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蝴廖
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1 ISSN CN / Q 中国生物化学与分子生物学报 http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 8 月 30(8):837 ~ 842 技术与方法 DOI: / j. cnki. cjbmb 利用 ZFN 敲除转基因猪细胞中多拷贝 EGFP 基因任广彩 1),2), 张英 1), 丛佩清 1), 陈瑶生 1) 1), 何祖勇 ( 1) 中山大学生命科学学院, 有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广州 ; 2) 广东大华农动物保健品股份有限公司, 广州 ) 摘要锌指核酸酶 (zinc finger nuclease, ZFN) 是由特异性识别 DNA 的锌指结构域和 Fok I 切割结构域组成, 能够在基因组特定位点上切割 DNA, 引起 DNA 双链断裂 (double strand break, DSB). 通过 DSB 修复机制, 可以使基因修饰的效率比传统方法提高 10 2 ~ 10 4 倍. 目前, 利用 ZFN 对动物内源基因进行敲除的研究较多, 但对转基因动物中外源多拷贝基因进行敲除的报道较少. 本研究首先利用荧光定量 PCR 法对本实验室培育的两头转基因猪中增强型绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因的拷贝数进行鉴定, 发现其拷贝数分别为和拷贝 ; 然后将靶向 EGFP 的一对 ZFN 转染进拷贝数为的 EGFP 转基因猪的成纤维细胞中, 并通过流式和 CEL 1 酶切方法检测敲除效率. 结果表明, 转染 400 ng 800 ng 和 ng ZFN 的切割效率分别为 0 97% 1 39% 和 1 76%, 可见随着转染 ZFN 剂量的增加,ZFN 的切割效率逐渐提高. 但是, 不发绿色荧光的细胞比例却没有明显提高, 因此认为,ZFN 敲除转基因动物中多拷贝基因的效率还是比较低. 关键词中图分类号锌指核酸酶 ; 外源基因 ; 增强型绿色荧光蛋白 ; 转基因猪 ; 敲除效率 Q812 Unsatisfied Removal of Multiple Exogenous EGFP Gene Inserts in Trangenic Porcine Somatic Cells by Zinc finger Nucleases REN Guang Cai 1), 2), ZHANG Ying 1), CONG Pei Qing 1),CHEN Yao Sheng 1), HE Zu Yong 1) ( 1) State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat Sen University, Guangzhou ; 2) Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co., Ltd, Guangzhou ) Abstract Recombinant zinc finger nuclease( ZFN) is engineered with site specific zinc finger domains and the cleavage domain of restriction enzyme Fok I. ZFNs have been showed to improve gene targeting efficiency by 100 to folds by introducing DNA double strand breaks in the target genes. Increasing studies employed ZFN to knockout endogenous gene. In two EGFP transgenic pigs of the study, the copy number of transgenic pig was estimated as and 17 36, respectively by quantitative real time PCR. EGFP transgenic ZFN plasmid was constructed and introduced into the transgenic pig fibroblast through electroporation. Using survey or nuclease assay( Cel 1 assay), we found that percentages of the cleavage of target sequence were 0 97%, 1 39% and 1 76% after transfecting 400, 800 and ng of the ZFN plasmids. The gene knockout efficiency was detected by fluorescence cytometry analysis and assays to detect mutations. However, the flow cytometric analysis indicated that the percentage of non fluorescent 收稿日期 : ; 接受日期 : 国家转基因重大专项 (No. 2011ZX ) 资助联系人共同第一作者 Tel: ; E mail: zuyonghe@ gmail. com Received: January 14, 2014; Accepted: May 4,2014 Supported by National Science and Technology Major Project of China( No. 2011ZX ) Corresponding author Co first authors Tel: ; E mail: zuyonghe@ gmail. com

14 利用 ZFN 敲除转基因猪细胞中多拷贝 EGFP 基因任广彩 1),2), 张英 1), 丛佩清 1), 陈瑶生 1) 1), 何祖勇 ( 1) 中山大学生命科学学院, 有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广州 510006; 2) 广东大华农动物保健品股份有限

2 838 中国生物化学与分子生物学报第 30 卷 cells was not significantly improved after ZFN treatment. The results implied that ZFNs might works less efficiently to disrupting multicopy genes in transgenic animals. Key words zinc finger nuclease; exogenous gene; EGFP; transgenic pig; knockout efficiency 基因敲除在功能基因研究生物制药开发动物品种改良等方面有很重要的应用价值. 传统意义上采用同源重组方法实现基因敲除, 但是敲除效率极低. 近些年, 发展起来的锌指核酸酶 (ZFN) 技术 [1] TALEN( transcription activator like effector nucleases) 技术 [2] RNA 干扰技术 [3] CRISPR / CAS9 ( clustered regulatory interspaced short palindromic repeat / Cas [4] based RNA guided DNA endonucleases ) 技术等都不同程度地提高了识别位点特异性和基因敲除效率, 其中 ZFN 技术应用最为广泛. ZFN 是人工合成的核酸内切酶, 由 1 个 DNA 识别结构域和 1 个非特异性核酸内切酶的剪切结构域融合而成, 能识别 1 段特异的 DNA 序列, 并在此特异位点产生 1 个 DNA 双链切口, 然后, 利用同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复, 从而达到精确定点修饰, 能使基因修饰的效率提高 10 2 ~ 10 4 倍 [5]. 目前 ZFN 技术已应用于果蝇 [6] 斑马鱼 [7] 小鼠 [8] [9] 拟南芥等多种动植物的基因修饰. Bibikova [10] 等利用设计的 3 对锌指结构的 ZFN 实现了对果蝇 X 染色体上 yellow 基因的敲除. 后来, Doyon [11] 等将编码 ZFN 的 mrna 注射到斑马鱼胚胎中, 发现 Ntl 基因有 20% 发生了突变, 同时也表现出了 [12] 相应的突变性状年, Hauschild 等通过 ZFN 技术, 敲除了猪的 α 1,3 半乳糖基转移酶基因. ZFN 已成功敲除多种内源基因, 但是对外源基因的敲除研究较少. 在转基因动物中, 外源基因通常是随机插入到基因组中, 插入的拷贝数及位点都是不确定的. 同时, 在制作转基因动物过程中, 通常会用到 GFP 等标记基因进行筛选, 这使转基因动物的安全性受到质疑. 本研究利用 ZFN 技术对转基因猪中 GFP 基因进行敲除效率的研究, 为 ZFN 敲除转基因动物的外源基因提供一定的理论根据. 1 材料与方法 1 1 材料两头转基因猪 (318 4,364 2 ) 为本实验室制作并保存使用 ; 细胞系源于两头转基因猪的耳样细胞所建系 ;ZFN 载体质粒 ( pegfp N1 ZFN L 和 pegfp N1 ZFN R) 为本实验室所保存 ; 高保真 LA 酶, 定量 PCR 试剂 SYBR Premix Ex Taq qpcr Kit 均购自 TaKaRa 公司 ;EcoRI 和 NotI 限制性内切酶购自 NEB ( New England Biolabs ) 公司 ; DMEM 购自 Sigma 公司 ; 电转试剂盒购自英韦创津公司 ;Endo free Plasmid Midi Kit Gel Extraction Kit Tissue DNA Kit 均购自 OMEGA 公司 ; 过硫酸氨 ( AP), 四甲基乙二胺 ( TEMED) 及丙烯酰胺购自 Bio Red 公司. 1 2 ZFN 质粒的检测用 EcoRI 和 NotI 双酶切 pegfp N1 ZFN L 和 pegfp N1 ZFN R 质粒 ( 本实验室已经验证过有活性并保存质粒 ), 于 1% 琼脂糖凝胶电泳上分离成像, 并测序分析序列的正确性. 1 3 转基因猪 EGFP 拷贝数的检测引物设计与合成根据转基因猪外源基因 EGFP 基因序列设计应用于实时荧光定量 PCR 引物 GFP F(5 CGTAAACGGCCACAAGTTCA 3 ) 和 GFP R(5 CTTCATGTGGTCGGGGTAGC 3 ), 根据猪管家基因 TFRC 设计引物 TFRC F ( 5 GAGACAGA AACTTTCGAAGC 3 ) 和 TFRC R(5 GAAGTCTGT GGTATCCAATCC 3 ) 实时荧光定量 PCR 采用 10 μl RT PCR 反应体系 [ SYBR Premix DimerEraser TM ( 2 ), 2 μl; PCR Forward Primer ( 10 μmol / L), 0 2 μl; PCR Reverse Primer ( 10 μmol / L ), 0 2 μl; DNA (100 ng / μl),1 μl;ddh 2 O,3 6 μl], 反应组分在冰上加入到 384 孔板中, 加样完毕后贴膜, 用水平转子 g 离心 3 ~ 5 min. 之后, 放入罗氏 LightCycler 480qPCR 仪中, 反应条件为预变性 :95,30 s;pcr 反应 :95,5 s;60,20 s;72,20 s;40 个循环 ; 扩增曲线分析 :95,5 s;65,1 min;97. 反应结果使用 LightCycler 480 software 和 Excel 软件收集分析标准曲线的建立将含 EGFP 基因的转基因质粒 pegfp N1 与长白猪基因组混合, 设置含有个转基因拷贝数的标准品对照. 设置公式如下 : 假设含有转基因片段的大小为 a bp, 长白猪基因组 DNA 用量为 b ng, 猪基因组 DNA 单倍体大小为 bp, 转基因片段完全随机插入一条染色体上, 那么 b ng 的转基因阳性猪基因组

Key words zinc finger nuclease; exogenous gene; EGFP; transgenic pig; knockout efficiency 基因敲除在功能基因研究生物制药开发动物品种改良等方面有很重要的应用价值.

3 第８期任广彩等利用ＺＦＮ敲除转基因猪细胞中多拷贝ＥＧＦＰ基因ＤＮＡ含有１个转基因拷贝的质量为ａｂ０５３１０９以ＥＧＦＰ引物扩增转基因片段以ＴＦＲＣ引物扩增管家基因ＴＦＲＣ作为内参标化基因组ＤＮＡ的８３９琼脂糖凝胶电泳中分析Ｆｉｇ１获得的目的片段与理论长度一致确定质粒是正确的同时测序结果在ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｄｖａｎｃｅ１０软件中进行比对序列一致量ＥＧＦＰ引物的扩增产物１５６ｂｐＴＦＲＣ引物的扩增产物８１ｂｐ将转基因片段检测引物ＥＧＦＰ扩增Ｃｔ值减去相应的ＴＦＲＣ基因的扩增Ｃｔ值得到Ｃｔ再对样品的拷贝数的对数值作图得到绝对定量的标准曲线１４电转仪转染ＺＦＮ质粒到ＥＧＦＰ基因猪细胞培养转ＥＧＦＰ基因猪细胞ＤＭＥＭ１３５ｇＬＮａＨＣＯ３３７ｇＬ２０胎牛血清待１０ｃｍ平板培养的细胞长至８０９０时利用电转仪电转细胞电转参数为１７００Ｖ２０ｍｓ１ｐｕｌｓｅ按２４孔板每孔１１０５个细胞转染质粒０５２０ μｇ来计算所需要的细胞数量电击后将电转液转移至２４孔板的孔中放入ＣＯ２培养箱中培养１５流式细胞分析检测敲除效率培养转基因猪细胞分别转染质粒ＺＦＮＬ和ＺＦＮＲ各２００ｎｇ４００ｎｇ６００ｎｇ每个浓度重复３Ｆｉｇ１ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐａｔｔｅｒｎｏｆｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｓｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｏｒＺＦＮｐｌａｓｍｉｄｗｉｔｈＥｃｏＲＩａｎｄＮｏｔＩＬｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＬｐｌａｓｍｉｄＲｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＲｐｌａｓｍｉｄＮＬｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＬｐｌａｓｍｉｄＮＲｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＲｐｌａｓｍｉｄＭ２０００ｂｐｌａｄｄｅｒＤＮＡｍａｒｋｅｒ次另设３个孔不转染质粒作为对照５ｄ后流式上２２外源基因ＧＦＰ拷贝数的检测１６酶切实验检测突变时荧光定量ＰＣＲ扩增中Ｃｔ值与初始拷贝数的关机检测培养转基因猪３１８４３６４２细胞电转后５ｄ收集细胞提取基因组用引物ＺＦＮ２Ｆ和ＺＦＮ２Ｒ扩增基因组ＺＦＮ２Ｆ５ＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣ３ＺＦＮ２Ｒ５ＧＡＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴ３扩增条件９５５ｍｉｎ９４３０ｓ５７３０ｓ７２３０ｓ３０个循环７２１０ｍｉｎ４保存在１琼脂糖凝胶上电泳分离ＰＣＲ产物切下含有目的片段的凝胶用ＯＭＥＧＡ凝胶回收试剂盒进行对应片段的回收纯化回收后取２０ μｌ按以下程序退火９５２ｍｉｎ９５ｔｏ８５２ｓ８５ｔｏ２５０１ｓ４Ｈｏｌｄ退火完成后按如下体系加样１０ｂｕｆｆｅｒ５ μｌＴ７ＥＩ０５ μｌＤＮＡ２２１实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线为了确定实系制备了分别含有１２８３２１２８和５１２个拷贝的标准品作为对照以引物ＥＧＦＰＦＲ扩增转基因片段扩增产物１５６ｂｐ以引物ＴＦＲＣＦＲ扩增猪管家基因ＴＦＲＣ作为内参扩增产物８１ｂｐ每个反应重复３次取平均Ｃｔ值将转基因片段检测引物扩增ＣｔＥＧＦＰ减去相应的ＴＦＲＣ基因扩增ＣｔＴＦＲＣ得到Ｃｔ本实验同一标准品的３次重复Ｃｔ值差异很小定量分析的精确度高重复性好以Ｃｔ对样品拷贝数的对数ｌｏｇ２Ｎ作绝对定量标准曲线Ｆｉｇ２计算公式为Ｃｔ０８１２８ｌｏｇ２Ｎ拷贝数５０８８３Ｒ２相关系数０９９８８Ｆｉｇ３显示的是ｑｐｃｒ的溶解曲线ＴＦＲＣ的溶１０ μｌＨ２Ｏ３４５ μｌ进行酶切３７反应１ｈ用解曲线在９０左右有１个单峰ＥＧＦＰ的溶解曲线照相用ＩｍａｇｅＪ分析结果异性非常好在ＰＣＲ过程中没有非特异性的条带１０ＰＡＧＥ进行电泳检测ＥＢ染色后凝胶成像仪２结果２１ＺＦＮ质粒的检测取实验室保存的１０ μｌＺＦＮ质粒ｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＬ和ｐｅｇｆｐＮ１ＺＦＮＲ用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ进行双酶切获得的目的片段长度应为１０３４ｂｐ然后在１在８０左右有１个单峰说明了２个引物扩增的特出现２２３转基因猪ＥＧＦＰ基因的拷贝数我们用实时荧光定量ＰＣＲ对２只转基因猪３１８４３６４２的拷贝数进行了鉴定结果表明３１８４转基因猪的拷贝数为１１９５３６４２转基因猪的拷贝数为１７３６

１３５ｇＬＮａＨＣＯ３３７ｇＬ２０胎牛血清待１０ｃｍ平板培养的细胞长至８０９０时利用电转仪电转细胞电转参数为１７００Ｖ２０ｍｓ１ｐｕｌｓｅ按２４孔板每孔１１０５个细胞转染质粒０５２０ μｇ来计算所需要的细胞数量电击后将电转液转移至２４孔板的孔中放入ＣＯ２培养箱中培养１５流式细胞分析检测敲除效率

4 ８４０中国生物化学与分子生物学报第３０卷２３ＺＦＮ的敲除效率２３１流式分析ＺＦＮ的切割效率培养转基因猪细胞３６４２分别转染ＺＦＮＬ和ＺＦＮＲ各２００ｎｇ４００ｎｇ６００ｎｇ每个浓度重复３次另设３个孔不转染质粒作为对照５ｄ后流式上机检测检测结果如Ｆｉｇ４所示利用ＦｌｏｗＪｏ软件将未转染ＺＦＮ和转染ＺＦＮ后的峰图合并绿色表示未转染ＺＦＮ的峰图情况蓝色表示转染２００ｎｇＺＦＮＬ２００ｎｇＺＦＮＲ的转基因猪细胞的峰图情况青色表示转染４００ｎｇＦｉｇ２ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅＥＧＦＰａｎｄｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅＴＦＲＣｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＺＦＮＬ４００ｎｇＺＦＮＲ的转基因猪细胞的峰图情况红色表示转染６００ｎｇＺＦＮＬ６００ｎｇＺＦＮＲ的转基因猪细胞的峰图情况从峰图中可以看出无论Ｔｈｅ１２８３２１２８ａｎｄ５１２ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓ转染４００ｎｇ８００ｎｇ还是１２００ｎｇ与对照相比荧光ＴＦＲＣｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｓＴｈｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｗｅｒｅ变化这也许因为拷贝数较高敲除一两个拷贝荧光ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｔａｒｇｅｔｇｅｎｅＥＧＦＰａｎｄｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄＴｈｅＣｔｏｆＥＧＦＰａｎｄＴＦＲＣｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍａｋｅａｂｓｏｌｕｔｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ强度都没有明显降低非荧光细胞的比例也没显著强度变化并不明显所以进一步作ＣＥＬｌ实验来检测ＺＦＮ的切割效率Ｆｉｇ３ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＴｈｅｍｅｌｔｉｎｇｐｅａｋｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅＥＧＦＰｗａｓａｂｏｕｔ８０ＴｈｅｍｅｌｔｉｎｇｐｅａｋｏｆｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅＴＦＲＣｗａｓａｂｏｕｔ９０２３２突变检测分析培养转基因猪细胞３６４２分别转染ＺＦＮＬ和ＺＦＮＲ各４００ｎｇ８００ｎｇ１２００ｎｇ培养５ｄ后分别提取基因组用ＺＦＮ２Ｆ和ＺＦＮ２Ｒ扩增所提取的基因组将１００ μｌ的ＰＣＲ产物于１琼脂糖凝胶电泳中分析用上述胶回产物退火后用Ｔ７ＥＩ进行３７酶切１ｈ取２０ μｌ的反应产物于１０ＰＡＧＥ中分析成像Ｆｉｇ５ＺＦＮ样品ＰＣＲ条带为５９８ｂｐ如果发生切割形成４４２ｂｐ和１５６ｂｐ两条带Ｎ作为阴性对照从Ｆｉｇ５可以看Ｆｉｇ４ＴｈｅＦＡＣＳｒｅｓｕｌｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｉｇｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈ４００８００ａｎｄ１２００ｎｇＺＦＮｐｌａｓｍｉｄＴｈｅｐｉｇｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ４００８００ａｎｄ１２００ｎｇＺＦＮｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｅＥＧＦＰｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＦＡＣＳａｆｔｅｒ５ｄａｙｓ出阴性对照只有单一条带分别转染了４００ｎｇ８００ｎｇ和１２００ｎｇ的ＺＦＮ样品酶切后在４４２处有一条微弱的条带说明了ＺＦＮ对于ＥＧＦＰ基因的敲除发挥了作用但是作用效率比较低使用ＩｍａｇｅＪ软件进行计算Ｆ切割条带的面积总面积转染４００ｎｇ８００ｎｇ和１２００ｎｇＺＦＮ的切割效率分别为

ＰＣＲＺＦＮＬ４００ｎｇＺＦＮＲ的转基因猪细胞的峰图情况红色表示转染６００ｎｇＺＦＮＬ６００ｎｇＺＦＮＲ的转基因猪细胞的峰图情况从峰图中可以看出无论Ｔｈｅ１２８３２１２８ａｎｄ５１２ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓ转染４００ｎｇ８００ｎｇ还是１２００ｎｇ与对照相比荧光

5 第８期任广彩等利用ＺＦＮ敲除转基因猪细胞中多拷贝ＥＧＦＰ基因０９７１３９和１７６８４１基因组中插入的拷贝数及位点都是不确定的从目前的研究来看外源基因整合到基因组中的拷贝数较低时一般能较好的表达如果整合的拷贝数过多通常表达不是很稳定有时候会发生基因沉默１６１７所以在获得转基因动物后需要测定其拷贝数近年来ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时荧光定量ＰＣＲ越来越多地应用于基因拷贝数的测定它成本低快速逐渐代替了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹１８在本研究中我们采用高度灵敏和重复性好的ｑｐｃｒ方法对转基因猪外源基因ＥＧＦＰ的拷贝数进行鉴定本实验将野生型的猪基因组与不同拷贝数Ｆｉｇ５ＴｈｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｕｓｉｎｇＴ７ＥＩｅｎｚｙｍｅｓＴｈｅｐｉｇｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ４００８００ａｎｄ１２００ｎｇＺＦＮｐｌａｓｍｉｄｔｈｅｇｅｎｏｍｅｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｆｔｅｒ５ｄａｙｓＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＺＦＮｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＴ７ＥＩｅｎｚｙｍｅｓＬａｎｅＭ２０００ｂｐＬａｄｄｅｒＤＮＡｍａｒｋｅｒｌａｎｅＮｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ０９７１３９ａｎｄ１７６ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ４００ｎｇ８００ｎｇａｎｄ１２００ｎｇＺＦＮｐｌａｓｍｉｄｓｉｎｔｏｃｅｌｌｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ的外源基因混合从而制作标准曲线选用的内参是猪高度保守的管家基因ＴＦＲＣ对基因组ＤＮＡ浓度进行标化从溶解曲线中也可以看出在扩增曲线中没有出现非特异性的条带表明了引物的特异性比较高本实验用ｑｐｃｒ的方法鉴定了两头转基因猪的ＥＧＦＰ基因的拷贝数分别为１１９５和１７３６个拷贝ＺＦＮ发挥作用需要锌指结合域和切割域具有一定的距离以便各自能够独立发挥功能１９当锌指结构域特异性结合ＤＮＡ序列ＦｏｋＩ形成正确的空３讨论本文中对转基因猪细胞中ＥＧＦＰ基因的拷贝数进行了测定对有１７３６个拷贝的转基因猪细胞进行敲除检测锌指核酸酶ＺＦＮ敲除多拷贝基因的间构象并且２个ＦｏｋＩ距离适当的位置后发生二聚化激活ＦｏｋＩ的切割活性２０当基因组内存在多个拷贝的ＺＦＮ靶序列时其中一个锌指结构域结合上某一拷贝的靶序列上而相应的另一个锌指结构效率从结果中可以看出ＺＦＮ对多拷贝基因敲除域却很有可能结合到相距几千ｋｂ的另一个拷贝的Ｗａｔａｎａｂｅ等挥其切割功能另外我们还需要进一步研究转基因的效率并不是很高大概只有１左右２０１０年１３利用ＺＦＮ将稳定表达外源基因靶序列上两个ＦｏｋＩ就无法发生二聚化就无法发ＥＧＦＰ的猪原代成纤维细胞系中的ＥＧＦＰ敲除经猪细胞中外源基因ＥＧＦＰ的结合位点以及结合方并没检测ＥＧＦＰ的拷贝数另外流式分析的细胞尾尾相连的方式插入到同一位点这样当两对ＺＦＮ流式细胞检测分析敲除效率达２０５４文中作者为转染７ｄ后的而本实验检测的是转染５ｄ的细胞因此可能敲除效率与转染细胞的拷贝数及敲除时间长短有关转染剂量对ＺＦＮ的切割效率有影响随着转染ＺＦＮ剂量的增加ＺＦＮ的切割效率逐渐提高转染了１２００ｎｇＺＦＮ的切割效率要高于转染了４００ｎｇ和８００ｎｇＺＦＮ的切割效率这可能是由于足够的ＺＦＮ对细胞基因切割产生了比较高的效率但是在细胞转染过程中我们也观察到了随着转染ＺＦＮ剂量的增加细胞死亡比例也逐渐增大细胞毒性随之加强在以前的研究中也有相似的报道随着转染ＺＦＮ剂量的加大切割效率会提高细胞死亡比例会增加细胞毒性也增强１４１５在转基因动物中外源基因通常是随机插入到式以检验ＥＧＦＰ多拷贝基因是否以头尾相连或者分别结合在第一个拷贝和最后一个拷贝时可形成两个ＤＳＢ导致多拷贝ＥＧＦＰ基因的全部缺失去除标记基因从以上的结果我们可以基本得出结论ＺＦＮ敲除多拷贝基因的效率比较低有一定的限制还有待更深入的研究参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ１ＫｉｍＹＧＣｈａＪＣｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎＳＨｙｂｒｉｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｆｕｓｉｏｎｓｔｏＦｏｋＩｃｌｅａｖａｇｅｄｏｍａｉｎＪＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９６９３３１１５６１１６０２ＪｏｕｎｇＪＫＳａｎｄｅｒＪＤＴＡＬＥＮｓａｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇＪＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２０１３１４１４９５５３ＦｉｒｅＡＸｕＳＱＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙＭＫｅｔａｌＰｏｔｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃ

ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ４００８００ａｎｄ１２００ｎｇＺＦＮｐｌａｓｍｉｄｔｈｅｇｅｎｏｍｅｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｆｔｅｒ５ｄａｙｓＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＺＦＮｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＴ７ＥＩｅｎｚｙｍｅｓＬａｎｅＭ２０００ｂｐＬａｄｄｅｒ

6 842 中国生物化学与分子生物学报第 30 卷 genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans[ J]. Nature, 1998, 391(6669): [ 4 ] Qi L S, Larson M H, Gilbert L A, et al. Repurposing CRISPR as an RNA guided platform for sequence specific control of gene expression [ J]. Cell, 2013, 152(5): [ 5 ] Porteus M H, Carroll D. Gene targeting using zinc finger nucleases [ J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(8): [ 6 ] Beumer K J, Trautman J K, Bozas A, et al. Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc finger nucleases[ J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 ( 50 ): [ 7 ] Meng X, Noyes M B, Zhu LJ, et al. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc finger nucleases [ J ]. Nat Biotechnol, 2008, 26(6): [ 8 ] Cui X, Ji D, Fisher D, et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc finger nucleases[ J]. Nat Biotechnol, 2011, 29(1): [ 9 ] Zhang F, Maeder M L, Unger Wallace E, et al. High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases[ J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107 ( 26 ): [10] Bibikova M, Goloc M, Golick G, et al. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc finger nucleases[ J]. Genetics,2002, 161(3): [11] Doyon Y, McCammon J M, Miller J C, et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc finger nucleases [ J]. Nat Biotechnol, 2008, 26(6): [12] Hauschild J, Petersen B, Santiago Y, et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc finger nucleases [ J]. Proc Natl Acad Sci USA Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108 (29): [13] Watanabe MWatanabe M, Umeyama KUmeyama K, Matsunari H, et al. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc finger nucleases [ J ]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 402(1):14 18 [14] Mussolino C, Morbitzer R, Lutge F, et al. A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity[ J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39 (21): [15] Urnov F D, Rebar E J, Holmes M C, et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases[ J]. Nat Rev Gene,2010, 11 (9): [16] Strathdee D, Ibbotson H, Grant S G. Expression of transgenes targeted to the Gt ( ROSA) 26Sor locus is orientation dependent [J]. PLoS One, 2006, 1(1): e4 [17] Tang W, Newton R J, Weidner D A. Genetic transformation and gene silencing mediated by multiple copies of a transgene in eastern white pine[j]. J Exp Bot, 2007, 58(3): [18] D ' Haene B, Vandesompele J, Hellemans J. Accurate and objective copy number profiling using real time quantitative PCR [J]. Methods, 2010, 50(4): [19] Smith J, Bibikova M, Whitby F G, et al. Requirements for double strand cleavage by chimeric restriction enzymes with zinc finger DNA recognition domains[ J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(17): [20] Bibikova M, Carroll D, Segal D J, et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases[ J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(1):

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第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪