-7'' *%37'-0$8,--/,,-%-,'-$,',0%2,2%0 收稿日期修回日期上接第页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收稿日期修回日期

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0 年上半年评价与考核细则序号部门要素值考核内容考核方式考核标准考核 ( 扣原因 ) 考评得 3 安全生产目 30 无同等责任以上道路交通亡人事故无轻伤责任事故无重大质量

0 年上半年评价与考核细则序号部门要素值考核内容考核方式考核标准考核 ( 扣原因 ) 考评得 3 安全生产目 30 无同等责任以上道路交通亡人事故无轻伤责任事故无重大质量 0 年上半年评价与考核细则序号部门要素值考核内容考核方式考核标准无同等责任以上道路交通亡人事故 3 无轻伤责任事故目标 30 及事无重大质量工作过失故管无其他一般责任事故理在公司文明环境创建中, 无工作过失及被追究的

重 庆 医 学 年 月 第 卷 第 期 表 引 物 序 列 基 因 上 游 下 游 片 段 大 小 2/ *"*"**"*** "**""""" +& ""**"""*"**"*** **""*"**"*"*" +& *****""""" """*"""**" **"***""""** *****"

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