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1 328 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology DOI: /j.cjb 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 March 25, 2015, 31(3): Chin J Biotech, All rights reserved 综 述 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 朱 莉, 许 超 艳, 李 晶 晶, 田 俊, 冯 昭 中, 彭 学 江 苏 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 江 苏 徐 州 朱 莉, 许 超 艳, 李 晶 晶, 等. 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展. 生 物 工 程 学 报, 2015, 31(3): Zhu L, Xu CY, Li JJ, et al. Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 摘 要 : 对 羟 基 苯 甲 酸 (4-Hydroxybenzoate,4HBA) 是 用 途 广 泛 的 有 机 原 料, 现 行 的 生 产 工 艺 是 以 石 油 成 分 合 成 而 得, 在 环 境 污 染 不 断 恶 化 人 类 生 存 已 经 面 临 威 胁 之 际, 开 发 利 用 可 再 生 资 源 的 生 产 工 艺 已 成 为 全 球 当 务 之 急 本 综 述 在 简 要 介 绍 从 石 油 成 分 合 成 4HBA 之 后, 主 要 阐 述 利 用 植 物 和 微 生 物 从 可 再 生 资 源 合 成 4HBA 的 研 究 进 展 莽 草 酸 途 径 是 生 物 合 成 芳 香 族 化 合 物 的 重 要 途 径, 从 该 途 径 的 最 终 产 物 分 支 酸 到 4HBA 有 两 条 途 径 一 条 是 分 支 酸 裂 解 酶 直 接 催 化 分 支 酸 生 成 4HBA ( 莽 草 酸 - 分 支 酸 路 线 ) 另 外 一 条 途 径 是 在 植 物 细 胞 内 引 入 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonas fluorescens 的 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 裂 解 酶 打 通 从 苯 丙 素 合 成 4HBA 的 通 路 ( 植 物 苯 丙 素 路 线 ) 最 后 介 绍 了 一 个 天 然 合 成 积 累 4HBA 的 微 泡 菌 Microbulbifer, 并 对 其 深 入 研 究 进 行 了 展 望 关 键 词 : 对 羟 基 苯 甲 酸, 合 成 生 物 学, 莽 草 酸 途 径 Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote Li Zhu, Chaoyan Xu, Jingjing Li, Jun Tian, Zhaozhong Feng, and Xue Peng School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou , Jiangsu, China Abstract: 4-Hydroxybenzoate (4HBA) is an important chemical compound used for synthesis of liquid crystal. Production of 4HBA from renewable resources is an effective mean to solve problems such as environmental pollution and petroleum shortage. This review briefly introduces the chemical synthesis of 4HBA from oil compounds, and mainly describes the progress in 4HBA biosynthesis from renewable resources by plants and microorganisms. In most intriguing aspect of plant-based synthesis of 4HBA is the appeal of directly synthesizing a chemical from CO 2. However, the Received: May 28, 2014; Accepted: October 15, 2014 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No ), Science and Technology Project of Xuzhou (No. XM12B105), Jiangsu Science and Technology Agency Project (No. BK ). Corresponding author: Xue Peng. Tel/Fax: ; 国 家 自 然 科 学 基 金 (No ), 徐 州 市 科 技 项 目 (No. XM12B105), 江 苏 科 技 厅 项 目 (No. BK ) 资 助 网 络 出 版 时 间 : 网 络 出 版 地 址 :

2 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 329 glucosylation system in plant cells converting 4HBA to glucose conjugates, causing the post treatment a problem. The recombinant microorganisms produce pure 4HBA, but less efficient. A new strain of Microbulbifer has ability to naturally accumulate 4HBA from glucose. Elucidation of the metabolic pathways and regulation systems would improve 4HBA synthesis efficiency. Keywords: 4 hydroxybenzoate, synthetic biology, shikimate pathway 对 羟 基 苯 甲 酸 (4-Hydroxybenzoate,4HBA) 是 用 途 广 泛 的 有 机 合 成 原 料, 主 要 应 用 于 食 品 化 妆 品 医 药 的 防 腐 和 防 霉 剂 杀 菌 剂 的 合 成 方 面 2002 年, 我 国 4HBA 的 生 产 量 为 t, 并 以 每 年 11.4% 的 速 度 递 增, 预 计 2014 年 的 生 产 量 可 达 t 以 上 [1] 4HBA 的 用 途 之 一 是 4HBA 酯 类 的 合 成, 该 酯 类 化 合 物 的 英 文 名 为 Paraben, 其 中 甲 酯 又 名 为 尼 泊 金 甲, 乙 酯 又 名 为 尼 泊 金 乙, 是 目 前 使 用 最 多 的 防 腐 剂 [2] 4HBA 的 另 外 一 个 重 要 用 途 是 合 成 液 晶 高 分 子 [3] 液 晶 是 在 1959 年 利 用 4HBA 的 乙 酸 酯 经 熔 融 和 固 相 聚 缩 合 后 首 次 获 得, 后 来 经 过 改 良 成 具 有 实 用 价 值 的 材 料 现 在 市 场 上 的 液 晶 商 品 Xydar 是 4HBA 对 苯 二 酚 和 酞 酸 的 聚 合 物 ; X-7G 是 4HBA 和 聚 对 苯 二 甲 酸 乙 二 酯 在 熔 融 状 态 下 的 聚 合 物 ; Vectra 是 4HBA 和 2- 羟 基 -6- 萘 甲 酸 熔 融 聚 合 物 ; Tian 是 4HBA 和 2- 羟 基 -6- 萘 甲 酸 及 对 苯 二 酚 的 聚 合 物 随 着 电 子 信 息 化 社 会 的 不 断 发 展,4HBA 的 市 场 需 求 量 日 益 增 加, 现 行 的 4HBA 生 产 工 艺 是 从 石 油 成 分 合 成 而 得, 在 环 境 污 染 的 不 断 恶 化 人 类 的 生 存 已 经 面 临 威 胁 之 际, 利 用 可 再 生 资 源 代 替 以 石 油 为 原 料 的 生 产 工 艺 已 成 为 全 球 当 务 之 急 4HBA 的 化 学 结 构 类 似 于 芳 香 族 氨 基 酸, 在 理 论 上 利 用 生 物 的 芳 香 族 氨 基 酸 合 成 途 径, 即 莽 草 酸 途 径 (Shikimate pathway) 可 以 合 成 4HBA 这 篇 综 述 首 先 介 绍 现 行 的 4HBA 化 学 合 成 工 艺, 然 后 着 重 阐 述 利 用 植 物 和 微 生 物 从 可 再 生 资 源 合 成 4HBA 的 实 例, 为 生 物 合 成 4HBA 提 供 理 论 依 据 1 从 石 油 成 分 合 成 4HBA 1.1 化 学 合 成 现 行 的 4HBA 生 产 工 艺 是 以 石 油 产 物 的 苯 (Benzene) 和 丙 烯 (Propylene) 出 发, 在 催 化 剂 氯 化 铝 的 存 在 下 高 温 高 压 合 成 异 丙 苯 (Cumene), 然 后 将 异 丙 苯 在 左 右 用 氧 气 氧 化 成 过 氧 化 氢 异 丙 苯 (Cumenehydroperoxide) ( 图 1A) 过 氧 化 氢 异 丙 苯 在 酸 性 和 条 件 下 生 成 苯 酚 (Phenol) [4] 从 苯 酚 到 4HBA 的 制 备 有 多 种 方 法 常 规 工 艺 是 利 用 Kolbe-Schmitt 反 应, 即 将 苯 酚 加 入 KOH 制 备 成 酚 钾 盐, 然 后 与 二 氧 化 碳 在 高 温 高 压 下 进 行 气 固 相 羧 基 化 反 应 生 成 4HBA 整 个 合 成 工 艺 必 须 在 高 温 高 压 下 进 行, 需 要 消 耗 大 量 能 源 导 致 生 产 效 率 低 成 本 高 特 别 是 合 成 途 径 中 有 环 境 污 染 物 质 苯 酚 的 生 成, 给 工 业 排 水 的 处 理 带 来 很 大 困 难 [5] 1.2 生 物 转 化 白 色 生 物 技 术 (White biotechnology) 是 近 年 来 提 出 的 新 概 念, 即 利 用 已 知 的 代 谢 调 节 机 理 对 各 种 微 生 物 进 行 改 造, 构 建 成 一 个 细 胞 工 厂, 使 其 更 好 地 服 务 于 人 类 甲 苯 (Toluene) 是 石 油 中 的 一 种 没 有 得 到 有 效 利 用 的 芳 香 族 成 分, 一 些 研 究 人 员 利 用 白 色 生 物 技 术 将 恶 臭 假

3 330 ISSN CN /Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 单 胞 菌 Pseudononas putida DOT-T1E 改 造 成 一 [6-9] 个 从 甲 苯 合 成 4HBA 的 细 胞 工 厂 ( 图 1B) DOT-T1E 菌 株 本 来 是 甲 苯 降 解 菌 株, 且 耐 有 机 溶 剂 DOT-T1E 菌 株 降 解 甲 苯 的 第 一 步 骤 是 由 甲 苯 双 加 氧 酶 催 化 将 甲 苯 氧 化 为 cis- 甲 苯 2,3- 二 氢 二 醇 (cis-toluene 2,3-dihydrodiol), 该 酶 由 todc1c2ba 基 因 编 码 todd 基 因 编 码 的 脱 氢 酶 将 cis- 甲 苯 2,3- 二 氢 二 醇 氧 化 成 3- 甲 基 苯 二 酚 (3-Methylcatechol), 然 后 开 环 后 进 入 三 羧 酸 循 环 [6] Ramos-González 等 将 编 码 甲 苯 双 加 氧 酶 基 因 中 的 todc 基 因 敲 除, 同 时 将 该 菌 株 的 poba 基 因 也 敲 除 掉 构 建 成 一 个 甲 苯 营 养 缺 陷 型 (DOT- todc poba),poba 编 码 的 是 4HBA-4- 羟 化 酶, 催 化 氧 化 4HBA 成 原 儿 茶 酸 (Protocatechuate) 的 反 应 DOT- todc poba 成 为 不 能 降 解 甲 苯 和 4HBA 的 菌 株 在 此 遗 传 背 景 下, 负 责 转 化 甲 苯 图 1 利 用 石 油 成 分 和 可 再 生 资 源 的 4 条 4HBA 合 成 途 径 Fig. 1 Four 4HBA synthetic routes from oil compounds and renewable source. (A) Chemical synthesis route with benzene as raw material. (B) Biocatalysis synthesis route with toluene as raw material. (C) Shikimate-chorismate pathway. (D) Plant phenylpropanoids pathway.

4 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 331 至 4HBA 的 一 系 列 基 因 从 门 多 萨 假 单 胞 菌 Pseudomonas mendocina KR1 菌 株 引 入 到 该 菌 株 的 染 色 体 中, 构 建 成 DOT-T1E-24 菌 株 这 一 系 列 基 因 包 括 :tmoabcdef, 编 码 甲 苯 单 加 氧 酶, 催 化 的 反 应 是 在 甲 苯 的 4 位 引 入 一 个 羟 基 生 成 甲 酚 (p-cresol);pcubxa 编 码 甲 酚 单 加 氧 酶, 催 化 将 甲 酚 氧 化 为 4- 羟 基 苯 醇 (4-Hydroxybenzyl alcohol) 和 进 一 步 氧 化 为 4- 羟 基 苯 醛 (4-Hydroxybenzyl aldehyde) 的 两 步 反 应 ;pcuc 编 码 4- 羟 基 苯 醛 脱 氢 酶, 催 化 生 成 4HBA 的 反 应 在 摇 瓶 分 批 培 养 条 件 下 DOT-T1E-24 菌 株 成 功 将 甲 苯 转 化 成 4HBA, 并 得 到 12 mmol/l 的 积 累 记 录 从 石 油 成 分 甲 苯 出 发, 理 论 上 一 个 甲 苯 可 以 合 成 一 个 4HBA 2 利 用 植 物 的 生 物 合 成 2.1 利 用 莽 草 酸 途 径 的 4HBA 合 成 莽 草 酸 途 径 由 7 步 反 应 合 成 分 支 酸 (Chorismate), 是 普 遍 存 在 于 植 物 真 菌 和 细 菌 中 的 一 条 重 要 芳 香 族 氨 基 酸 合 成 代 谢 途 径 第 一 步 是 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 和 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 缩 合 成 一 个 七 碳 酮 糖 开 环 磷 酸 化 合 物,3- 脱 氧 -β- 阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (DAHP) [10] 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 和 赤 藓 糖 4- 磷 酸 分 别 是 糖 酵 解 途 径 和 磷 酸 戊 糖 途 径 上 的 重 要 中 间 代 谢 产 物 分 支 酸 是 合 成 酪 氨 酸 色 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 的 分 支 点, 从 分 支 酸 到 4HBA 的 合 成 途 径 有 3 条 第 一 条 是 分 支 酸 裂 解 酶 (Chorismate lyase, UbiC) 直 接 催 化 分 支 酸 生 成 4HBA ( 分 支 酸 裂 解 酶 途 径 ) [11-12] ( 图 1C) 第 二 条 是 利 用 合 成 苯 丙 素 (Phenylpropanoids) 的 途 径 ( 苯 丙 素 途 径 ) ( 图 1D) 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 催 化 脱 掉 芳 香 族 氨 基 酸 上 的 氨 基 生 成 相 应 的 苯 丙 素, 然 后 和 CoA 链 接 成 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA (4-Hydroxycinnamoyl-CoA) 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 裂 解 酶 (4-Hydroxycinnamoyl-CoA lyase,hchl), 催 化 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 的 侧 链 生 成 对 羟 基 苯 甲 醛 (4-Hydroxybenzaldehyde), 然 后 该 产 物 被 氧 化 成 4HBA [13] HCHL 基 因 在 植 物 中 不 存 在, 从 外 源 引 入 后 能 打 通 从 苯 丙 素 合 成 4HBA 的 通 路 第 三 条 在 胡 萝 卜 Daucuscarota 中 被 发 现, 属 于 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 非 依 赖 途 径 [14-16] 苯 丙 氨 酸 在 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 的 催 化 下 生 成 肉 桂 酸 (Cinnamate), 肉 桂 酸 羟 化 酶 在 4 位 引 入 一 个 羟 基, 生 成 对 羟 基 肉 桂 酸, 再 通 过 非 氧 化 途 径 (Non-β-oxidative route) 合 成 4HBA 植 物 细 胞 是 从 CO 2 合 成 的, 无 论 哪 条 途 径, 其 理 论 得 率 是 4HBA/7CO 重 组 植 物 利 用 重 组 烟 草 作 为 4HBA 的 生 产 宿 主 有 两 [17] 个 报 道 一 是 Mayer 等 在 烟 草 的 细 胞 质 内 表 达 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonas fluorescence AN103 的 HCHL 基 因, 使 酪 氨 酸 能 够 生 成 4HBA 获 得 的 4HBA 产 量 为 烟 草 总 量 的 2.9%, 但 是 得 到 的 4HBA 都 是 葡 糖 基 化 产 物, 而 且 重 组 烟 草 的 [18] 生 长 受 到 影 响 二 是 杜 邦 公 司 的 Viitanen 等 [19-20] 和 Sommer 等 把 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 转 化 到 烟 草 的 叶 绿 体 染 色 体 上, 并 在 其 上 游 插 入 在 叶 绿 体 中 特 异 转 录 的 启 动 子 ubic 基 因 在 烟 草 的 叶 绿 体 内 表 达 成 功, 并 合 成 了 4HBA, 产 量 为 烟 草 总 量 的 13%, 但 得 到 的 4HBA 也 都 是 葡 糖 基 化 产 物 另 外 利 用 植 物 作 为 4HBA 生 产 宿 主 的 还 有 [21] Rahman 等 把 HCHL 基 因 重 组 到 甜 菜 Beta vulgaris 染 色 体 中 合 成 了 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为

5 332 ISSN CN /Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 [22] 甜 菜 总 重 的 14% Mitra 等 把 荧 光 假 单 胞 菌 P. fluorescence AN103 的 HCHL 基 因 重 组 到 曼 陀 罗 甜 菜 Daturastramonium 染 色 体 中 合 成 了 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为 曼 陀 罗 甜 菜 总 重 的 [23] 0.5% McQualter 等 向 甘 蔗 Sugarcane 内 分 别 导 入 了 HCHL 基 因 和 ubic 基 因, 比 较 了 4HBA 的 产 量, 发 现 HCHL 基 因 重 组 株 的 产 量 高 于 ubic 基 因 重 组 株 从 HCHL 基 因 重 组 株 的 叶 子 里 得 到 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为 叶 子 总 重 的 7.3% 利 用 0.1 mol/l 的 NaCl 水 解 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA 可 以 获 得 4HBA 利 用 光 合 作 用 的 植 物 合 成 4HBA 的 最 大 优 点 是 直 接 利 用 二 氧 化 碳, 省 去 了 繁 琐 的 木 质 纤 维 素 的 糖 化 过 程 但 是 植 物 细 胞 中 含 有 葡 糖 基 转 移 酶, 将 4HBA 葡 糖 基 化 或 酯 化, 给 下 游 提 纯 工 程 带 来 困 难 另 外 利 用 胡 萝 卜 甜 菜 和 甘 蔗 等 食 物 资 源 生 产 工 业 原 料 会 造 成 粮 食 价 格 的 上 涨, 给 社 会 带 来 不 安 定 因 素 3 利 用 微 生 物 的 生 物 合 成 3.1 大 肠 杆 菌 Escherichia coli 利 用 微 生 物 生 产 4HBA 的 研 究 和 植 物 相 比 比 较 少 美 国 密 歇 根 州 立 大 学 的 Frost 教 授 课 题 [24] 组 对 大 肠 杆 菌 进 行 了 一 系 列 的 重 组 转 化, 构 建 了 一 株 重 组 菌 从 葡 萄 糖 生 物 合 成 了 4HBA 在 大 肠 杆 菌 中 生 物 合 成 的 4HBA 没 有 被 糖 基 化 或 酯 化 该 课 题 组 利 用 的 菌 株 是 E. coli D2704 [pheatyratrpe-c], 合 成 酪 氨 酸 苯 丙 氨 酸 和 色 氨 酸 的 3 个 基 因 (phea tyra 和 trpe) 均 被 敲 除 因 此 培 养 E. coli D2704 时 必 须 在 培 养 基 中 加 入 3 种 芳 香 族 氨 基 酸 在 E. coli D2704 的 染 色 体 上 引 入 了 3 个 外 源 基 因 : 一 个 是 经 过 诱 变 的 DAHP 合 成 酶 基 因 arof FRB, 其 酶 活 性 不 受 中 间 代 谢 产 物 的 反 馈 抑 制 ; 二 是 分 支 酸 裂 解 酶 ubic 基 因, 负 责 将 分 支 酸 转 化 成 4HBA; 三 是 转 酮 醇 酶 tklt 基 因, 用 来 大 量 提 供 莽 草 酸 途 径 的 中 间 体 赤 藓 糖 4- 磷 酸 最 后 向 该 重 组 菌 中 转 化 了 一 个 在 tac 启 动 子 下 高 效 表 达 一 系 列 莽 草 酸 途 径 基 因 的 质 粒, 包 括 3- 磷 酸 莽 草 酸 1- 羧 乙 烯 基 转 移 酶 基 因 aroa 莽 草 酸 激 酶 基 因 arol 分 支 酸 合 成 酶 基 因 aroc 和 3- 脱 氢 奎 尼 酸 基 因 arob 最 终 构 建 的 菌 株 名 为 E. coli JB161 [pjb2.274] 在 实 验 室 规 模 上 生 产 了 12.0 g/l 4HBA (98.4 mmol/l), 对 葡 [24] 萄 糖 的 收 率 为 13% 另 外 Barker 等 还 调 查 了 4HBA 对 大 肠 杆 菌 的 毒 性 实 验 证 明 10 g/l 的 4HBA 会 抑 制 大 肠 杆 菌 的 生 长 繁 殖, 同 时 抑 制 了 莽 草 酸 的 中 间 体 3- 脱 氢 莽 草 酸 的 产 量 以 上 实 验 说 明 利 用 重 组 大 肠 杆 菌 生 产 的 4HBA 虽 然 没 有 被 糖 基 化 或 酯 化, 但 是 4HBA 对 大 肠 杆 菌 表 现 出 了 毒 性, 提 高 产 量 比 较 困 难 另 外 培 养 基 中 需 要 添 加 芳 香 族 氨 基 酸, 使 培 养 基 的 制 备 复 杂 化 而 且 生 产 成 本 提 高 3.2 恶 臭 假 单 胞 菌 Pseudomonas putida 恶 臭 假 单 胞 菌 P. putida S12 是 一 个 耐 有 机 [25-26] 溶 剂 菌 株,Verhoef 等 将 其 4HBA 羟 化 酶 (4HBA hydroxylase) 基 因 poba 敲 除 后, 转 化 了 一 个 载 有 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 (Phenyalanine ammonia lyase, Pal) 基 因 的 质 粒, 构 建 成 S12palB1 菌 株, 该 菌 株 失 去 了 降 解 4HBA 的 能 力 S12palB1 菌 株 能 将 酪 氨 酸 通 过 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 转 化 为 对 羟 基 肉 桂 酸, 然 后 利 用 对 羟 基 肉 桂 酸 降 解 途 径 合 成 4HBA 以 葡 萄 糖 为 初 始 基 质 在 摇 瓶 中 培 养 S12palB1 菌 株 得 到 11% 4HBA/ 葡 萄 糖 (Cmol%) 为 了 提 高 莽 草 酸 途 径 的 前 体

6 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 333 [27] 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 供 应,Meijnen 等 将 大 肠 杆 菌 的 木 糖 降 解 基 因 xylab 引 入 到 S12palB1 菌 株 的 染 色 体 上 构 建 成 S12xylB7 菌 株, 使 该 菌 株 获 得 了 利 用 木 糖 的 功 能 xylab 基 因 分 别 编 码 木 糖 异 构 酶 和 木 酮 糖 激 酶, 催 化 木 糖 转 化 为 木 酮 糖 -5- 磷 酸 的 反 应, 构 建 了 从 木 糖 到 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 途 径 在 同 时 提 供 甘 油 和 木 糖 的 培 养 基 中, 合 成 出 来 的 4HBA 对 基 质 的 收 率 为 16.3% (Cmol%) 4HBA 是 从 葡 萄 糖 合 成 而 得, 如 果 葡 萄 糖 的 6 个 碳 在 发 酵 过 程 中 没 有 生 成 CO 2 释 放 出 去, 全 部 用 于 4HBA 的 合 成, 那 么 碳 的 理 论 收 率 (Cmol%) 应 该 为 100%, 而 质 量 的 理 论 收 率 (W/W) 为 65.6% [28] 从 这 个 数 字 来 看, 开 发 改 造 的 潜 力 非 常 大 3.3 酿 酒 酵 母 Saccharomyces cerevisiae [29] Krömer 等 将 酿 酒 酵 母 S. cerevisiae 的 编 码 分 支 酸 变 位 酶 (Chorismate mutase) 基 因 aro7 敲 除 掉 构 建 成 aro7 菌 株, 因 此 该 菌 株 是 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 的 营 养 缺 陷 型 然 后 把 载 有 大 肠 杆 菌 ubic 基 因 的 质 粒 转 化 进 aro7 菌 株 中 构 建 成 aro7pcv3-ubic 菌 株 该 菌 株 从 83.3 mmol/l 葡 萄 糖 合 成 了 650 μmol/l 的 4HBA, 相 当 于 0.6% 4HBA/ 葡 萄 糖 产 量 不 是 很 理 想, 这 是 由 于 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 的 密 码 子 偏 好 性 和 酿 酒 酵 母 的 差 异 很 大,ubiC 基 因 没 有 得 到 有 效 表 达 迄 今 为 止 没 有 发 现 酿 酒 酵 母 的 ubic 基 因, 今 后 只 能 通 过 人 工 改 良 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 来 提 高 4HBA 的 产 量 另 外 酿 酒 酵 母 也 不 存 在 对 羟 基 肉 桂 酸 降 解 途 径, 从 酪 氨 酸 合 成 4HBA 的 难 度 很 大 利 用 酿 酒 酵 母 作 为 4HBA 合 成 宿 主 的 最 大 优 点 是 糖 利 用 效 率 高, 而 且 高 浓 度 的 糖 不 抑 制 菌 株 的 生 长 繁 殖 4 微 泡 菌 Microbulbifer 的 次 级 代 谢 产 物 4.1 微 泡 菌 Microbulbifer 微 泡 菌 Microbulbifer 又 称 溶 藻 细 菌, 属 于 变 形 菌 纲, 广 泛 分 布 于 海 洋 环 境 中, 它 生 产 的 生 理 活 性 物 质 以 及 海 藻 成 分 降 解 酶 等 越 来 越 受 到 人 们 的 重 视 [30-32] 2006 年, 本 课 题 组 首 次 发 现 从 海 洋 环 境 中 分 离 出 的 微 泡 菌 Microbulbifer 菌 株 有 合 成 4HBA 和 4HBA 酯 类 的 功 能, 在 我 们 的 调 查 范 围 内 A4B-17 菌 株 所 合 成 的 量 最 多 [33] [34] 后 来 Quévrain 等 在 2009 年 也 报 道 了 他 们 分 离 的 微 泡 菌 Microbulbifer 菌 株 也 合 成 了 4HBA 合 成 积 累 4HBA 和 酯 类 是 微 泡 菌 Microbulbifer 的 一 个 特 征 4HBA 是 芳 香 族 高 分 子 木 质 素 的 降 解 产 物, 在 土 壤 环 境 中 很 多 微 生 物 拥 有 降 解 4HBA 基 因,4HBA 不 会 在 体 内 外 积 累 [35-37] 微 泡 菌 Microbulbifer 是 在 海 洋 环 境 中 生 存 的 微 生 物, 表 现 出 和 土 壤 环 境 不 同 的 面 目, 不 但 不 降 解 而 且 还 合 成 积 累 4HBA 4.2 微 泡 菌 Microbulbifer sp. A4B-17 菌 株 微 泡 菌 Microbulbifer sp. A4B-17 菌 株 在 含 有 葡 萄 糖 的 培 养 基 中 培 养 时 有 合 成 积 累 4HBA 和 其 酯 化 物 的 功 能, 当 细 胞 进 入 稳 定 期 后 在 培 养 基 里 积 累 了 10 mg/l 的 4HBA 和 各 种 酯 化 物, 总 量 约 30 mg/l 虽 然 4HBA 的 量 不 是 很 高, 但 是 野 生 菌 株 合 成 积 累 4HBA 的 能 力 是 首 次 发 现 如 果 适 当 发 挥 其 天 然 潜 力, 对 A4B-17 菌 株 的 4HBA 合 成 基 因 进 行 改 造, 有 希 望 合 成 更 多 的 4HBA, 以 满 足 工 业 生 产 的 需 求 4HBA 和 相 应 醇 类 酯 化 后 的 产 物 叫 4HBA 酯 类 (Parabens) 1920 年, 人 工 合 成 并 发 现 4HBA 酯 类 有 抑 菌 作 用 后, 由 于 4HBA 酯 类 具 有 价 格 便 宜 无 色 无 毒 较 为 广 泛 的 抑 菌 谱 且 抑

7 334 ISSN CN /Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 菌 作 用 不 受 ph 影 响 等 特 点, 现 在 作 为 防 腐 剂 广 泛 应 用 于 食 品 和 化 妆 品 的 保 存 方 面 [38-40] 以 前 认 为 4HBA 酯 类 是 人 工 化 合 物, 我 们 的 发 现 阐 明 微 泡 菌 Microbulbifer 早 已 经 把 它 们 当 作 抑 菌 剂, 遏 制 周 围 微 生 物 的 生 长 繁 殖 扩 大 自 己 的 生 存 空 间 通 过 A4B-17 菌 株 的 次 级 代 谢 产 物 的 研 究 也 会 使 我 们 了 解 海 洋 环 境 中 微 生 物 与 微 生 物 之 间 的 拮 抗 作 用 研 究 还 发 现,A4B-17 菌 株 的 次 级 代 谢 产 物 中 含 有 4HBA 丁 酯 4HBA 壬 酯 和 4HBA 庚 酯, 而 且 是 按 照 梯 度 4HBA 丁 酯 >4HBA 壬 酯 >4HBA 庚 酯 合 成 出 来 的 而 这 个 梯 度 具 有 生 理 意 义, 是 有 效 抑 制 微 生 物 生 长 的 合 理 梯 度 是 什 么 调 控 机 制 使 A4B-17 菌 株 按 照 这 个 梯 度 合 成 4HBA 酯 类, 这 个 梯 度 是 否 受 到 环 境 因 素 的 影 响? 这 些 问 题 将 在 今 后 的 研 究 中 阐 明 本 课 题 组 完 成 了 A4B-17 菌 株 的 基 因 组 测 序 和 注 释 工 作 A4B-17 菌 株 不 含 有 质 粒, 只 有 一 个 染 色 体, 全 长 为 bp, 共 预 测 出 个 基 因 A4B-17 菌 株 有 3 条 葡 萄 糖 降 解 途 径 ( 糖 酵 解 途 径 磷 酸 戊 糖 途 径 和 Entner-Doudoroff (ED) 途 径 ) 而 且 还 预 测 出 一 些 酶 催 化 连 接 这 3 条 途 径 的 反 应, 因 此 从 葡 萄 糖 至 烯 醇 式 丙 酮 酸 和 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 途 径 非 常 通 畅 5 展 望 利 用 植 物 合 成 4HBA 的 缺 点 是 4HBA 在 植 物 中 是 以 葡 糖 基 化 或 酯 化 产 物 的 形 式 存 在, 给 下 游 提 纯 工 程 带 来 困 难, 特 别 是 苯 丙 素 (Phenylpropanoids) 合 成 途 径 中 的 一 些 步 骤 尚 不 明 了 利 用 细 菌 作 为 合 成 4HBA 的 细 胞 工 厂 有 以 下 优 点 :1) 细 菌 的 生 长 繁 殖 速 度 快, 代 谢 周 期 短 ;2) 4HBA 的 合 成 可 以 部 分 利 用 细 菌 的 芳 香 族 氨 基 酸 的 合 成 途 径 ;3) 4HBA 对 细 菌 的 毒 性 较 小, 可 以 高 浓 度 积 累 生 产 ;4) 没 有 对 环 境 和 人 类 有 害 的 中 间 产 物 生 成 ;5) 在 中 国, 苯 甲 苯 和 葡 萄 糖 的 价 格 分 别 为 每 吨 和 元, 而 4HBA 的 价 格 为 元 /t [41] 虽 然 从 苯 和 甲 苯 出 发 理 论 上 可 以 获 得 100% 的 4HBA 收 率, 而 葡 萄 糖 转 化 为 4HBA 的 理 论 收 率 也 为 65.6% (W/W), 葡 萄 糖 的 价 格 相 对 较 低, 经 过 计 算 理 论 上 可 以 获 得 元 /t 的 4HBA 无 论 从 环 境 角 度 还 是 经 济 角 度 利 用 微 生 物 从 可 再 生 资 源 的 葡 萄 糖 合 成 4HBA, 理 论 上 要 优 于 其 他 方 法 目 前 虽 然 利 用 重 组 微 生 物 合 成 4HBA 有 一 定 的 研 究 进 展, 但 是 这 些 微 生 物 都 是 本 身 不 合 成 积 累 4HBA 的 菌 株, 通 过 复 杂 的 改 造 代 谢 途 径 和 反 馈 调 控 机 制 会 给 4HBA 的 高 效 生 产 带 来 局 限 性 本 课 题 组 拟 采 取 以 下 策 略 研 究 开 发 A4B-17 菌 株 1) 合 成 基 因 研 究 通 过 基 因 敲 除 表 达 谱 分 析 等 手 段 验 证 4HBA 合 成 途 径 中 的 关 键 基 因 功 能, 如 葡 萄 糖 转 运 和 磷 酸 化 基 因 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 合 成 基 因 DAHP 合 成 酶 基 因 和 分 支 酸 裂 解 酶 基 因 2) 阐 明 关 键 部 位 的 调 控 机 制 4HBA 和 酯 类 都 属 于 次 级 代 谢 产 物, 它 们 的 合 成 必 将 受 到 各 种 因 素 的 影 响 我 们 假 设 3 种 因 素 ( 内 在 因 素 物 化 因 素 和 抑 制 对 象 ) 对 代 谢 途 径 上 的 3 个 作 用 位 点 (PEP 位 点 4- 磷 酸 赤 藓 糖 位 点 分 支 酸 位 点 ) 有 一 定 影 响 PEP 位 点 包 括 PEP 激 酶 和 DAHP 合 成 酶 ;4- 磷 酸 赤 藓 糖 位 点 包 括 转 酮 酶 和 DAHP 合 成 酶 ; 分 支 酸 位 点 包 括 分 支 酸 裂 解 酶 邻 氨 基 苯 甲 酸 合 成 酶 (Anthranilate synthase) 和 分 支 酸 变 位 酶 本 课 题 组 将 利 用 天 然 合 成 积 累 4HBA 的 A4B-17 菌 株 作 为 宿 主, 在 深 入 研 究 代 谢 途 径 和 调 控 机 制 的 基 础 上 开 发 合 成 4HBA 的 工 业 微 生 物

8 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 335 REFERENCES [1] Chem SJ. Status quo and development trends of PHBA in China. Fine Spec Chem, 2003, 11(12): 6 7 (in Chinese). 甲 醛 / 甲 醇 信 息 研 究 室. 我 国 对 羟 基 苯 甲 酸 的 现 状 和 发 展 趋 势. 精 细 与 专 用 化 学 品, 2003, 11(12): 6 7. [2] Abbas S, Greige-Gerges H, Karam N, et al. Metabolism of parabens (4-hydroxybenzoic acid esters) by hepatic esterases and UDP-glucuronosyltransferases in man. Drug Metab Pharmacok, 2010, 25(6): [3] Yan B, Zhang YF, Liang ZJ, et al. Application of p-hydoxybenzoic acid in organic synthesis. Fine Chem Ind R Mat Int, 2010, 245(12): (in Chinese). 严 兵, 章 亚 峰, 梁 子 军, 等. 对 羟 基 苯 甲 酸 在 有 机 合 成 中 的 应 用. 精 细 化 工 原 料 及 中 间 体, 2010, 245(12): [4] Li HY, Yan CH, Cai QH, et al. Progress in preparation of phenol. Chem Eng, 2010, 179(8): (in Chinese). 李 红 艳, 闫 翠 红, 蔡 青 海, 等. 苯 酚 制 备 工 艺 研 究 进 展. 化 学 工 程 师, 2010, 179(8): [5] Li GD. Synthesis of p-hydroxybenzoic acid. Nat Sci J Xiangtan Univ, 1988, 10(1): (in Chinese). 李 国 涤. 对 羟 基 苯 甲 酸 合 成 的 研 究. 湘 潭 大 学 自 然 科 学 学 报, 1988, 10(1): [6] Ramos-González MI, Ben-Bassat A, Campos MJ, et al. Genetic engineering of a highly solvent-tolerant Pseudomonas putida strain for biotransformation of toluene to p-hydroxybenzoate. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(9): [7] Miller ES Jr1, Peretti SW. Toluene bioconversion to p-hydroxybenzoate by fed-batch cultures of recombinant Pseudomonas putida. Biotechnol Bioeng, 2002, 77(3): [8] Bailey LJ, Acheson JF, McCoy JG, et al. Crystallographic analysis of active site contributions to regiospecificity in the diiron enzyme toluene 4-monooxygenase. Biochemistry, 2012, 51(6): [9] Peng X, Taki H, Komukai S, et al. Characterization of four Rhodococcus alcohol dehydrogenase genes responsible for the oxidation of aromatic alcohols. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71(6): [10] Li PP, Li DF, Liu D, et al. Interaction between DAHP synthase and chorismate mutase endows new regulation on DAHP synthase activity in Corynebacterium glutamicum. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(24): [11] Siebert M, Severin K, Heide L. Formation of 4-hydroxybenzoate in Escherichia coli: characterization of the ubic gene and its encoded enzyme chorismate pyruvate-lyase. Microbiology, 1994, 140(4): [12] Siebert M, Sommer S, Li SM, et al. Genetic engineering of plant secondary metabolism. Accumulation of 4-hydroxybenzoate glucosides as a result of the expression of the bacterial ubic gene in tobacco. Plant Physiol, 1996, 112(2): [13] Mitra A, Kitamura Y, Gasson MJ, et al. 4-Hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase (HCHL): an enzyme of phenylpropanoid chain cleavage from Pseudomonas. Arch Biochem Biophys, 1999, 365(1): [14] Sircar D, Roychowdhury A, Mitra A. Accumulation of p-hydroxybenzoic acid in hairy roots of Daucuscarota. J Plant Physiol, 2007, 164(10): [15] Sircar D, Mitra A. Evidence for p-hydroxybenzoate formation involving enzymatic phenylpropanoid side-chain cleavage in hairy roots of Daucuscarota. J Plant Physiol, 2008, 165(4): [16] Sircar D, Mitra A. Accumulation of p-hydroxybenzoic acid in hairy roots of Daucuscarota 2: confirming biosynthetic steps through feeding of inhibitors and precursors. J Plant Physiol, 2009, 166(13):

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