前 言 本 标 准 代 替 GB/T 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 本 标 准 与 GB/T 相 比, 主 要 变 化 如 下 : 修 改 了 标 准 的 中 文 名 称 ; 修 改 了 样 品 制 备 过

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1 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 发 布 实 施 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布

2 前 言 本 标 准 代 替 GB/T 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 本 标 准 与 GB/T 相 比, 主 要 变 化 如 下 : 修 改 了 标 准 的 中 文 名 称 ; 修 改 了 样 品 制 备 过 程 ; 修 改 了 培 养 基 与 试 剂 ; 修 改 了 操 作 步 骤 ; 修 改 了 菌 数 计 算 部 分 ; 增 加 了 附 录 A I

3 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 1 范 围 本 标 准 规 定 了 食 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens) 的 检 验 方 法 本 标 准 适 用 于 食 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 的 检 验 2 设 备 和 材 料 除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外, 其 他 设 备 和 材 料 如 下 : a) 恒 温 培 养 箱 :36 ±1 ; b) 冰 箱 :2 ~5 ; c) 恒 温 水 浴 箱 :50 ±1,46 ±0.5 ; d) 天 平 : 感 量 0.1 g; e) 均 质 器 ; f) 显 微 镜 :10 ~100 ; g) 无 菌 吸 管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻 度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻 度 ) 或 微 量 移 液 器 及 吸 头 ; h) 无 菌 试 管 :18mm 180mm; i) 无 菌 培 养 皿 : 直 径 90 mm; j) ph 计 或 ph 比 色 管 或 精 密 ph 试 纸 ; k) 厌 氧 培 养 装 置 3 培 养 基 和 试 剂 3.1 胰 胨 - 亚 硫 酸 盐 - 环 丝 氨 酸 (TSC) 琼 脂 : 见 附 录 A 中 A 液 体 硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 (FTG): 见 附 录 A 中 A 缓 冲 动 力 - 硝 酸 盐 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A 乳 糖 - 明 胶 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A 含 铁 牛 乳 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A % 蛋 白 胨 水 : 见 附 录 A 中 A 革 兰 氏 染 色 液 : 见 附 录 A 中 A 硝 酸 盐 还 原 试 剂 : 见 附 录 A 中 A 缓 冲 甘 油 - 氯 化 钠 溶 液 : 见 附 录 A 中 A.9 4 检 验 程 序 1

4 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 程 序 见 图 1 检 样 25g(mL) 检 样 +225 ml0.1% 蛋 白 胨 水 均 质 稀 释 10-1 ~10-6 稀 释 液 各 1mL + TSC 琼 脂 混 合 厌 氧 培 养,36 ±1 20h~24h, 黑 色 菌 落 计 数 任 选 黑 色 菌 落 5 个, 分 别 接 种 FTG 培 养 基 确 证 试 验 镜 检 形 态 牛 奶 发 酵 动 力 - 硝 酸 盐 乳 糖 - 明 胶 报 告 图 1 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 程 序 5 操 作 步 骤 5.1 样 品 制 备 样 品 采 集 后 应 尽 快 检 验, 若 不 能 及 时 检 验, 可 在 2 ~5 保 存 ; 如 8 h 内 不 能 进 行 检 验, 应 以 无 菌 操 作 称 取 25 g(ml) 样 品 加 入 等 量 缓 冲 甘 油 - 氯 化 钠 溶 液 ( 液 体 样 品 应 加 双 料 ), 并 尽 快 至 于 -60 低 温 冰 箱 中 冷 冻 保 存 或 加 干 冰 保 存 以 无 菌 操 作 称 取 25 g(ml) 样 品 放 入 含 有 225 ml 0.1% 蛋 白 胨 水 ( 如 为 中 冷 冻 保 存 样 品, 室 温 解 冻 后, 加 入 200 ml 0.1% 蛋 白 胨 水 ) 的 均 质 袋 中, 在 拍 击 式 均 质 器 上 连 续 均 质 1 min~2 min; 或 置 于 盛 有 225 ml0.1% 蛋 白 胨 水 的 均 质 杯 中,8 000 r/min~ r/min 均 质 1min~2 min, 作 为 1:10 稀 释 液 以 上 述 1:10 稀 释 液 按 1 ml 加 0.1% 蛋 白 胨 水 9 ml 制 备 10-2 ~10-6 的 系 列 稀 释 液 2

5 5.2 培 养 吸 取 各 稀 释 液 1 ml 加 入 无 菌 平 皿 内, 每 个 稀 释 度 做 两 个 平 行 每 个 平 皿 倾 注 冷 却 至 50 的 TSC 琼 脂 ( 可 放 置 于 50 ±1 恒 温 水 浴 箱 中 保 温 )15 ml, 缓 慢 旋 转 平 皿, 使 稀 释 液 和 琼 脂 充 分 混 匀 上 述 琼 脂 平 板 凝 固 后, 再 加 10 ml 冷 却 至 50 的 TSC 琼 脂 ( 可 放 置 于 50 ±1 恒 温 水 浴 箱 中 保 温 ) 均 匀 覆 盖 平 板 表 层 待 琼 脂 凝 固 后, 正 置 于 厌 氧 培 养 装 置 内,36 ±1 培 养 20 h~24 h 典 型 的 产 气 荚 膜 梭 菌 在 TSC 琼 脂 平 板 上 为 黑 色 菌 落 5.3 确 证 试 验 从 单 个 平 板 上 任 选 5 个 ( 小 于 5 个 全 选 ) 黑 色 菌 落, 分 别 接 种 到 FTG 培 养 基,36 ±1 培 养 18 h~24 h 用 上 述 培 养 液 涂 片, 革 兰 氏 染 色 镜 检 并 观 察 其 纯 度 产 气 荚 膜 梭 菌 为 革 兰 氏 阳 性 粗 短 的 杆 菌, 有 时 可 见 芽 孢 体 如 果 培 养 液 不 纯, 应 划 线 接 种 TSC 琼 脂 平 板 进 行 分 纯,36 ±1 厌 氧 培 养 20 h~24 h, 挑 取 单 个 典 型 黑 色 菌 落 接 种 到 FTG 培 养 基,36 ±1 培 养 18 h~24 h, 用 于 后 续 的 确 证 试 验 取 生 长 旺 盛 的 FTG 培 养 液 1 ml 接 种 于 含 铁 牛 乳 培 养 基, 在 46 ±0.5 水 浴 中 培 养 2 h 后, 每 小 时 观 察 一 次 有 无 暴 烈 发 酵 现 象, 该 现 象 的 特 点 是 乳 凝 结 物 破 碎 后 快 速 形 成 海 绵 样 物 质, 通 常 会 上 升 到 培 养 基 表 面 5 h 内 不 发 酵 者 为 阴 性 产 气 荚 膜 梭 菌 发 酵 乳 糖, 凝 固 酪 蛋 白 并 大 量 产 气, 呈 暴 烈 发 酵 现 象, 但 培 养 基 不 变 黑 用 接 种 环 ( 针 ) 取 FTG 培 养 液 穿 刺 接 种 缓 冲 动 力 - 硝 酸 盐 培 养 基, 于 36 ±1 培 养 24 h 在 透 射 光 下 检 查 细 菌 沿 穿 刺 线 的 生 长 情 况, 判 定 有 无 动 力 有 动 力 的 菌 株 沿 穿 刺 线 呈 扩 散 生 长, 无 动 力 的 菌 株 只 沿 穿 刺 线 生 长 然 后 滴 加 0.5 ml 试 剂 甲 和 0.2 ml 试 剂 乙 以 检 查 亚 硝 酸 盐 的 存 在 15 min 内 出 现 红 色 者, 表 明 硝 酸 盐 被 还 原 为 亚 硝 酸 盐 ; 如 果 不 出 现 颜 色 变 化, 则 加 少 许 锌 粉, 放 置 10 min, 出 现 红 色 者, 表 明 该 菌 株 不 能 还 原 硝 酸 盐 产 气 荚 膜 梭 菌 无 动 力, 能 将 硝 酸 盐 还 原 为 亚 硝 酸 盐 用 接 种 环 ( 针 ) 取 FTG 培 养 液 穿 刺 接 种 乳 糖 - 明 胶 培 养 基, 于 36 ±1 培 养 24 h, 观 察 结 果 如 发 现 产 气 和 培 养 基 由 红 变 黄, 表 明 乳 糖 被 发 酵 并 产 酸 将 试 管 于 5 左 右 放 置 1 h, 检 查 明 胶 液 化 情 况 如 果 培 养 基 是 固 态, 于 36 ±1 再 培 养 24 h, 重 复 检 查 明 胶 是 否 液 化 产 气 荚 膜 梭 菌 能 发 酵 乳 糖, 使 明 胶 液 化 6 结 果 与 报 告 6.1 典 型 菌 落 计 数 选 取 典 型 菌 落 数 在 20 CFU~200 CFU 之 间 的 平 板, 计 数 典 型 菌 落 数 如 果 : a) 只 有 一 个 稀 释 度 平 板 的 典 型 菌 落 数 在 20CFU~200CFU 之 间, 计 数 该 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 ; b) 最 低 稀 释 度 平 板 的 典 型 菌 落 数 均 小 于 20 CFU, 计 数 该 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 ; c) 某 一 稀 释 度 平 板 的 典 型 菌 落 数 均 大 于 200 CFU, 但 下 一 稀 释 度 平 板 上 没 有 典 型 菌 落, 应 计 数 该 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 ; d) 某 一 稀 释 度 平 板 的 典 型 菌 落 数 均 大 于 200 CFU, 且 下 一 稀 释 度 平 板 上 有 典 型 菌 落, 但 其 平 板 上 的 典 型 菌 落 数 不 在 20 CFU~200 CFU 之 间, 应 计 数 该 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 ; e)2 个 连 续 稀 释 度 平 板 的 典 型 菌 落 数 均 在 20CFU~200CFU 之 间, 分 别 计 数 2 个 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 6.2 结 果 计 算 6.1 计 数 结 果 按 公 式 (1) 计 算 : 3

6 T ( n 1 B ( A ) C 0.1n ) d 2 (1) GB 式 中 : T 样 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 的 菌 落 数 ; A 单 个 平 板 上 典 型 菌 落 数 ; B 单 个 平 板 上 经 确 证 试 验 为 产 气 荚 膜 梭 菌 的 菌 落 数 ; C 单 个 平 板 上 用 于 确 证 试 验 的 菌 落 数 ; n 1 第 一 稀 释 度 ( 低 稀 释 倍 数 ) 经 确 证 试 验 有 产 气 荚 膜 梭 菌 的 平 板 个 数 ; n 2 第 二 稀 释 度 ( 高 稀 释 倍 数 ) 经 确 证 试 验 有 产 气 荚 膜 梭 菌 的 平 板 个 数 ; 0.1 稀 释 系 数 ; d 稀 释 因 子 ( 第 一 稀 释 度 ) 6.3 报 告 根 据 TSC 琼 脂 平 板 上 产 气 荚 膜 梭 菌 的 典 型 菌 落 数, 按 照 6.2 中 公 式 计 算, 报 告 每 g(ml) 样 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 数, 报 告 单 位 以 CFU/ g(ml) 表 示 ; 如 T 值 为 0, 则 以 小 于 1 乘 以 最 低 稀 释 倍 数 报 告 4

7 附 录 A 培 养 基 和 试 剂 A.1 胰 胨 - 亚 硫 酸 盐 - 环 丝 氨 酸 (TSC) 琼 脂 A.1.1 基 础 成 分 胰 胨 1 大 豆 胨 酵 母 粉 焦 亚 硫 酸 钠 柠 檬 酸 铁 铵 琼 脂 ml ph 7.6±0.2 A.1.2 D- 环 丝 氨 酸 溶 液 溶 解 1 gd- 环 丝 氨 酸 于 200 ml, 膜 过 滤 除 菌 后, 于 4 冷 藏 保 存 备 用 A.1.3 制 法 将 基 础 成 分 加 热 煮 沸 至 完 全 溶 解, 调 节 ph, 分 装 到 500 ml 烧 瓶 中, 每 瓶 250 ml,121 高 压 灭 菌 15 min, 于 50 ±1 保 温 备 用 临 用 前 每 250 ml 基 础 溶 液 中 加 入 20 ml D- 环 丝 氨 酸 溶 液, 混 匀, 倾 注 平 皿 A.2 液 体 硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 (FTG) A.2.1 成 分 胰 蛋 白 胨 1 L- 胱 氨 酸 0.5g 酵 母 粉 葡 萄 糖 氯 化 钠 2.5g 硫 乙 醇 酸 钠 0.5g 刃 天 青 0.001g 琼 脂 0.75g ph 7.1±0.2 A.2.2 制 法 将 以 上 成 分 加 热 煮 沸 至 完 全 溶 解, 冷 却 后 调 节 ph, 分 装 试 管, 每 管 10 ml,121 高 压 灭 菌 15 min 临 用 前 煮 沸 或 流 动 蒸 汽 加 热 15 min, 迅 速 冷 却 至 接 种 温 度 A.3 缓 冲 动 力 - 硝 酸 盐 培 养 基 A.3.1 成 分 蛋 白 胨 牛 肉 粉 3.0 g 硝 酸 钾 磷 酸 氢 二 钠 2.5g 5

8 半 乳 糖 甘 油 5.0 ml 琼 脂 3.0 g ph 7.3±0.2 A.3.2 制 法 将 以 上 成 分 加 热 煮 沸 至 完 全 溶 解, 调 节 ph, 分 装 试 管, 每 管 10 ml,121 高 压 灭 菌 15 min 如 果 当 天 不 用, 置 4 左 右 冷 藏 保 存 临 用 前 煮 沸 或 流 动 蒸 汽 加 热 15 min, 迅 速 冷 却 至 接 种 温 度 A.4 乳 糖 - 明 胶 培 养 基 A.4.1 成 分 蛋 白 胨 1 酵 母 粉 10.0 g 乳 糖 10.0 g 酚 红 0.05g 明 胶 g ph 7.5±0.2 A.4.2 制 法 加 热 溶 解 蛋 白 胨 酵 母 粉 和 明 胶 于 1000 ml 中, 调 节 ph, 加 入 乳 糖 和 酚 红 分 装 试 管, 每 管 10 ml,121 高 压 灭 菌 10 min 如 果 当 天 不 用, 置 4 左 右 冷 藏 保 存 临 用 前 煮 沸 或 流 动 蒸 汽 加 热 15 min, 迅 速 冷 却 至 接 种 温 度 A.5 含 铁 牛 乳 培 养 基 A.5.1 成 分 新 鲜 全 脂 牛 奶 硫 酸 亚 铁 (FeSO 4 7H 2 O) 50.0 ml A.5.2 制 法 将 硫 酸 亚 铁 溶 于 中, 不 断 搅 拌, 缓 慢 加 入 1000 ml 牛 奶 中, 混 匀 分 装 大 试 管, 每 管 10 ml, 118 高 压 灭 菌 12 min 本 培 养 基 必 须 新 鲜 配 制 A.6 0.1% 蛋 白 胨 水 A.6.1 成 分 蛋 白 胨 ph 7.0±0.2 A.6.2 制 法 加 热 溶 解, 调 节 ph,121 高 压 灭 菌 15 min A.7 革 兰 氏 染 色 液 A.7.1 结 晶 紫 染 色 液 A 成 分 结 晶 紫 1.0g 6

9 95% 乙 醇 20.0 ml 1% 草 酸 铵 水 溶 液 80.0 ml A 制 法 将 结 晶 紫 完 全 溶 于 乙 醇 中, 然 后 与 草 酸 铵 溶 液 混 合 A.7.2 革 兰 氏 碘 液 A 成 分 碘 碘 化 钾 2.0 g ml A 制 法 将 碘 与 碘 化 钾 先 混 合, 加 入 少 许 振 摇, 待 完 全 溶 解 后, 再 加 入 至 300 ml A.7.3 沙 黄 复 染 液 A 成 分 沙 黄 0.25 g 95% 乙 醇 10.0 ml 90.0 ml A 制 法 将 沙 黄 溶 解 于 95% 乙 醇 中, 然 后 用 稀 释 A.7.4 染 色 方 法 涂 片 在 火 焰 上 固 定, 滴 加 结 晶 紫 染 液, 染 色 1 min, 水 洗 滴 加 革 兰 氏 碘 液, 作 用 1 min, 水 洗 滴 加 95% 乙 醇 脱 色 约 15 s~30 s, 直 至 染 色 液 被 洗 掉, 不 要 过 分 脱 色, 水 洗 滴 加 沙 黄 复 染 液, 复 染 1 min, 水 洗 待 干 镜 检 A.8 硝 酸 盐 还 原 试 剂 A.8.1 甲 液 ( 对 氨 基 苯 磺 酸 溶 液 ) 在 ml 5 mol/l 乙 酸 中 溶 解 8 g 对 氨 基 苯 磺 酸 A.8.2 乙 液 (α- 萘 酚 乙 酸 溶 液 ) 在 ml 5 mol/l 乙 酸 中 溶 解 5 g α- 萘 酚 A.9 缓 冲 甘 油 - 氯 化 钠 溶 液 A.9.1 成 分 甘 油 ml 氯 化 钠 4.2 g 磷 酸 氢 二 钾 ( 无 水 ) 12.4 g 磷 酸 二 氢 钾 ( 无 水 ) 4.0 g ml ph7.2±0.1 A.9.2 制 法 将 以 上 成 分 加 热 至 完 全 溶 解, 调 节 ph,121 高 压 灭 菌 15 min 配 制 双 料 缓 冲 甘 油 溶 液 时, 用 甘 油 200 ml 和 800 ml 7

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